arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

إمكانات اللقاحات القائمة على الخلايا الجذعية لتعديل مجموعات الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 3

Nov 24, 2023

خلاصة:

لقاحات الخلايا الجذعية (DC) هي نوع من العلاج المناعي الذي يعتمد على تواصل الخلايا الجذعية مع جوانب أخرى من الجهاز المناعي. تعد الخلايا النامية عبارة عن خلايا قوية تقدم المستضد وتشارك في تنشيط الاستجابات المناعية الفطرية وتعليم المناعة التكيفية، مما يجعلها أهدافًا مثالية للعلاجات المناعية. تم تحديد الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILCs) حديثًا نسبيًا في مجال علم المناعة ولها أدوار مهمة في الصحة والمرض. استكشفت الدراسات الموضحة هنا الاتصالات بين ILCs من النوع 3 (ILC3s) والبلدان النامية باستخدام نموذج الفئران للتطعيم المعتمد على DC. وقد لوحظت تغيرات محلية وجهازية في مجموعات ILC3 بعد إعطاء لقاح DC، وعند التحدي مع خلايا سرطان الجلد B16F10، لوحظت تغيرات في مجموعات ILC3 في الرئتين. ينبغي استكشاف التفاعلات بين البلدان النامية و ILC3s بشكل أكبر لتحديد الإمكانات التي يمكن أن تتمتع بها اتصالاتهم في الصحة والمرض وتطوير العلاجات المناعية.

Cistanche deserticola—improve immunity -

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

الكلمات الدالة:

خلية شجرية (DC)؛ النوع 3 من الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC3)؛ فطري؛ تواصل

1 المقدمة

الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILCs) هي مجموعة غير متجانسة من الكريات البيض المستمدة من الخلايا السلفية اللمفاوية الشائعة التي لها وظائف حاسمة في تطوير الأنسجة وإصلاحها والتوازن. تم ربط ILCs بأمراض التهابية مختلفة بما في ذلك مرض التهاب الأمعاء والصدفية والربو وأمراض المناعة الذاتية المختلفة [1]. يتم فصلها عادةً إلى ثلاث مجموعات رئيسية، النوع 1 (ILC1)، والنوع 2 (ILC2)، والنوع 3 (ILC3)، بناءً على التعبير عن عوامل النسخ، وملامح السيتوكينات، وعلامات النمط الظاهري المحددة [2]. يتم أحيانًا تجميع الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) كمجموعة فرعية من ILC1s بسبب أوجه التشابه بينها؛ ومع ذلك، فقد ثبت أن الخلايا القاتلة الطبيعية لها سمات مميزة عن ILC1s مثل تعبيرات عامل النسخ ونشاط التحلل الخلوي الذي ميزها كنوع فرعي خاص بها من ILCs [3]. ومع ذلك، لا يزال الكثيرون يعتبرون الخلايا القاتلة الطبيعية مجموعة فرعية من ILC1s [4]. نظرًا لملامح السيتوكينات المماثلة وعوامل النسخ والوظائف المناعية، تعتبر ILCs (خلايا NK و ILC1s و ILC2s و ILC3s) بمثابة نظيرات فطرية لمكونات الجهاز المناعي التكيفي التي تعكس الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا، Th1، Th2، و Th17. الإجابات على التوالي [4]. ومع ذلك، على عكس الخلايا التائية، فإنها تفتقر إلى مستقبلات خاصة بمستضد معين [5].

البلدان النامية هي كريات الدم البيضاء الفطرية التي تعتبر حاسمة في تحريض الاستجابات المناعية والتسامح. لديهم مستقبلات التعرف على الأنماط التي تتعرف على الأنماط الجزيئية المسببة للمرض و/أو الضرر، وهي الخلايا الأكثر كفاءة في تقديم المستضد [6]. من خلال عرض المستضد وإفراز السيتوكين، يمكن للبلدان النامية أن تملي مصير الخلايا التائية الساذجة وتحفز الاستجابات المؤيدة للالتهابات أو كبت المناعة. يمكن تعليم الخلايا التائية للتعرف على المستضد الخطير ومهاجمته أو غير الخطير واتخاذ النمط الظاهري المتسامح [6]. وتشارك البلدان النامية أيضًا في تنشيط المناعة الفطرية وكذلك تعليم المناعة التكيفية. من خلال الاتصال المباشر أو إنتاج السيتوكينات المختلفة والعوامل القابلة للذوبان، يمكن للخلايا DC تنشيط كريات الدم البيضاء الفطرية الأخرى وتعزيز الاستجابات المناعية الفطرية [7].

تم استخدام قوة DC في العلاجات المناعية مثل لقاحات DC. يتم تحضير لقاحات DC عن طريق عزل DC عن المريض أو عزل سلائف DC واشتقاق DC. يتم التلاعب بهذه البلدان النامية خارج الجسم الحي، والذي ينطوي على نضوج البلدان النامية بطريقة مناعية. يتم أيضًا تحميل البلدان النامية بمستضدات محددة، والتي ستكون ما سيهدف إليه اللقاح لتطوير استجابات مناعية موجهة نحو [8]. لقاحات DC هي منصة علاجية مناعية تستفيد من قدرة DC على تثقيف الجهاز المناعي التكيفي للحث على استجابات خاصة بمستضد معين، وخاصة الخلايا التائية السامة للخلايا الخاصة بمستضد معين. لذلك، ركزت غالبية أبحاث لقاح DC على قدرة البلدان النامية على تثقيف جهاز المناعة التكيفي. ومع ذلك، في السنوات الأخيرة، ثبت أن العلاقة بين الخلايا DC والخلايا NK لها تأثير قوي على المناعة المضادة للورم وهو أمر بالغ الأهمية لفعالية التطعيم ضد DC [9-11]. يوضح هذا الحاجة المهمة لاستكشاف العلاقات الأخرى بين البلدان النامية وخلايا الدم البيضاء الفطرية المختلفة والتأثير الذي يمكن أن تحدثه هذه الاتصالات على فعالية لقاحات العاصمة. نظرًا لأن خلايا NK هي جزء من عائلة ILC وبسبب التشابه الوثيق بين ILC والخلايا التائية [5]، كان الهدف من الدراسات المقدمة هنا هو استكشاف العلاقة المحتملة بين البلدان النامية وعضو آخر في عائلة ILC، ILC3s. استخدمنا منصة لقاح DC (moDC) المشتقة من الخلايا الأحادية حيث تم إنشاء البلدان النامية خارج الجسم الحي من خلايا سلائف نخاع العظم الفئران. تعد لقاحات MoDC هي الشكل الأكثر شيوعًا للقاحات DC، حيث كانت تاريخيًا هي الأسهل في الإنتاج [12].

Desert ginseng—Improve immunity (12)

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

تتمتع ILC3s بوظائف مهمة في التوازن المعوي، والمناعة ضد البكتيريا خارج الخلية، وتطوير الأنسجة اللمفاوية [5]. يمكن تقسيم ILC3s إلى مجموعات تختلف في تعبيرها عن العلامات السطحية وإنتاج السيتوكينات. ومع ذلك، فإن جميع ILC3s تعبر عن ROR t [13]. إحدى المجموعات الفرعية من ILC3s هي الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية ILC3- والتي تعتبر مهمة في تكوين الأعضاء [14]. يمكن أيضًا تقسيم ILC3s بناءً على تعبير مستقبل السمية الخلوية الطبيعية (NCR)، والذي يكون في الفئران تعبير NKp46 [15،16]، وفي البشر، يكون NKp44 [17،18]. لذلك، هناك NCR+ وNCR-ILC3 التي لديها اختلافات في قدراتها الوظيفية وخصائصها المظهرية. على سبيل المثال، تم اقتراح أن NCR+ ILC3s تنتج IL-22 ولكن ليس IL-17، في حين أن NCR− ILC3s يمكنها إنتاج كلا السيتوكينات [19]. ومع ذلك، في دراسة حديثة أجراها Fiancette وآخرون، تبين أن NCR+ ILC3s قادر على إنتاج كمية منخفضة من IL-17 [20]. رانكين وآخرون. أظهر في الفئران أن NCR + ILC3s تتطلب عامل النسخ T-bet. لذلك، يمكن التمييز بين NCR+/− ILC3s بناءً على تعبير NKp46 وT-bet. في الدراسات الموصوفة هنا، تم تعريف ILC3s الفأرية بواسطة النسب −CD45+DX5−ROR t +، مع كون NCR+ ILC3s أيضًا T-bet+NKp46+ وNCR−ILC3s هو T-bet−NKp46 - (الجدول 1 والملحق أ الأشكال من أ1 إلى أ3).

الجدول 1. مجموعات فرعية ILC3 يحددها تحليل التدفق الخلوي.

Table 1. ILC3 subsets defined by flow cytometry analysis.


كان هدف هذا البحث هو المساعدة في توضيح ما إذا كانت هناك اتصالات بين لقاحات DC وILC3s وإمكانات تفاعلاتهم في العلاجات المناعية DC. لقد ثبت أن ILC3s لها أدوار في العديد من الأمراض والسرطانات، وبالتالي لديها إمكانات في سياقات العلاج المناعي المختلفة. تعد ILC3s جديدة نسبيًا على مسرح علم المناعة، ونتيجة لذلك، تم استكشاف تأثيرها على الأمراض والعلاجات بشكل محدود. تستجيب ILC3s للمحفزات الخارجية، والتي ستحدد أنشطتها وما إذا كانت تعزز تطور الأورام أو قمعها [21،22]. على غرار خلايا Th17، تمتلك ILC3s عامل النسخ ROR t وتنتج سيتوكينات استجابة Th17 مثل IL-17 وIL-22. IL-22 مهم للسيطرة على الالتهابات البكتيرية في الأمعاء [16]. ومع ذلك، في نموذج لسرطان القولون الناجم عن البكتيريا، ثبت أن IL-17 و IL-22 من ILCs في القولون ساهم في تطور سرطان القولون [23]. علاوة على ذلك، ارتبطت ILC3s بالنتائج السلبية في سرطانات الثدي [24]. على العكس من ذلك، لوحظ وجود ارتباط بين NCR+ ILC3s والهياكل اللمفاوية الثالثية (TLS) والنتائج السريرية الأفضل في سرطانات الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة [18]. بالإضافة إلى ذلك، بحثت دراسة حديثة ILC3s في سرطان القولون والمستقيم. لاحظت الدراسة زيادة في ILC1s وانخفاض في ILC3s في عينات المرضى من أورام القولون والمستقيم المستأصلة مقارنة بالأنسجة المجاورة غير الخبيثة المتطابقة. كشف تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) والتوصيف النسخي أن ILC3s لديها زيادة في اللدونة وقدرات وظيفية مختلفة داخل أورام القولون والمستقيم مقارنة بالأنسجة غير الخبيثة. ومن المثير للاهتمام أن تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) يشير أيضًا إلى أن ILC3s المتسللة للورم قد قامت بتنظيم اللدونة للتحول إلى النمط الظاهري ILC1. ولاحظت الدراسة أن تفاعلات ILC3 مع الخلايا التائية تدعم مناعة النوع الأول، وفي سرطانات القولون والمستقيم، تكون هذه التفاعلات محدودة، مما يعيق الاستجابات المضادة للورم. وهذا يدعم وظيفة مهمة لـ ILC3s في المناعة المضادة للورم. بشكل عام، أظهرت الورقة الأدوار المهمة التي تلعبها ILC3s في تنظيم التوازن المناعي وسرطان القولون والمستقيم [25]. لذلك، تعتبر ILC3s لها أدوار مزدوجة في الصحة والمرض. يمكنهم تعزيز تطور السرطان [23،24،26] ولكن يمكنهم أيضًا المساهمة في الاستجابات المضادة للورم [18،25،27،28]. يبدو أن النمط الظاهري ومساهماتهم في السرطان سياقية، مما يشير إلى إمكانية التعامل مع ILC3s عبر العلاج المناعي للحصول على النمط الظاهري الذي يساعد في الاستجابات المضادة للسرطان بدلاً من دعم تطور الورم. وبالتالي، تمثل اللقاحات المستندة إلى DC طريقة ممكنة للتأثير على البيئة الدقيقة للورم من خلال التلاعب بالأنماط الظاهرية لـ ILC وإنتاج السيتوكينات الخاصة بها، مما يسمح بتكييف الاستجابة المناعية اعتمادًا على الظروف ويمكن أن يكون مفيدًا في أبحاث السرطان.

نظرًا لوجود بحث محدود في الاتصالات بين البلدان النامية و ILC3s، خاصة في سياق التطعيم ضد DC، فقد بحثت الدراسات الموصوفة هنا في التغيرات في مجموعات ILC3 بعد إعطاء لقاح يعتمد على DC للفئران. في هذه الورقة، لوحظ التواصل بين اللقاح المعتمد على DC وILC3s، والذي ظهر من خلال التأثير المستمر للقاح على استجابات ILC3 لمدة 10 أيام على الأقل بعد التحصين.

Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

2. النتائج

2.1. زيادة أعداد كل من NCR+ وNCR− ILC3s في العقدة الليمفاوية التصريفية المحلية بعد إعطاء لقاحات DC 

تم تحضير لقاح DC عن طريق تمييز الخلايا DC عن الخلايا المشتقة من نخاع العظم الفأري خارج الجسم الحي. تم تحفيز هذه البلدان النامية لتعزيز نضوجها حتى يكتسبوا النمط الظاهري المناعي. ثم تم تحميل البلدان النامية بالببتيد. نظرًا لأن هذه الدراسة تركز على طبيعة الاتصال بين اثنين من الكريات البيض الفطرية، وDC، وILC3s، فإن الببتيد المختار لإنتاج اللقاح كان غير ذي صلة عمدًا بنموذجنا البيولوجي لتجنب أن تصبح الخلايا التائية الخاصة بمستضد محدد متغيرًا مربكًا. ولذلك، تم تحميل لقاح DC مع الببتيد المشتق من ألبومين الدجاج.

لبدء التحقيق فيما إذا كان التطعيم ضد DC يؤثر على مجموعات ILC3، قمنا أولاً بتقييم ما إذا كانت هناك اختلافات في الخلوية القريبة من موقع التطعيم. كانت هناك تغييرات في العقدة الليمفاوية التصريفية المحلية بعد تطعيم DC، والتي تضمنت زيادة في عدد ILC3s (الشكل 1). أظهرت حركية الزيادة في ILC3s أن ILC3s زادت تدريجياً بعد التطعيم DC (الشكل 1 ب، ج). تم تقييم عدد NCR+ وNCR− ILC3s في العقدة الليمفاوية التصريفية المحلية وزادت كلتا المجموعتين السكانيتين بعد إعطاء لقاح DC. على الرغم من أن كلا من NCR+ وNCR− ILC3 قد بلغا ذروتهما بعد ثلاثة أيام من التطعيم ضد DC، إلا أن NCR− ILC3s عادت إلى أرقام التماثل الساكن بعد سبعة أيام من التحصين بينما بقي عدد NCR+ ILC3s أعلى بكثير مقارنة بفئران التحكم المعالجة بشكل زائف.

Figure 1. The number of natural cytotoxicity receptors (NCR)+ and NCR− type 3 innate lymphoid cells (ILC3s) increased in the local draining lymph node after DC immunization. Female C57BL/6 mice were inoculated with DC vaccines via hind footpad injections. Popliteal lymph nodes were examined for ILC3 populations. (a) The total number of cells in the lymph node was determined. Accumulation of (b) NCR− ILC3s and (c) NCR+ ILC3s in the lymph node and the percentage of CD45+ cells in the lymph node that were (d) NCR− ILC3s and (e) NCR+ ILC3s. Each bar represents data from four popliteal lymph nodes. A Student's t-test was used at each time point to determine significant differences between the control mice inoculated with phosphate-buffered saline (PBS) and the mice inoculated with the DC vaccine (p-values * < 0.05, ** < 0.005, *** < 0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of (f) NCR− ILC3s and (g) NCR+ ILC3s in the draining popliteal lymph node. The graphs display the mean with the standard deviation.


الشكل 1. زاد عدد مستقبلات السمية الخلوية الطبيعية (NCR) + والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 3 NCR− (ILC3s) في العقدة الليمفاوية التصريفية المحلية بعد تحصين DC. تم تلقيح الفئران الأنثوية C57BL/6 بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية. تم فحص الغدد الليمفاوية المأبضية لسكان ILC3. (أ) تم تحديد العدد الإجمالي للخلايا في العقدة الليمفاوية. تراكم ( ب ) NCR− ILC3s و (ج) NCR + ILC3s في العقدة الليمفاوية والنسبة المئوية لخلايا CD {{1 0}} في العقدة الليمفاوية التي كانت (د) NCR− ILC3s و (هـ) إن سي آر + آي إل سي 3. يمثل كل شريط بيانات من أربع عقد ليمفاوية مأبضية. تم استخدام اختبار الطالب في كل نقطة زمنية لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين فئران التحكم الملقحة بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS) والفئران الملقحة بلقاح DC (القيم p * < 0.{{ 21}}5، ** < 0.005، *** < 0.0005، و **** < 0.0001). مخططات نقطية تمثيلية توضح متوسط ​​عدد (f) NCR− ILC3s و (g) NCR + ILC3s في العقدة الليمفاوية المأبضية المستنزفة. تعرض الرسوم البيانية المتوسط ​​مع الانحراف المعياري.

2.2. أدت لقاحات DC إلى زيادة إنتاج السيتوكينات ILC3 في الطحال دون تغيير العدد الإجمالي لـ ILC3s الطحالية

بعد ذلك، تم فحص التغيرات الجهازية في مجموعات ILC3 من خلال تقييم الطحال، وهو أكبر عضو لمفاوي ثانوي [29]، بعد أسبوع واحد من التطعيم ضد DC، وهي النقطة الزمنية القياسية لمختبرنا لتقييم التغيرات في كريات الدم البيضاء بشكل منهجي. لم يكن هناك فرق كبير لوحظ في العدد الإجمالي لـ NCR + أو NCR− ILC3s في الطحال (الشكل 2).

Figure 2. There were no changes in the number of splenic ILC3s after DC immunization. Female C57BL/6 mice (n = 8 [PBS] or 10 [DC]) were inoculated with DC vaccines via hind footpad injections. Spleens were harvested one-week following inoculation and examined for ILC3 populations. Splenic total number of (a) NCR− ILC3s and (b) NCR+ ILC3s (and the geometric mean fluorescent intensity of T-bet for NCR+ ILC3s) and the percentage of splenic CD45+ cells that were (c) NCR− ILC3s and (d) NCR+ ILC3s were monitored and quantified by flow cytometry analysis. A Student's t-test was used to determine the significance between the populations in the control mice inoculated with phosphate-buffered saline (PBS) and the DC-inoculated mice. The means were not significantly different. Representative dot plots showing the average number of splenic (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The standard deviation and mean are represented by the graph bars and error bars.


الشكل 2. لم تكن هناك تغييرات في عدد ILC3s الطحال بعد تحصين العاصمة. تم تلقيح الفئران الأنثوية C57BL/6 (n=8 [PBS] أو 10 [DC]) بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية. تم حصاد الطحال بعد أسبوع واحد من التلقيح وفحصها لسكان ILC3. إجمالي عدد الطحال لـ (أ) NCR− ILC3s و (ب) NCR + ILC3s (والمتوسط ​​الهندسي لكثافة الفلورسنت T-bet لـ NCR + ILC3s) والنسبة المئوية لخلايا الطحال CD 45+ التي كانت (ج) NCR− تمت مراقبة ILC3s و (d) NCR + ILC3s وقياسها عن طريق تحليل التدفق الخلوي. تم استخدام اختبار t للطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات السكانية في فئران التحكم الملقحة بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS) والفئران الملقحة بالتيار المستمر. الوسائل لم تكن مختلفة بشكل كبير. مخططات نقطية تمثيلية توضح متوسط ​​عدد الطحال (e) NCR− ILC3s وNCR+ ILC3s. يتم تمثيل الانحراف المعياري والمتوسط ​​بواسطة أشرطة الرسم البياني وأشرطة الخطأ.

نظرًا لأن ملفات تعريف السيتوكينات ILC3 يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية، فقد تم قياس إنتاج ILC3 لـ IL-22 و IL-17 في الطحال بعد أسبوع واحد من تطعيم DC. كانت هناك زيادة في ILC3s التي تنتج IL-17 أو IL-22 أو كلا السيتوكينات في الفئران المعالجة بلقاحات DC مقارنة بفئران التحكم (الشكل 3).

Figure 3. There was an increase in splenic ILC3s producing IL-17 and IL-22 following DC immunization. Female C57BL/6 mice (n = 12–18) were inoculated with DC vaccines via hind footpad injection. The control mice were treated with phosphate-buffered saline (PBS). One week after immunization, spleens were harvested and examined for IL-17- and IL-22-producing ILCs. The number of lineage−CD127+DX5− cells producing (a) IL-17, (b) IL-22, and (c) both IL-17 and IL-22 and their corresponding geometric mean fluorescent intensities were determined using intracellular cytokine staining and flow cytometry. Data were analyzed using a two-way ANOVA test (p-values * < 0.05, ** < 0.005). (d) Representative dot plots show the average number of splenic CD45+ lineage−CD127+DX5− cells producing IL-17 and/or IL-22. The graphs display the mean with the standard deviation.


الشكل 3. كانت هناك زيادة في ILC3s الطحالية التي تنتج IL-17 وIL-22 بعد تحصين DC. تم تلقيح الفئران الأنثوية C57BL / 6 ( ن=12–18) بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية. عولجت الفئران الضابطة بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS). بعد أسبوع واحد من التحصين، تم حصاد الطحال وفحصها بحثًا عن IL-17- و IL{{10}} المنتجة للـ ILCs. عدد خلايا النسب −CD 127+ DX5− التي تنتج (أ) IL-17، (ب) IL-22، و (ج) كلاً من IL-17 و IL{{ 16}} وتم تحديد متوسط ​​شدة الفلورسنت الهندسي المقابل لها باستخدام تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه (القيم p * < 0.05، ** < 0.005). ( د ) تُظهر المخططات النقطية التمثيلية متوسط ​​عدد خلايا الطحال CD 45+ النسب − CD 127+ DX5− التي تنتج IL -17 و / أو IL -22. تعرض الرسوم البيانية المتوسط ​​مع الانحراف المعياري.

2.3. المجموعات السكانية الفرعية ILC3 بعد التحصين DC والتحدي مع خلايا سرطان الجلد B16F10

يمكن أن تلعب ILC3s أدوارًا مزدوجة في تطور السرطان من خلال المساهمة في الاستجابات المؤيدة والمضادة للأورام [22]. ولذلك، تم التحقيق في تأثير التطعيم ضد DC على استجابات ILC3 في سياق السرطان. عولجت الفئران بلقاحات DC وبعد أسبوع واحد، تم حقنها عن طريق الوريد بخلايا سرطان الجلد B16F10، مما أدى إلى زرع الرئتين. كما ذكرنا سابقًا، نظرًا لأنه تم تقييم مكونات المناعة الفطرية فقط، لم يكن من المقرر تقييم التعليم الخاص بالمستضد بواسطة اللقاح في تجاربنا، وبالتالي، فإن نموذج سرطان الجلد المستخدم لم يعبر عن الألبومين البيضاوي، مما يجعل الببتيد محملاً على البلدان النامية عَرَضِيّ. أظهرت تجربة الحركية (الشكل 1) أنه يمكن ملاحظة الاستجابات المحلية لـ ILC3s خلال ثلاثة أيام. لذلك، بعد ثلاثة أيام من التحدي، تم فحص عدد المجموعات السكانية الفرعية ILC3 وقدرتها على إنتاج السيتوكينات في الطحال والرئتين. على غرار ما لوحظ في طحال الفئران الساذجة، لم يكن هناك فرق كبير في العدد الإجمالي لل NCR + الطحال وNCR− ILC3s بين المجموعة الضابطة والمجموعة المحصنة بالتيار المستمر (الشكل 4). ومع ذلك، على عكس النموذج الساذج، في الطحال، لم تعد هناك تغييرات في إنتاج IL-17 و/أو IL-22 (الشكل 5).


imageFigure 4. There was no change in the total number of splenic ILC3s after DC vaccination and challenge with B16F10 melanoma cells. Female C57BL/6 mice (n = 10) were inoculated with DC vaccines via hind footpad injection and one week later, the mice were administered with 3 × 105 B16F10 cells via tail vein injection. Spleens were harvested and examined for the accumulation of ILC3 populations three days after B16F10 administration. The number of splenic (a) NCR− ILC3s and (b) NCR+ ILC3s (and the geometric mean fluorescent intensity of T-bet for NCR+ ILC3s) and the percentage of splenic CD45+ cells that were (c) NCR− ILC3s and (d) NCR+ ILC3s were monitored and quantified by flow cytometry. A Student's t-test was used to determine the significance between the populations in the control mice treated with phosphate-buffered saline (PBS) and the DC-inoculated mice. The means were not significantly different. Representative dot plots show the average number of splenic (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The mean and standard deviation are represented with the bar graphs and error bars.

الشكل 4. لم يكن هناك أي تغيير في العدد الإجمالي لـ ILC3s الطحالية بعد التطعيم ضد DC والتحدي مع خلايا سرطان الجلد B16F10. تم تلقيح الفئران الأنثوية C57BL/6 (n=10) بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية وبعد أسبوع واحد، تم إعطاء الفئران 3 × 105 خلايا B16F10 عن طريق حقن الوريد الذيل. تم حصاد الطحال وفحصه لتراكم مجموعات ILC3 بعد ثلاثة أيام من إعطاء B16F10. عدد الطحال (أ) NCR− ILC3s و (ب) NCR + ILC3s (والمتوسط ​​الهندسي لكثافة الفلورسنت T-bet لـ NCR + ILC3s) والنسبة المئوية لخلايا الطحال CD 45+ التي كانت (ج) NCR− تمت مراقبة ILC3s و (d) NCR + ILC3s وقياسها بواسطة قياس التدفق الخلوي. تم استخدام اختبار t للطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات السكانية في فئران التحكم التي عولجت بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS) والفئران الملقحة بالتيار المستمر. الوسائل لم تكن مختلفة بشكل كبير. تُظهر مخططات النقاط التمثيلية متوسط ​​عدد الطحال (e) NCR− ILC3s وNCR+ ILC3s. يتم تمثيل المتوسط ​​والانحراف المعياري بالرسوم البيانية الشريطية وأشرطة الخطأ.

Figure 5. There was no change in the number of splenic IL-17 and/or IL-22-producing ILCs after DC vaccination and challenge with B16F10 melanoma cells. Female C57BL/6 mice (n = 10) were inoculated with DC vaccines via hind footpad injection and one week later, 3 × 105 B16F10 cells were administered intravenously. Three days later, spleens were harvested and examined for ILC3 cytokine production. The number of lineage CD127+DX5- cells producing (a) IL-17, (b) IL-22, and (c) both IL-17 and IL-22 and their corresponding geometric mean fluorescent intensities were determined using intracellular cytokine staining and flow cytometry. Data were analyzed using a two-way ANOVA test and no significant difference between the DC-vaccinated mice and the phosphate-buffered saline (PBS)-treated controls was detected. (d) Representative dot plots show the average number of splenic CD45+lineage CD127+DX5- cells producing IL-17 and/or IL-22.


الشكل 5. لم يكن هناك أي تغيير في عدد الطحال IL-17 و/أو IL-22- المنتج للـ ILCs بعد التطعيم ضد DC والتحدي مع خلايا سرطان الجلد B16F10. تم تلقيح إناث الفئران C57BL/6 (n=10) بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية وبعد أسبوع واحد، تم إعطاء 3 × 105 خلايا B16F10 عن طريق الوريد. وبعد ثلاثة أيام، تم حصاد الطحال وفحصه لإنتاج السيتوكينات ILC3. عدد خلايا النسب CD 127+ DX 5- التي تنتج (أ) IL -17، (ب) IL -22، و (ج) كلاً من IL -17 و تم تحديد IL -22 ومتوسط ​​شدة الفلورسنت الهندسي المقابل لها باستخدام تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. وقد تم تحليل البيانات باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه ولم يتم اكتشاف فرق كبير بين الفئران المحصنة بالتيار المستمر والضوابط المعالجة بالمحلول الملحي بالفوسفات (PBS). ( د ) تُظهر المخططات النقطية التمثيلية متوسط ​​عدد خلايا الطحال CD 45+ CD 127+ DX 5- التي تنتج IL -17 و / أو IL -22.

يعد الحقن الوريدي لخلايا B16F10 عبر الوريد الذيل نموذجًا شائعًا للفأر لانتشار سرطان الجلد الاصطناعي إلى الرئتين [30]. لذلك، تم فحص الرئتين أيضًا لتحديد عدد المجموعات السكانية الفرعية ILC3 وتقييم إنتاجها من السيتوكينات.

كان هناك انخفاض في عدد NCR− ILC3s مع زيادة مصاحبة في عدد NCR + ILC3s (الشكل 6). ومع ذلك، لم يكن هناك أي تأثير ملحوظ للتطعيم ضد DC على إنتاج السيتوكينات بوساطة ILC3-في الرئتين (الشكل 7).

Figure 6. Following DC immunization and challenge with B16F10 cells, there were numerical changes in ILC3 subpopulations in the lungs. Female C57BL/6 mice (n = 10) received DC vaccines via hind footpad injection and one week later, 3 × 105 B16F10 cells were administered intravenously. Three days post-challenge, the lungs were examined using flow cytometry for the number of (a) NCR− ILC3s and (b) NCR+ ILC3s (and the geometric mean fluorescent intensity of T-bet for NCR+ ILC3s) and the percentage of CD45+ cells that were (c) NCR− ILC3s and (d) NCR+ ILC3s. A Student's t-test was used to determine the significance between the subpopulations in the control mice treated with phosphate-buffered saline (PBS) and the DC-inoculated mice (p-values * <0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

الشكل 6. بعد التحصين DC والتحدي مع الخلايا B16F10، كانت هناك تغييرات عددية في المجموعات السكانية الفرعية ILC3 في الرئتين. تلقت إناث الفئران C57BL/6 (n=10) لقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية وبعد أسبوع واحد، تم إعطاء 3 × 105 خلايا B16F10 عن طريق الوريد. بعد ثلاثة أيام من التحدي، تم فحص الرئتين باستخدام قياس التدفق الخلوي لعدد (أ) NCR− ILC3s و (ب) NCR+ ILC3s (والمتوسط ​​الهندسي لكثافة الفلورسنت T-bet لـ NCR+ ILC3s) والنسبة المئوية للقرص المضغوط { {18}} الخلايا التي كانت (ج) NCR− ILC3s و (د) NCR + ILC3s. تم استخدام اختبار الطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات السكانية الفرعية في فئران التحكم التي عولجت بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS) والفئران الملقحة بالتيار المستمر (القيم p *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Figure 7. There was no change in the number of ILC3s producing IL-17 and/or IL-22 in the lungs after DC vaccination and challenge with B16F10 melanoma cells. Female C57BL/6 mice (n = 10) were inoculated with DC vaccines via hind footpad injection and one week later, they were intravenously administered with 3 × 105 B16F10 cells. Three days later, the lungs were harvested and examined for ILC3-mediated cytokine production. The number of lineage−CD127+DX5− cells producing (a) IL-17, (b) IL-22, and (c) both IL-17 and IL-22 and their corresponding geometric mean fluorescent intensities were determined using intracellular cytokine staining and flow cytometry. Data were analyzed using a two-way ANOVA test (p-values *** < 0.0005). There was no significant difference in the total number of IL-22-producing, IL-17-producing, and IL-22 and IL-17 multi-cytokine-producing lineage−CD127+DX5− cells. (d) Representative dot plots showing the average number of pulmonary CD45+ lineage−CD127+DX5− cells producing IL-17 and/or IL-22. The standard deviation and mean are represented by the graph bars and error bars.


الشكل 7.لم يكن هناك تغيير في عدد ILC3s التي تنتج IL-17 و/أو IL-22 في الرئتين بعد التطعيم ضد DC والتحدي مع خلايا سرطان الجلد B16F10. تم تلقيح إناث الفئران C57BL/6 (n=10) بلقاحات DC عن طريق حقن وسادة القدم الخلفية وبعد أسبوع واحد، تم إعطاؤها عن طريق الوريد باستخدام 3 × 105 خلايا B16F10. وبعد ثلاثة أيام، تم حصاد الرئتين وفحصهما بحثًا عن إنتاج السيتوكينات بوساطة ILC3-. عدد خلايا النسب − CD 127+ DX5− المنتجة (a) إيل-17, (b) إيل-22، و (c) تم تحديد كل من IL{{0}} و IL-22 ومتوسط ​​شدة الفلورسنت الهندسي المقابل لها باستخدام تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه (القيم p *** <0.0005). لم يكن هناك اختلاف كبير في إجمالي عدد IL-22- المنتجة، IL-17- المنتجة، و IL-22 و IL-17 النسب المنتجة للسيتوكينات المتعددة −CD{{ 12}} خلايا DX5−. (d) مخططات نقطية تمثيلية توضح متوسط ​​عدد خلايا CD الرئوية 45+ النسب − CD 127+ DX5− التي تنتج IL -17 و/أو IL -22. يتم تمثيل الانحراف المعياري والمتوسط ​​بواسطة أشرطة الرسم البياني وأشرطة الخطأ.

3. المناقشة

سعت الدراسات الموضحة هنا إلى استكشاف الاتصالات المحتملة بين ILC3s وDC في سياق لقاح DC. كانت هناك زيادات في عدد المجموعات السكانية الفرعية NCR+ وNCR− ILC3 في تصريف العقد الليمفاوية (الشكل 1) بعد التطعيم ضد DC، مما يشير إلى حدوث اتصالات محلية بين لقاح DC والمجموعات السكانية الفرعية ILC3. ومع ذلك، كان للاتصال بين DC وNCR+ ILC3 تأثير أطول أمدًا على العدد الإجمالي لـ NCR+ ILC3s من ذلك الذي لوحظ بين DC وNCR− ILC3s. يشير هذا إلى أن البلدان النامية قد يكون لها تفاعلات فريدة مع ILC3s اعتمادًا على تعبيرها عن NCRs. لم يكن هناك أي تغيير ملحوظ في عدد المجموعات السكانية الفرعية ILC3 في الطحال بعد سبعة أيام من التطعيم ضد DC (الشكل 2) أو عشرة أيام بعد التطعيم ضد DC وثلاثة أيام بعد تحدي خلايا سرطان الجلد B16F10 (الشكل 4). أساليبنا لفحص ILC3s لإنتاج IL-17 و IL-22 لها قيود لأنها تظهر الاستجابات الترجمية والنسخية بسبب إعادة تحفيز الخلايا في المختبر. ومع ذلك، أضفنا عنصر تحكم تجريبي في جميع التجارب، والذي سيكون بمثابة العلاج بدون تحفيز في المختبر لاكتشاف ما تنتجه ILC3s استجابةً للإشارة الواردة في الجسم الحي. كما هو موضح في الأشكال 3d و5d و7d، فإن الخلايا التي لم تتلق أي تحفيز في المختبر أنتجت IL-17 وIL-22. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن أرقام خلايا ILC3 الطحالية لم تتغير (الشكل 2)، إلا أن إنتاج السيتوكينات من قبل المجموعات السكانية الفرعية ILC3 كان مختلفًا بعد سبعة أيام من التطعيم بالتيار المستمر (الشكل 3). يشير هذا إلى أن تطعيم DC يمكن أن يؤثر على وظيفة استجابات ILC3 دون التأثير عليها عدديًا. نظرًا لكونها مكونات في الجهاز المناعي الفطري، فمن الممكن أن يحدث الاتجار بـ ILC3 داخل الأنسجة وخارجها في غضون بضعة أيام، وبالتالي يمنع اكتشاف الاختلافات العددية المعدلة بالعلاج بعد سبعة إلى عشرة أيام من التطعيم ضد DC. وقد لوحظ وجود دليل على ذلك في العقدة الليمفاوية التي تستنزف لقاح DC حيث زاد عدد ILC3s على مدار ثلاثة أيام ثم بدأ في التناقص (الشكل 1). وبالتالي، ربما كانت هناك تغييرات عددية في المجموعات السكانية الفرعية ILC3 في الطحال والتي تم تفويتها لأنها عادت إلى أرقام التوازن بحلول التحصين في اليوم السابع بعد DC. ومع ذلك، ركزت الدراسات على الاستجابات طويلة الأمد بدلاً من الاستجابات العابرة قصيرة المدى، وبالتالي، لم تبحث في هذا الطريق بشكل أكبر. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من أن عدد المجموعات السكانية الفرعية ILC3 الطحال لم يكن مختلفًا عن مجموعات التحكم، فقد تم تغيير ملفات تعريف السيتوكينات الخاصة بهم (الشكل 3). تمت زيادة إنتاج IL-22 و IL-17 في ILC3s الطحالية، مما يدل على أن التطعيم DC كان له تأثير نظامي على ILC3s. باختصار، لم يؤثر التطعيم ضد DC على كمية ILC3 الطحالية ولكنه أثر على وظائفها.

على الرغم من وجود تأثير مستمر على إنتاج السيتوكينات المشتقة من ILC3-بعد سبعة أيام من التحصين ضد DC في طحال الفئران الخالية من الأورام، فإن هذا التأثير على ILC3s في الطحال لم يكن قابلاً للاكتشاف بعد ثلاثة أيام من التحدي الوريدي بخلايا سرطان الجلد B16F10 ( الشكل 5). يبدو أن لقاح DC يقوم بإعداد مجموعات ILC3 في النموذج الخالي من الورم والذي تم قمعه عند تحدي الورم. نظرًا لأن ILCs تتأثر بشكل كبير ببيئتها، فقد يشير هذا إلى أن الاتصالات بين البلدان النامية في اللقاح وILC3s كانت مقتصرة على النموذج الخالي من الورم. على العكس من ذلك، يمكن أن يكون هذا أيضًا بسبب تعبئة ILC3s المجهزة إلى مواقع أخرى في الجسم حيث قد تكون B16F10 قد تجمعت وأنشأت بيئة دقيقة تسببت في تجنيد كريات الدم البيضاء.

كان هناك تحول في المجموعات السكانية الفرعية ILC3 التي لوحظت في الرئتين بعد عشرة أيام من التطعيم ضد DC وثلاثة أيام بعد تحدي الخلايا B16F10 مقارنة بفئران التحكم غير المحصنة ضد DC والتي تلقت فقط إدارة خلايا B16F10. على وجه التحديد، كانت هناك زيادة في عدد NCR+ ILC3s وانخفاض في NCR− ILC3s في الرئتين (الشكل 6). T-bet هو عامل النسخ المرتبط باستجابات Th1 [31]. ولذلك، فإن الزيادة في NCR + ILC3s، التي تعبر عن T-bet، تشير إلى تعزيز محتمل للمناعة من النوع الأول. يمكن أن يكون هذا استجابة ILC3 مفيدة في سياق السرطان حيث تكون الاستجابات المناعية من النوع الأول مرغوبة عادةً.

cistanche benefits for men-strengthen immune system

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

لقد ثبت أن NCR + ILC3s يمكن اشتقاقها من مجموعة فرعية من NCR− ILC3s [16]. لذلك، يمكن أن تعزى الزيادة في NCR+ ILC3s والانخفاض في NCR− ILC3s إلى التحفيز الذي أدى إلى التحول في NCR− ILC3s ليصبح NCR+ ILC3s. إذا كانت ILC3s تخضع لتبديل النمط الظاهري من NCR− إلى NCR+، فقد لا تكون قادرة على إنتاج السيتوكينات أثناء التبديل أو بعده بفترة قصيرة وأثناء التكيف مع البيئة المحيطة ونمطها الظاهري الجديد. لذلك، ربما يكون إنتاج السيتوكينات قد توقف أو تأخر أثناء حدوث تبديل النمط الظاهري، وهو ما قد يفسر سبب عدم وجود تغييرات في إنتاج ILC3-بوساطة IL-17 و/أو IL-22 في الرئتين (الشكل 7). ومع ذلك، فمن الممكن أيضًا أن التطعيم ضد DC لم يؤثر ببساطة على إنتاج السيتوكينات بواسطة ILC3s في الرئتين في هذه المرحلة الزمنية.

4. المواد والأساليب

موافقة الأخلاق

تم إجراء جميع دراسات الفئران باتباع بروتوكول استخدام الحيوان رقم 3807 تحت إشراف موظفي رعاية الحيوان في جامعة جيلف.

الفئران

تم استلام فئران C57BL6 الأنثوية من مختبرات Charles River التي تتراوح أعمارها بين خمسة وثمانية أسابيع. تم إيواء الفئران في بيئة خاضعة للرقابة في وحدة عزل الحيوانات بجامعة جيلف وتم منحها أسبوعًا واحدًا للتأقلم قبل بدء التجارب. تم إطعام الفئران وإعطائها الماء حسب الرغبة.

ثقافات الخلايا الجذعية

تم حصاد عظام الفخذ والساق لإناث الفئران C57BL6 وقطعت أطراف العظام. باستخدام حقنة، تم مسح النخاع العظمي للظنبوب وعظم الفخذ باستخدام برنامج تلفزيوني في طبق بيتري. تمت إعادة تعليق النخاع العظمي في تعليق أحادي الخلية وتم حسابه باستخدام عدادة الكريات. تم بعد ذلك إعادة تعليق الخلايا في الوسائط (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] مع 2- ميركابتوإيثانول [Gibco Ref# 21985-023]، و1% بنسلين/ستربتوميسين [HyClone Cat# SV30010]، و10% مصل الأبقار الجنيني [VWR Cat # 97068-085]) إلى تركيز 1.25 × 106 خلية لكل مل، مع إضافة 20 نانوغرام / مل من عامل تحفيز مستعمرة المحببات البلاعم (GM-CSF) (Biolegend Cat #576308) و قسامة إلى قوارير الثقافة 25 سم 2، 5 مل لكل دورق. تم وضع الثقافات في حاضنات مرطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون وتم السماح لها بالنمو لمدة 7 أيام. في اليوم الثاني من الثقافة، تمت إضافة 5 مل من الوسائط الطازجة مع 20 نانوغرام/مل من GM-CSF. في اليوم الخامس، تم طرد 5 مل من كل ثقافة، وتمت إزالة المادة الطافية. تمت إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من الوسائط الطازجة مع 20 نانوغرام / مل من GM-CSF وأعيد إضافتها إلى قوارير الثقافة. تم حصاد الثقافات في اليوم السابع وإعدادها للتطعيم.

إعداد تطعيم الخلايا الجذعية

تم نقل ثقافات الخلايا الجذعية (DC) إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وتم حسابها باستخدام عدادة الكريات. تم تحفيز الخلايا باستخدام 100 نانوغرام / مل من عديد السكاريد الدهني (LPS) من الإشريكية القولونية O55: B5 (Sigma Cat # L2880) و1 ميكروغرام / مل من ألبومين بيض الدجاج (OVA) 257–264 (SIIN) (PepScan Systems، Lelystad، هولندا) لمدة ساعة واحدة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات وتم إعادة تعليقها إلى تركيز 5 × 105 خلية لكل 30 ميكرولتر. تم إعطاء اللقاحات بجرعات 5 × 105 خلية لكل 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

معالجة الأنسجة

تم حصاد العقد الليمفاوية والطحال ووضعها في أطباق بيتري مع 2 مل من محلول ملحي هانكس (HBSS). تم ضغطهم في معلقات أحادية الخلية باستخدام الجزء الخلفي من سدادة حقنة سعة 3 مل. تم ترشيح المعلقات أحادية الخلية في أنبوب مخروطي سعة 5 0 مل باستخدام مصفاة خلية بحجم مسام 7 0 ميكرومتر. تم حساب العقد الليمفاوية باستخدام عدادة الكريات. تم طرد الطحال بالطرد المركزي، وتمت إزالة الطاف، وتم إعادة تعليق الخلايا في محلول تحلل ACK (8.29 جم NH4Cl [0.15 M]، 1 جم KHCO3 [10.0 مم]، 37.2 مجم Na2EDTA [0.1 مم] في 1 مل من ماء ملي كيو) ويترك لمدة خمس دقائق لتحلل كريات الدم الحمراء. تم غسل الخلايا باستخدام HBSS مرتين قبل إعادة تعليقها في الوسائط وحسابها باستخدام مقياس الكريات.

تم حصاد الرئتين ووزنهما قبل وضعها في أنبوب لطيف MACSTM يحتوي على 1 ملغم / مل كولاجيناز IV (Gibco Ref # 17104-019) و 5 ميكروغرام / مل DNase I (Roche Ref # 11284932001) في HBSS. باستخدام جهاز فصل GentleMACSTM، تم تشغيل العينات من خلال بروتوكول الرئة A ثم تم حضنها لمدة 20 دقيقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون. تم بعد ذلك تشغيل العينات من خلال بروتوكول الرئة B على مُفكك GentleMACSTM. تمت إضافة ضعف حجم عينة HBSS إلى العينات لتحييد تفاعل الإنزيم. تم ترشيح العينات في أنبوب مخروطي سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية بحجم مسام 70 ميكرومتر. تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS وتم إعادة تعليقها في المخزن المؤقت لتحلل ACK. بعد خمس دقائق في محلول تحلل ACK، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS وتم إعادة تعليقها في الوسائط.

فحص استجابة السيتوكين

تم زرع المعلقات أحادية الخلية من عينات الأنسجة في 96-ألواح بئر في نسخ مكررة، حيث تمت معالجة بئر واحدة كعنصر تحكم بدون تحفيز بينما تم استقبال الآخر جيدًا كعلاج منشط. تم إعطاء الآبار غير المحفزة فقط الوسائط، وتلقت الآبار المعالجة بالمنشطات 10 نانوغرام/مل من خلات phorbol ميريستات (PMA) و1500 نانوغرام/مل أيونوميسين في الوسائط. تم وضع الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تمت إضافة Brefeldin A (GolgiPlug، Biolegend Cat # 420601) (× 100 تخفيف) إلى جميع آبار العينات، وتم وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لمدة أربع ساعات إضافية. ثم تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وملطخة لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

خلايا سرطان الجلد B16F10

تم إذابة خلايا B16F10 من النيتروجين السائل وحسابها باستخدام مقياس الكريات. تم بعد ذلك إعادة تعليق الخلايا في الوسائط (وسط النسور المعدل عالي الجلوكوز في Dulbecco [HyClone Cat # SH3002201] مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين [HyClone Cat # SV30010] و 10٪ مصل العجل البقري [VWR Cat # 10158-358]) ل تركيز 1 × 105 خلايا لكل مل. تم بعد ذلك قسامة الخلايا B16F10 في قوارير الاستنبات ووضعها في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون. لتحضير خلايا B16F10 للإعطاء، تم نقل الخلايا من قوارير الاستزراع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل، وتم غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني، ثم إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني. تم حساب الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتم إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني لإعطاء جرعات من 3 × 105 خلايا لكل 200 ميكرولتر.

تلوين الأجسام المضادة للسيتوكينات داخل الخلايا

تم زرع الخلايا في صفائح جيدة {{0}} وتم إعادة تعليقها في كتلة Fc (مضاد لـ CD16/CD32، BioLegend Cat # 101320) وحضنت عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تم غسل الخلايا بمحلول ملحي بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ من ألبومين المصل البقري (FACS buffer) مرتين، ثم أعيد تعليقها في مزيج رئيسي من الأجسام المضادة لتلوين سطح الخلية (CD45، BioLegend Cat # 103132؛ NKp46، BioLegend Cat # 137617؛ DX5، BioLegend Cat # 108919؛ CD127، BioLegend Cat # 135007؛ Lineage Cocktail، BioLegend Cat # 133311) وحضنت عند 4 درجات لمدة 20 دقيقة. تم غسل الخلايا بمحلول ملحي بالفوسفات مرتين وتم إعادة تعليقها في صبغة Zombie Aqua Fixable قابلة للحياة (FVD) (BioLegend Cat # 423101) وحضنت عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تم استخدام محلول ملحي بالفوسفات لغسل الخلايا مرتين قبل إعادة التعليق في المخزن المؤقت للتثبيت (BioLegend Cat # 420801). تم تحضين الخلايا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد التثبيت، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول نفاذية مؤقت (BioLegend Cat#421002). تمت إعادة تعليق الخلايا في مزيج رئيسي من الأجسام المضادة المصبوغة داخل الخلايا (IL-22، ​​BioLegend Cat#516404؛ IL-17A، eBioscience Cat# 17-7177-81) وتم احتضانها عند درجة حرارة 4 ◦ مئوية لمدة 20 دقيقة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت للنفاذية، ثم إعادة تعليقها في المخزن المؤقت FACs، ثم معالجتها باستخدام مقياس التدفق الخلوي BD FACSCantoTM II وتحليلها باستخدام برنامج BD FACSDivaTM.

Desert ginseng—Improve immunity (21)

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

عامل النسخ تلطيخ الأجسام المضادة

تم زرع الخلايا في صفائح جيدة {{0}} وتم إعادة تعليقها في كتلة FC (مضاد لـ CD16 / CD32 BioLegend Cat # 101320) وحضنت عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول FACs (0.5٪ في ألبومين المصل البقري [HyClone Cat# SH30574.02] في PBS)، ثم أعيد تعليقها في مزيج رئيسي من الأجسام المضادة لتلوين سطح الخلية (CD45، BioLegend Cat#103132؛ NKp46) ، BioLegend Cat # 137617؛ DX5، BioLegend Cat # 108919؛ CD127، BioLegend Cat # 135007؛ Lineage Cocktail، BioLegend Cat # 133311)، وحضنت عند درجة حرارة 4 ◦ مئوية لمدة 20 دقيقة. تم بعد ذلك غسل الخلايا بمحلول ملحي معزز بالفوسفات مرتين وتم إعادة تعليقه في FVD (BioLegend Cat # 423101) وحضنت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تم غسل الخلايا بمحلول ملحي بالفوسفات مرتين وتم إعادة تعليقها في المخزن المؤقت لتثبيت FoxP3 للماوس (BD Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124) واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت، تم غسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية FoxP3 للماوس (BD Pharmingen BD Sciences Cat# 51-9006125) الذي تم إعادة تعليقه في المخزن المؤقت لنفاذية FoxP3، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تمت إعادة تعليق الخلايا في الأجسام المضادة لعامل النسخ (ROR gamma(t)، eBioscience Cat#17-6988-82؛ T-bet، eBioscience Cat# 12-5825-82) وحضنت عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تم غسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للنفاذية مرتين، ثم تم إعادة تعليقها في المخزن المؤقت FACs، وتم تحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي BD FACSCantoTM II وبرنامج BD FACSDivaTM.

تحليل احصائي

تم تحليل مجموعات الطحال والرئتين من NCR + وNCR− ILC3s باستخدام اختبارات t غير المقيدة. تمت مقارنة تحليل مجتمع التجربة الحركية باستخدام تحليل التباين العادي أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار المقارنة المتعددة لتوكي. تم فحص تحليل السيتوكينات في الطحال والرئتين باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه واختبار Šídák للمقارنات المتعددة. تم تعريف وسائل مجموعات العلاج على أنها مختلفة بشكل كبير مع قيمة p <0.05.

استراتيجية النابضة

أولاً، باستخدام منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A)، تم بوابات الخلايا الليمفاوية. ثم، تم استبعاد الخلايا المزدوجة باستخدام FSC-A وFSC-height (FSC-H). تم بوابات الخلايا الحية عن طريق أخذ الخلايا السلبية لـ FVD. بعد ذلك، تم أخذ CD 127+ وخلايا كوكتيل النسب لتضييق نطاق ILCs. تم بعد ذلك وضع بوابات على خلايا القرص المضغوط 45+. للتأكد من استبعاد جميع خلايا NK، تم بعد ذلك ربط DX5−. لتحديد عامل النسخ لـ ILC3s، تم بعد ذلك ربط خلايا ROR t +، ومن هذه الخلايا، كانت NCR + ILC3s هي T-bet + وNKp46+ وNCR− ILC3s كانت T-bet− وNKp46. للتعرف على السيتوكينات، بعد البوابات على الخلايا الليمفاوية، والخلايا المفردة، والخلايا الحية، وCD 127+ نسب − CD 45+، IL -17، و IL -22 تم بعد ذلك ربطها على أنها يتم إنتاجها بواسطة ILC3s نظرًا لأن ILC3s ستكون الخلايا الوحيدة في هذه البوابة النهائية التي يمكن أن تنتج IL-22 و IL-17.

Desert ginseng—Improve immunity (9)

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

5. الاستنتاجات

على الرغم من أن زيادة إنتاج ILC3-المشتق من IL-17 وIL-22 في الطحال الذي لوحظ في النموذج الخالي من الورم قد فقد في نموذج تحدي الورم، فقد كان هناك تحول معاكس في NCR+ و مجموعات NCR− ILC3 في الرئتين. يشير هذا إلى أن التطعيم ضد DC كان من الممكن أن يؤثر على ILC3s في نموذج تحدي الورم وكذلك في الفئران الخالية من الورم. ومع ذلك، فإن تأثير هذه العلاقة بين الخلايا الجذعية في اللقاح وILC3s على الاستجابات المضادة للورم لا يزال غير معروف وهو اتجاه بحثي مستقبلي. وبالتالي، فإن الدراسات الموضحة هنا توضح أن هناك اتصالات تحدث بين اللقاحات المعتمدة على DC والمجموعات السكانية الفرعية ILC3، سواء في الفئران الخالية من الورم أو الفئران الحاملة للورم. يبدو أن هذه الاتصالات وتأثيراتها اللاحقة على الاستجابات المناعية معقدة. تساهم هذه الملاحظات في مجموعة الأدبيات التي تسعى إلى فك العلاقة بين لقاحات DC و ILC3s في محاولة لتطوير استراتيجيات التطعيم المحسنة للـ DC. نوصي بإجراء مزيد من الدراسات التي تبحث في إمكانية تصميم استراتيجيات التطعيم التي يمكنها تعديل هذه الاتصالات لتحسين استجابات ILC3 للمساعدة في الاستجابات المضادة للورم والحد من دعم الاستجابات المؤيدة للورم.

مراجع

1. كرينير، أ.؛ فيفيير، E.؛ بليري، M. الخلايا اللمفاوية الفطرية الشبيهة بالمساعد والعلاج المناعي للسرطان. سيمين. إيمونول. 2019، 41، 101274. [CrossRef] [PubMed]

2. سليمي، م.؛ وانغ، ر. ياو، X.؛ لي، العاشر. وانغ، العاشر. هو، Y.؛ تشانغ، X.؛ فان، ص. دونغ، T.؛ Ogg، G. تتراكم مجموعات الخلايا اللمفاوية الفطرية المنشطة في أنسجة الورم البشري. BMC السرطان 2018، 18، 341. [CrossRef] [PubMed]

3. يبصق، ه.؛ بيرنينك، JH. خلايا Lanier، L. NK والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع الأول: شركاء في دفاع المضيف. نات. إيمونول. 2016، 17، 758-764. [CrossRef] [مجلات]

4. بروشارد، م.؛ Ghiringhelli، F. فك رموز أدوار الخلايا اللمفاوية الفطرية في السرطان. أمام. إيمونول. 2019، 10، 656. [المرجع المتقاطع]

5. مازورانا، ل.؛ راو، أ.؛ فان أكير، أ.؛ Mjösberg، J. أدوار الخلايا اللمفاوية الفطرية في جهاز المناعة البشري. سيمين. مناعي. 2018، 40، 407-419. [المرجع المتقاطع]

6. سولانو جالفيز، سان جرمان؛ توفار توريس، SM. ترون غوميز، MS؛ وايزر-سميك، الإمارات العربية المتحدة؛ ألفاريز هيرنانديز، دا؛ فرانيوتي كيلي، جورجيا؛ تابيا مورينو، م.؛ إيبارا، أ.؛ غوتييريز-كوبيه، L.؛ فاسكيز لوبيز، ر. الخلايا الجذعية البشرية: تطور الجينات ومجموعاتها الفرعية في الصحة والمرض. ميد. الخيال العلمي. 2018، 6، 88. [المرجع المتقاطع]

7. ستاينمان، آر إم؛ Hemmi، H. الخلايا الجذعية: ترجمة فطرية إلى مناعة تكيفية. العملة. قمة. ميكروبيول. إيمونول. 2006، 311، 17-58. [المرجع المتقاطع]

8. فو، سي؛ حصيرة.؛ تشو، L.؛ مي، كيو إس؛ جيانغ، أ. اللقاحات المستندة إلى الخلايا الجذعية ضد السرطان: التحديات والتقدم والفرص المستقبلية. إيمونول. تحقيق. 2022، 51، 2133-2158. [المرجع المتقاطع]

9. كريمي، ك.؛ بودرو، جي إي؛ فريزر، ك.؛ ليو، ه.؛ ديلانجي، J.؛ جولدي، J .؛ شينغ، Z .؛ برامسون، JL. Wan, Y. إن المناعة المضادة للأورام المعززة الناتجة عن لقاحات الخلايا الجذعية هي نتيجة لقدرتها على إشراك كل من الخلايا القاتلة الطبيعية المنتجة لـ CTL وIFN. مول. هناك. 2008، 16، 411-418. [المرجع المتقاطع]

10. باور، آل. سوندرسون، SC؛ كالدويل، ف.ج. داماني، تي تي؛ بيلهام، إس جيه؛ دن، AC. جاك، آر دبليو؛ ستويتزنر، ب. خلايا McLellan، AD NK مطلوبة للعلاج المناعي القائم على الخلايا الجذعية في وقت تحدي الورم. جي إمونول. 2014، 192، 2514-2521. [المرجع المتقاطع]

11. بامبينا، MB. Levy، EM الخلايا القاتلة الطبيعية كخلايا مساعدة في لقاحات سرطان الخلايا الجذعية. أمام. إيمونول. 2015، 6، 13. [المرجع المتقاطع] [مجلات]

12. جاردنر، أ. دي مينغو بوليدو، Á .؛ روفيل، ب. الخلايا الجذعية ودورها في العلاج المناعي. أمام. إيمونول. 2020، 11، 924. [CrossRef] [PubMed]

13. كورتيز، في إس؛ روبينيت، مل؛ Colonna، M. الخلايا اللمفاوية الفطرية: رؤى جديدة في الوظيفة والتطور. العملة. رأي. إيمونول. 2015، 32، 71-77. [CrossRef] [مجلات]

14. مونتالدو، إي. جويلكي، ك. Romagnani، C. Group 3 الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC3s): الأصل والتمايز واللدونة عند البشر والفئران. يورو. جي إمونول. 2015، 45، 2171-2182. [المرجع المتقاطع]

15. فاكا، ب.؛ تشيوسون، L.؛ مينجاري، MC؛ موريتا، إل. عدم تجانس الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا اللمفاوية الفطرية الأخرى في الإنسان والفئران الساقطة. أمام. إيمونول. 2019، 10، 170. [CrossRef] [PubMed]

16. رانكين، إل سي. جيرارد مادو، إم جي؛ سيليت، C .؛ ميلكي، لوس أنجلوس؛ كيرديليس، Y.؛ فينيس، أ.؛ فيدويلد، إي؛ بوتوتشكي، T.؛ موندوت، S .؛ لانتز، O .؛ وآخرون. التكامل والتكرار في إنتاج IL-22-الخلايا اللمفاوية الفطرية. نات. إيمونول. 2016، 17، 179-186. [CrossRef] [مجلات]

17. هورويج، ك.؛ بيترز، CP؛ كورنيليسن، F .؛ أباريسيو دومينغو، ب. بابازيان، ن.؛ كازيمير، ج.؛ ميوسبيرج، JM. يبصق، ه.؛ كوبيدو، T. الاختلافات الوظيفية بين الخلايا اللمفاوية الفطرية NKp44(-) وNKp44(+) RORC(+) البشرية. أمام. إيمونول. 2012، 3، 72. [المرجع المتقاطع]

18. كاريجا، ب. لوياكونو، ف. دي كارلو، إي. سكاراموتشيا، أ؛ مورا، م.؛ كونتي، ر. بينيلي، ر. سباجياري، جنرال موتورز؛ كانتوني، سي؛ كامبانا، س.؛ وآخرون. يركز NCR(+)ILC3 على سرطان الرئة البشري ويرتبط بالهياكل اللمفاوية داخل الفم. نات. مشترك. 2015، 6، 8280. [المرجع المتقاطع]

19. يبصق، ه.؛ أرتيس، د.؛ كولونا، م. ديفنباخ، أ.؛ دي سانتو، جي بي؛ إيبرل، ج.؛ كوياسو، س. لوكسلي، آر إم؛ ماكنزي، آن؛ ميبيوس، ري؛ وآخرون. الخلايا اللمفاوية الفطرية – اقتراح لتسمية موحدة. نات. القس إيمونول. 2013، 13، 145-149. [المرجع المتقاطع]

20. خطيبة، ر. فينلي، سم؛ ويليس، C.؛ بيفينجتون، SL؛ سولي، J.؛ نانوغرام، STH. بيكر، سم؛ أندروز، س. هيبوورث، السيد. Withers ، تتحكم شبكات عامل النسخ المتبادل DR في وظيفة وهوية المجموعة الفرعية ILC3 المقيمة في الأنسجة. نات. إيمونول. 2021، 22، 1245-1255. [المرجع المتقاطع]

21. فان بيك، جي جي بي؛ مارتنز، أوج؛ بكداش، ج.؛ دي فريس، IJM الخلايا اللمفاوية الفطرية في مناعة الورم. الأدوية الحيوية 2016، 4، 7. [CrossRef] [PubMed]

22. ماتنر، ج.؛ Wirtz، S. صديق أم عدو؟ الدور الغامض للخلايا اللمفاوية الفطرية في تطور السرطان. اتجاهات إيمونول. 2017, 38, 29-38. [المرجع المتقاطع]

23. كيرشبيرجر، إس. رويستون، دي جي؛ بولارد، O .؛ ثورنتون، إي. فرانشيني، ف؛ زبادي، ر.ل. هاريسون، O .؛ Powrie، F. الخلايا اللمفاوية الفطرية تحافظ على سرطان القولون من خلال إنتاج الإنترلوكين -22 في نموذج الفأر. جي إكسب. ميد. 2013، 210، 917-931. [CrossRef] [مجلات]

24. إرشاد، س. فلوريس-بورخا، ف.؛ لولر، ك. مونيبيني، J.؛ إيفانز، ر. ذكر، ف؛ جوردون، ب. تشيونغ، أ. غازينسكا، ب. نور، ف.؛ وآخرون. تعمل الخلايا اللمفاوية الفطرية RORgammat (+) على تعزيز ورم خبيث في العقدة الليمفاوية لسرطانات الثدي. الدقة السرطان. 2017، 77، 1083-1096. [CrossRef] [مجلات]

25. جوك، J.؛ الوقف، م. بيسمان، نيوجيرسي؛ فلامار، AL. ساهوتا، س.؛ سوزوكي، ه.؛ تنغ، F.؛ بوتزل، جي جي؛ إيبرل، ج.؛ ويذرز، د. وآخرون. يؤدي خلل تنظيم ILC3s إلى إطلاق العنان للتقدم ومقاومة العلاج المناعي في سرطان القولون. خلية 2021، 184، 5015-5030.e16. [المرجع المتقاطع]

26. ليو، ي.؛ أغنية، Y.؛ لين، د.؛ لي، L.؛ مي، Y.؛ جين، Z .؛ غونغ، ه.؛ تشو، Y.؛ مَركَز.؛ تشانغ، Y.؛ وآخرون. NCR(-) المجموعة 3 الخلايا اللمفاوية الفطرية تنظم محور IL-23/IL-17 لتعزيز تطور سرطان الخلايا الكبدية. إي بيوميديسين 2019, 41, 333–344. [CrossRef] [مجلات]

27. بروشارد، م. جيندرو، م.؛ بيريشيت، أ.؛ ترنتزر، سي. الاقتراع، E.؛ بويدوت، ر. راكور، C .؛ بارساك، إي. تشالمين، ف. هيبوس، سي؛ وآخرون. توظيف وتفعيل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 3 يعزز الاستجابات المناعية المضادة للأورام. نات. إيمونول. 2022، 23، 262-274. [المرجع المتقاطع]

28. ريثاكر، ل.؛ بوي، م. بيسيو، V.؛ روسين، ف. دينيزو، J .؛ فنسنت سالومون، أ.؛ بوركومان، إي. سيدليك، C .؛ بياجيو، E.؛ توبرت، أ.؛ وآخرون. الخلايا اللمفاوية الفطرية: تتسلل مجموعات NK و ILC3 السامة للخلايا إلى الغدد الليمفاوية لسرطان الثدي النقيلي. علم المناعة الأورام 2022، 11، 2057396. [المرجع المتقاطع]

29. سيستا، MF الهيكل الطبيعي، وظيفة، وأنسجة الطحال. توكسيكول. باثول. 2006، 34، 455-465. [المرجع المتقاطع]

30. إيشيجورو، ت.؛ ناكاجيما، م.؛ نايتو، م.؛ موتو، T.؛ Tsuruo، T. تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا في خطوط فرعية من سرطان الجلد الفئران B16 ذات إمكانات نقيلية مختلفة. الدقة السرطان. 1996، 56، 875-879.

31. زابو، إس جيه؛ كيم، ST. كوستا، جي إل؛ تشانغ، العاشر. فاطمة، CG. Glimcher، LH عامل النسخ الجديد، T-bet، يوجه التزام نسب Th1. الخلية 2000، 100، 655-669. [CrossRef] [مجلات]

قد يعجبك ايضا