تم استخدام Tetrahymena Thermophila كمادة تجريبية

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

في هذه التجربة ، تم استخدام Tetrahymena thermophila كمادة تجريبية. T. thermophila هو كائن يعيش بحرية يتواجد على نطاق واسع في النظم البيئية المائية العالمية ويشبه خلايا metazoan في التركيب والتعقيد الوظيفي l5. أعطى اكتشاف ribozynnel6 و telomerasel7 في رباعي الغشاء دفعة كبيرة في أبحاث آلية مكافحة الشيخوخة ، والتي حصلت على جائزتي نوبل 8. نظرًا لدورة نموها القصيرة ، وثقافتها السهلة ، وخلفيتها الوراثية الواضحة ، فإن T. يمكن أن يوفر المحبة للحرارة بحثًا مزدوجًا في الجسم الحي وفي المختبر في تصميم تجريبي واحد. تم استخدام T. thermophila بنجاح في فحص الأدوية والآليات الدوائية. والأهم من ذلك ، أنه تم الكشف عن المعلومات المتعلقة بالتطور الجزيئي لعائلة T. thermophila glutathione peroxidase 9-2. ملف معلومات T.cistanche جنكيز خانيمكن الحصول على جينات thermophila GPX من قاعدة بيانات الجينوم الوظيفي رباعي الغشاء (TetraFGD) (http://tfgd.ihb.ac.cn/) و TGD (http: // ww. ciliate.org) 22- عشرة من اثني عشر GPX مفترضة تم التعرف على أنها phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) في قاعدة البيانات المقارنة لجينوم رباعي الغشاء. PHP ، مركب GPX يعتمد على السيلينيوم ، يمكنه على وجه التحديد أن يقلل هيدروبيروكسيد الفوسفوليبيد لحماية الليسيثين الجسيمات والأغشية الحيوية من التلف التأكسدي 23. يحتوي PHGPxin T. كيلو دالتون) لبروتين أحادي PHGPx الموصوف في الثدييات. علاوة على ذلك ، أظهر عدد كبير من التقارير أن تعبير GPX لـ Tthermophila كان مختلفًا كميًا ويعتمد على مصدر الإجهاد (مؤكسد أو محفز موت الخلايا المبرمج أو معدن) 2122 ووقت التعرض 20-24

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

بمقارنة تأثيرات المستخلص المائي والمونومرات الرئيسية لـ G.lucidum على منحنى النمو والحد الأقصى لكثافة T. thermophila ، حصلت هذه الدراسة على أفضل مستخلص G. تم فحص آلية مكافحة الشيخوخة لـ G. lucidum ، وخاصة تحديد نوع العمل لعائلة GPX ، على المستويات الجزيئية والخلوية والفردية. من المتوقع أن تساهم نتائج هذه الدراسة في التطبيق السريري لمنتجات G.Lucidum.

المواد والأساليب

خلاصة الجانوديرما لوسيدوم المائية والمونومرات. بالإشارة إلى تقرير Cuong ، تم طحن 25،20 جم من G. تم جمع المستخلص المائي بالطرد المركزي ، وتركيزه حتى 100 مل عن طريق التجفيف بالفراغ ، وتخزينه عند درجة -20 حتى الاستخدام.

تم شراء عديد السكاريد G.Lucidum و Ganoderic Acid A و Ganoderal A و G. تم إذابة هذه المعايير الثلاثة في ميثانول وفقًا للتصميم الموحد وإضافتها إلى وسط SPP. زراعة الخلايا والعلاج من تعاطي المخدرات. تم تقديم Tetrahymenathermophila (SB21 0) من قبل معهد علم الأحياء المائية ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، ووهان ، IPR الصين. تمت تربية T. thermophila في حاضنة 28 درجة. احتوى وسط SPP على 2 بالمائة (وزن / حجم) ببتون بروتيني ، 0. 1 بالمائة مستخلص خميرة (أوكسويد) ، 0. 2 بالمائة جلوكوز ، و 0.003 بالمائة سيكسترين. وفقًا للتصميم الموحد (الجدولان التكميليان S1 و S2) ، فإن المستخلص المائي G. تمت إضافة عديد السكاريد lucidum و Ganoderic Acid A و Ganoderal A و G.Lucidum ergosterol إلى وسط الاستزراع. تم استبدال المجموعة الضابطة بنفس الحجم من الماء المقطر المزدوج ، مع 3 عينات متوازية في كل مجموعة. بعد دخول المرحلة اللوغاريتمية ، تم أخذ العينات كل ساعتين حتى مرحلة الانحدار. تم حساب كثافة T. thermophila بواسطة لوحة عد خلايا الدم ، وتم رسم العلاقة بين كثافة T. thermophila والوقت.

تحليل النسخ. تم إجراء التجربة باستخدام لوحة بئر 24- ، وكان كل بئر مكونًا من 900 ميكرولتر من SPP. في المجموعة التجريبية ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من 200 مجم / مل من مستخلص G. عولجت المجموعة الضابطة بـ 100 ميكرولتر ddH O بدلاً من ذلك. تم وضع ثلاث عينات متوازية في كل مجموعة.تمديد الحياة cistancheكانت كل من المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية في المرحلة اللوغاريتمية (2 0 ح) ، وتم جمع مرحلة الانحدار (27 ساعة) لتحليل النسخ. تم تكرار كل مجموعة بيولوجيًا ، وخضعت جميع العينات لاختبار ميكروأري كامل النسخ (Biomarker Technologies ، بكين ، الصين). تم اكتشاف ملف تعريف التعبير الجيني بواسطة مصفوفة تعبير Affymetrix 3'IVT لتقليل تأثير التعبير عن جينات القيمة ، تم استخدام RPKM أكبر من أو يساوي 5 و FC (تغيير الطية) أكبر من أو يساوي 2 كمعيار للشاشة تم استخدام الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) KOBAS لتحقيق تحليل مسار GeneOntology (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG). تم تحديد مسار التخصيب بواسطة القيمة المصححة P -add أقل من أو تساوي 0.05. تم التحقق من نتائج النسخ باستخدام النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) (الطريقة انظر الملف التكميلي). بعد ذلك ، تم إنشاء شبكة تفاعل البروتين البروتين (PPI) بناءً على قاعدة بيانات STRING ، وتم فحص الجين المركزي باستخدام CytoHubla لتحديد العقدة المركزية في برنامج Cytoscape.

تلطيخ الفضة والملاحظة المجهري الإلكتروني (TEM). كان إجراء تلطيخ sil-ver وفقًا لطريقة Foissner. تم ملاحظة ثيرموفيلا تحت مجهر الزيت. تمت ملاحظة البنية الدقيقة لـ T. thermophila بواسطة TEM. تم جمع الخلايا المعالجة بمستخلص G.lucidum المائي ومجموعة التحكم بالطرد المركزي عند 600 × جم لمدة دقيقتين. كانت الخلايا مسبوقة في 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد وتم الحفاظ عليها عند 4 درجات لمدة 8 ساعات. تم غسل العينات باستخدام PBS (pH7.5) ثلاث مرات ، وطردها عند 3000xg لمدة 5 دقائق ، ثم تم تثبيتها بنسبة 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (4 ساعات). بعد ذلك ، تم إجراء الجفاف باستخدام أسيتون متدرج بنسبة 15 في المائة إلى 100 في المائة. بعد ذلك ، تم دمج الخلايا في راتنج Embed 812 (TAAB) منخفض اللزوجة. علاج Aftel ، تم قطع المقاطع الرقيقة (60-80 نانومتر) بواسطة آلة تقطيع رفيعة للغاية. تمت ملاحظة البنية التحتية الفائقة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (JEOL JEM -1010 ، اليابان).

تحديد تلف الخلايا. تم الكشف عن lROS داخل الخلايا بواسطة المسبار الحساس الفلوري 2 '، 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). تم تحديد نشاط malondialdehyde (MDA) بواسطة مجموعات تجارية مقدمة من Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (نانجينغ ، جيانغسو ، الصين). تم وصف طريقة تحديد القدرة على التخلص من جذور الهيدروكسيل (· OH) كما وصفها Takemura. تم التعبير عن قدرة المستخلص المائي لـ G.

يمكن للكيستانش مكافحة الشيخوخة

نشاط PHGPx. تم تحديد نسبة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADPH) / نسبة NADP * ونسبة الجلوتاثيون / ثاني كبريتيد الجلوتاثيون (GSH / GSSG) باستخدام NADP * / NADPH Quantification Kit (S0179 ، Beyotime) ، GSH / GSSG Assay Kit (S0053 ، Beyotime). تم إجراء المقايسات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

نتائج

تأثير المستخلص المائي G.lucidum و G.lucidum monomers على نمو T. ther-mochila. كما في الدراسات السابقة 7 ، G. كان عديد السكاريد lucidum هو المكون الرئيسي لمستخلص G. lucidum المائي في هذه التجربة وفقًا لتحديد مقياس الطيف الضوئي (الشكل التكميلي S1). كما تم تحليل المواد الفعالة لمستخلص G.Lucidum المائي بواسطة GC-MS. أظهر الرسم البياني الأيوني الكلي للمستخلص المائي G.Lucidum أن جميع المكونات موجودة في المستخلص المائي (الشكل التكميلي S2). من بين مركبات المستخلص المائي G.lucidum (الجداول التكميلية S3 و S4) ، G. تم اختيار حمض lucidum A و Ganoderal A و G.

من أجل مقارنة تأثيرات المستخلص المائي G. lucidum وهذه المونومرات الرئيسية على نمو T. تم عرض النتائج في الشكل 1. كانت أقصى كثافة لمجموعة التحكم 6 × 104 خلية / مل عند 24 ساعة. كانت كثافة الخلايا لمجموعة المستخلص المائي G.cistanche nzفي نفس الوقت ، تم إطالة المرحلة اللوغاريتمية بمقدار ساعة واحدة ، وكانت أقصى كثافة 1.15 × 105 خلية / مل. على الرغم من أن الكثافة القصوى لمجموعة عديد السكاريد G. لم تتجاوز الكثافة القصوى لحمض G. lucidum A و Ganoderal A و G. يمكن الاستنتاج أن المستخلص المائي G.lucidum الذي يحتوي على مجموعة متنوعة من المواد الفعالة يمكن أن يعزز نمو T. thermophila أكثر من مونومراته.

تأثير مضاد للشيخوخة لمستخلص G. lucidum المائي. مع زيادة وقت الثقافة ، كانت شدة الضوء لـ ROS في مرحلة الانحدار (الشكل 2 ب) أعلى من تلك الموجودة في الطور اللوغاريتمي (الشكل 2 أ). بعد إضافة المستخلص المائي G. كان محتوى MDA في المجموعة الضابطة أعلى أيضًا في مرحلة الانحدار منه في المرحلة اللوغاريتمية (الشكل 2 هـ). وفي الوقت نفسه ، كانت قدرة الكسح الخاصة بـ OH في مرحلة الانحدار أقل من تلك الموجودة في المرحلة اللوغاريتمية (الشكل 2 هـ). فقد التوازن بين الأكسدة والاختزال وشيخوخة الجسم. بعد إضافة المستخلص المائي G. مجموعة التحكم (العمود الأيمن في الشكل 2 هـ). يمكن مقارنة نمو T [thermophila بعملية الشيخوخة للكائنات متعددة الخلايا من خلال تلفها الخلوي. مع تراكم ROS و MDA ، توقف النمو وانخفضت كثافة T. thermophila. يمكن أن تحافظ إضافة مستخلص G.Lucidum المائي على توازن الأكسدة والاختزال في T.

تحليل الجينات المعبر عنها تفاضليًا والتحقق بواسطة RT-qPCR. مقارنة مع مجموعة التحكم ، تغير التعبير عن 11519 جينًا في الطور اللوغاريتمي لـ T. thermophila بشكل ملحوظ بعد إضافة مستخلص G. lucidum المائي إلى SPP. من بينها ، تم تنظيم 6201 جينة و 5318 جينًا خاضعًا للتنظيم.cistanche حجم القضيبتغير التعبير عن 8772 جينًا بشكل كبير خلال مرحلة التدهور ، من بينها 4721 جينًا تم تنظيمها و 4051 جينًا خاضعًا للتنظيم. في الدراسات السابقة في مختبرنا ، فإن

انعكس التأثير المضاد للشيخوخة لـ G.lucidum على Stylonychia في مؤشر مضادات الأكسدة ، لذلك تم اختيار 10 جينات (الجدول التكميلي S5) المتعلقة بمضادات الأكسدة بشكل عشوائي من بين DEGs ، وتم التحقق من دقة بيانات RNA-seq بواسطة RT- qPCR. كانت أنماط التعبير عن هذه الجينات العشرة في الطور اللوغاريتمي ومرحلة الانحدار متوافقة مع اتجاه بيانات RNA-seq (الشكل التكميلي S3). أشارت النتيجة إلى أن بيانات RNA-seq كانت موثوقة ويمكن استخدامها للتحليل اللاحق.

تخصيب GO وتحليلات مسار KEGG. شاركت DEGs في المرحلة اللوغاريتمية في 14 عملية بيولوجية (BP) مع 6 أنواع من الوظائف الجزيئية (MF) وكانت موجودة في جميع مكونات الخلية (CC) (الشكل 3 أ). كانت DEGs في مرحلة الانحدار متورطة في 12 BP مع 4 أنواع من MF وكانت موجودة في 12 CC. كانت BP الأكثر مشاركة في المرحلتين هي عملية التمثيل الغذائي ، وكان MF ملزمًا ، وكان CC عبارة عن غشاء. من بين عملية التمثيل الغذائي ، الربط والغشاء ، شكلت الجينات المنتظمة 70 بالمائة في الطور اللوغاريتمي (الشكل 3 ب) و 75 بالمائة في مرحلة الانحدار (الشكل 3 ج). تظهر هذه النتائج أن المستخلص المائي G. lucidum يمكن أن يعزز الحفاظ على سلامة غشاء الخلية في كلتا المرحلتين.

تم إجراء تحليل تخصيب مسار KEGG لمزيد من تحليل DEGs بين المرحلتين. في المرحلة اللوغاريتمية ، تم تركيز 94 مسارًا ، من بينها 68 بالمائة من إجمالي الجينات تشارك في عملية التمثيل الغذائي. في مرحلة التدهور ، تم إثراء 91 مسارًا ، من بينها كان التمثيل الغذائي لا يزال هو المسار الأكبر ، حيث يمثل 68 بالمائة. تم استخدام أفضل 20 مسارًا في المرحلة اللوغاريتمية (الشكل ثلاثي الأبعاد) ومرحلة الانحدار (الشكل 3 هـ) لرسم مخطط فقاعي وأظهر أنه بغض النظر عن أهمية أو عدد الجينات المعنية ، فإن تأثير G.مسحوق cistancheيركز المستخلص المائي لوسيدوم بشكل أساسي على مسار استقلاب الجلوتاثيون. في المرحلة اللوغاريتمية ، تم إثراء 38 جينًا معبرًا تفاضليًا في هذا المسار ، وهو ما يمثل 45 بالمائة. في مرحلة التدهور ، تم إثراء 43 جينًا معبرًا تفاضليًا في هذا المسار ، وهو ما يمثل 50 بالمائة.

شبكات تفاعل البروتين البروتين (PPI) من DEGs. سيساعد توضيح DEGs في مسار استقلاب الجلوتاثيون وإلقاء نظرة ثاقبة على تفاعلاتها مع البروتينات الأخرى على استكشاف الآلية التنظيمية المحتملة لمستخلص G. كان لكل من المرحلة اللوغاريتمية (الشكل 4 أ) ومراحل الانحدار (الشكل 4 ب) أهم التأثيرات على GPX1 و GPX2 و GPX7 و GPX11. من خلال الاستعلام عن قاعدة بيانات TetraFGD ، تنتمي إنزيمات GPX هذه إلى PHGPx (الجدول التكميلي S6). لذلك ، تلعب إنزيمات مضادات الأكسدة ، وخاصة PHGPx ، دورًا مهمًا في تعزيز نمو T. thermophila عن طريق تحفيز مستخلص G.

نشاط GPS والتحقق من الوظيفة. يشير نشاط PHGPx إلى معدل انخفاض امتصاص NADPH 2 ". كانت قيمة NADPH / NADP * في مرحلة الانحدار لمجموعة التحكم أقل من تلك الموجودة في المرحلة اللوغاريتمية (الشكل 5 أ). وتشير النتيجة إلى أن نشاط PHGPx انخفض مع زيادة وقت الاستزراع. بعد إضافة المستخلص المائي لـ G. يمكن أن يعزز المستخلص المائي G.lucidum من نشاط PHGPx.

يمكن أن تحفز PHP على وجه التحديد تقليل هيدرو بيروكسيد الفوسفوليبيد عن طريق تقليل الجلوتاثيون (GSH) ، وذلك لتحويل بيروكسيد الدهون السامة (PL-PUFA-OOH) إلى أحماض دهنية غير مشبعة غير سامة (PL-PUFA-OH) بكفاءة. يمكن أن يعكس تغيير نسبة GSH / GSSH تغيير PL-PUFA-OOH و PL-PUFA-OH بسبب الانخفاض في نشاط PHGPx (الشكل 5 أ) ، انخفضت أيضًا نسبة GSH / GSSH في مجموعة التحكم مع زيادة زمن الثقافة (الشكل 5 ب). ومع ذلك ، بعد إضافة مستخلص G.lucidum المائي ، تمت زيادة نسبة GSH / GSSH في الطور اللوغاريتمي ومرحلة الانحدار. تم تحويل PL-PUFA-OOH السام داخل الخلايا في المجموعة التجريبية إلى PL-PUFA-OH غير السامة ، والذي كان أكثر من المجموعة الضابطة. مراقبة التشكل المجهري والبنية التحتية. تم تصور التأثير الوقائي لمستخلص G. Luci-dum المائي على الغشاء بواسطة تلطيخ الفضة بالأمونيا و TEM. بمقارنة المرحلة اللوغاريتمية لمجموعة التحكم (الشكل 6 أ) ومرحلة الانحدار للمجموعة الضابطة (الشكل 6 ج) ، وجد أن مورفولوجيا خلية T. كانت النواة غير واضحة ، مما يشير إلى أن الخلايا تبدو في حالة الشيخوخة. ومع ذلك ، في مجموعة المستخلص المائي G. لوحظت تغييرات البنية التحتية في الخلايا بواسطة TEM. تم تشويش التلال ومحيط الميتوكوندريا في مرحلة الانحدار (الشكل 6 د) مقارنة بالمرحلة اللوغاريتمية (الشكل 6 ب) في المجموعة الضابطة. زاد تسوس الميتوكوندريا مع تمديد وقت الثقافة. أدت إضافة مستخلص مائي G. يضمن مستخلص G. lucidum المائي وظيفة الميتوكوندريا ، والتي ترتبط ارتباطًا وثيقًا بسلامة الغشاء. وتجدر الإشارة إلى أنه في المرحلة اللوغاريتمية ، أظهرت الميتوكوندريا في المجموعة التجريبية تغيرات شكلية (الشكل 6 و ، ح) ، لكن سلامة الغشاء لم تتأثر.

مناقشة

استخدام مستخلصات G.lucidum له تاريخ طويل في الطب الصيني التقليدي وشرق آسيا. أظهر عدد كبير من الدراسات فعاليتها. وجدت التقارير السابقة أن مستخلص G.lucidum المائي لا يحتوي فقط على عديد السكاريد G. وفقًا للتقارير السابقة ، فإن حمض الجانوديرما ، وألدهيد الجانوديرما ، والجانوديرما إرغوستيرول هي المكونات الرئيسية لـ G. يحتوي مستخلص غانوديرما لوسيدوم المائي على مجموعة متنوعة من المواد الفعالة ، التي تدمج وظائف المواد الفعالة الأربعة الأخرى ، والتي لا يمكنها مقاومة الأكسدة فحسب ، بل تحافظ أيضًا على سلامة الغشاء. في هذه الدراسة،

أثبت تعزيز نمو مستخلص G.Lucidum المائي على T. thermophila علاقة الشمول هذه. من خلال تحليل المستخلص المائي G. لذلك يصبح المستخلص المائي G.Lucidum مذيبًا عضويًا معقدًا مع إطالة وقت الغليان. نعتقد أن المواد الفعالة في المستخلص المائي لـ G.lucidum قد تعمل في أوقات مختلفة ، مما يؤدي إلى التآزر. يجب أن تكون هذه دراسة أخرى في المستقبل.

استكشف تحليل ترنسكريبتوم T. thermophila تأثير مستخلص G.Lucidum المائي على التعبير الجيني أثناء النمو. بعد العلاج بمستخلص G.Lucidum المائي ، ظهر PHGPx تأثير رئيسي في كثافة الخلايا ووقت التوليد. أكدت هذه النتيجة أن المستخلص المائي G.lucidum يعمل على النوع المعتمد على السيلينيوم لعائلة GPX. PHP عبارة عن بروتين سيلينو متعدد الوظائف يتم توزيعه على نطاق واسع في الجسم ولا يمكنه المشاركة فقط في التفاعلات المضادة للأكسدة ولكن أيضًا يقلل بشكل مباشر من الدهون في الغشاء لحماية سلامة نظام الغشاء. بالمقارنة مع GPXs الأخرى ، فإن PHGPx له حجم أصغر وكراهية أكبر للماء. أظهرت العديد من التقارير أن التعبير الزائد PHGPx في الخلايا يمكن أن يقاوم استجابة الخلية للتلف الداخلي (على سبيل المثال ، الشيخوخة) وضرر بيروكسيد خارجي (على سبيل المثال ، البيئة) 2-45. PHP هو الإنزيم الوحيد الذي يمكنه تقليل PL-PUFA- بشكل مباشر OOH للغشاء في مركبات الهيدروكسيل المقابلة ، وبالتالي تمكين إنهاء بيروكسيد وحماية الغشاء البيولوجي من أضرار الأكسدة. كانت الزيادة في محتوى PL-PUFA-OOH سبب تلف غشاء الخلية في المجموعة الضابطة خلال مرحلة التدهور ، والتي أصبحت حلقة مفرغة وشيخوخة متسارعة للخلية. في هذه الدراسة ، محتويات ROS و MDA زاد (الشكل 2) من T.thermophila في المجموعة الضابطة مع زيادة وقت الثقافة. ظهر الغشاء تشوه خطير في مرحلة التدهور من خلال الملاحظة المورفولوجية. ومع ذلك ، عندما تمت إضافة مستخلص G.Lucidun المائي ، تم تنظيم تعبير PHGPx. وهكذا ، تم تحويل PL-PUFA-OOH على الغشاء إلى PL-PUFA-OH غير سام ، وتم تعزيز استقرار بنية الغشاء في كل من المرحلة اللوغاريتمية ومرحلة الانحدار. وفقًا لملاحظة الغشاء بواسطة تلطيخ الفضة بالأمونيا و TEM ، يمكن الاستنتاج أن المستخلص المائي لـ G.lucidum اخترق غشاء الخلية أثناء عملية النمو. يمكن أن يؤدي تأثير الإصلاح هذا على غشاء الخلية إلى تحفيز المواد الفعالة من المستخلص المائي G. كما تظهر نتائج تخصيب lKEGG ، يتركز عدد كبير من الجينات التفاضلية في المسارات الأيضية. أشارت هذه النتائج إلى أن المستخلص المائي G.

بشكل عام ، شجع المستخلص المائي G. lucidum على التعبير عن الإنزيم المعتمد على السيلينيوم PHGPx في عائلة GPX. لا يمكن أن يؤدي تعزيز نشاط PHGPx إلى تقليل استجابة الإجهاد التأكسدي في الجسم الحي فحسب ، بل يقلل أيضًا بشكل خاص وفعال من ترسب الدهون في الغشاء البيولوجي والحفاظ على سلامة الغشاء (الشكل 7). وبالتالي ، تدخل المواد الفعالة في المستخلص المائي G.Lucidum إلى الخلايا من خلال الغشاء السليم وتعزز عملية التمثيل الغذائي. هذا خلق دورة حميدة لتحقيق تأثير مكافحة الشيخوخة.

تم استخراج هذه المقالة من موقع ساينتيفك ريبورتس|(2022) 12: 3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z