كيف تقوم بروتينات إصلاح غشاء الخلية بتنظيم نقل إشارة عامل النسخ للتحكم في التليف الكلوي

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

هايتشانغ لي

الكلىيرتبط التليف بتطور الحالة الحادةالكلىإصابة لمرض الكلى المزمن. تم إثبات أن MG53 ، وهو بروتين لإصلاح غشاء الخلية ، يحمي من إصابة الخلايا الظهارية في الكلى وإصابات الكلى الحادة. هنا ، قمنا بتقييم دور MG53 في تعديلالكلىالتليف في الفئران المسنة وفي الفئران المصابة بانسداد الحالب أحادي الجانب (UUO) وهو نموذج معروف للتليف الكلوي التدريجي. طورت الفئران التي خضعت لاجتثاث MG53 مزيدًا من التليف الخلالي مع تقدم العمر مقارنة بالفئران السليمة من نفس العمر. وبالمثل ، في غياب MG53 ،الكلىتم تضخيم التليف مقارنة بالفئران التي كانت سليمة من MG53 في الكلى المسدودة مقارنة بالكلى المقابلة غير المعوقة أو كليتي الفئران التي تم تشغيلها بطريقة صورية. انسداد الحالبالكلىمن الفئران المصابة بـ MG53 أظهرت أيضًا التهابًا أكثر بكثير من الكلى المسدودة بالحالب من الفئران السليمة MG53. أظهرت التجارب في المختبر أن MG53 يمكن أن تدخل نوى الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة وتتفاعل مباشرة مع مكون p65 لعامل النسخ NF-kB ، مما يوفر تفسيرًا محتملاً للالتهاب المعزز في غياب MG53. لاختبار ذلك ، تم إعطاء تعبير MG53 المعزز من خلال الخلايا المهندسة أو توصيل البروتين المؤتلف المباشر إلى الفئران المعرضة لـ UUO. هذا يقلل من تنشيط NF-kB والالتهاب وتليف الكلى الموهن. وبالتالي ، قد يكون لـ MG53 دور علاجي في علاج التهاب الكلى المزمن وبالتالي توفير الحماية ضدهتليفمما يؤدي إلى النمط الظاهري لمرض الكلى المزمن.

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

البيان الانتقالي يؤدي الالتهاب المزمن إلى إعادة التشكيل التليفية التي قد تكمن أيضًا وراء الانتقال من إصابة الكلى الحادة إلى مرض الكلى المزمن. تنشيط عامل النسخ البروتيني الالتهابي kB (NF-kB) له دور في التسبب في التهاب الكلى. هنا ، نقدم دليلًا على أن MG53 ، وهو بروتين لإصلاح غشاء الخلية تم تحديده مسبقًا ، يتفاعل مباشرة مع NF-kB ويقلل من نشاط النسخ. في نفس الوقت ، يمكن أن يقلل MG53 الذي يتم إعطاؤه خارجيًا من إعادة التشكيل الليفي للكلية الملتهبة. تشير هذه النتائج إلى تفاعل وقائي بين MG53 و NF-kB للتخفيف من تطور التليف الكلوي الناتج عن الالتهاب. قد يكون الإعطاء الدوائي لـ MG53 نهجًا واعدًا لعلاج التليف الكلوي التدريجي.

تطور ضعف الكلى ، والذي يمكن تصنيفه على أنه إصابة حادة في الكلى (AKI) أو مرض الكلى المزمن (CKD) ، إلى وباء لدى كبار السن. في عام 2017 ، بلغ معدل انتشار مرض الكلى المزمن 14.5 في المائة من الأشخاص الذين تبلغ أعمارهم 65 عامًا أو أكثر ، مما أدى إلى نفقات الرعاية الطبية بأكثر من 84 مليار دولار للعلاج.^1,2يعتبر AKI و CKD أكثر شيوعًا لدى الأفراد الأكبر سنًا ، ويرجع ذلك أساسًا إلى زيادة التعرض للإصابة بالإضافة إلى تقلص القدرة على إصلاح الكلى المسنة. أظهرت الدراسات السريرية أن CKD هو عامل خطر رئيسي لـ AKI ، وعلى العكس من ذلك ، فإن نوبات AKI يمكن أن تسرع من تطور CKD نحو مرض الكلى في المرحلة النهائية. في الوقت الحالي ، يعتبر علاج القصور الكلوي الحاد داعمًا بشكل أساسي ، ويركز علاج مرض الكلى المزمن على إبطاء التقدم من خلال تثبيط نظام الرينين-أنجيوتنسين-الألدوستيرون ، وربما الآن من خلال تثبيط الناقل المشترك للجلوكوز والصوديوم -2.^3,4

اعتمادًا على شدة الإصابة ، قد تخضع الخلايا الأنبوبية القريبة ، وهي الهدف الرئيسي للإصابة الحادة ، لتغييرات في تقدم دورة الخلية ، والتمثيل الغذائي 5،6 ، و 7 إفراز السيتوكينات البروتينية الالتهابية والالتهاب ، أو الانتقال الجزئي الظهاري - اللحمية المتوسطة ، 8 والتي ستحدد ما إذا كانت إعادة البناء / الإصلاح ستكون ناجحة أو غير قادرة على التكيف وتؤدي إلى تليف الكلى ، وهي سمة مميزة لمرض الكلى المزمن 9،10 ، وتحدث عملية إعادة البناء هذه بشكل عام على خلفية التهاب الكلى ،

قلة الإمداد الوعائي ، وإنتاج بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ويشمل فقدان الخلايا الظهارية وتراكم الكولاجين ، وأكتين العضلات الملساء ، والفيبرونيكتين ؛ كما أن له ارتباطًا وثيقًا بتدهور وظائف الكلى.

يؤدي الالتهاب المزمن إلى إعادة التشكيل الليفي الذي قد يكمن أيضًا وراء الانتقال من AKI إلى CKD. 11-13 تشير الأبحاث التراكمية إلى تورط عامل النسخ النووي kB (NF-kB) في التسبب في التهاب الكلى الناجم عن العدوى والإصابة ، أو الزرع 11،12،14 يبدأ تنشيط مسار NF-kB الكنسي بتفعيل مثبط كيناز NF-kB (IkB) ، مما يؤدي إلى الفسفرة وتدهور IkBa والانتقال النووي لمغاير NF-kB. تنشيط إشارات NF-kB في الخلايا الظهارية للكلى والخلايا المناعية المتسللة يمكن أن يتم تحفيزها من خلال المحفزات الفيزيولوجية المرضية مثل التعرض لعديدات السكاريد الدهنية (LPSs) أو إصابة نقص التروية - ضخه .16 دراسات التنميط الجزيئي تكشف أن nfkb1 هو المحرك الرئيسي للتليف الكلوي.¹⁷بالإضافة إلى الخلايا الأنبوبية للكلى ، تساهم الخلايا المناعية الفطرية مثل البلاعم والخلايا المتغصنة أيضًا في إصابة الكلى والالتهاب وإعادة التشكيل الليفي.^13,18–20

cistanche فعال في علاج ضعف الكلى

تشير الدلائل المتزايدة إلى أن العوامل الإفرازية المشتقة من العضلات (على سبيل المثال ، myokines) تعدل الفسيولوجيا الجهازية عبر الحديث المتبادل للأنسجة للتأثير على تطور أمراض الكلى.²¹MG53 (يُسمى أيضًا TRIM72) هو بروتين ثلاثي الأطراف غني بالعضلات (TRIM) له وظيفة حاسمة في إصلاح غشاء الخلية. 22،23 بروتينات عائلة TRIM لها وظائف متنوعة تتراوح من تنظيم الإشارات المناعية إلى إصلاح الأنسجة.²⁴إصلاح الغشاء بوساطة MG 53- يدخل في تخفيف الإصابات الحادة للعضلات الهيكلية ،²⁵الكلى²⁶قلب،²⁷ الرئتين ، 28 عقل ،^29,30والجلد.³¹حددت دراساتنا السابقة مستوى منخفض من تعبير MG53 في الكلى ، وهو مكون رئيسي في حماية AKI ، وكانت الفئران التي تعاني من نقص في MG53 (mg53 /) أكثر عرضة للإصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي الناجم عن الإجهاد.²⁶لقد أظهرنا مؤخرًا أيضًا أن الارتفاع المستمر لـ MG53 في الدورة الدموية يعزز إصلاح إصابة الأنسجة وتجديدها. لا تزال الأدوار النسبية لـ MG53 الخاصة بالكلى والدوران الخارجي في تعديل التليف الكلوي أثناء CKD التدريجي غير معروفة.

في الآونة الأخيرة ، تطور دور MG53 الناشئ في تعديل حماية الأنسجة من خلال تثبيط الالتهاب ، وخاصة عن طريق تعديل إشارات NF-kB. على سبيل المثال ، يخفف MG53 السمية العصبية والالتهاب العصبي الناجم عن LPS عن طريق تثبيط مسار TLR4 / NF-kB ، وينظم MG53 للقلب تعبير KChIP2 للتحكم في إعادة تشكيل الفيزيولوجيا الكهربية أثناء تضخم القلب .34 بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا وظيفة مزدوجة لـ MG53 في منع الاستجابة غير القادرة على التكيف مع فرط الالتهاب أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا A تحت المميتة ، والتي تتميز بالإنتاج المفرط للإنترفيرون-ب ، عن طريق قمع تنشيط IRF3 / NF-kB وتثبيط الإشارات الشاذة داخل الخلايا Ca2þ في البلاعم 35 علاوة على ذلك ، عند جرعة قاتلة من الأنفلونزا أ ثبت أن عدوى الفيروس ، MG53 تمنع الوفيات وتلف الرئة ، ليس عن طريق التأثير المباشر على التتر الفيروسي بحد ذاته ولكن عن طريق التخفيف من عاصفة السيتوكين (إنترفيرون-ب ، وإنترلوكين -6 ، وإنترلوكين -1 ب) من خلال التنظيم السلبي من الجسيم الالتهابي NLRP3 والوقاية من التهاب الحنجرة في الرئة .36 علاوة على ذلك ، تم ربط العلاج المزمن بجرعات عالية من MG53 الخارجي بقمع NF-kB - التهاب بوساطة في القلب المسن .37 تشير هذه الدراسات إلى أن MG53 يمكنه تعديل إشارات NF-kB الشاذة أثناء الالتهاب ولكن لم يتم دراسة ما إذا كان هذا يحدث في سياق التهاب الكلى أم لا.

افترضنا أن MG53 ينظم التهاب الكلى عن طريق تعديل نشاط النسخ لـ NF-kB وبذلك يمكن أن يخفف من تليف الكلى الذي يحدث نتيجة للالتهاب المزمن. أجريت هذه الدراسة لمعالجة هذه الفرضية.

cistanche فعال في علاج أمراض الكلى

طُرق

دراسات على الحيوانات

التزمت جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات بدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر واتبع البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية أوهايو. النوع البري المتطابق مع العمر (WT) أو mg53^-/-تم استخدام nonlittermates من سلالة 129S1 / SvImJ لتأسيس دور MG53 في تعديل التليف الكلوي الناتج عن انسداد الحالب المعتمد على العمر وأحادي الجانب (UUO). تم شراء الفئران C57B6 / J (9-10 أسابيع) من Jackson Labs.

بالنسبة لدراسات إصابات الكلى ، تعرضت الفئران (9-12 أسبوعًا) لـ UUO للحث على تليف الكلى. تم تخدير الفئران عن طريق الأيزوفلورين (1.5 بالمائة -2. 0 بالمائة) لضمان مستوى عميق من التخدير. تم إجراء عملية UUO عن طريق ربط الحالب الأيسر بـ 5-0 حرير جراحي مرتين وفقًا للبروتوكولات المنشورة. 38 كان لدى الفئران الشام شق في جلد البطن فقط. لتقييم تأثير rhMG53 على إصابة الكلى الانسدادي ، تلقت مجموعة واحدة من الفئران UUO rhMG53 (2 مجم / كجم) عن طريق حقن الوريد الذيل بعد جراحة UUO مباشرة (اليوم 0) ثم يوميًا لمدة 7 أيام ، مع 2 جرعات إضافية في اليومين 9 و 11. تلقت مجموعة تحكم من الفئران UUO حقن محلول ملحي وفقًا لنفس الجدول الزمني. قُتلت الفئران في اليوم 12 بعد جراحة UUO ، وتم ترطيب الكلى في الموقع بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات ، وتم جمع عينات الأنسجة من كلية UUO والكلية المقابلة من أجل الأنسجة وتحليل اللطخة الغربية.

في دراسات منفصلة ، WT و mg53^-/-خضعت الفئران لعملية جراحية غير رسمية أو صورية وقتلت في اليوم السابع بعد العملية. أُعطي MG53 للفئران باستخدام نهج العلاج القائم على الخلايا. وأصيب 39 RAW 264.7 من الضامة بجزيئات فيروسية الكرز الدوكسيسيكلين (DOX) المعتمدة على Ad tPA-MG 53- لمدة 24 ساعة. تم حقن الخلايا المصابة (بتركيز {{1 0} / 1 0 0 مل من محلول ملحي لكل فأر) في وريد الذيل في الفئران فورًا بعد الجراحة (حقن اليوم 0). تلقت الفئران 4 حقن من خلايا RAW المنقولة من Ad-tPA-MG53 في الأيام 0 و 1 و 3 و 6. مباشرة بعد اليوم 0 حقن الخلية ، تم اختيار الفئران بشكل عشوائي في المجموعة التي تلقت ومجموعة لم تتلق DOX (2) ملغم / مل في محلول سكروز 5 في المائة) في مياه الشرب لمدة 7 أيام ثم يقتل. تم جمع عينات الأنسجة من كلية UUO والكلية المقابلة لتحليل الأنسجة ، RNA ، والبروتين.

التحليلات الإحصائية يتم التعبير عن البيانات كوسائل - SD. تم إجراء مقارنة داخل المجموعات باستخدام اختبار الطالب t عند مقارنة بحثين تجريبيين أساسيين H Li وآخرون: يعدل MG53 NF-kB في التليف الكلوي 2 Kidney International (2 0 21) - ، - - المجموعات و 1- طريقة تحليل التباين لأكثر من مجموعتين (Graphpad Prism 8.2 ؛ GraphPad) متبوعةً إما باختبار المقارنة المتعددة المخصص لاختبار Bonferroni أو Holm-Sidak. اعتبرت قيمة P <0.05 ذات="" دلالة="">

الطرق التكميلية الأساليب الكاملة بما في ذلك التقييم النسيجي ، وقياسات الكرياتينين في المصل ، وتركيبات البلازميد ، وثقافة الخلية وعزل الخلايا الظهارية الأنبوبية الأولية ، وإعداد الفيروس الغدي وعدوى الخلية ، ومقايسة الانتقال النووي NF kB p65 ، والكيمياء المناعية والصور متحد البؤر ، ومقايسة مراسل NF-kB luciferase ، السيتوكين مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، وتجزئة الأنسجة ، والتكتل المناعي ، والترسيب المناعي المشترك ، وتفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي (الجدول التكميلي S1) ، وإنتاج rhMG53 في الطرق التكميلية.

مستخلص نوبيولوسا cistanche tubulosa: يعالج أمراض الكلى

النتائج

تصاب الفئران التي تم استئصال MG53 بتليف كلوي مرتبط بالعمر

قارنا تأثير الشيخوخة على وظائف الكلى والتليف في mg53^-/-وفئران WT. أكدنا ملاحظتنا السابقة أنه على الرغم من أن مستويات الكرياتينين في مصل الفئران الصغيرة (شهرين) مع وبدون MG53 لم تكن مختلفة بشكل كبير ، إلا أن كبار السن (16-20 شهرًا) ملغ 53-/-عرضت الفئران كرياتينين مصل أعلى بكثير من ضوابط WT المطابقة للعمر (الشكل 1 أ). بناءً على تلطيخ ثلاثي الكروم ، وجدنا أن mg53-/-كان لدى الفئران المزيد من تليف الكلى مقارنة بالفئران WT ، بدءًا من سن 5 أشهر وتستمر حتى سن 20 شهرًا (الشكل 1 ب و ج). تم استخدام التلوين الكيميائي الهيستولوجي المناعي لتقييم تأثير استئصال MG53 على تسلل الكريات البيض ، وحيدات ، والضامة في 2- شهر و 5- شهرًا من كلى الفأر (الشكل 1 د و هـ). تحتوي الكلى من الفئران الصغيرة WT و mg 53- / - على مستويات مماثلة من كريات الدم البيضاء داخل الكلية ، ولكن تم العثور على خلايا التهابية أكثر بشكل ملحوظ في mg53 / كلوي مقارنةً بالكلى WT في الفئران البالغة من العمر 5- شهرًا.

علاوة على ذلك ، أظهرت الكيمياء النسيجية المناعية للأكتين العضلي الأملس والفيبرونيكتين ، وهما بروتينان مصفوفان خارج الخلية موجودان بشكل شائع في مناطق تليف الكلى ، تلطيخًا محسنًا (3- إلى 8- طيات) في الكبيبات والنبيبات البينية للكلى من { {4}} فئران بعمر شهر {6}} / - مقارنة بفئران WT عمرها 10- شهر (الشكل التكميلي S1).

يتسبب UUO في حدوث التهاب وتليف حاد في الكلى في الفئران 53- / - زادت مستويات الكلى MG53 المكتشفة عن طريق التخمير المناعي بشكل ملحوظ بعد 7 أيام من UUO (الشكل 2 أ). أظهرت الكلى mg 53- / - UUO تليفًا مبالغًا فيه ، مع 30 بالمائة إضافية من المنطقة الملطخة بالكروم ، مقارنة بالكلى WT UUO (الشكل 2 ب).

يعدل MG53 تنشيط NF-kB والتوطين النووي p65

تم تقييم نشاط NF-kB (p65) في نموذج UUO. تمت زيادة إجمالي p65 (t-p65) بشكل كبير في الكلى UUO من WT و mg53 / الفئران ، لكن تنشيط NF-kB ، الذي تم تقييمه على أنه فسفرة لـ p65 ، كان أكبر (16- أضعاف) في mg53 / UUO كلية من كلية WT UUO (2- أضعاف) مقارنة مع الحيوانات التي تديرها صورية (الشكل 3 أ). قمنا بتحليل مستويات الحمض النووي الريبي النسبية لعامل النمو المحول b1 (TGF-b1) ، ومثبط منشط البلازمينوجين -1 (PAI -1) ، ونوع الكولاجين الأول ألفا 1 (Col1a1) في الكلى المسدودة. اكتشف مستويات منخفضة من التعبير الجيني في الحيوانات الزائفة والاستقراء المماثل (TGF-b1 ، w10 fold ؛ PAI -1 ، w40 fold ؛ Col1a1 ، w40 fold) في كلية UUO من WT و mg53 / (الشكل 3 ب). لفحص التوزيع المكاني لـ MG53 في قشرة الكلى في ظل الظروف العادية ، تم تحليل أجزاء أنسجة الكلى. لقد حصلنا بانتظام على 10- ضعف إجمالي بروتين العصارة الخلوية مقارنة بإجمالي البروتين النووي المستخرج. كانت مستويات t-p65 قابلة للمقارنة في الجزء العصاري الخلوي بين الفئران WT و mg 53- / - ولكنها كانت أكبر في الجزء النووي من الفئران بالملجم 53- / - (الشكل 3 ج). تم الكشف عن MG53 في جزء العصارة الخلوية (مع توبولين كعلامة عصارة خلوية). بشكل غير متوقع ، تم اكتشاف كمية كبيرة من MG53 في الجزء النووي (مع هيستون H3 كعلامة جزء نووي).

لتأكيد هذه النتيجة ، قمنا أيضًا بفحص توطين MG53 في كسور العضلات الهيكلية (الشكل التكميلي S2). أعدنا إنتاج دراساتنا السابقة التي تم فيها ترجمة MG53 إلى العصارة الخلوية والغشاء الساركوليمالي (الصوديوم والبوتاسيوم أدينوسين ثلاثي فوسفاتيز كعلامة لكسر الغشاء) 22،23،25 ولكن أيضًا اكتشفنا MG53 المخصب النووي من العضلات الهيكلية.

يتفاعل MG53 مع p65 للتحكم في نشاط النسخ الناجم عن نخر الورم لتأكيد نتائج تجزئة الأنسجة لدينا ، أجرينا الدراسات الكيميائية الهيستوكيميائية المناعية التالية. في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة المستزرعة من WT ، تم العثور على p65 بشكل رئيسي في العصارة الخلوية ولكن مترجمة إلى النوى في غياب MG53 (الشكل 4 أ). عندما عولجت هذه الخلايا بـ LPS (5 مجم) لمدة 8 ساعات ، كان إفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات أكبر بشكل ملحوظ في mg53 / خلية من خلايا WT (الشكل 4 ب).

نظرًا لأن هذه البيانات تشير إلى أن MG53 قد يتفاعل مع p65 لتنظيم التعبير الخلوي الالتهابي ، فقد تم تقييم التفاعل المباشر بين p65 و MG53 عن طريق مقايسات الترسيب المناعي المشترك باستخدام خلايا HEK293 المصابة بـ Flag-p65 و HA-MG53. أظهرنا تفاعلًا ضعيفًا (الشكل 4 ج). أكد ترانسفكأيشن من GFP-p65 و RFP-MG53 البلازميدات والتحليل (كنفوكل) كولوكاليشن من p65 و MG53 (الشكل 4 د). قمنا بعد ذلك بتحديد ما إذا كان MG53 يؤثر على نشاط النسخ NF-kB (p65) بعد تحفيز TNF عن طريق قياس نشاط luciferase من خط خلية مراسل نسخي NF-kB / 293- GFP-Luc المستقر الذي تم نقله بشكل عابر باستخدام ناقل pHM6 أو HA-MG53. تحتوي خلايا المراسل على مراسل لوسيفيراز لتعبير الفيروس البطيء المنقولة مدفوعًا بمروج الحد الأدنى من الفيروس المضخم للخلايا جنبًا إلى جنب مع 4 نسخ من عناصر الاستجابة النسخية NF-kB (موقع kB) المنبع. في غياب TNF-a ، كان هناك نشاط منخفض جدًا للوسيفيراز الداخلي تم اكتشافه في الخلايا المراسل التي تعبر عن بروتينات MG53. قام MG53 بقمع نشاط نسخ TNF-a- أثار NF-kB (p65) بحوالي 40 بالمائة (الشكل 4 هـ).

أدى الإفراط في التعبير عن MG53 إلى منع الانتقال النووي لـ NF-kB p65 عند معالجة TNF-a تم نقل NF-kB p65 إلى النواة عند علاج عامل نخر الورم- وهو علاج في ظهارة النبيبات القريبة من الكلى. عند تحفيز TNF-a ، قمنا بإفراط في التعبير عن MG53 في خلايا HKC -8 إما عن طريق النقل الفيروسي المعتمد على DOX Ad-tPA-MG53 أو من خلال العلاج باستخدام MG53 البشري المؤتلف (rhMG53). استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة MG 53- المحدد ، بعد اكتشاف التحريض المعتمد على DOX MG53 عن طريق التكتل المناعي. كان MG53 موجودًا على مستوى عالٍ جدًا في خلايا HKC المحولة من Ad-tPA-MG53 -8 ،

ما يعادل 1 نانوغرام rhMG53 / ملغ محلول خلوي. في المقابل ، تناولت HKC -8 وأبدت كمية أقل بكثير من rhMG53 (الشكل 5 أ). تم تأكيد امتصاص rhMG53 المسمى FL بواسطة HKC -8 بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل التكميلي S3). بعد علاج TNF-a ، كان الوقت اللازم للوصول إلى ذروة تنشيط p65 من 15 إلى 30 دقيقة (الشكل 5 ب). في ظل الظروف القاعدية ، أقام NF-kB p65 بشكل أساسي في العصارة الخلوية ، ولم يغير الإفراط في التعبير عن MG53 هذا (الشكل 5 ج و د). ومع ذلك ، بعد تحفيز TNF-a ، تم نقل p65 إلى نوى في خلايا HKC -8 التي لا تُفرط في التعبير عن MG53. بالمقارنة ، انخفض الانتقال النووي لـ p65 بنسبة 33 في المائة (الخلايا المعطاة rhMG53) إلى 50 في المائة (الخلايا المنقولة المعطاة DOX) في الخلايا التي تزيد من التعبير عن MG53 (الشكل 5 ج و د).

تم إجراء النقل التبني لخلايا RAW المصممة هندسيًا إلى نموذج UUOmouse باستخدام 1 - 106 من الخلايا التي تم إعطاؤها من خلال حقن الوريد الذيل مباشرة بعد جراحة UUO. تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعة تلقت مياه الشرب العادية (-DOX) ومجموعة تلقت DOX (2 مجم / مل) في مياه الشرب. تلقت الفئران UUO RAW كل يوم آخر لما مجموعه 4 حقن. تم حصاد الكلى بعد 7 أيام من الجراحة.

أظهرت الفئران المملوءة بـ RAW المصمم هندسيًا متبوعًا بتحريض DOX انخفاضًا كبيرًا (بنسبة 30 بالمائة) في التليف الكُلوي مقارنةً مع أولئك الذين لم يتلقوا خلايا أو تلك التي تم غمرها بخلايا RAW المهندسة ولكن بدون تحفيز Dox (66 بالمائة منطقة تليفية ؛ الشكل 6 أ و ب).

نجا عدد قليل فقط من سكان RAW / Ad-tPA-MG53 من مراقبة النظام الشبكي البطاني بنهاية التجارب. أكد تلطيخ الكيمياء المناعية أن تعبير MG53 RAW بوساطة معالجة DOX في الكلى (الشكل 6 ج). ومن المثير للاهتمام ، أن الكلى UUO من الفئران المصابة بـ RAW و MG53 الناجم عن DOX أظهرت نسبة p -65 / t-p65 أقل (بحوالي 40 بالمائة) من أولئك الذين لم يتلقوا RAW أو أولئك الذين أعطوا RAW بدون DOX (الشكل 6 د و هـ). تم تأكيد انخفاض مستوى p-p65 مع تلطيخ الكيمياء المناعية p-p65 (S536) للكلى UUO (الشكل 6f). نعتقد أن تعميم MG53 الذي يتم تسليمه بواسطة Raw / Ad-tPA-MG53 / þDOX وامتصاصه بواسطة خلايا النبيبات القريبة من الكلى يمكن أن يساهم في تقليل p-p65 (S536) وتقليل التهاب الكلى UUO. بالمقارنة مع الكلى UUO فقط ، زاد تعبير TGF-b1 و PAI - 1 و Col1a1 بشكل ملحوظ في كلى UUO من الفئران التي تم غمرها بـ RAW بدون DOX (بدون تحريض MG53). يمكن أن يُعزى ارتفاع هذه الجينات البروتيفيبر إلى تحريض تفاعل طعم خيفي قوي من الخلايا المحقونة في الفئران ذات الكفاءة المناعية. ومع ذلك ، فإن الكلى UUO من الفئران التي تم غمرها بـ RAW وتم إعطاء DOX (تحريض MG53) أظهرت انخفاضًا ملحوظًا (60٪ -72٪) PAI -1 ومستويات أقل نسبيًا من TGF-b1 و Col1a1 مقارنة بالفئران بدون علاج DOX (الشكل 6 ز).

تخفف الإدارة المنهجية لـ rhMG53 تنشيط NF-kB وتطور التليف في الفئران المعرضة لـ UUO

اختبرنا ما إذا كان rhMG53 قد أظهر تأثيرًا مضادًا للالتهاب مشابهًا للعلاج بخلايا RAW الذي تم وصفه سابقًا. أشارت بيانات الحرائك الدوائية السابقة إلى فترة نصف العمر القصيرة المتداولة (حوالي 90 دقيقة في القوارض) لـ rhMG53.42 الفئران التي تحملت إعطاء مزمن من 2 إلى 6 مجم / كجم

rhMG5326،37 جيدًا ، لذلك تم استخدام استراتيجية الإدارة الموضحة في الشكل 7 أ. تم إعطاء الفئران UUO بشكل عشوائي إما مركبة (محلول ملحي) أو rhMG53 (2 ملغم / كغم) يوميًا للأيام السبعة الأولى بعد الجراحة ثم مرة كل يومين حتى تم قتلها في اليوم الثاني عشر. ومستويات التعبير الفبرونيكتين ، مع زيادة طفيفة في مستويات p-p65 في الكلى المقابلة مقارنة بالكلى الزائفة. بعد UUO ، زادت الكلية t-p65. مقارنة بالحيوانات المعالجة بمحلول ملحي ، انخفضت نسبة p -65 / t-p65 في الكلى UUO للحيوانات المعالجة rhMG 53- بحوالي 37 بالمائة ، بينما زاد IkBa بحوالي 27 بالمائة (الشكل 7 ب و ج). بالإضافة إلى ذلك ، انخفض الفبرونيكتين بنحو 33 في المائة (الشكل 7 ب و ج). أكدت الكيمياء النسيجية المناعية أن rhMG53 كان موجودًا في الكلى UUO بعد العلاج (الشكل 7 د). تم تقليل التليف الكلي في الكلى rhMG المعالجة 53- UUO (الشكل 7 هـ). ومع ذلك ، كان تعبير RNA لـ TGF-b1 و PAI -1 و Col1a1 مشابهًا في الفئران التي عولجت إما بمحلول ملحي أو rhMG53 (الشكل 7f).

cistanche فعال في علاج ضعف الكلى

نقاش

MG53 هو بروتين TRIM غني بالعضلات تم تحديده في البداية على أنه مكون بارز في آلات إصلاح غشاء البلازما. myokine.32 لقد أظهرنا سابقًا أن MG53 يمكنه التحكم في الالتهاب أثناء تلف الأنسجة في الأعضاء البعيدة. نستنتج أن MG53 يمكن أن يخفف الالتهاب داخل الكلى والتليف الكلوي عن طريق منع التنشيط الناجم عن السيتوكين لعامل النسخ المسبّب للالتهابات والالتهاب NF-kB. يعتمد هذا الاستنتاج على الملاحظات التالية: (1) الحذف الجيني لـ MG53 في الفئران العادية.

أدى إلى انخفاض في وظائف الكلى مع تقدم عمر الفئران المصحوب بزيادة في التليف الكلوي وتسلل الكريات البيض والضامة إلى الكلية. (2) في نموذج إصابة الكلى UUO في الفئران ، أظهرت الكلى المسدودة 53- للفئران الناقصة تليفًا والتهابًا أكثر من الفئران المملوءة بالـ MG 53- ؛ (3) تم تخفيف إنتاج TNF-a و interleukin -6 بواسطة الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة المعالجة بـ LPS في وجود MG53 ؛ (4) أدى العلاج مع MG53 أو الإفراط في التعبير عنه في خط الخلية الظهارية الأنبوبية القريبة إلى تقليل تنشيط NF-kB الناجم عن TNFa عن طريق منع الانتقال النووي لمكون p65 من kB (تم العثور على MG53 لربطه مباشرة بـ p65 ، وإن كان ضعيفًا) ؛ و (v) تم تقليل فسفرة p65 ، وهي خطوة ضرورية في تنشيط NF-kB ، في الكلى المسدودة لفئران UUO التي عولجت بـ MG53 المؤتلف المستحث على زيادة التعبير عن MG53 في الضامة. علاوة على ذلك ، تمت زيادة مثبط تنشيط NF-kB ، IkBa ، في الكلى المسدودة لفئران UUO المحقونة بـ MG53 المؤتلف.

كان الحذف الجيني لـ MG53 في الفئران العادية يسمح للآثار الضارة للشيخوخة على الكلى. يشير هذا إلى أن وجود MG53 الذاتية يوفر مستوى أساسيًا من الحماية أثناء الشيخوخة. وبالمثل ، فإن فقدان MG53 الذاتية جعل AKI بسبب الانسداد أسوأ. تراكمت الكلية UUO MG53 ، وربما تعكس نشاط ميوكيني بعيد من عضلات الهيكل العظمي. لا يزال من غير الواضح كيف يمكن تجنيد العضلات MG53 للكلية أثناء الإصابة ؛ ومع ذلك ، غالبًا ما تتطور الكلى التالفة إلى نقص الأكسجة وتتعرض للإجهاد التأكسدي ،^44,45الإشارات التي يمكن أن تعمل على تجنيد MG53. إذا كان الأمر كذلك ، يمكن الاستفادة من محور "خلية العضلات - الكلى - المناعة" لتخفيف تلف الكلى.²⁶وأثناء الإصابة الحادة أو المزمنة ، يمكن زيادة تنظيم إنتاج MG53.

NF-kB هو محرك نسخي بارز للالتهاب والتليف في إصابة الكلى والشيخوخة.^14,17,47,48لقد طُلب منا التحقيق فيما إذا كان يمكن التوسط في تأثيرات MG53 عبر NF-kB لأن وجود MG53 في الحجرة النووية لمجانسات الكلى يشير إلى احتمال حدوث تداخل نسخي. التوطين النووي لـ MG53 لا يخلو من سابقة. في نموذج معدّل وراثيًا يفرط في التعبير عن عضلة القلب MG53 ، نظمت MG53 النووية التعبير عن مستقبلات ألفا التي تنشط بالبيروكسيسوم على مستوى النسخ وتأثر أيض دهون القلب. من خلال تقليل السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، والاستماتة ، والإجهاد التأكسدي في خلايا عضلة القلب المسنة.³⁷

لا تزال الآلية الجزيئية لكيفية تعديل MG53 للتعبئة النووية / السيتوبلازمية لـ p65 غير واضحة. لا يحتوي MG53 على إشارة توطين نووي ، ولكنه يحتوي على 3 إشارات تصدير نووي مفترضة من N-terminal الغنية بالليوسين ، وهي فكرة معترف بها من خلال تصدير البروتين النووي.⁵⁰كان التفاعل المباشر بين MG53 و p65 ضعيفًا نوعًا ما باعتباره التأثير التخريبي الوحيد أو الرئيسي لـ MG53 على تنشيط NF-kB. على الرغم من أن MG53 يبدو أنه يؤثر على النقل المكوكي الخلوي النووي الديناميكي للمكونات الحرجة NF-kB ، إلا أن الآليات الدقيقة لا تزال بحاجة إلى تحديد.

يبدو أن النتيجة الحاسمة للحماية الكلوية بوساطة MG 53- هي تقليل إعادة التشكيل الليفي من خلال تخفيف الالتهاب بوساطة NF-kB. إن تليف الكلى هو عملية معقدة تنطوي على الترسب المرضي لبروتينات ECM المختلفة. 51 يبدو أن MG53 لها تأثيرات واضحة على بروتين الفبرونيكتين ECM. زاد الفبرونكتين في عوز الكلى UUO في MG53 وانخفض في الفئران UUO المعالجة بـ MG53. يصعب فهم التعبير عن بروتينات ECM الأخرى في وجود MG53 وغيابه. لقد أوضحنا سابقًا أن rhMG53 ينظم بشكل سلبي إشارات TGF-b1 / Smad ويثبط تخليق بروتينات ECM في دراسة في المختبر. ملغ 53 / الحيوانات الناقصة. انخفضت هذه النسخ في حيوانات UUO التي تم تحفيزها للإفراط في التعبير عن MG53 من خلال إدارة الماوس المستحث بالفيروس

الضامة ، ولكن عندما أعطيت MG53 المؤتلف ، لم يلاحظ أي تأثير. قد يكون هذا مجرد حالة من الجرعات الكافية لأن مستويات MG53 التي تم تحقيقها كانت أكبر بكثير في الحيوانات بالنظر إلى ناقل البلاعم بدلاً من MG53 المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم قياس مستويات البروتين ، ويمكن لأحداث ما بعد النسخ تعديل ECM في UUO. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح الدور الناشئ لـ MG53 في تعديل بروتينات ECM المحددة. في الختام ، أظهرت هذه الدراسة أن الميوكين قد يساعد في تنظيم الالتهاب الأساسي في عضو بعيد مثل الكلى ، وفي حالة إصابة الكلى ، قد يساعد في تخفيف الالتهاب والسيطرة عليه. يقدم الشكل 8 نموذجًا عمليًا لدور MG53 في الحماية الكلوية. خلال الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMP ، مثل TNF-a) والأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (PAMP ، مثل LPS) التحفيز والإجهاد الإقفاري ، يتم تنشيط إشارة NF-kB في الكلى. يحمي MG53 الكلى عن طريق تثبيط الفسفرة وتفعيل إشارات NF-kB ، وتثبيت IkBa ، وتقليل التعبئة النووية لـ p65 ، مما يمنع تنشيط البرامج المؤيدة للالتهابات. على الرغم من أن MG53 الذاتية قد تتوسط في هذه التأثيرات ، فإننا نقترح أنه قد يتم توفير حماية أكثر قوة باستخدام MG53 علاجيًا ، وهو أمر ممكن بناءً على قدرة MG53 الخارجية لتقليل الإصابة في UUO. هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيق لفهم كيف يمكن استغلال هذا الميوكين سريريًا.

فائدة cistanche: حماية الكبد ومكافحة التليف

إفشاء

تمتلك JM حصة في الأسهم في TRIM-edicine، Inc. ، التي تطور rhMG53 لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان. براءات الاختراع الخاصة باستخدام MG53are مملوكة من قبل جامعة روتجرز وجامعة ولاية أوهايو. أعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم تضارب المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R 01- DK106394 (JM و BHR و P-HL) والمعاهد الوطنية للصحة R 01- AG062896 (P-HL andBHR). كان هذا المشروع أيضًا مدعومًا جزئيًا من خلال صندوق Lockwood الداخلي من جامعة ولاية أوهايو (P-HL) وجائزة من المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية (NCATS ؛ P-HL ، رقم الجائزة UL1TR002733). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لـ NCATS أو المعاهد الوطنية للصحة.

مساهمات المؤلف HL ،

قام PD و P-HL و JM و BHR بتصميم و / أو تصميم الدراسات ؛ أجرى HL و PD و P-HL و ZL و XZ التجارب واكتسبوا البيانات وأجروا تحليل البيانات ؛ فسر PD و P-HL و BHR النتائج ؛ و P-HL و BHR قاموا بصياغة ومراجعة واعتماد المخطوطة. كل المؤلفين قرأوا ووافقوا على النسخة الأخيرة.

المواد التكميلية

ملف تكميلي (PDF) طرق تكميلية.

الجدول S1.متواليات التمهيدي. الشكل S1. mg 53- / - الفئران تعرض ترسب بروتين ECM محسنًا. العمر المتطابق (1 0 شهرًا) من النوع البري (WT) و {6}} / - أنسجة الكلى كانت ملطخة بـ 40 6- دياميدينو -2- فينيليندول (DAPI ؛ أزرق ، الألواح اليسرى) ، الأكتين العضلي الأملس (SMA ؛ الألواح الخضراء ، الثانية) ، الفبرونيكتين (الأحمر ، الألواح الثالثة) ، والمدمج (الألواح اليمنى). شريط ¼ 25 ملم. القياس الكمي لمنطقة التليف الكلوي (ن ¼ 3 لكل مجموعة). يتم تقديم البيانات كوسائل - SD. اختبار الطالب. *** P <>

الشكل S2.توزيع العضلات الهيكلية MG53 بين النواة والسيتوبلازم. العضلات الهيكلية المشتقة من النوع البري (WT) ormg 53- / - تم تجزئة الفئران وتقطيعها مناعيًا باستخدام جسم مضاد مضاد لـ MG53 مصنوع خصيصًا (3 مجم ليسيتس) وعلامات حجرة الخلية (20 مجم ليسيتس). تستخدم ثلاثي فوسفات أدينوسين الصوديوم والبوتاسيوم كعلامة غشاء الخلية ، وهيستون H3 كعلامة نووية ، والتوبولين كعلامة عصارة خلوية.

الشكل S3.HKC -8 تمتص خلايا النبيبات القريبة من الكلى على وجه التحديد AlexaFluor 647 – المسمى rhMG53. تم تصنيف rhMG53 (Trimedicine) وألبومين المصل البقري (BSA ؛ ThermoFisher Scientific) باستخدام مجموعات وضع العلامات على الأجسام المضادة Alexa Fluor (AF) (تقنيات الحياة) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم زراعة خلايا HKC -8 على طبق ذو قاع زجاجي Delta TPG (Bioptechs Inc.) في وسيط Eagle's المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) في وجود بروتينات مصنفة ، BSA-AF647 (يسار ) و rhMG 53- AF647 (يمين) لمدة 24 ساعة. تم التقاط صور Z-stack من مجهر متحد البؤر LSM780 (زايس). تظهر الصور الخلايا في الجزء السفلي من الأطباق. شريط ¼ 25 ملم.

الشكل S4.هندسة خلايا RAW للتوسط في إفراز MG53 المحرض. (أ) أصيبت خلايا RAW بـ Ad-tPA-MG53 لمدة 24 ساعة وعولجت بدون (دوكسيسيكلين [Dox]) أو بـ Dox (þDox ، 1 مجم / مل) لمدة 24 ساعة إضافية للحث على تعبير tPA-MG53. أظهرت الصور البؤرية تحريض تعبير MG53 (جسم مضاد مضاد لـ MG53 مصنوع خصيصًا ، أحمر ، لوحات سفلية) من خلايا RAW شبيهة بالبلعم (F4 / 8 0 تلطيخ ، لوحات علوية خضراء). قضبان ¼ 25 مم. (B ، C) تحليل اللطخة الغربية لمحللات الخلية (بكمية 0. 6 و 3 و 6 مجم) للتعبير المستحث عن tPA-MG53 و MG53 من خلايا RAW المصابة (B) والثقافة المقابلة مركزات الوسائط (بأحجام 2 و 5 و 1 0 مل) (ج). تم تحميل كميات مختلفة من rhMG53 (بمبلغ 0. 2 ، 1 ، 0.05 ، 0.025 نانوغرام) كمعايير. ميغاواط ، علامات الوزن الجزيئي.