بناء لقاح Lactobacillus Casei المؤتلف لـ PEDV واستجاباته المناعية في الفئران
Sep 06, 2023
خلاصة
خلفية: الإسهال الوبائي الخنازير (PED) هو مرض معوي معدي يسببه فيروس إسهال وباء الخنازير (PEDV) ويتميز بالقيء والإسهال وفقدان الشهية والجفاف، مما تسبب في خسائر اقتصادية فادحة في جميع أنحاء العالم. في الوقت الحاضر، لا تزال المناعة ضد اللقاح هي الطريقة الأكثر فعالية للسيطرة على انتشار عدوى PED. في هذه الدراسة، قمنا ببناء سلالة L. casei-OMP 16- PEDVS جديدة معادة التركيب معبرة عن بروتين PEDVS لـ PEDV وبروتين OMP16 لسلالة Brucella abortus. لمعرفة مناعة اللقاح المرشح المؤتلف L. casei-OMP16-PEDVS، تمت مقارنته مع BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS، والبروتين المؤتلف BL21-PEDVS.
نتائج: أظهرت النتائج أنه يمكننا اكتشاف مستويات أعلى من IgG، والأجسام المضادة المعادلة، IL-4، IL-10، وINF- في المصل وIgA في براز L. casei-OMP16- تم تحصين الفئران بواسطة PEDVS، مما يشير إلى أن لقاح L. casei-OMP16- المرشح لـ PEDVS يمكن أن يحفز مستويات أعلى من المناعة الخلطية، والمناعة الخلوية، والمناعة المخاطية.
خاتمة: لذلك، يعتبر L. casei-OMP16-PEDVS لقاحًا مرشحًا واعدًا للوقاية من عدوى PEDV.
الكلمات المفتاحية: PEDV، لقاح الملبنة المجبنة، بروتين PEDV S، OMP16، الاستجابات المناعية
فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة
مقدمة
يحدث إسهال وباء الخنازير (PED) بسبب فيروس إسهال وباء الخنازير (PEDV) مع أعراض تشمل الإسهال والقيء وفقدان الشهية والجفاف وفقدان الوزن في الخنازير [1، 2]. يمكن أن تصاب الخنازير من جميع الأعمار بأعراض مختلفة ويصل معدل الوفيات في الخنازير إلى 100% [3]، مما أدى إلى خسائر اقتصادية فادحة في جميع أنحاء العالم. للسيطرة على انتشار فيروس PEDV، يتم تصنيع معظم أنواع اللقاحات، مثل اللقاح المعطل المدعم بهيدروكسيد الألومنيوم، وفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال ثنائي التكافؤ غير النشط (TGEV)، ولقاح PEDV، ولقاح PEDV المخفف [4]. على الرغم من أن هذه اللقاحات تلعب دورًا مهمًا في السيطرة على أمراض الجهاز الهضمي، إلا أن جميعها لها عيوبها. لا يمكن للقاحات المعطلة تنشيط الاستجابات المناعية الخلوية، واللقاح الموهن ليس آمنًا جدًا، ولا يمكنها تحفيز إنتاج كافٍ من الأجسام المضادة IgA الخاصة بالفيروس من الاستجابات المناعية المخاطية. لذلك، من الضروري والعاجل تطوير لقاح جديد للسيطرة على أمراض الجهاز الهضمي.
غالبًا ما يُعتبر الملبنة المجبنة نوعًا من نظام النواقل الآمن للتوصيل المستهدف للمستضدات في التحصين عن طريق الفم، مع تأثيرات مفيدة على صحة البشر والحيوانات [5]. وفي الوقت نفسه، يمكن استخدامه كنظام توصيل لتنظيم استجابة الخلايا التائية المساعدة وتحفيز إفراز IgAs محدد للمناعة المخاطية [6]. من ناحية أخرى، فإن اللقاح المؤتلف Lactobacillus Casei أسهل في الإدارة، وفرصة أقل لتفاعل فرط الحساسية، وأكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة باللقاحات التقليدية. بناءً على التقارير، تم استخدام اللقاحات المؤتلفة Lactobacillus casei بنجاح في الوقاية من فيروس الورم الحليمي البشري ومكافحته والالتهاب الرئوي العقدي والإشريكية القولونية [7-9]. هناك أيضًا بعض المحاولات المماثلة لتصميم لقاحات PED. وجد الباحثون أن سلالة المكورات اللبنية المؤتلفة التي تعبر عن الجين المتغير لفيروس إسهال وباء الخنازير S1 يمكن أن تحفز مستويات عالية من IL-4 وIFN- في الفئران المحصنة [10]. يمكن للقاح المضاد لـ PEDV المستند إلى Lactobacillus casei والذي يعبر عن الببتيد Co1 الذي يستهدف الخلايا الدقيقة والمدمج مع مستضد COE لـ PEDV أن يحفز أيضًا استجابة مناعية فعالة [11]. لتحسين فعالية لقاح PEDV. في هذه الدراسة، قمنا ببناء لقاح جديد مؤتلف من Lactobacillus Casei لـ PED، والذي يمكن أن يحفز استجابات مناعية مخاطية وخلطية وخلوية أقوى ضد عدوى PEDV عن طريق تناوله عن طريق الفم. PEDV، وهو عضو في عائلة الفيروسات التاجية، يتكون من أربعة بروتينات هيكلية تحتوي على بروتين ارتفاع الجليكوزيلات (S) 150-220 كيلو دالتون، وبروتين الغشاء (M) 20-30 كيلو دالتون، وبروتين المغلف (E) 7 كيلو دالتون، و58 كيلو دالتون بروتين القفيصة النووية (N) [12]. هناك، يمكن تقسيم بروتين S إلى نطاقات S1 (1–735 حمض أميني) وS2 (736-آخر حمض أميني) [13]، ويتضمن بروتين S1 منطقة ربط المستقبلات والحواتم المعادلة الرئيسية [13] 14]. يعمل اللقاح المساعد كمعدل مناعي ويمكن أن يحفز ويعزز الاستجابات المناعية ضد المستضدات المشتركة. تم التحقق من أن بروتين OMP16 من سلالة Brucella abortus ينشط الخلايا الجذعية في الجسم الحي، ويحفز الاستجابة المناعية th1، وكان لقاحًا مساعدًا ذاتيًا واعدًا [15-17]. لذلك، تم إدخال بروتين OMP16 في اللقاح المؤتلف لحالة عصية اللاكتو في دراستنا. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدد قليل من الدراسات حول اللقاح المؤتلف Lactobacillus casei لفيروس PEDV. ولذلك، تهدف هذه الدراسة إلى بناء لقاح عن طريق الفم مرشح جديد لـ Lactobacillus casei، والذي يمكن أن يوفر مناعة خلطية ومناعة خلوية ومناعة مخاطية أفضل لمنع انتشار PED.
نبات السيستانش الصيني – مضاد للأورام
المواد والأساليب
السلالات البكتيرية والفيروسات وظروف الثقافة والبلازميدات والاشعال
مسحوق سيستانش
يتم سرد السلالات البكتيرية والبلازميدات والبادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. تمت زراعة السلالة المرجعية القياسية لـ Lactobacillus casei ATCC 393 في مرق دي مان روغوسا وشارب (MRS) عند 37 درجة [18]. تمت زراعة BL21 (DE3) وDH5 في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة [19]. تمت زراعة سلالات Lactobacil lus casei وBL21 (DE3) وDH5 المؤتلفة في الوسط المقابل باستخدام المضادات الحيوية المناسبة، على التوالي. تمت زراعة البروسيلا المجهضة في وسط مرق الصويا التريبتيك (TSB) أو أجار الصويا التريبتيك (TSA) (مختبرات ديفكو، ديترويت، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية) عند درجة حرارة 37 درجة. تم استزراع خلايا Vero المصابة بسلالات PEDV في DMEM (Gibco، Langley، VA، USA) مع إضافة 10 ميكروغرام / مل من التربسين (Gibco، Langley، VA، USA) [20]. كانت البلازميدات pVE5523 وpET28a (+) عبارة عن ناقلات تعبير عن Lactobacillus casei وEscherichia coli، على التوالي.
الجدول 1: خصائص السلالات البكتيرية والبلازميدات والاشعال المستخدمة في هذه الدراسة
بناء سلالات Lactobacillus casei وBL21 المؤتلفة
تم بناء بلازميدات التعبير المؤتلف بناءً على البلازميدات والبادئات في الجدول 1. في البداية، التسلسل الجزئي لجين PEDV S (493-708 حمض أميني)، التسلسل الجزئي لجين PEDV S (493-708 حمض أميني)، وتم تضخيم التسلسل الجزئي لجين Brucella abortus OMP16 (26–168 حمض أميني) باستخدام أزواج التمهيدي PEDVS-F1/R1، وPEDVS-F2/R2، وOMP16-F/R، على التوالي. بعد ذلك، تم استخدام طريقة تمديد التداخل في أجزاء OMP16 وPEDVS لإنشاء جزء جديد OMP16-PEDVS مع رابط متعدد الببتيد (GGGGSGGGGGGGGGS) عالق في المنتصف. بعد ذلك، تم إدراج شظايا PEDVS في بلازميد pET28a مع إنزيمات تقييد EcoRI/XbaI لتوليد البلازميد المؤتلف pET28a-PEDVS، وتم إدراج الشظايا الجديدة OMP16- PEDVS في بلازميدات pET28a وpVE5523 باستخدام EcoRI/XbaI وSalI/EcoRV. إنزيمات التقييد لتوليد البلازميد المؤتلف pET28a-OMP16-PEDVS وpVE5523-OMP16-PEDVS، على التوالي. تم تحويل البلازميدات المؤتلفة (pET28a-PEDVS، pET28a-OMP 16- PEDVS، و pVE 5523- OMP 16- PEDVS) إلى BL21 (DE3) أو Lactobacillus casei ATCC393 عن طريق التحويل أو الكهربة بناءً على الصحيفة المذكورة [21].
تحليل التعبير البروتيني بواسطة لطخة غربية
كان التعبير البروتيني لسلالات BL21-pET28a-PEDVS، وBL21- pET28a-OMP16-PEDVS، وL. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS تم اكتشافه بناءً على الطريقة المُبلغ عنها مع بعض التعديلات [21-23]. تمت زراعة السلالات المؤتلفة BL21-pET28a-PEDVS وBL21-pET28a OMP16-PEDVS في مرق LB وتم استخدام IPTG للحصاد إلى pET28a-PEDVS وpET28a-OMP{{22} } بروتينات بيدفس. تم استخدام المتجه الفارغ كعنصر تحكم سلبي. بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي، تم جمع الطاف والرواسب. بعد ذلك، تمت تنقية البروتينات المستهدفة باستخدام عمود كروماتوجرافيا تقارب النيكل بناءً على الدراسة السابقة [24]. في هذه الأثناء ، تم أيضًا حصاد الطاف الثقافي لسلالة L. casei pVE 5523- OMP 16- PEDVS عن طريق الطرد المركزي عند 9000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. بعد ذلك، تم غلي العينات التي تحتوي على محلول تحميل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لمدة 10 دقائق. تم فصل البروتينات بنسبة 12٪ من هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ثم نقلها إلى أغشية PVDF (ميليبور، ميسيسوجا، أونتاريو، كندا). تم حظر الأغشية Mem بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعتين عند 37 درجة ثم تم تحضينها بجسم مضاد أحادي النسيلة من بروتين S خلال الليل عند 4 درجات و IgG المصاحب لـ HRP الماعز المضاد للفأر (ABclonal ، ووهان ، الصين) لمدة ساعتين عند 37 درجة . تم تصور نطاقات البروتين باستخدام Clarity ™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad، Hercules، CA، USA).
التحصين وجمع العينات
تم تقييم مناعة لقاح Lactobacillus casei المؤتلف باستخدام فئران BALB / c خالية من مسببات الأمراض (SPF) تبلغ من العمر ستة أسابيع [1 0}، 18]، والتي تم شراؤها من مركز الحيوانات بجامعة شاندونغ الزراعية. تم تقسيم 50 فئران بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات بواقع 10 فئران في كل مجموعة. تم تحصين الفئران بلقاح Lactobacillus casei المؤتلف والبروتين المنقى (pET28a-PEDVS، pET28a OMP16-PEDVS، pET28a-OMP16-PEDVS+Freund's مساعد كامل)، على التوالي. تم تنفيذ بروتوكول التحصين بناءً على الجدول 2 وتم إعطاء تحصين معزز بعد 13 يومًا. بالنسبة للدراسة المصلية، تم جمع المصل في 0 و14 و28 يومًا بعد التحصين (dpi) عن طريق ثقب الوريد الذيل وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة حتى الاستخدام. تم جمع البراز قبل يوم واحد من التطعيم وفي كل مرة تعزيز. للكشف عن IgA، تم تخفيف البراز (وزن / حجم) باستخدام EDTA 0.05 مولار صوديوم بنسب 1: 4 مباشرة بعد التجميع وحضنت لمدة 14 ساعة عند 4 درجات بعد الخلط المناسب. تم جمع الطاف بواسطة الطرد المركزي 12 000 × جم وحفظه عند درجة حرارة -20 درجة حتى الاستخدام. عند 28 نقطة في البوصة؛ تمت التضحية بثلاثة فئران من كل مجموعة وتمت معالجة الأمعاء للكشف عن IgA وفقًا للمؤلف الموصوف سابقًا [10، 18، 23].
تحديد تحليل مستويات الأجسام المضادة
تم قياس مستويات IgG في الأمصال وIgA في البراز بواسطة طرق ELISA مع بعض التعديلات [18، 23]. كانت الطرق على النحو التالي: تم طلاء ألواح ميكروتيتر من البوليسترين طوال الليل عند 4 درجات مع 100 ميكرولتر 10 ميكروغرام / مل من بروتين PEDVS، أو بروتين OMP 16- PEDVS، أو 100 ميكرولتر من سلالة L. casei-OMP 16- PEDVS. . بعد تجميدها بحليب منزوع الدسم بنسبة 5%، تم تخفيف العينات المجمعة بشكل متسلسل في برنامج تلفزيوني، وأضيفت في ثلاث نسخ، واحتضنت عند درجة حرارة 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تمت إضافة جسم مضاد IgG أو IgA مضاد للفأر مترافق مع HRP (Invi trogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى كل بئر (1: 5000) واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. تم غسل ألواح ميكروتيتر البوليسترين 5 مرات خلال كل خطوة. أخيرًا، تمت إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة TMB (رباعي ميثيل بنزيدين وH2O2) إلى كل بئر وتم إضافة 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف بعد 10 دقائق. تم قياس قيم OD عند 630 نانومتر باستخدام قارئ لوحة متعدد الأوضاع (EnVision).
فحوصات تحييد الفيروس
تم فحص عيار الأجسام المضادة المعادلة لـ PEDV في الأمصال وفقًا للطرق مع بعض التعديلات [25، 26]. باختصار ، تم تعطيل مصل الفئران بالحرارة (56 درجة لمدة 30 دقيقة) ثم تم تخفيفه بشكل متسلسل مرتين في 96 طبقًا جيدًا (كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع ثلاث نسخ من كل عينة. بعد ذلك ، تمت إضافة حجم متساوٍ من 200 TCID50 / 50 ميكرولتر من سلالات PEDV إلى 96 طبقًا جيدًا واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. تمت إضافة الخليط إلى 96 طبق بئر جديد مطلي بطبقة أحادية من خلايا Vero وحضنت لمدة ساعة عند 37 درجة. تم بعد ذلك غسل الخلايا واحتضانها في وسط الصيانة عند 37 درجة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين، لوحظ تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) باستخدام المجهر المقلوب، وتم تعريف تركيز التحجيم المحايد على أنه أدنى تركيز للأجسام المضادة في المصل.
الجدول 2: البروتوكول المناعي للفئران BALB/c
كشف السيتوكين
للكشف عن إفراز السيتوكينات، تم الحصول على المواد الطافية من فئران المختبر (0، 14، و28 يومًا). تم تحديد مستويات IL-4، وIL-10، وIFN- المفرزة باستخدام مجموعات ELISA التجارية (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.، Wuhan) وفقًا لتوصيات صانع المصنع، على التوالي. تم قياس كمية السيتوكين من منحنيات قياسية مختلفة تم إعدادها من الكواشف القياسية المقدمة من المجموعات على التوالي وتم اكتشاف قيمة الكثافة البصرية (OD) عند 450 نانومتر من كل لوحة باستخدام قارئ لوحة متعدد الأوضاع (EnVision) [23، 27].
تحليل احصائي
تم الحصول على جميع البيانات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل، وتم عرض النتائج كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبارات t ثنائية الطرف والتحليل أحادي الاتجاه في Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعريف الفرق الكبير كـ ∗ p < 0.05، وتم تحديد الدرجات المختلفة للفرق الكبير كـ ∗∗ p < 0.01، ∗∗∗ و p < 0.001 على التوالي.
نتائج
التحقق من سلالات Lactobacillus casei وBL21 المؤتلفة
للتحقق من البلازميدات المؤتلفة التي تم إنشاؤها، تم هضم بلازميدات التعبير المؤتلف pET28a-PEDVS، وpET28a-OMP16-PEDVS، وpVE5523-OMP16- PEDVS باستخدام إنزيمات تقييد NcoI/XhoI، و تم عرض نتائج هضم الإنزيم في الشكل 1. وكانت أحجام النطاقات المستهدفة في المخططات الكهربية هي نفس النتائج المتوقعة وأشارت نتائج التسلسل إلى أن بلازميدات التعبير المؤتلف لم تظهر أي طفرة. أشارت هذه النتائج إلى نجاح بناء pET28a-PEDVS، وpET28a OMP16-PEDVS، وpVE5523-OMP16-PEDVS البلازميدات المؤتلفة. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أنه تم التعبير عن البروتينات المؤتلفة pET28a-OMP16-PEDVS وpET28a-PEDVS في طاف BL21-pET28a OMP16-PEDVS وBL21- سلالات pET28a-PEDVS، على التوالي. تم أيضًا التحقق من بروتين pVE5523-OMP16-PEDVS في الطاف الثقافي لسلالة L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. أظهرت النطاقات المحددة من الشكل 2 أن البروتينات المؤتلفة pET28a-OMP16- PEDVS، وpVE5523-OMP16-PEDVS، وpET28a-PEDVS تم حصادها جميعًا بنجاح (الشكل 2).
الشكل 1: نتائج هضم الإنزيم للبلازميدات المؤتلفة. ج: نتائج هضم الإنزيم لبلازميد pVE5523-OMP16-PEDVS. م: D8000 علامة سلم الحمض النووي؛ 1: pVE 5523- OMP 16- PEDVS البلازميد. ب: نتائج هضم الإنزيم لـ pet28a-OMP16-PEDVS وpET28a-PEDVS البلازميد. م: D8000 علامة سلم الحمض النووي؛ 1: pet28a-OMP 16- PEDVS بلازميد؛ 2: البلازميد pET28a-PEDVS
مستويات الأجسام المضادة IgG في مصل الفئران المحصنة باللقاحات المرشحة
لتقييم المناعة المحددة لمرشحي اللقاحات المولدة، تم اختيار فئران BALB/c وتقسيمها إلى 5 مجموعات. بعد ذلك، تم قياس مستويات IgG في المصل وIgA في البراز باستخدام مجموعات ELISA التجارية. كشفت النتائج أنه لا توجد فروق جوهرية في مستويات IgG بين المجموعات الملقحة ولم يتم العثور على أي جسم مضاد IgG تقريبًا في جميع الفئران قبل التحصين. ومع ذلك، تم العثور على اختلافات كبيرة لاحقًا بعد التطعيم الأول وكانت مستويات الأجسام المضادة IgG في المصل عند 28 يومًا أعلى من تلك الموجودة في 14 يومًا. من بين 5 فئران مجموعة، أظهرت الفئران المحصنة باستخدام L. casei-OMP16- PEDVS وBL21-OMP16- PEDVS-F مناعة متشابهة وأعلى. لذلك، يمكن أن ينتج L. casei-OMP16- PEDVS وBL21-OMP16-PEDVS-F أعلى مناعة، يليه BL21-OMP16- PEDVS و BL 21- PEDVS (الشكل 3).
فوائد مكملات cistanche - زيادة المناعة
انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity
【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
مستويات الأجسام المضادة IgA في براز الفئران المحصنة باللقاحات المرشحة
ولتقييم المناعة النوعية للقاحات المرشحة، تم أيضًا تقييم مستويات الأجسام المضادة IgA في براز الفئران. أظهرت النتائج عدم وجود جسم مضاد خاص لـ PEDVS IgA قبل التحصين. ومع ذلك، فإن كميات كبيرة من الأجسام المضادة IgA في براز L. casei-OMP16-PEDVS قامت بتحصين الفئران BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS، وBL21-مجموعة الفئران PEDVS بعد 14 يومًا من التحصين. بعد 28 يومًا من التحصين، وصلت مستويات الأجسام المضادة IgA للفئران المحصنة L. casei-OMP16-PEDVS إلى أعلى مستوياتها. وفي الوقت نفسه، لم تظهر مستويات الأجسام المضادة IgA في المجموعات الثلاث الأخرى زيادة واضحة. ولذلك، فإن اللقاح المرشح L. casei OMP16-PEDVS يمكن أن يحفز مستويات أعلى من الأجسام المضادة في الفئران المحصنة مقارنة بـ BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}} PEDVS، و BL 21- PEDVS الفئران المحصنة (الشكل 4).
الشكل 2: التحقق من بروتينات التعبير المؤتلف. M: علامة البروتين؛ 1: شكل البروتين الإفرازي المؤتلف L. casei pVE5523-OMP16-سلالة PEDVS؛ 2: البروتين المنقى من سلالة BL21- pET28a-OMP16- PEDVS؛ 3: البروتين المنقى من سلالة BL21-pET28a-PEDVS
مستويات الأجسام المضادة المعادلة في المصل في الفئران المحصنة
لتقييم التأثير الوقائي للقاحات المرشحة لـ L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS و BL21-PEDVS في الفئران، تم قياس مستويات الأجسام المضادة المعادلة. أظهرت النتائج أنه لم يتم اكتشاف أي جسم مضاد معادل قبل التحصين. تم اكتشاف الأجسام المضادة المحايدة بعد 14 يومًا من التحصين وزادت بعد 14 يومًا من التحصين المعزز. امتلكت استجابة الجسم المضاد في الفئران التي تلقت L. casei-OMP16-PEDVS نشاطًا أقوى لتحييد مضاد PEDV من ذلك الموجود في الفئران التي تم تناولها عن طريق الفم باستخدام BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS، وBL21-PEDVS. ولذلك، فإن اللقاح المرشح L. casei OMP16-PEDVS يمكن أن يحفز أعلى مستوى من الأجسام المضادة المعادلة، يليه BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}} PEDVS، و BL21- PEDVS (الشكل 5).
مستويات السيتوكين
لمقارنة مستوى الاستجابة المناعية الخلوية لـ L. casei-OMP16-PEDVS، BL21-OMP16-PEDVS-F، BL21- OMP16-PEDVS، وتم تحديد الفئران المحصنة BL21- PEDVS، IL- 4، IL-10، وIFN-، على التوالي. أظهرت النتائج أن مستويات السيتوكينات IL-4 و IL-10 و IFN- في أمصال الفئران كانت جميعها منخفضة للغاية ولم يكن هناك فرق كبير قبل التحصين. حيث لوحظت تغييرات مماثلة في نتائج IL-4 و IL-10 و IFN- . بعد 14 يومًا من التحصين، كان مستوى IL-4 وIL-10 وIFN- في الفئران المحصنة L. casei-OMP16-PEDVS أعلى من BL21- OMP 16- PEDVS F، BL 21- OMP 16- PEDVS، و BL 21- PEDVS الفئران المحصنة. بعد 14 يومًا من التحصين المعزز، تم اكتشاف مستوى أعلى من IL-4 وIL-10 وIFN- في الفئران المحصنة L. casei-OMP16- PEDVS مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الأخرى ثلاث مجموعات. ولذلك، فإن اللقاح المرشح L. casei-OMP16-PEDVS يمكن أن يحفز أعلى مستويات IL-4 وIL-10 وIFN-، يليها BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F، BL21-OMP16-PEDVS، وBL21-PEDVS (الشكل 6).
الشكل 3: مستويات الأجسام المضادة IgG للقاحات المرشحة في مصل الفئران المحصنة. تم جمع المصل في الأيام 0، و14، و28 يومًا قبل أو بعد فحص التحصين عبر مجموعات ELISA التجارية، وتم قياسه عند امتصاص قدره 450 نانومتر. تمثل الأشرطة الانحراف المعياري المتوسط لثلاث تجارب مستقلة. * p < 0.05، ** p < 0.01، و **** p < 0.0001 تمثل درجات متزايدة من الاختلافات المهمة، على التوالي، وns تعني عدم وجود فرق كبير
مناقشة
حدث تفشي واسع النطاق لـ PED الناجم عن متغيرات PEDV في أكتوبر 2010، مما أدى إلى خسائر اقتصادية هائلة في الصين وجميع أنحاء العالم [1]. ومع ذلك، تم تصميم جميع اللقاحات التقليدية بناءً على السلالة الكلاسيكية CV777 التي لا يمكنها توفير حماية كافية لمتغير PEDV [4]. وللسيطرة على انتشار فيروس PEDV وتقليل الخسائر الاقتصادية، تم أيضًا تصميم لقاحات جديدة لسلالات فيروس PEDV. في الوقت الحاضر، تمت الموافقة على لقاح PEDV المعطل واللقاح الموهن لسلالات PEDV المختلفة من قبل الحكومة الصينية، وتظهر جميعها آفاقًا واعدة في السيطرة على PED. لكن العيوب موجودة أيضًا في نوعي اللقاحات الجديدة. يصيب فيروس PEDV الخنازير عبر الجهاز الهضمي وله انتحاء الأنسجة المعوية. لذلك، تعد المناعة المخاطية أكثر فعالية من المناعة الجهازية في منع دخول فيروس PEDV إلى الخلايا الظهارية المعوية، ويجب أن توفر اللقاحات حماية الغشاء المخاطي بشكل فعال في القناة المعوية. لذلك، في هذه الدراسة، قمنا ببناء نوع جديد من اللقاح الذي يمكنه تحفيز الأجسام المضادة IgG وIgA الخاصة بـ PEDV. تحتوي Lactobacillus casei على خصائص تعديل مناعية محتملة كوسيلة لتوصيل اللقاح والتعبير عن المركبات النشطة بيولوجيًا على جدار الخلية لهذه البكتيريا يمكن أن يحفز الاستجابات المناعية المناسبة [28، 29]. ويستخدم على نطاق واسع للتعبير عن العديد من المستضدات غير المتجانسة لفيروس الورم الحليمي البشري، والالتهاب الرئوي العقدي، والإشريكية القولونية كلقاحات في النماذج الحيوانية، والتي أظهرت جميعها مناعة ممتازة [7-9]. بالمقارنة مع اللقاح المعطل واللقاح الموهن، يمكن للقاح ناقلات الملبنة المجبنة أيضًا تحفيز مستويات IgA الأعلى والاستجابة المناعية الخلوية. أظهرت الدراسات أن خط الدفاع الأول لـ IgA في الأمعاء سيكون أفضل من IgG في حماية الخنازير من عدوى PEDV [10، 30]. لذلك، من الواعد تطوير نوع من لقاح Lactobacillus casei الناقل لمرض PED. بناءً على التقارير، يمكن تقسيم بروتين S الخاص بـ PEDV إلى نطاقات S1 (1–735 حمض أميني) وS2 (736-آخر حمض أميني) [13]، ويتضمن بروتين S1 منطقة ربط المستقبلات و الحواتم المحايدة الرئيسية [14]. يمكن للحاتمة المعادلة الأساسية (COE) أن تحفز أجسامًا مضادة قوية تحييدًا ضد PEDV [31، 32]. بالاشتراك مع تحليل مولد الضد، تم اختيار تسلسل جزئي لجين S1 (1477-2124 سنة مضت) لبناء البلازميد المؤتلف. ثبت أن الجزء الصغير المختار ليس فقط يتمتع بقدرة مناعية جيدة ولكنه يساهم أيضًا في التعبير المفرز لبكتيريا Lactobacillus casei. من ناحية أخرى، وجد باسكيفيتش أن بروتين الغشاء الخارجي البروسيلا أبورتس 16 يمكن أن ينشط الخلايا الجذعية في الجسم الحي، ويحفز الاستجابة المناعية th1، وكان لقاحًا واعدًا ذاتيًا ضد داء البروسيلات المكتسب الجهازي والفموي [15]. بحث مماثل أن بروتين الغشاء الخارجي غير الدهني omp16 من Brucella spp. كما تم إثبات أن مساعد الأنف يمكن أن يحفز الاستجابة المناعية th1 ويعدل الاستجابة التحسسية th2 لبروتينات حليب البقر [16]. لذلك، تم اختيار تسلسل جزئي لجين omp16 لبناء البلازميد المؤتلف لتعزيز وظيفة المناعة في دراستنا. لمعرفة ما إذا كان اللقاح الجديد الموصى به لـ Lactobacillus casei يمكن أن يحفز استجابات مناعية خلطية، تم قياس مستويات IgG وIgA والأجسام المضادة المعادلة. لم يكن لمستوى الأجسام المضادة IgG للفئران المحصنة بلقاح المؤتلف L. casei-OMP16- PEDVS فرق كبير مع الفئران المحصنة بلقاح إعادة التركيب BL21-OMP16- PEDVS-F. ومع ذلك، كانت مستويات IgA والأجسام المضادة المعادلة أعلى من تلك الموجودة في BL21-OMP16-PEDVS-F، وBL21-OMP16-PEDV S، وBL{{47 }} فئران PEDVS المؤتلفة المجهزة باللقاح. أظهرت النتائج أن L. casei-OMP16-PEDVS يمكن أن يحفز استجابات مناعية خلطية أقوى، وخاصة مستويات الأجسام المضادة IgA. أظهرت الدراسات أن IgA هو خط الدفاع الأول في الأمعاء وسيكون أفضل من IgG في حماية الخنازير من عدوى PEDV [30]. أثبت البحث أيضًا أن اللقاح المؤتلف L. casei-OMP16-PEDVS يمكن أن يوفر حماية مناعية أفضل لـ PEDV. لاستكشاف نوع الاستجابة المناعية الناجمة عن المؤتلف L. casei-OMP16-PEDVS، تم اكتشاف مستويات IL-4 وIL-10 وIFN- لتقييم نشاط T الخلايا الليمفاوية. بناءً على التقرير، يلعب IFN- دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية الخلوية التي تحدث عندما تغزو مسببات الأمراض الجسم، ويلعب IL-4 دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية الخلطية وتعزيز التحمل المناعي والمناعة المخاطية [33]، IL يلعب -10 أدوارًا أساسية في مكافحة العدوى الميكروبية المخاطية والحفاظ على سلامة الحاجز المخاطي داخل الأمعاء [34]. وفي الوقت نفسه، أظهرت نتائج اكتشاف السيتوكين أن الفئران المحصنة بلقاح L. casei-OMP16- PEDVS المؤتلف يمكن أن تحفز تعبيرًا أقوى عن IL-4 وIL-10 وIFN-، والذي دعمت النتائج التي مفادها أن اللقاح المؤتلف L. casei-OMP16-PEDVS يمكن أن يحفز استجابة مناعية خلطية أقوى، ومستوى الأجسام المضادة IgA، والاستجابة المناعية الخلوية، على التوالي.
الشكل 5: مستويات الأجسام المضادة المعادلة للقاحات المرشحة في مصل الفئران المحصنة. تم جمع المصل في الأيام 0 و14 و28 يومًا قبل أو بعد التحصين وتم فحصه عن طريق اختبار التعادل. تمثل الأشرطة الانحراف المعياري المتوسط لثلاث تجارب مستقلة. * p < 0.05، ** p < 0.01، و **** p < 0.0001 تمثل درجات متزايدة من الاختلافات المهمة، على التوالي، و ns تعني عدم وجود اختلافات كبيرة اختلاف
الشكل 6. الكشف عن مستويات السيتوكين من مصل الفئران المحصنة. تم جمع المصل في الأيام 0 و14 و28 يومًا قبل أو بعد التحصين وتم فحصه عبر مجموعات ELISA التجارية. تم قياس قيمة الامتصاصية عند امتصاص قدره 45 0 نانومتر لـ IL-4 (a)، IL-10 (b)، وIFN- (c)، على التوالي. تمثل الأشرطة الانحراف المعياري المتوسط لثلاث تجارب مستقلة. * p < {{10}}.05، ** p < 0.01، و **** p < 0.0001 تمثل درجات متزايدة من الاختلافات المهمة، على التوالي
خاتمة
باختصار، L. casei-OMP16-PEDVS، BL21-OMP16- PEDVS-F، BL21-OMP16-PEDVS، و BL{{7 }}تم إنشاء اللقاحات المرشحة لـ PEDVS في هذه الدراسة. وفي الوقت نفسه، تم تقييم الاستجابة المناعية الخلطية ومستويات الاستجابة المناعية الخلوية لهذه اللقاحات المرشحة في الفئران. أظهرت النتائج أن الفئران المحصنة بـ L. casei-OMP16- PEDVS يمكن أن تنتج مستويات أعلى من IgG وIgA والأجسام المضادة المعادلة وIL-4 وIL- 10 وINF- مقارنةً بـ الفئران المحصنة باستخدام BL21-OMP16-PEDVS-F، وBL21-OMP16-PEDVS، وBL21-PEDVS. ولذلك، فإن اللقاح المرشح المؤتلف L. casei OMP16- PEDVS قد يمهد الطريق لتطوير لقاح مخاطي مؤتلف آمن وفعال ومريح للوقاية من عدوى PEDV.
cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي
مراجع
1. وانغ د، فانغ إل، إس إكس. إسهال وباء الخنازير في الصين. الدقة الفيروسية. 2016; 226: 7-13.
2. سويوشي إم، تسودا تي، يامازاكي كيه، يوشيدا كيه، ناكازاوا إم، ساتو كيه، وآخرون. دراسة هستوكيميائية مناعية للإسهال الوبائي الخنازير. ي شركات باثول. 199؛113(1):59–67.
3. صن آر كيو، كاي آر جيه، تشن واي كيو، ليانغ بي إس، سونغ سي إكسجيد. تفشي وباء الإسهال الخنازير في الخنازير المرضعة، الصين. ظهور العدوى ديس. 2012; 18(1):161–3.
4. Tong YE، Feng L، Li W. تطوير لقاح مخفف ثنائي المركب ضد فيروس التهاب المعدة والأمعاء المنقول وفيروس إسهال وباء الخنازير. الذقن J السابق الطبيب البيطري ميد. 199;21(6):35-9.
5. باولز بي إتش، لير آر جيه، بويرسما دبليو جيه. إمكانات Lactobacillus كحامل للتحصين عن طريق الفم: التطوير والتوصيف الأولي لأنظمة المتجهات للتوصيل المستهدف للمستضدات. ي بيوتكنول. 1996;44(1–3):183.
6. تساي واي تي، تشينج بي سي، بان تي إم. التكنولوجيا الحيوية: التأثيرات المناعية لبكتيريا حمض اللاكتيك لتحسين وظائف وفوائد المناعة. تطبيق ميكروبيول للتكنولوجيا الحيوية. 2012;96(4):853-62.
7. أداتشي ك، كوانا ك، يوكوياما تي، فوجي تي، توميو أ، ميورا إس، وآخرون. التحصين عن طريق الفم باستخدام لقاح الملبنة المجبنة الذي يعبر عن فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) من النوع 16 E7 هو استراتيجية فعالة للحث على الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا المخاطية ضد HPV16 E7. مصل. 2010;28(16):2810–7.
8. كامبوس آي بي، داريو إم، فيريرا دي إم، مياجي إن، سيلفا دا، آرياس إيه بي إم، وآخرون. التحصين الأنفي للفئران باستخدام الملبنة المجبنة التي تعبر عن البروتين السطحي للمكورات الرئوية A: تحريض الأجسام المضادة والترسب التكميلي والحماية الجزئية ضد تحدي العقدية الرئوية. تصيب الميكروبات. 2008;10(5):481–8.
9. ون إل جيه، هو إكس إل، وانغ جي إتش، يو لي، وي إكس إم، ليو جي كيه، وآخرون. التحصين باستخدام سلالات Lactobacillus casei المؤتلفة المنتجة لـ K99 والبروتين الخملي K88 يحمي الفئران من الإشريكية القولونية المسببة للذيفان المعوي. مصل. 2012;30(22): 3339–49.
10. قوه إم، يي إس، قوه واي، تشانغ إس، نيو جيه، وانغ كيه، وآخرون. بناء سلالة المكورات اللبنية المؤتلفة التي تعبر عن الجين المتغير لفيروس إسهال وباء الخنازير S1 وتحليل المناعة في الفئران. المناعي الفيروسي. 2019;32(3):144–50.
11. Wang X، Wang L، Zheng D. التحصين عن طريق الفم باستخدام لقاح فيروس الإسهال الوبائي المضاد للوباء الخنازير (PEDV) المستند إلى Lactobacillus casei والذي يعبر عن الببتيد Co1 الذي يستهدف الخلايا الدقيقة والمدمج مع مستضد COE الخاص بـ PEDV. ي أبل ميكروبيول. 2017;124(2):368–78.
12. Duarte M، Tobler K، Bridgen A، Rasschaert D، Ackermann M، HL. تحليل تسلسل جينوم فيروس إسهال وباء الخنازير بين جينات القفيصة النووية والبروتين الشوكي يكشف عن ORF متعدد الأشكال. علم الفيروسات. 199؛198(2):466.
13. Lee DK، Park CK، Kim SH، Lee C. عدم التجانس في جينات البروتين الشوكي لفيروسات إسهال وباء الخنازير المعزولة في كوريا. الدقة الفيروسية. 2010;149(2): 175-82.
14. صن دي بي، فنغ إل، شي إتش واي، تشن جي إف، ليو إس دبليو، تشن إتش واي، وآخرون. تعد منطقة البروتين الشوكي (aa 636789) لفيروس إسهال وباء الخنازير ضرورية لتحفيز الأجسام المضادة المعادلة. اكتا فيرول. 2007;51(3):149–56.
15. باسكيفيتش كا، جارسيا سامارتينو سي، كوريا إل إم، إيستاين إس إم، زويردلينج إيه، إيبانيز إيه إي، وآخرون. إن الجزء البروتيني لبروتين الغشاء الخارجي البروسيلا أبورتس 16 هو نمط جزيئي جديد مرتبط بمسببات الأمراض البكتيرية والذي ينشط الخلايا الجذعية في الجسم الحي، ويحفز الاستجابة المناعية Th1، وهو لقاح واعد ذاتي المساعدة ضد داء البروسيلات المكتسب الجهازي والفموي. ي إيمونول. 2010;184(9):5200.
16. إيبانيز AE، سمالديني P، كوريا LM، ديلبينو MV، باسيفيكو LGG، أوليفيرا SC، وآخرون. بروتين الغشاء الخارجي غير المصفى Omp16 (U-Omp16) من Brucella spp. حيث أن مساعد الأنف يحفز الاستجابة المناعية Th1 وينظم استجابة الحساسية Th2 لبروتينات حليب البقر. بلوس واحد. 2013;8(7):e69438.
17. باسكيفيتش كا، إيستين إس إم، سامارتينو سي جي، زويردلينج إيه، كوريا إل إم، باريونويفو بي، وآخرون. المناعة: التحصين باستخدام بروتين الغشاء الخارجي لأنواع البروسيلا المؤتلفة Omp16 أو Omp19 في المادة المساعدة يحفز خلايا CD4+ وCD8+ T محددة بالإضافة إلى الحماية الجهازية والفموية ضد عدوى البروسيلا المجهضة. تصيب المناعة. 200;77(1):436–45.
18. ما إس، وانغ إل، هوانغ إكس، وانغ إكس، تشن إس، شي دبليو، وآخرون. يستهدف لقاح Lactobacillus المؤتلف عن طريق الفم الخلايا الدقيقة المعوية والخلايا الجذعية لتوصيل الحاتمة المعادلة الأساسية لفيروس الإسهال الوبائي الخنازير. مصانع الخلايا الميكروبية. 2018;17(1):20.
19. Chu S، Zhang D، Wang D، Zhi Y، Zhou P. التعبير غير المتجانس والتوصيف الكيميائي الحيوي للنترات الاستيعابية ومختزل النتريت يكشف عن التكيف وإمكانات Bacillus megaterium NCT -2 في تربة التملح الثانوية. إنت J بيول ماكرومول. 2017;101:1019.
20. قوه إن، تشانغ بي، هو إتش، يي إس، تشن إف، لي زي، وآخرون. يمنع Caerin1.1 نمو فيروس إسهال وباء الخنازير في المختبر عن طريق الارتباط المباشر بالفيروس. الفيروسات. 2018;10:9.
21. Chen Z، Lin J، Ma C، Zhao S، She Q، Liang Y. التكنولوجيا الحيوية: توصيف pMC11، وهو بلازميد ذو أصول مزدوجة للتكرار معزول عن Lactobacillus casei MCJ وبناء ناقلات مكوكية مع كل نسخة متماثلة. تطبيق ميكروبيول للتكنولوجيا الحيوية. 2014;98(13):5977.
22. شياونا دبليو، لي دبليو، شيويوي إتش، سونيتنج إم، ميلينغ واي، وين إس، وآخرون. التسليم عن طريق الفم للبروبيوتيك الذي يعبر عن الببتيد المستهدف للخلايا الجذعية الممزوج بمستضد فيروس الإسهال الوبائي الخنازير COE: استراتيجية لقاح واعدة ضد PEDV. الفيروسات. 2017;9(11):312.
23. بهويان إيه إيه، ميمون آم، بهوييان إيه إيه، تشونغهوا إل، تشانغ بي، يي إس، وآخرون. بناء Lactobacillus casei المؤتلف الذي يعبر عن بروتين BVDV E2 واستجابته المناعية في الفئران. ي بيوتكنول. 2018;270:51–60.
24. Noi NV، Chung YCJB، Equipment B. تحسين التعبير وتنقية مجال S1 المؤتلف من بروتين فيروس إسهال وباء الخنازير (PEDV-S1) في الإشريكية القولونية. معدات التكنولوجيا الحيوية. 2017;31(2):1–11.
25. لي سي، لي دبليو، إيسارتي إي، جوو إتش، إلزين بي، آرتس إي، وآخرون. تعد مجالات ارتباط الخلايا بالبروتين الشوكي لفيروس إسهال وباء الخنازير أهدافًا رئيسية لتحييد الأجسام المضادة. جي فيرول. 2017;91(12):1–16.
26. ون زي، شو زي، تشو كيو، لي دبليو، وو واي، دو واي، وآخرون. أثار تناول الكريات المجهرية المطلية المحملة بـ PEDV عن طريق الفم مناعة خاصة بـ PEDV في الخنازير المفطومة. مصل. 2019;09(014):161–6.
27. Gao Q، Zhao S، Qin T، Yin Y، Yang Q. آثار فيروس الإسهال الوبائي الخنازير على الخلايا الجذعية المشتقة من خلية وحيدة الخنازير والخلايا الجذعية المعوية. الطبيب البيطري ميكروبيول. 2016;106:149–58.
28. Bonet MEB، Chaves AS، Mesón O. النشاط المناعي والمضاد للالتهابات الناجم عن تناوله عن طريق الفم لسلالة بروبيوتيك من العصيات اللبنية المجبنة. اشتعال. 2006;4(1):31-41.
29. Grangette C، Müller-Alouf H، Geoffroy MC، Goudercourt D، Turner M، Mercenier A. الحماية ضد توكسين الكزاز بعد إعطاء داخل المعدة لاثنين من بكتيريا حمض اللاكتيك المؤتلف: تأثير بقاء السلالة واستمرارها في الجسم الحي. مصل. 2002;20(27–28):3304–9.
30. سونغ دي إس، أوه جي إس، كانغ بي كيه، يانغ جي إس، مون إتش جيه، يو إتش إس، وآخرون. الفعالية الفموية لسلالة فيروس إسهال وباء الخنازير المخفف بخلايا فيرو DR13. الدقة العلوم البيطرية. 2007;82(1):134–40.
31. مكاديا إن، براونلي آر، جان في، بيروب إن، آلان بي، جيردتس في، وآخرون. مجال S1 من بروتين إسهال فيروس وباء الخنازير كمستضد لقاح. فيرول ج. 201؛13:1.
32. تشانغ إس إتش، باي جيه إل، كانغ تي جيه، جو كيه، تشونغ جي إتش، ليم سي دبليو، وآخرون. الخلايا: تحديد منطقة الحاتمة القادرة على تحفيز الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروس الإسهال الوبائي الخنازير. خلية مول. 2002;14(2): 295-9.
33. سومي تي، فوكوشيما أ، فوكودا ك، كوماجاي إن، نيشيدا تي، ياجيتا إتش، وآخرون. المساهمات التفاضلية لـ B7-1 و B7-2 في تطور التهاب الملتحمة التحسسي التجريبي الفئران. إيمونول ليت. 2007;108(1):62–7.
34. شيويه إم، تشاو جي، ينج إل، فو إف، لي إل، ما واي، وآخرون. يمنع IL-22 عدوى فيروسات كورونا المعوية الخنازيرية وفيروس الروتا عن طريق تنشيط مسار إشارة STAT3. برامج مكافحة الفيروسات الدقة. 2017;142:68–75.
