يعمل استهداف Cathepsin B بواسطة Cycloastragenol على تعزيز المناعة المضادة للورم لخلايا CD8 T عن طريق تثبيط تدهور MHC-I ، الجزء 1

خلاصة

خلفيةيعد فقدان مستضدات الورم واستنفاد خلايا CD8 التائية الناتجة عن مسار PD -1 / PD-L1 من العوامل المهمة للهروب المناعي للورم. في السنوات الأخيرة ، كانت هناك أبحاث متزايدة حول الطب الصيني التقليدي في علاج الأورام. تم العثور على Cycloastragenol (CAG) ، وهو جزيء فعال فعال في غشاء Astragalus ، له وظائف مضادة للفيروسات ومضادة للشيخوخة ومضادة للالتهابات وغيرها. ومع ذلك ، فإن تأثيره وآليته المضادة للورم غير واضحين.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ولديه القدرة على البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر على قائمة الإيجابيات والسلبيات

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 8613632399501】

طُرقتم التحقيق في التأثير المضاد للورم لـ CAG في نماذج الورم المزروع بالماوس MC38 و CT26. تم تحليل التأثير المضاد للورم لـ CAG عبر تسلسل متعدد الخلايا وحيدة الخلية. تم استخدام تقنية تحديد ملامح إمكانية الوصول المستجيبة للهدف للعثور على البروتين المستهدف لـ CAG. بعد ذلك ، تم استكشاف آلية مضاد الأورام لـ CAG باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، والترسيب المناعي ، وترنسفكأيشن من البلازميدات الطافرة. أخيرًا ، تم فحص التأثير المضاد للورم المشترك للأجسام المضادة لـ CAG و PD -1 في الفئران أو الكائنات العضوية.

نتائجوجدنا أن CAG منع بشكل فعال نمو الورم في الجسم الحي. أظهر أطلسنا متعدد الخلايا أحادي الخلية أن CAG عزز عرض مستضدات سطح الخلية السرطانية وتميز بوظيفة القتل المحسّنة لخلايا CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية. ميكانيكيًا ، ارتبط CAG بالبروتين المستهدف كاثيبسين B ، والذي أدى بعد ذلك إلى تثبيط التحلل الليزوزومي لمركب التوافق النسيجي الرئيسي I (MHC-I) وعزز إجمالي n من MHC-I إلى غشاء الخلية ، مما أدى إلى تعزيز المحطة التمهيدية لمستضد الورم . وفي الوقت نفسه ، أدى الجمع بين CAG والأجسام المضادة لـ PD -1 بشكل فعال إلى تعزيز قتل الورم للورم CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية في الفئران ذات الطعم الخارجي وعضوية سرطان القولون والمستقيم. الخلاصة ذكرت بياناتنا لأول مرة أن تقليل تنظيم الكاثيبسين ب يمنح مناعة ضد الورم ويؤرخ آلية مضادات الأورام لمنتج CAG الطبيعي.

مقدمة

يعد سرطان القولون والمستقيم أحد أكثر أنواع السرطان شيوعًا في جميع أنحاء العالم. يعد معدل الإصابة ومعدل الوفيات من بين المراكز الثلاثة الأولى ، مما يهدد حياة الإنسان وصحته بشكل خطير. 1 تشمل طرق العلاج الشائعة الجراحة العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والأدوية الموجهة والعلاج المناعي. مستويات عالية من الجزيئات المثبطة للهروب من مراقبة الخلايا المناعية. لذلك ، لحل مشكلة الهروب المناعي للورم ، طور الباحثون مثبطات نقاط التفتيش المناعية وعلاج المستضدات الجديدة لمنع إخفاء الخلايا السرطانية عن الخلايا المناعية. الخلايا لم يتم ved بشكل ملحوظ. لذلك ، من المهم بشكل خاص العثور على الأدوية التي يمكن أن تعزز عرض المستضدات السطحية للورم. يعتمد التعرف على الخلايا السرطانية عن طريق CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية السامة للخلايا على مسار TCR / CD3 / معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC-I). يستقبل TCR المستضد الموجود عن طريق الخلية التغصنية / بروتين غشاء الخلية السرطانية CI وينقل الإشارة لربط CD3 بإحكام ، والذي يمتد بعد ذلك بشكل أعمق في السيتوبلازم. 9 10 في نفس الوقت ، مع تنشيط إشارة CD28 / B7 ، يمكن تنشيط خلايا CD8 + T للتعرف على الخلايا السرطانية وقتلها. وقد وجدت الدراسات الحديثة أنه في عملية تطور الورم ، تؤدي الليزوزومات إلى تقليل تراكم MHC-I على سطح الخلايا السرطانية ، وهو أمر غير فعال. المستضدات الحالية. 12 13 أفاد Liu et al أن تثبيط PCSK9 يمكن أن يمنع تدهور MHC-I في الجسيمات الحالة ويمكّن MHC-I من العودة إلى غشاء الخلية لتقديم المستضدات .12 لذلك ، استعادة وظيفة تقديم المستضد من MHC-I مهم بشكل خاص لمنع الهروب المناعي للورم.

لقد وجد عدد متزايد من الدراسات أن تطبيق الجزيئات النشطة للطب الصيني التقليدي والتدخل المضاد للورم له آفاق كبيرة. 14 15 Cycloastragenol (CAG) هو جزيء فعال فعال n Astragalus الغشاء ، الذي يحتوي على مضاد للفيروسات ومضاد للبكتيريا ومضاد للجرثومة. التأثيرات الالتهابية والدوائية الأخرى ، ولكن نادرًا ما يتم الإبلاغ عن تأثيره المضاد للأورام .16-19 في هذه الدراسة ، وجدنا أن CAG يثبط نمو الأورام العابرة لأورام سرطان القولون. cathepsin B (CTSB) ، الذي يعزز عرض المستضد للخلايا السرطانية ، ثم يعزز القدرة القاتلة لخلايا CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية.

المواد والأساليب

الأجسام المضادة والكواشف

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 بالمائة). الأجسام المضادة لـ CTSB (Cat # 12216-1- AP ، PRID: AB _2086929) ، HLA (Cat # 15240-1- AP ، PRID: AB _1557426) ، Actin (Cat # {{ 5}} Ig ، PRID: AB _2782959) ، Tubulin (Cat # 10094-1- AP ، PRID: AB _2210695) ​​، ومجموعة أدوات الكشف عن الكيمياء المناعية ضد الفئران / الأرانب (Cat # PK10006) تم شراؤها من Proteintech. الأجسام المضادة لـ H 2- Kd (Cat # sc -53852 ، PRID: AB _784514) ، LAMP1 (Cat # sc - 20011 ، PRID: AB _626853) ، و CTSB (Cat # sc -365558 ، PRID: AB _10842446) تم شراؤهما من Santa Cruz Biotechnology. تم شراء Antibody of Ki -67 (Cat # 12202، PRID: AB _2620142) من Cell Signaling Technology. تم شراء الجسم المضاد لـ Na / K ATPase (Cat # ab3528 ، RRID: AB _303877) من Abcam. الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي للقرص المضغوط 45- V500 (Cat # 561487 ، RRID: AB _1069704 6) ، CD 3- APC (Cat # 345767 ، RRID: AB _2833003) و CD { {31}} تم شراء PerCP (Cat # 345774 ، RRID: AB _2868802) من BD Bioscience. تم شراء الجسم المضاد لقياس التدفق الخلوي لـ Gzmb-FITC (Cat # 515403 ، RRID: AB _2114575) من BioLegend. الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي لـ NK1. 1- PE-Cy7 (Cat # 25-5941-81 ، RRID: AB _469664) و IFN - - PE (Cat # 12-7311-81 ، RRID : AB _466192) تم شراؤها من Thermo Fisher Scientific. تم شراء وسيط DMEM (Cat # 01-052-1 ACS) ، والبنسلين Streptomycin (Cat # 15140122) ، ومصل الأبقار الجنينية (Cat # C 04001-500) من Biological Industries. تم شراء مصل الماعز (Cat # 88RNG001) ومجموعة فحص البروتين Pierce BCA (Cat # 23225) من Thermo Fisher Scientific. الأجسام المضادة لـ PD ضد الإنسان -1 (Cat # BE0188، RRID: AB _1095031 8) و anti-mouse PD -1 (Cat # BE0146، RRID: AB _1094905 3) تم شراؤها من خلية Bio X. تم شراء مجموعة تفكك نسيج الورم MACS (Cat # 130-095-929) من Miltenyi Biotec.

زراعة الخلايا

تم الحفاظ على سلالات خلايا سرطان القولون بالفأر MC38 و CT26 في مختبرنا. 20 تم الحصول على خطوط HCT لسرطان القولون البشري -116 من مجموعة الثقافة النوعية للأكاديمية الصينية للعلوم (شنغهاي ، الصين). تمت زراعة خلايا MC38 و CT26 و HCT -116 في وسط DMEM يحتوي على 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 بالمائة.

تجربة زرع الورم

تم شراء فئران C57BL / 6JGpt تبلغ من العمر ستة أسابيع ، وفئران BALB / c ، وفئران BALB / ، فئران عارية من GemPharmatech (نانجينغ ، الصين). تم تلقيح الخلايا السرطانية MC38 أو CT26 (1 × 106) تحت الجلد في كل فأر. عندما ينمو الورم إلى 100 مم 3 ، تم تقسيم الميكروفون بشكل عشوائي إلى مجموعة محلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) (على سبيل المثال ، مرة واحدة يوميًا) ومجموعة CAG (على سبيل المثال ، 50 مجم / كجم مرة واحدة في اليوم). تم تحديد حجم الورم من خلال قياس الفرجار باستخدام الصيغة V=الطول × العرض 2/2. عندما وصل حجم الورم في فئران مجموعة PBS إلى 1000 مم 3 ، تم إخراج ورم الفئران وتصويرها ووزنها.

تفكك وحيدة الخلية من الماوس لخلية واحدة RNA / ATACseq

تم هضم الأورام الصلبة من الفئران باستخدام مجموعة تفكك الورم للحصول على خلايا مفردة الخلية. خلية أحادية أحادية الخلية بتركيز 1000 خلية / 1000 خلية محملة على خلية مفردة خلية مفردة للتحكم في الجينوم 10 × كروم باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للجينوميات 10 ×. تم خلط كواشف النسخ العكسي وحبات الهلام المشفرة وزيت التقسيم مع الخلايا للجين لتوليد حبات هلامية في المستحلبات (GEM) للنسخ العكسي. scRNA-seq معالجة البيانات والتحكم فيها.

استنادًا إلى الجينوم المرجعي للماوس GRCm38 (mm1 0) ، خط أنابيب CellRanger V.4. 0. 0 (1 0 × الجينوميات) لمعالجة الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بيانات التسلسل لكل تجربة (GSE197229). تم إضافة مصفوفات التعبير الجيني الرقمي في R (V.4. 0 .4) باستخدام حزمة Seurat (V.4.0.0). 21 قبل تحليل dBeforem ، تمت تصفية الخلايا بواسطة رقم UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq للمعالجة المسبقة للبيانات ومراقبة الجودة

تمت معالجة البيانات أحادية الخلية ATAC-seq (GSE197229) مسبقًا بواسطة حارس الخلية في (V.2. 0. 0) باستخدام سطر أوامر العد. لمعالجة وتحليل بيانات scATAC-seq اللاحقة ، استخدمنا حزمة ArchR (الإصدار 1. 0. 1). وبعد ذلك ، استخدمنا وظيفة addArchRGethe nome ('mm10') للتعليق التوضيحي للجينوم وإنشاء ملف سهم مع وظيفة cre ArrowFiles مع المعلمات الافتراضية. بعد ذلك ، استخدمنا وظيفة filterDoublets لحذف المضاعفات المحتملة وإنشاء مشروع ArchR باستخدام وظيفة ArchRProject مع المعلمات الافتراضية. ثم استخدمنا حزمة Harmony لإزالة تأثير الدُفعة بواسطة وظيفة addHarmony. 25 لتقليل الأبعاد ، نستخدم وظيفة addIterativeLSI في ArchR للتشغيل مع معلمات def t. للتضمين أحادي الخلية ، اخترنا كائن RedDims بتناغم واستخدمنا وظيفة addTSNE مع المعلمة "الحيرة =30" للتصور.

تحليل متكامل لبيانات siRNA-seq و scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0 5. لتحسين دقة التنبؤات لدمج مجموعتي البيانات بشكل أفضل ، قمنا مرة أخرى بدمج بيانات scATAC-seq و scRNA-seq باستخدام وضع "التكامل المقيد". باختصار ، قمنا بتعليق توضيحي لبيانات scATAC-seq بأنواع الخلايا بناءً على الدرجات الجينية لـ scATAC-seq. بعد ذلك ، أنشأنا قائمة مقيدة بحيث تم حساب تشابه التعبير الجيني فقط في نفس نوع الخلية لكل من scATAC-seq و scRNA-seq. كشفت المجموعات غير الخاضعة للإشراف باستخدام t-SNE عن 13 مجموعة من الخلايا الفرعية ، والتي تم شرحها بواسطة علامات معروفة أو مفترضة في الجدول التكميلي 1 عبر الإنترنت.

مسار النسب الزائف

تم استنتاج مسار سلالة الخلايا للخلايا السرطانية باستخدام حزمة R (V.2.18. 0). 26 تتعلم Monocytes الرسم البياني الرئيسي الواضح من بيانات جينوم الخلية المفردة عن طريق التضمين المعكوس للرسم البياني لفرز الخلايا ، وبالتالي حل المعقد بقوة ودقة .27 استخدمنا وظيفة "اختبار الجينات التفاضلية" لاشتقاق DEG من كل مجموعة ، وبعد إنشاء مسار الخلية ، اكتشفنا الجينات المعبر عنها تفاضليًا في الوقت الزائف. تم تصور جميع الجينات المعتمدة على الوقت الزائف من خلال وظيفة خريطة الحرارة _ pseudotime _ التي تأخذ كائن CellDataSet. تم إنشاء مخططات مسار النسب ومنحنيات التعبير السلس استنادًا إلى CellDataSet بواسطة جينات _ الخلية _ والمخطط _ _ في _ الوقت الزائف ، على التوالي. 28

استدعاء تباين رقم نسخة وحيدة الخلية

لتحديد الخلايا الخبيثة ذات الاختلافات في عدد نسخ الكروموسومات النسيلي واسع النطاق (CNV) ، استخدمنا حزمة الاستنتاج CNV R لاستنتاج الملامح الجينية لكل خلية بناءً على متوسط ​​التعبير عن مجموعات الجينات الكبيرة في كل منطقة كروموسومية من جينوم الورم مقارنةً بـ 29 على أساس عينة بعينة ، تم استخدام الخلايا المناعية كمرجع لتقدير CNVs في الخلايا المرتبطة بالسرطان.

تحليل الإثراء

تم إجراء تحليلات مسار KEGG والتعليقات التوضيحية GO باستخدام حزمة R PackageProfiler (V.3.11.1) مع معلمات PValueCutoff =0. 0 5 ، PAdjustMethod=BH ، QValueCutoff {{6} } .05 و MingsSize =10 و MaxGSSize =500. تم ​​تطبيق 20 تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) باستخدام 50 مجموعة جينات مميزة (h.all.V.7.4.symbols. gmt) لتحديد التخصيب بشكل كبير المسارات الوظيفية عبر برنامج GSEA (الإصدار 4.1.0) ، مع معايير فحص ذات قيمة P الاسمية<0.05and false discovery rate q<0.250.30

التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR

تم زرع خلايا MC38 و HCT -116 في ستة أطباق جيدة لمدة 6 ساعات ثم تمت معالجتها باستخدام CAG لمدة 24 ساعة أخرى. تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، وطردها عند 18 0 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات. في نفس الوقت بعد طحن أنسجة الورم. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا MC38 و HCT {9}} وأنسجة الورم باستخدام كاشف TRIzol ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. كان حجم التفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على: 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، 5 ميكرولتر 5 × Hiscript III qRT SuperMix ، و RNase Free dH2 O. تعرض (كدنا) لـ PCR الكمي ، مع حجم تفاعل 10 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر (كدنا) ، 5 ميكرولتر مزيج qPCR ، 0.75 ميكرولتر 5 ميكرومتر بادئات (إلى الأمام والعكس) ، و 3.25 ميكرولتر خالٍ من RNase O. تم تصنيع الاشعال بواسطة GenScript Biotech Corporation (نانجينغ ، الصين) وفقًا للتسلسلات التالية (الجدول الإضافي عبر الإنترنت 2).

اكتشاف الهدف من خلال نهج تحديد الوصول المستجيب للهدف

تم إجراء فحص بروتينات ربط CAG كما هو موضح سابقًا. 31 32 باختصار ، تم استخدام نهج تحديد الوصول المستجيب للهدف (TRAP) لاكتشاف بروتينات الربط لـ CAG في بيئة الخلية عن طريق مراقبة ligand الناجم عن الارتباط الناجم عن الارتباط. تتغير إمكانية الوصول على مستوى البروتيوم. باختصار ، عولج طبقان من الخلايا بـ 1 0 ميكرومتر CAG وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، على التوالي. بعد 1- ساعة من الحضانة ، تم نفاذية الخلايا بواسطة المخزن المؤقت M-PER (Thermo Scientific) وتم وضع العلامات التساهمية على المحلول الناتج عن طريق إضافة مركب الفورمالديهايد و borane pyridine الذي يقوم معًا بتسمية بقايا الليسين البروتينية على وجه التحديد في درجة حرارة الغرفة لتحديد ملامح إمكانية الوصول . بعد ذلك ، تم ترسيب المستحلبات بواسطة مذيب عضوي ، وتم إعادة إذابة الكريات المجمعة في 8 مل / لتر من اليوريا ، وتم تقليلها بواسطة dithiothreitol (DTT) عند 56 درجة لمدة 30 دقيقة ، تليها الألكلة باستخدام iodoacetamide (IAA) في الظلام لمدة 30 دقيقة. تمت إضافة كمية مناسبة من محلول DTT مرة أخرى للتفاعل مع IAA الزائد. بعد ذلك ، تم تخفيف البروتين بمحلول بيكربونات الأمونيوم حتى يصل التركيز النهائي لليوريا إلى 1 مول / لتر. تم تحلية هضم البروتينات المجمعة على أعمدة C18 HLB (ووترز ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تجفيف الببتيدات المخصبة وإعادة تكوينها في محلول مائي من حمض الفورميك (FA) بنسبة 0.1 بالمائة. تم استخدام نظام AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) لتحليل العينات من أجل التنميط الكمي لتغييرات إمكانية الوصول إلى ليسين استجابةً لربط CAG لاكتشاف الهدف. تم استخدام اكتساب الاعتماد على البيانات في الوضع الإيجابي للحصول على البيانات. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions ، Waterloo ، كندا). على وجه التحديد ، تم اختيار ألكلة cys كتعديل ثابت ، وتم تعيين أكسدة الميثيونين وثنائي ميثيل الليسين ، الذي تم تحقيقه بواسطة وسم TRAP ، كتعديلات متغيرة. باختصار ، تم تعيين الببتيدات التي تحتوي على ثنائي الميثيل الناجم عن TRAP وأظهرت تغييرات كبيرة في الوفرة مع وبدون حضانة CAG كببتيدات مستجيبة للهدف. تشير نسبة وفرة كل ببتيد يحمل علامة TRAP إلى مدى تغير إمكانية الوصول وترتبط ارتباطًا وثيقًا بتقارب ربط الترابط. تم إجراء اختبار t للطالب لتقييم ما إذا كانت تغييرات إمكانية الوصول المكتشفة للببتيدات المسمى ذات دلالة إحصائية. قيمة p بين المجموعات (ص<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

الثقافة العضوية

تم بناء ورعاية عضيات سرطان القولون والمستقيم البشري بواسطة Chongqing Kingbiotech. تم تقطيع عينات نسيج المريض التي تم الحصول عليها من خلال العملية الجراحية إلى قطع صغيرة قدر الإمكان بواسطة مقص معقم. تم خلط قطع الأنسجة جيدًا مع Matrigel (Corning ، Cat # 356231) بنسبة تقريبية 1: 4 على الجليد. أشارت المعالجة اللاحقة إلى البروتوكولات المنشورة. باختصار ، تم بذر معلقات القطع-Matrigel بسرعة في لوحة multiwell لتشكيل قطرات نصف كروية ونقلها إلى 37 درجة لمدة 15-20 دقيقة ، مما يسمح للقطرات بالتصلب. تمت إضافة المقدار المناسب من وسط الاستزراع (KingcultureTM Organoid Growth Medium، Cat # KCW -2) ​​لكل بئر ، وقم بتغيير الوسيط كل 2-4 أيام.

عزل وثقافة خلايا CD8 T.

أضف نفس الحجم من المحلول الملحي الطبيعي إلى الدم المحيطي للأشخاص الأصحاء الذي يحتوي على مضادات التخثر لتخفيف الدم كله. أضف حجمًا معينًا من محلول الفصل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأضف الدم الكامل المخفف ببطء على طول جدار الأنبوب إلى الجزء العلوي من محلول الفصل ، وجهاز الطرد المركزي عند 750 جم لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة لامتصاص الوحيدات في الطبقة البيضاء الوسطى بعناية في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل ، وأضف حجمًا معينًا من برنامج تلفزيوني لإعادة التعليق ، وطرد مركزي 250 جم لمدة 5 دقائق ، وتجاهل المادة الطافية. بعد إضافة حبات مغناطيسية CD8 بشرية إلى رواسب الخلية ، تم فرز خلايا CD8 T بواسطة عمود فرز LS. تمت إضافة خلايا CD8 T إلى اللوحة المثقبة المطلية مسبقًا بجسم مضاد 5 ميكروغرام / مل CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat # 16-0032-38 ، RRID: AB _2865578) ، ثم 10ng / mL IL {{15} } (Peprotech Cat # 212-12) و 5 ميكروغرام / مل CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat # 16-0281-81 ، RRID: AB _468920) تمت إضافة الأجسام المضادة الوظيفية المزروعة لمدة 24 ساعة.

Coculture

بعد تحضين العضيات مع CAG لمدة 24 ساعة ، تم استبدال وسط المزرعة الطازج ، ثم تم تعليق العضويات وخلايا CD8 T المنشطة في هلام المصفوفة ، ثم تمت إضافة المعلق إلى اللوحة المكونة من ستة آبار ووضعها في 37 حاضنة درجة لمدة 15 دقيقة ، ثم تمت إضافة وسط استزراع كامل خالٍ من المصل 2 مل لمدة 24 ساعة.

لطخة غربية

تم زرع خلايا MC38 و HCT -116 في ستة أطباق جيدة لمدة 6 ساعات ثم تمت معالجتها باستخدام CAG لمدة 24 ساعة أخرى. تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS بارد ، وطردها عند 180 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات. تم تحلل البروتين الكلي باستخدام تحلل WB-IP الذي يحتوي على 1 في المائة من مثبط البروتياز لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم تقييم البروتين الكلي باستخدام مجموعة تقدير كمية البروتين BCA. تم فصل عينات البروتين بنسبة 10 في المائة - 12 في المائة من الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS ونقلها إلى أغشية PVDF (فلوريد البولي فينيلدين) عند 350 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة. تم حظر أغشية PVDF بنسبة 5 في المائة من مساحة سطح الجسم لمدة ساعة واحدة ، والشرائط التي تحتوي على الجسم المضاد الأولي المحدد طوال الليل ، ومع الجسم المضاد الثانوي المحتضن لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تم اكتشاف الشرائط باستخدام نظام الركيزة LumiGLO الكيميائي (KPL ، Gaithersburg ، Maryland ، الولايات المتحدة الأمريكية).

التدفق الخلوي

بعد هضم أنسجة الورم وتم تحضير المعلق أحادي الخلية. تم إجراء تلطيخ السطح باستخدام الأجسام المضادة السطحية للمستضد في المخزن المؤقت FCM (قياس التدفق الخلوي) (PBS يحتوي على 1 بالمائة FBS) وتم تلوينه على الجليد بأجسام مضادة مناسبة لمدة 30 دقيقة. تم استخدام الأصباغ التفاعلية (eBioscience) للقضاء على الخلايا الميتة. تم إجراء تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا باستخدام محلول مثبت للخلايا BD / محلول غشاء خارج الخلية ، وتم إصلاح الخلايا وتغلغلها ، ثم تلطيخها بالأجسام المضادة ضد السيتوكينات في محلول بيرم / واش (BD Biosciences).

يتم نقل البلازميدات الطافرة CTSB

تم زرع خلايا HCT -116 في أطباق بئر 6- لمدة 12 ساعة ثم تم نقلها باستخدام بلازميدات CTSB-WT-EGFP أو CTSB المتحولة (Y75A و A77V و G198A) لمدة 36 ساعة.

تداخل تعداء أو إفراط في التعبير عن بلازميد CTSB في خلايا MC38 أو خلايا HCT -116

تم تلقيح خلايا MC38 (1 × 106 / بئر) في 6- لوحات جيدة لمدة 6 ساعات ، ثم تم نقلها باستخدام CTSB المتداخل RNA (التسلسل: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT و Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) لمدة 48 ساعة ، ومستويات التعبير mRNA أو البروتين تم اكتشاف من Ctsb و H 2- k1. تم تلقيح خلايا HCT -116 (1 × 106 / بئر) في لوحات بئر 6- لمدة 6 ساعات ، ثم تم نقلها بتداخل CTSB (تسلسل: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) أو بلازميد مفرط التعبير لمدة 48 ساعة ، و mRNA تم الكشف عن مستويات التعبير البروتيني لـ CTSB و HLA-A.

تقنية الإرساء

تم تنزيل البنية ثلاثية الأبعاد لـ CTSB من قاعدة بيانات البروتين (PDB ID: 2iPP) ، وتم تنزيل هياكل CAG من PubChem. تم إجراء عملية الالتحام في Autodock 2 مع الإرساء الخشن باستخدام خوارزمية محاكاة التلدين والتحسين اللاحق باستخدام خوارزمية جينية.

فحص التحول الحراري الخلوي

تم زرع خلايا MC38 في ألواح بحجم 1 {{2} سم طوال الليل ثم تمت معالجتها باستخدام CAG أو 0.1 بالمائة DMSO لمدة ساعتين أخريين. تم جمع الخلايا وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وطردها عند 180 جم لمدة 5 دقائق. تم بعد ذلك تقسيم الخلايا بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي (70 ميكرولتر لكل أنبوب) وتم تسخينها لمدة 3 دقائق عند درجة الحرارة التالية: 46 ، 49 ، 52 ، 55 ، 58 ، 61 ، 64 ، و 67 درجة ، تم تبريد العينات لمدة 3 دقائق عند درجات حرارة و ثم أبقى على الجليد. بعد ذلك ، تم وضع العينات في الثلاجة عند درجة حرارة -80 درجة بين عشية وضحاها. تم إذابة العينات عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم تبريدها عند درجة حرارة -80 درجة لمدة 4 ساعات. أخيرًا ، تم طرد العينات عند 12 ، 000 جم لمدة 25 دقيقة ، تمت إضافة المادة الطافية إلى مخزن التحميل المؤقت ، وتم تحليلها بواسطة النشاف الغربي.

تلطيخ المناعي

تم غمر أقسام البارافين من أنسجة الورم في الزيلين لمدة 20 دقيقة لإزالة الشمع ، ثم في 100 في المائة ، و 75 في المائة ، و 50 في المائة من الإيثانول لمدة 10 دقائق. بعد إخضاع الشرائح لإصلاح مستضد بمحلول إصلاح مستضد سترات الصوديوم ، تم تعطيل بيروكسيد الهيدروجين الداخلي بنسبة 3 في المائة من بيروكسيد الهيدروجين. بعد حجب 5 في المائة من مصل الماعز لمدة ساعة واحدة ، تمت إضافة الجسم المضاد لـ Ki67 (1: 200) واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات. تمت إضافة البوليمر المسمى HRP المضاد للفأر / الأرانب (100 ميكرولتر) وتم تحضين العينات عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة ، تليها 100 ميكرولتر من محلول DAB العامل ، والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد دقيقة واحدة من تلطيخ الهيماتوكسيلين ، تم غسل العينات بنسبة 50 في المائة ، و 75 في المائة ، و 100 في المائة من الإيثانول والزيلين لمدة 5 دقائق ، وتم استخدام صمغ محايد لختم الفيلم. تمت مشاهدة الفيلم وتصويره تحت المجهر.

الإحصاءتحليل

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism (V.8. 0). يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها متوسط ​​± SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Dunnett اللاحق لتقييم الاختلافات عندما كان هناك أكثر من مجموعتين. تم استخدام اختبار الطالب t لتقييم الاختلاف الكبير بين المجموعتين. تم تعيين دلالة إحصائية في p<0.05.

نتائج

تحليل متعدد الخلايا أحادي الخلية لـ CAG يثبط نمو سرطان القولون المزروع في الفئران

للتحقق مما إذا كان CAG له تأثير مضاد للأورام ، قمنا أولاً بزرع خلايا سرطان MC38 في الفئران C57BL / 6. لاحظنا أن CAG منع نمو الأورام بشكل كبير (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S1A ، B). بعد ذلك ، قمنا بزرع خلايا CT26 في فئران BALB / c ووجدنا أن CAG يمنع أيضًا نمو الأورام (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S1C ، D).

للكشف عن الآلية المحددة التي يمنع بها CAG نمو الورم ، قمنا بتحليلها باستخدام تقنيات scRNA-seq و scATAC-seq (الشكل 1 أ). قمنا بتقسيم عدد الخلايا إلى أربع مجموعات: الخلايا السرطانية ، والأرومات الليفية ، والخلايا النخاعية ، والخلايا الليمفاوية (الشكل 1 ب ، الشكل التكميلي عبر الإنترنت S2A ، B). وجدنا أن الخلايا السرطانية (52 في المائة) والأرومات الليفية (41 في المائة) تم اختراقها بشكل رئيسي في أنسجة الورم ، بينما شكلت الخلايا المناعية 7 في المائة فقط. ثم قسمنا الخلايا السرطانية إلى ثماني مجموعات فرعية والأرومات الليفية إلى ثلاث مجموعات فرعية (الشكل 1C-E). بعد ذلك ، أظهر تحليل الإثراء للجينات المعبر عنها بشكل كبير في كل مجموعة خلايا أن المسارات الجزيئية MHC-I في الخلايا السرطانية قد تم إثرائها ، وكذلك الإشارات المضادة للأورام للخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S2C). بعد ذلك ، تم العثور أيضًا على أربع مجموعات من الخلايا باستخدام تحليل تكامل scATAC-seq و scRNA-seq (الشكل 2D-G). بعد المقارنة ، وجدنا أن الخلايا السرطانية (خلايا C01 و C03) و CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية وخلايا Spp1 بالإضافة إلى خلايا TAM والخلايا الليفية (خلايا F01 و F02) ظهرت في تسلسل ATAC (الشكل 1F ، G) ، وأكثر من ذلك ، تم التعبير عنها بشدة تم إثراء عوامل النسخ في هذه الخلايا (الشكل 1 ح). من خلال هذه التحليلات ، نتوقع أن تثبيط نمو الورم بواسطة CAG يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالتغيرات في هذه الخلايا.

Cag يعزز عرض مستضد الخلايا السرطانية

لتحليل آلية مضاد الأورام لـ CAG ، قمنا أولاً بتحليل عدد الخلايا السرطانية وقسمنا الخلايا السرطانية إلى ثماني مجموعات فرعية (الشكل 2 أ ، ب ، الشكل التكميلي عبر الإنترنت S3A). أظهرت النتائج ، بالمقارنة مع مجموعة PBS ، أن خلايا مجموعة C05 انخفضت بشكل ملحوظ بينما زادت خلايا مجموعة C07 (الشكل 2C). وفي الوقت نفسه ، للتحقق من دقة تجميع الخلايا السرطانية لدينا ، قمنا بمقارنة CNV للخلايا الليمفاوية والخلايا النخاعية كخلايا مرجعية. أظهرت النتائج أن CNV للخلايا السرطانية كان أعلى بكثير من الخلايا المناعية (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S3B). عند تحليل مجموعات فرعية من الخلايا السرطانية ، وجدنا أن جينات استجابة الإنترفيرون Isg15 و Irf7 و Ifit3 و Ifi47 تم التعبير عنها بشكل كبير في مجموعات الخلايا C07 و C08 من مجموعة CAG مقارنة بمجموعة PBS (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S3C). وجد تحليل مجموعة الخلايا السرطانية أن المسارات المتعلقة بعرض المستضد قد تم إثرائها بشكل كبير في مجموعات خلايا متعددة. لذلك ، نتوقع أن CAG قد تعزز عرض المستضد للخلايا السرطانية لتلعب دورًا مضادًا للورم (الشكل 2D). بعد ذلك ، اخترنا الجينات المرتبطة بعرض المستضد ووجدنا أن مستوى التعبير في مجموعة CAG كان أعلى بكثير من ذلك في مجموعة PBS (الشكل 2E ، الشكل التكميلي عبر الإنترنت S3D). وجدنا أيضًا أن CAG عزز عرض المستضد في أنسجة الورم (الشكل 2F ، G).

بعد ذلك ، استخدمنا scATAC-seq لتحليل الأسباب المحددة وراء عرض مستضد الخلايا السرطانية المعزز لـ CAG. وجدنا أن سكان الخلايا السرطانية عبروا بشكل كبير عن عوامل النسخ Fos و Junb و Jund و Fosb و Fosl1 (الشكل 2H ، I). بعد ذلك ، قمنا ببناء خريطة للتفاعل بين عوامل النسخ والجينات المقابلة لشرح أن CAG عزز التعبير عن الجينات المرتبطة بتقديم مستضد الخلايا السرطانية (الشكل 2J). في أنسجة الورم ، وجدنا أيضًا أن عوامل النسخ Junb و Fos و Jund و Fosb قد تم التعبير عنها بشكل مفرط في مجموعة PBS تحت علاج CAG (الشكل 2K-N ، الشكل الإضافي عبر الإنترنت S3E-I). حتى الآن ، وجدنا أن CAG يمكن أن تعزز التعبير عن عوامل النسخ للجينات المرتبطة بتقديم المستضد ، وبالتالي تعزيز وظيفة تقديم المستضد للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، لا تزال كيفية استجابة هذه الخلايا السرطانية لاستجابات الخلايا المناعية غير واضحة.

للكشف عن الظاهرة التي يعزز بها CAG عرض المستضد للخلايا السرطانية ، أجرينا تحليلًا للمسار لاستكشاف كيفية تغيير الخلايا السرطانية لبعضها البعض استجابةً لاستجابات الخلايا المناعية. وجدنا أنه بمرور الوقت ، تحولت الخلايا السرطانية C07 إلى خلايا C05 و C06 و C08 ، كما أظهر الإثراء الجيني أن الخلايا السرطانية ستتحول إلى عرض مستضد (الشكل 3A-E).

يعزز CAG وظيفة قتل الخلايا المناعية

تظهر هذه النتائج أن CAG يمكن أن تقدم مستضدات الخلايا السرطانية ، فهل يؤدي تحسين عرض مستضد الخلايا السرطانية إلى تعزيز وظيفة الخلايا المناعية؟ لمعرفة ذلك ، قمنا بتحليل الخلايا الليمفاوية والخلايا النخاعية ، على التوالي. أظهرت النتائج أن CAG عزز تسلل خلايا CD8 بالإضافة إلى T في أنسجة الورم ، كما تم زيادة تسلل خلايا CD8 بالإضافة إلى T وخلايا NK ، تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S4A-F). لاحظنا أيضًا أن CAG عزز التعبير عن جينات Ifitm2 و Cxcr6 و S100a6 في خلايا CD8 بالإضافة إلى T ،

جينات Fcer1g و Gzmb و AW112010 و Zfp36i2 في الخلايا القاتلة الطبيعية وجينات Nfkbia و Junb في الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S4G). تم أيضًا تحسين التعبير عن Ifng و Gzmb في خلايا CD8 بالإضافة إلى T بشكل كبير ، كما تم اكتشافه بواسطة قياس التدفق الخلوي (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S4H ، I). علاوة على ذلك ، وجدنا أنه بعد علاج CAG ، انخفض التعبير عن المستقبلات المثبطة Lag3 و Tigit و Havcr2 على سطح خلايا CD8 بالإضافة إلى T ، كما انخفض التعبير عن جينات Cd28 و Cd69 و Gzmk و Ccl5 و Pdcd1 ، التي تميز تنشيط خلايا CD8 plus T ، زاد بشكل ملحوظ (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S4J). لمزيد من التحقق من أن CAG عززت وظيفة القتل لخلايا CD8 بالإضافة إلى T من خلال تعزيز عرض مستضد الورم المحسن ، قمنا بزرع خلايا CT26 في أورام مزروعة في الفئران العارية ولاحظنا أن CAG لا يمكن أن تمنع نمو الأورام بشكل فعال (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S4K-M ).

بعد ذلك ، قمنا بتحليل الخلايا النخاعية ووجدنا أن خلايا Spp1 بالإضافة إلى TAM زادت بعد علاج CAG ، في حين انخفض عدد خلايا C1qc بالإضافة إلى TAM وزاد عدد Il1b plus monocytes (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S5A-D). بعد علاج CAG ، كانت خلايا Spp1 plus TAM و C1qc بالإضافة إلى TAM أكثر عرضة للتحول المؤيد للالتهابات TAM. وجد تحليل التخصيب أنه يركز بشكل أساسي على Tnf- و Ifn-g ومسار إشارات الاستجابة الالتهابية (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S5E-H). بناءً على النتائج المذكورة أعلاه ، نستنتج أن CAG يعزز التعرف على الخلايا المناعية وقتلها من خلال تعزيز عرض المستضد في الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن كيفية تنظيم CAG ليست واضحة.

اكتشاف CAG البروتين المستهدف CTSB عن طريق المصيدة

بعد ذلك ، سوف نتحرى عن بروتين CAG المستهدف المحدد الذي يلعب دورًا مضادًا للورم. لقد اخترنا الخلايا السرطانية كهدف للبحث لأننا وجدنا أن CAG يمكن أن تعزز عرض المستضد للخلايا السرطانية ، وبالتالي تعزيز وظيفة القتل للخلايا المناعية. لقد صنعنا أولاً مشتق البيوتين من CAG ووجدنا أن 3- OH فقط هي التي يمكن أن تتفاعل (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S6A). قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كان CAG-biotin يعزز أيضًا التعبير عن الجينات المرتبطة بعرض المستضد في خط الخلايا السرطانية للفأر MC38. أظهرت النتائج أن CAG-biotin لم يؤثر على تعبير جينات H 2- K1 و Cd74 و Anxa1 (الشكل التكميلي عبر الإنترنت S6B-D).

لذلك ، استخدمنا طريقة البحث السابقة عن الهدف TRAP في المختبر. تم تحضين كل من CAG و DMSO بخط خلية MC38 (الشكل 4 أ). اخترنا البروتين الذي يحتوي على FC أكبر من أو يساوي 2 و ap أقل من أو يساوي 0. 05 كبروتين مستهدف مرشح لـ CAG. وفقًا لمبدأ أن ارتباط الجزيئات الصغيرة بالبروتينات سيؤدي إلى انخفاض كفاءة وضع العلامات لليسين ، اخترنا CTSB للدراسة (الشكل 4 ب). بعد ذلك ، استخدمنا مقايسة التحول الحراري الخلوي (الشكل 4C) والرحلان الحراري المجهري (MST) (الشكل 4 د) للتحقق من الارتباط بين CAG و CTSB ، ووجدنا أن التقارب بين CAG و CTSB كان 26.6 نانومتر (الشكل 4 د). بعد ذلك ، توقعنا مواقع الربط بين CAG و CTSB وفقًا للبنية البلورية البروتينية لـ CTSB في مكتبة PDB. وجدنا أن مجموعات الهيدروكسيل في طرفي CAG و ALA77 و GLY198 من CTSB كانت مرتبطة برابطة هيدروجينية ، بينما كانت مواقع TYR75 و PRO76 و ALA173 في CAG و CTSB مرتبطة بقوة فان دير فال (الشكل 4E) . للتحقق من موقع الربط بين CAG و CTSB ، قمنا بنقل البلازميد الطافر لـ CTSB في خلايا HCT -116. أظهرت النتائج أن التقارب بين البلازميد الطافر في A77V و G198A و CAG كان أعلى بمئات المرات من بلازميد WT (الشكل 4F ، G). في القسم التالي ، نستكشف الآلية المحددة التي يلعب بها CAG دورًا مضادًا للورم من خلال CTSB.

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 8613632399501】