الحمض النووي خارج الفيروس في مستحضرات النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدد الصماء يستحث الاستجابات المناعية الفطرية المعتمدة على TLR9 في الخلايا الجذعية البلازمية البشرية

تختلف معلقات المتجهات الفيروسية المرتبطة بـ Adeno (AAV) المنتجة إما في خلايا HEK المشتقة من الإنسان أو في خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (Sf9) من حيث مكونات الخلية المضيفة المتبقية بالإضافة إلى تعديلات ما بعد الترجمة الخاصة بالأنواع المعروضة على بروتينات القفيصة AAV . هنا قمنا بتحليل تأثير هذه الاختلافات على الخواص المناعية للناقل. قمنا بتحفيز الخلايا الجذعية البلازمية البشرية مع الكثير من ناقلات AAVCMV-eGFP التي تنتجها خلايا HEK وخلايا Sf9 المستمدة من شركات مصنعة مختلفة. لقد وجدنا أن ناقلات AAV8-CMV-eGFP وكذلك AAV2-CMV-eGFP قد تسببت في استجابات السيتوكينات الالتهابية الخاصة بمنصة الإنتاج أو الخاصة بالشركة المصنعة. يمكن تقليلها أو إلغاؤها عن طريق منع إشارات المستقبلات المشابهة 9 أو عن طريق تقليل الحمض النووي إنزيميًا في مجموعات المتجهات باستخدام DNase. أظهر نجاح نقل خلايا HEK بواسطة مجموعات AAV المعالجة بـ DNase وتحليلات الحمض النووي أن DNase لم يؤثر على سلامة الناقل ولكنه أدى إلى تدهور الحمض النووي خارج الفيروس. نستنتج أن كلا من مستحضرات AAV المشتقة من خلايا HEK وSf9- يمكن أن تحتوي على مكونات DNA خارج الفيروسية المناعية والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابات مناعية التهابية محددة. يشير هذا إلى أن الاستراتيجيات المحسنة لإزالة شوائب الحمض النووي خارج الفيروس قد تكون مفيدة في تقليل الخصائص المناعية لمستحضرات ناقلات AAV.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

شهد العقد الماضي اهتمامًا هائلاً بتطوير استراتيجيات جديدة قائمة على الفيروسات الغدية المؤتلفة (AAV) لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات السريرية . السبب الرئيسي يكمن في حقيقة أن ناقلات AAV كانت أدوات متعددة الاستخدامات للغاية في مجال العلاج الجيني نظرًا لقدرتها على توصيل الجينات العلاجية بكفاءة وأمان إلى الأنسجة المستهدفة. ومع ذلك، فإن عددًا متزايدًا من الباحثين يبلغون بشكل مستقل عن نتائج تشير إلى استجابات مناعية محلية وجهازية بعد تسليم AAV في الدراسات ما قبل السريرية والسريرية.

لقد ثبت أن نواقل AAV تعمل على تنشيط مستقبلات التعرف على الأنماط المناعية الفطرية مثل المستقبلات الشبيهة (TLR)2 وTLR9 مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكينات الالتهابية والفيروسات من النوع الأول (IFN)9،10. تشمل المكونات المناعية لـ AAV التي قد تحفز هذه الاستجابات بروتينات القفيصة وجينوم النواقل9،10. قد يتم أيضًا تشغيل الاستجابات المناعية بعد تطبيق AAV بواسطة الشوائب الموجودة في تعليق المتجهات . تم تعريف هذه الشوائب على أنها أي مكون موجود في نظام التعليق المتجه AAV المنقى بخلاف المنتج المطلوب 12 وينتج عن عملية إنتاج الناقل. اثنين من الأساليب الرئيسية لإنتاج ناقلات AAV المؤتلفة السريرية تنطوي على ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد إلى خلايا HEK وإصابة خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (Sf9) بفيروس باكولوفيروس. وبناءً على ذلك، يمكن أن تشمل الشوائب المناعية المحتملة الموجودة في معلقات ناقلات AAV السموم الداخلية، ومكونات وسط زراعة الخلايا، والكواشف التي تستخدم لتنقية AAV، والبروتينات والحمض النووي المشتق من الخلايا المضيفة، والحمض النووي الفيروسي العصوي المتبقي أو DNA5 البلازميد. العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على مناعة معلقات ناقلات AAV هي تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) المطبوعة على القفيصة بواسطة منصات إنتاج ناقلات مختلفة. الأهم من ذلك، أن نواقل AAV المشتقة من خلايا HEK والمشتقة من خلايا Sf9 تختلف اختلافًا كبيرًا من حيث PTMs الخاصة بها، وشوائب بروتين الخلية المضيفة المتبقية، وربما أيضًا في شوائب الحمض النووي (DNA لخلية HEK مقابل DNA لخلية Sf9 بالإضافة إلى DNA البلازميد المتبقي). مقابل الحمض النووي الفيروسي)14. الخلايا الجذعية البلازمية (pCDs) هي نوع من الخلايا المناعية الفطرية المتخصصة التي تفرز كميات كبيرة من النوع الأول من الإنترفيرون والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات عند الالتهابات الفيروسية وتلعب دورًا رئيسيًا في استشعار نواقل AAV. وفقًا لذلك، لتحليل ما إذا كانت الاختلافات بين ناقلات AAV المنتجة لخلايا HEK وSf9- المنتجة للخلايا تؤدي إلى اختلافات في خصائصها المناعية، قمنا بتحفيز pDCs البشرية بكميات مختلفة من نفس ناقل AAV الذي تم الحصول عليه من نظامي الإنتاج والمصنعين المختلفة. لقد وجدنا أن نصف مجموعات النواقل التي تم فحصها أثارت استجابات مناعية مؤيدة للالتهابات خاصة بالمجموعة والتي لم تكن مرتبطة بنظام إنتاج النواقل ولا بالشركة المصنعة. تم التوسط في هذه الاستجابات بواسطة إشارات TLR9 وكانت عرضة لعلاج مجموعات المتجهات باستخدام DNase. اقترح نجاح نقل خلايا HEK من خلال كل من مجموعات ناقلات AAV غير المعالجة والمعالجة بـ DNase وتحليلات الحمض النووي لمستحضرات AAV أن DNase لم يؤثر على سلامة جسيمات AAV ولكنه استهدف بدلاً من ذلك الحمض النووي غير الفيروسي غير المغلف. بشكل جماعي، يشير هذا إلى أن مستحضرات ناقلات AAV يمكن أن تحتوي على DNA خارج الفيروس غير مغلف والذي يمكن أن يؤثر على الخواص المناعية لمستحضرات ناقلات AAV في pDCs البشرية.

فوائد cistanche tubulosa-تقوية جهاز المناعة

نتائج

يستحث AAV استجابات مناعية فطرية محددة في pDCs البشرية.

وقد أثبتت الدراسات أن ناقلات AAV المشتقة من خلايا HEK، والمشتقة من الخلايا Sf9، تختلف من حيث PTMs والشوائب الموجودة في المعلقات الفيروسية. لقد افترضنا أن هذه العوامل يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في الخواص المناعية بين مجموعات ناقلات الخلايا المشتقة من خلايا HEK وSf9. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتحليل ما مجموعه ثمانية ناقلات من النمط المصلي AAV 8 (AAV8) تحتوي على تسلسل الحمض النووي المتطابق لمروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) والجينات المعدلة المتطابقة لبروتين الفلورة الأخضر المعزز (eGFP) (AAV 8- CMV-eGFP، وخمس مجموعات مشتقة من خلايا HEK وثلاث مجموعات Sf9) وأربع مجموعات AAV2- CMV-eGFP (اثنتان من خلايا HEK ومجموعتان مشتقتان من خلايا Sf9) من ثلاث شركات مصنعة مختلفة [الشركة المصنعة أ؛ المنشأة الأساسية للنواقل الفيروسية التابعة لجامعة أيوا (آيوا، الولايات المتحدة الأمريكية)، الشركة المصنعة ب؛ Virovek (كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) والشركة المصنعة C؛ فيجين للعلوم البيولوجية (دكتوراه في الطب، الولايات المتحدة الأمريكية)]. لتعظيم أوجه التشابه بين القطع، تم إنتاج مجموعات AAV8 السبعة من الشركة المصنعة A والشركة المصنعة B (الجدول 1) باستخدام نفس البلازميد الأصلي. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تسجيل PCR رقمي للقطرة (ddPCR) لجينومات المتجهات (vg) لمجموعة ناقلات AAV في قياس جنبًا إلى جنب باستخدام هدفين مختلفين: أحدهما داخل تسلسل CMV والآخر داخل تسلسل eGFP لـ المتجهات. واستخدمت النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق القياس الكمي للهدف CMV لمعايرة الكثير ناقلات AAV في التجارب التالية (الجدول 1). pDCs عبارة عن أجهزة استشعار فيروسية متخصصة تنتج على نطاق واسع النوع الأول من IFNs عند الإصابة الفيروسية، بما في ذلك ناقلات AAV. لاستكشاف ما إذا كانت ناقلات AAV المنتجة لخلايا HEK وSf9- تختلف في قدرتها على استنباط الاستجابات المناعية الفطرية في الخلايا ذات الكفاءة المناعية، قمنا بتحفيز pDCs البشرية باستخدام مجموعات ناقلات AAV المذكورة أعلاه. تحقيقًا لهذه الغاية، تمت تنقية pDCs من خلايا الدم وحيدة النواة المحيطية (PBMCs) من المتبرعين البشريين الأصحاء عن طريق الاختيار السلبي باستخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسي (MACS). أكد تحليل التدفق الخلوي نقاء pDCs المعزولة بنسبة تزيد عن 90٪ (الشكل S1). عشرة، تم زرع بذور pDCs الخاصة بمتبرع فردي وتحفيزها باستخدام مجموعات ناقلات AAV8 وAAV2 عند MOI تبلغ 1:1 × 106 vg/cell لمدة 18 ساعة. يتم ترجمة MOI البالغ 1:106 vg/cell المطبق على إجمالي 12.500 خلية في 50 ميكرولتر/بئر إلى عيار 2.5×1011 vg/ml. استخدمنا هذا العيار لأنه يقع ضمن نطاق ما يتم تطبيقه في دراسات العلاج الجيني لشبكية العين لدى البشر (على سبيل المثال 1 × 1012 vg/ml16 أو 4 × 1011–1.3 × 1012 vg/ml17) والرئيسيات غير البشرية (على سبيل المثال 5 × 1011–5 × 1012 حجم/مل6). خدم التحفيز مع السيارة كعنصر تحكم. لم ينتج عن الحضانة مع الكثير من ناقلات AAV8 وAAV2 أي تعبير جيني قابل للاكتشاف في pDCs. ومع ذلك، أربعة من مجموعات AAV8 الثمانية (الدفعات A-HEK -1، A-HEK -2، A-HEK -3، A-Sf 9-1) واثنان من أربع مجموعات AAV2 (الكثير B-Sf 9-1، B-Sf 9-2) تسبب في تكاثر الخلايا التفاعلية في pDCs المحفزة (الشكل 1 أ). كان ذلك مصحوبًا بإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (IP-10 وMIP-1 وTNF-) والنوع I IFN (IFN-). على العكس من ذلك، لم يتم تحفيز تكاثر الخلايا أو إطلاق السيتوكينات بواسطة AAV8 المتبقي (الكثير A-Sf 9-1، B-HEK -1، B-Sf 9-1، C-HEK {{92}) }) وAAV2 الكثير (الدفعات C-HEK-1، C-HEK-2). تم تأكيد هذه النتائج في ثلاث إلى أربع تجارب مستقلة أجريت كل منها على خلايا متبرع فردي واحد (الشكل 1 أ-ج والجدول S1). تم تحليل الاختلافات الخاصة بالدفعة في تركيزات السيتوكينات في هذه التجارب المستقلة إحصائيًا باستخدام نموذج التأثير الخطي المختلط واختبار دونيت اللاحق (Q=2.6) من خلال مقارنة الوسائل المربعة الصغرى لمجموعات ناقلات AAV المختلفة مع التحكم في السيارة (الجدولان S2 وS3). أظهر هذا فروق ذات دلالة إحصائية في استجابات السيتوكينات بين مجموعات ناقلات AAV "المناعية" (AAV8 Lots A-HEK-1، A-HEK-2، A-HEK-3، A-Sf{ {114}}، أو AAV2 الكثير B-Sf9-1، B-Sf9-2 على التوالي) والتحكم ولكن لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات ناقلات AAV "غير المناعية" (AAV8 الكثير A-Sf{{ 123}}، B-HEK-1، B-Sf9-1، C-HEK-1 أو AAV2 الكثير C-HEK-1، C-HEK-2 على التوالي) والتحكم (الجدول S3). كانت تركيزات بقية السيتوكينات المقاسة المدرجة في اختبار تعدد الإرسال إما أقل من نطاق الفحص (على سبيل المثال، IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5) ، IL-6، IL-10، IL-12، IL-13، IL-17، GM-CSF، IFN- ) أو لا "مناعة" ولا تسببت مجموعات المتجهات "غير المناعية" في حدوث أي زيادات كبيرة في إطلاقها (على سبيل المثال، IL-7، IL-8، G-CSF، MCP-1) (الشكل S2)، مما يشير إلى درجة من الخصوصية في استجابة السيتوكينات بوساطة AAV. للتحقيق في استجابات السيتوكينات في نقطة زمنية سابقة، تم تحفيز pDCs باستخدام مجموعة ناقلات AAV8 "المناعية" A-HEK-1. لاحظنا زيادة كبيرة في تركيز TNF- في الطاف بالفعل عند ساعتين بعد تحفيز pDC. ويمكن تأكيد نمط الاستجابة هذا في ثلاث تجارب، أجريت كل منها باستخدام خلايا متبرع فردي واحد (الشكل S3). لاستكشاف ما إذا كانت جرعة أعلى من مجموعة ناقلات AAV8 "غير المناعية" قادرة على تحفيز استجابة مناعية، قمنا بتحفيز pDCs باستخدام الحد الأقصى من MOI المطبق تقنيًا (1: 4.61 × 106 vg). ومن المثير للاهتمام أنه لم يتم اكتشاف تكاثر الخلايا التفاعلية أو استجابات السيتوكينات عند التحفيز باستخدام هذا العيار المتزايد (الشكل S4). خلافًا لفرضيتنا، توضح هذه النتائج أن الاستجابات المناعية الفطرية لـ AAV في pDCs كانت خاصة بالكثير ولا تتعلق بنظام إنتاج محدد أو طريقة الشركة المصنعة/التنقية.

الجدول 1. الكثير من النواقل الفيروسية AAV8 وAAV2 المستخدمة في هذه الدراسة.

الشكل 1. تحريض الاستجابات المناعية الخاصة بناقلات AAV في pDCs البشرية. تم تحفيز pDCs البشرية باستخدام مجموعات مختلفة من AAV 8- CMV-eGFP و AAV 2- CMV-eGFP (MOI: 1: 1 × 106 vg) لمدة 18 ساعة (أ) صور تمثيلية مشرقة للمجال من pDCs محفزة باستخدام التحكم في السيارة (الصورة العلوية) أو مجموعة ناقلات AAV المناعية (الصورة السفلية). شريط النطاق هو 100 ميكرومتر. ( ب ) إطلاق السيتوكين لـ IP -10 و MIP -1 و TNF- و IFN - 2 بواسطة AAV 8- pDCs المحفزة. (C) إطلاق السيتوكين بواسطة AAV2-تحفيز pDCs. قطع تمثيلية لواحدة من ثلاث إلى أربع تجارب مستقلة. نظرًا لأنه في قياسات IFN- 2 (b,c) وقياس TNF- (c) انخفضت بعض القيم إلى ما دون نطاق الاختبار، تمت إضافة الثابت 1 إلى جميع قيم IFN- 2 وTNF- المقاسة للعرض في مؤامرة شبه لوغاريتمية. تظهر المتوسطات والنطاقات الربعية. في تسميات مجموعات المتجهات الفردية، يتم تمثيل الشركات المصنعة الثلاثة بالأحرف A وB وC؛ تتم الإشارة إلى المتجهات المشتقة من خلايا HEK وSf9- من الخلايا بواسطة "HEK و"Sf9" ويتم ترقيم المجموعات المقابلة من نفس الشركة المصنعة ونفس نظام الإنتاج "1، 2، 3". الدائرة: مشتقة من HEK مجموعة المتجهات؛ المثلث: Sf 9- مجموعة المتجهات المشتقة؛ أسود: مجموعة المتجهات من الشركة المصنعة A؛ البرتقالي: مجموعة المتجهات من الشركة المصنعة B؛ الأخضر: مجموعة المتجهات من الشركة المصنعة C.

لا تتأثر الاستجابة المناعية لتحفيز AAV في pDCs بالاختلافات في نسبة القفيصة/VG.

أظهرت الدراسات قبل السريرية أن الاختلافات في أعداد جزيئات المتجهات الكاملة والفارغة في معلقات ناقلات AAV يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية. من أجل تقييم ما إذا كانت الاختلافات في الخواص المناعية بين مجموعات المتجهات التي تم تحليلها ترجع إلى الاختلافات في نسبة جزيئات المتجهات الكاملة والفارغة، قمنا بتحديد عيار كبسولات المتجهات في جميع مجموعات AAV بواسطة معايرة ELISA لـ AAV وقمنا بحساب القفيصة/VG نسبة. ومن المثير للاهتمام أنه تم العثور على اختلافات كبيرة في نسبة القفيصة/vg بين جميع مجموعات AAV (الشكل 2). تم العثور على كبسولات أكثر بمرتين تقريبًا من vg (2:1) في AAV8-CMV-eGFP الكثير A-HEK-1، A-HEK-3، A-Sf{{11} } وAAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; وأربعة أضعاف (4:1) في دفعة AAV8 A-Sf9-1. ولوحظت نسبة 1:1 في بقية القطع. ومع ذلك، لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين نسب القفيصة/vg لمجموعة ناقلات AAV "المناعة" و"غير المناعية" في AAV8 (P=0.27) ولا في AAV2 (P=0.37) الكثير من المتجهات (الشكل 2). يشير هذا إلى أن الاختلافات في الخواص المناعية لمجموعات ناقلات AAV التي تم تحليلها لم تكن مرتبطة أيضًا بالاختلافات في نسبة جزيئات المتجهات الكاملة والفارغة.

فوائد ملحق cistanche-كيفية تقوية جهاز المناعة

التعرف على مجموعات ناقلات AAV8 "المناعية" بواسطة TLR9.

لقد ثبت أن التعرف المناعي الفطري على AAV بواسطة pDCs الفأرية والبشرية يتم بوساطة استشعار الحمض النووي TLR99. وفقًا لذلك، قمنا بتقييم ما إذا كان TLR9 قد شارك أيضًا في التعرف على مجموعات ناقلات AAV8 "المناعية" الخاصة بنا. تحقيقًا لهذه الغاية، تم زرع بذور pDCs كما هو موصوف ومثقف باستخدام خصم TLR9 H154 (50 ميكرومتر) متبوعًا بالتحفيز باستخدام مجموعات ناقلات AAV8 "المناعية" A-HEK-1، A-HEK-2، A -HEK-3، وA-Sf9-1 (وزارة الداخلية: 1:1× 106 vg). بعد 18 ساعة، لم يلاحظ أي دليل على تكاثر الخلايا (الشكل 3 أ) وتم قياس انخفاض كبير في إطلاق IP -10 وMIP -1 وTNF- وIFN- (الشكل 1 أ). 3 ب). يشير هذا إلى أن الاستجابات المناعية للكثير من ناقلات AAV8 "المناعية" في pDCs البشرية تتم بوساطة إشارات TLR9.

الشكل 2. مقارنة نسب القفيصة/vg بين مجموعات ناقلات AAV8-CMV-eGFP وAAV2-المختلفة. نسب Te capsid / vg مستمدة من قياسات الامتصاص (ELISA) ونتائج ddPCR لـ (أ) ثمانية ناقلات AAV8 و (ب) أربع مجموعات متجهة AAV2. تفصل الخطوط المتقطعة بين مجموعات ناقلات AAV "المناعة" و"غير المناعية". تشير الأشرطة إلى الوسائل والانحرافات المعيارية للتكرارات. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار الطالب غير المقيَّم.

الشكل 3. التعرف على مجموعات ناقلات AAV 8- CMV-eGFP "المناعية" بواسطة pDCs يعتمد على TLR9. تمت معالجة pDCs البشرية باستخدام خصم TLR9 H154 (50 ميكرومتر) متبوعًا بالتحفيز باستخدام مجموعات ناقلات AAV8 "المناعية" (MOI: 1:1× 106 vg) لمدة 18 ساعة. (أ) صور ميدانية تمثيلية مشرقة لوحدات pDC المنقية المعالجة بكميات ناقلات AAV "المناعة" (الصورة العلوية) أو مجموعات ناقلات AAV "المناعة" وH154 (الصورة السفلية). شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. ( ب ) إطلاق السيتوكين لـ IP -10 و MIP -1 و TNF- و IFN - 2 بواسطة pDCs المحفزة. نظرًا لأن بعض القيم في قياسات IFN- 2 تقع تحت نطاق الاختبار، تمت إضافة الثابت 1 إلى جميع قيم IFN- 2 المقاسة للعرض في مخطط شبه لوغاريتمي. تظهر الوسائل والانحرافات المعيارية. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام تحليل ANOVA أحادي الاتجاه وتحليل Holm-Sidak اللاحق. قيم P: أقل من أو يساوي 0.05: *; أقل من أو يساوي 0.01: **؛ أقل من أو يساوي 0.001: ***.

يقلل علاج DNase من الاستجابات المناعية لمجموعات ناقلات AAV8 وAAV2 "المناعية".

في حين أثارت ناقلات AAV8 "المناعية" استجابة مناعية تعتمد على TLR9-في الخلايا pDC، لم يتم تحفيز مثل هذه الاستجابات بواسطة المجموعات "غير المناعية". يتم تنشيط TLR9 استجابة للحمض النووي، وخاصة الحمض النووي الذي يحتوي على عناصر CpG غير الميثيلية9. الأهم من ذلك، أن قياسات ddPCR الخاصة بنا أكدت أن نفس مكونات الحمض النووي الفيروسي كانت موجودة في كل من ناقلات الأمراض "المناعة" و"غير المناعية". بشكل جماعي، يشير هذا إلى أن الحمض النووي غير المعبأ/الحر في المعلق الفيروسي بدلاً من الحمض النووي داخل الفيروس يمكن أن يكون العامل المسبب للاستجابات المناعية المرصودة للكثير من ناقلات AAV "المناعية". ومن ثم، إذا كان الحمض النووي الحر المتبقي موجودًا في التعليق الفيروسي لمجموعات ناقلات AAV8 "المناعية"، فيجب تخفيف الاستجابة المناعية الفطرية بواسطة DNase. لاختبار هذه الفرضية، تمت معالجة الكثير من ناقلات AAV8 وAAV2 "المناعية" باستخدام DNase I (100 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة قبل تحفيز AAV. لاستبعاد التأثيرات غير المحددة لعلاج DNase على pDCs أو جزيئات AAV، في تحفيزات AAV فقط، تعرضت المتجهات لعلاج DNasemock قبل تحفيز pDC. في هذه العلاجات الوهمية بدون DNase، تم تحضين جزيئات AAV عند 37 درجة في وسط هضم DNase متطابق لنفس الفترة الزمنية مثل AAVs المعالجة بـ DNase. عشرة ، تم زرع بذور pDCs وتحفيزها باستخدام مجموعات ناقلات AAV "المناعة" المعالجة مسبقًا أو المعالجة الوهمية لـ DNase (MOI: 1: 1 × 106 vg). كانت pDCs التي تم احتضانها باستخدام DNase فقط أو تمت معالجتها بطريقة صورية باستخدام مركبة بمثابة عناصر تحكم. ومن المثير للاهتمام، أن معالجة DNase لمجموعات ناقلات AAV8 وAAV2 "المناعية" قللت من تكاثر الخلايا التفاعلية (الشكل 4 أ) وتم إلغاؤها بالكامل (AAV8 الكثير A-HEK-2 وA-Sf9-1؛ الكثير AAV2 B-Sf9-1 وB-Sf9-2) أو تم تقليلها بشكل كبير (AAV8 الكثير A-HEK-1 وA-HEK-3) إصدار IP{{40} } و MIP -1 و TNF- و IFN- بعد تحفيز AAV (الشكل 4 ب، ج). للتأكد من أن تأثير DNase المرصود كان ناجمًا بالفعل عن هضم الحمض النووي خارج الفيروس وليس عن طريق تأثير DNase على سلامة الناقل، قمنا بالتحقق مما إذا كان علاج DNase لعدد ناقلات AAV يؤثر على قدرة نقل AAV. وبما أن تطبيق AAV لم ينتج عنه أي نقل pDC يمكن اكتشافه، فقد تم استخدام خلايا HEK لهذه المقايسات حيث أن خلايا HEK هي نموذج خلية معروف لتحليل كفاءة النقل عند نقل AAV. قمنا بتحفيز خلايا HEK293T باستخدام مجموعات ناقلات AAV8 و AAV2 المعالجة بـ DNase والمعالجة بشكل صوري (MOI: 1: 8 × 104 vg) وقمنا بتقييم كفاءة النقل بواسطة الفحص المجهري الفلوري بعد 3 أيام من تطبيق المتجهات. كما هو موضح، أظهرت ناقلات AAV2 فعالية تحويل أعلى مقارنة بنواقل AAV8. الأهم من ذلك، علاوة على ذلك، أن المعالجة المسبقة باستخدام DNase لم تقلل من كفاءة النقل في الخلايا المشتقة من HEK ولا في مجموعات ناقلات AAV8 وAAV2 المشتقة من الخلايا Sf 9- (الشكل S5a، b). توفر هذه النتائج دليلًا إضافيًا على أن تأثير DNase على الخواص المناعية لمجموعات المتجهات يرجع إلى تدهور الحمض النووي خارج الفيروس. على الرغم من أن خصم TLR9 H154 ألغى بشكل أساسي إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات لجميع مجموعات AAV8 الأربعة المناعية (الشكل 3)، إلا أن المعالجة المسبقة لـ DNase يمكن أيضًا أن تقضي على استجابة السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في مجموعات AAV8 A-HEK{{75} } وA-Sf9-1، بينما لم تتم إزالته بالكامل بالنسبة لـ AAV8 الكثير A-HEK-1 وA-HEK-3 (الشكل 4). لاختبار ما إذا كان وقت معالجة DNase المتزايد يمكن أن يلغي استجابة السيتوكين هذه، كررنا تجارب محاكاة pDCs بعد زيادة عشرة أضعاف في وقت حضانة DNase للدفعات المعنية (A-HEK-1 وA-HEK{{87}) }). لاحظنا أنه بعد علاج DNase للناقلات لمدة 5 ساعات، انخفض متوسط ​​تركيزات السيتوكينات في طاف الخلايا المحفزة بـ AAV بحيث لم تعد مختلفة بشكل كبير عن تلك الخاصة بالتحكم في السيارة. ويمكن تأكيد نمط الاستجابة هذا في ثلاث تجارب، أجريت كل منها باستخدام خلايا متبرع فردي واحد (الشكل S6). يشير هذا إلى أن السبب الرئيسي للاستجابة المناعية المؤيدة للالتهابات التي تعتمد على TLR9-في الخلايا الجذعية السرطانية هو بالفعل الحمض النووي خارج الفيروس. من أجل اختبار ما إذا كان إطلاق الحمض النووي داخل الفيروس يزيد من نشاط التحفيز المناعي لنواقل AAV، قمنا عمدا بفتح الكبسولات الفيروسية لمجموعة AAV8 "المناعية" A-HEK-1 عن طريق المعالجة الحرارية عند 95 درجة لمدة 10 دقائق . ثم تم استخدام مجموعة المتجهات المعالجة بالحرارة لتحفيز pDCs. على الرغم من عدم وجود اختلافات في تكاثر الخلايا التفاعلية عند تحفيز AAV8 الكثير A-HEK-1 مع المعالجة الحرارية وبدونها، كانت هناك زيادة كبيرة في إطلاق IP-10 وMIP-1 ، TNF- و IFN- في حالة المعالجة الساخنة، مما يشير إلى أن إطلاق الحمض النووي الفيروسي المغلف في تعليق الناقل يمكن أن يساهم في تحفيز الاستجابات المناعية (الشكل 5). تشير هذه البيانات معًا إلى أن مستحضرات ناقل AAV قد تحتوي على ملوثات الحمض النووي خارج الفيروس والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابات مناعية محددة في pDCs. يتم التوسط في هذه الاستجابات بواسطة إشارات TLR9 ويمكن تقليلها/إلغاؤها عن طريق معالجة مجموعات المتجهات باستخدام DNase.

الشكل 4. المعالجة المسبقة للـ DNase تقلل من الاستجابات المناعية الناجمة عن الكثير من ناقلات AAV 8- CMV-eGFP وAAV 2- CMV-eGFP. تم تحفيز pDCs البشرية باستخدام مجموعات ناقلات AAV8 "المناعة" المعالجة بـ DNase لمدة 18 ساعة (MOI: 1:1 × 1 06 vg). ( أ ) صور تمثيلية مشرقة للمجال pDCs المنقى المحفزة باستخدام مجموعات ناقلات AAV "المناعة" (الصورة العلوية) ومجموعة ناقلات AAV "المناعية" المعالجة مسبقًا بـ 1{{30}}0 ميكروغرام / مل من DNase أنا (الصورة السفلية). شريط النطاق هو 500 ميكرومتر. ( ب ) إطلاق السيتوكين لـ IP -10 و MIP -1 و TNF- و IFN - 2 بواسطة AAV 8- pDCs المحفزة. (ج) إطلاق السيتوكين بواسطة AAV2-المحفز pDCs. نظرًا لأنه في قياسات IFN- 2 (b وc) وقياس TNF- (b)، انخفضت بعض القيم إلى ما دون نطاق الاختبار، تمت إضافة الثابت 1 إلى جميع قيم IFN- 2 وTNF- المقاسة لـ العرض في مؤامرة شبه لوغاريتمية. تظهر الوسائل والانحرافات المعيارية. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام تحليل ANOVA أحادي الاتجاه وتحليل Holm-Sidak اللاحق. قيم P: أقل من أو يساوي 0.05: *; أقل من أو يساوي 0.01: **؛ أقل من أو يساوي 0.001: ***.

التحليل الاستكشافي لملوثات الحمض النووي خارج الفيروس في مستحضرات ناقلات AAV8.

لإجراء التوصيف الاستكشافي الأول لمكونات الحمض النووي خارج الفيروس في مجموعات ناقلات AAV، تم تمثيل "مناعي" (A-HEK-1) و"غير مناعي" (B-HEK-1) تم تحليل مجموعة المتجهات المشتقة من خلايا HEK. تمت معالجة هذه الدفعات إما بـ DNase في وسط pDC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة كما هو موضح أعلاه، أو تمت معالجتها بشكل وهمي وترشيحها بشكل فائق باستخدام جهاز ترشيح مقطوع بقدرة 100 كيلو دالتون، أو تمت معالجتها بشكل وهمي فقط (الشكل S7a-). ز). كشف فصل وتقييم Bioanalyzer LabChip المتتالي للحمض النووي المنقى عن وجود كميات مماثلة من الحمض النووي المتجه (الشكل S7b-g) في العينات المعالجة والمعالجة الصورية لكل دفعة مما يؤكد عدم تأثير الترشيح الفائق أو معالجة DNase على محتوى الحمض النووي داخل القفيصة. بالإضافة إلى ذلك، فقد أظهر أن المجموعة الناقلة "المناعة" فقط (الشكل S7a-d) وليس المجموعة الناقلة "غير المناعية" (الشكل S7a,e-g) تحتوي على جزيئات DNA إضافية تتراوح في الحجم من 100 إلى 450 نقطة أساس (الشكل S7c وd وh). الأهم من ذلك أنه يمكن اكتشاف جزيئات الحمض النووي الإضافية هذه في العينة المعالجة الصورية والعينة فائقة الترشيح ولكنها كانت غائبة فعليًا في العينة المعالجة بـ DNase (الشكل S7a-d). يشير هذا إلى أن جزيئات الحمض النووي هذه تمثل ملوثات الحمض النووي خارج الفيروس والتي يمكن أن تتحلل بواسطة DNase ولكن لا يمكن إزالتها من تعليق الناقل عن طريق الترشيح الفائق. إن التمويل القائل بأن هذه الملوثات لا يمكن اكتشافها إلا في المجموعة الناقلة "المناعة" ولكن ليس في المجموعة الناقلة "غير المناعية" يثبت أن وجود جزيئات الحمض النووي خارج الفيروس هذه محدد وقد يشير بالإضافة إلى ذلك إلى أن هذه الجزيئات تحفز أو تساهم لخصائص التحفيز المناعي للناقل. لتقييم المصدر المحتمل للحمض النووي الملوث في "المناعي" (A-HEK -1) و"غير المناعي" (B-HEK -1) الكثير من التحليل الكمي (q) PCR لـ HEK تم إجراء الحمض النووي للخلية، والحمض النووي البلازميد، والحمض النووي المتجه AAV. تم استخدام قالب الحمض النووي من عينات DNase المعالجة والمعالجة الصورية والمرشحة للغاية والمعالجة الصورية فقط من كل دفعة لتضخيم تكرار Alu وجين NPIP المتعدد النسخ للجينوم النووي وتسلسل جينات الرنا الريباسي 16S للميتوكوندريا (mt16S) من أصل خلية HEK ، لتضخيم amplicon لتكرار amplicon الطرفي المقلوب AAV8 (ITR2 ؛ أصل الحمض النووي البلازميد المتجه والمتحول) ، ولتضخيم amplicon لجين blah (مقاومة الأمبيسلين) (Amp ؛ أصل DNA البلازميد) (الجدول S4). مقارنة نسب قيم ΔCt لخلايا HEK DNA الخاصة بـ amplicon مقابل ITR2 amplicon (أي Alu مقابل ITR2، NPIP مقابل ITR2، وmt16S مقابل ITR2) وamplicon البلازميد DNA الخاص مقابل ITR2 amplicon (Amp مقابل ITR2)، على التوالي، يشير إلى أن القطعتين تحتويان على كميات ضئيلة من الحمض النووي لخلايا HEK النووية والميتوكوندريا. في المقابل، كشف التحليل عن كمية لا بأس بها من الحمض النووي البلازميد في كل من مجموعة المتجهات "المناعة" و"غير المناعية" (حوالي 1/32 و1/50، على التوالي، من حيث عدد النسخ بالنسبة إلى DNA AAV)، وهي نسبة تقع ضمن نطاق القيم المُبلغ عنها لمتجهات AAV الأخرى (الشكل S7). ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق واضحة في النسبة النسبية للحمض النووي المتجه إلى DNA البلازميد وخلايا HEK بين العينات المعالجة بـ DNase والمعالجة الصورية أو الترشيح الفائق والمعالجة الصورية لكلا المجموعتين المتجهتين (الشكل S8). قد يشير هذا إلى أن الحمض النووي الملوث غير المعبأ يشبه في تكوين التسلسل المستهدف تكوين الحمض النووي المعبأ. ومع ذلك، فإن أحد القيود على تحليل qPCR هو حجم الحمض النووي الملوث (100-450 نقطة أساس) والذي سيحتوي على جزء لائق من الأجزاء ذات التسلسل المستهدف غير الكامل.

الشكل 5. إن إطلاق الحمض النووي داخل الفيروس عن طريق المعالجة الحرارية للنواقل يعزز استجابات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في pDCs. إطلاق السيتوكين لـ IP-10 وMIP-1 وTNF- وIFN- 2 بواسطة pDCs لمدة 18 ساعة بعد التحفيز باستخدام مجموعة AAV8 المعالجة بالحرارة A-HEK-1 (وزارة الداخلية: 1:1× 106 vg). تشير الخطوط الأفقية إلى الوسائل والانحرافات المعيارية. تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين استجابات السيتوكينات الناجمة عن ناقلات المعالجة بالحرارة وغير المعالجة باستخدام اختبار الطالب. قيمة P: أقل من أو يساوي 0.01: **; أقل من أو يساوي 0.001: ***.

مناقشة

تعد ناقلات AAV واحدة من أكثر الأدوات الواعدة في العلاج الجيني. ومع ذلك، فإن الأدلة المتراكمة تتحدى الرأي القائل بأن المناعة لدى AAV لا تذكر. في ضوء ذلك، أصبح من المهم بشكل متزايد فهم الآليات التي تحدث من خلالها الاستجابات المناعية لفيروس AAV. نوضح في هذه الدراسة أن (1) AAV8 وAAV2 يحفزان استجابات مناعية فطرية محددة في pDCs البشرية والتي ليست خاصة بنسبة القفيصة/vg ولا منصة الإنتاج ولا طريقة الشركة المصنعة/التنقية؛ (2) تعتمد الاستجابات المناعية الفطرية في pDCs على إشارات TLR9 ويمكن تقليلها عن طريق المعالجة المسبقة باستخدام DNase؛ (3) لا يؤثر علاج DNase على سلامة الجسيم المتجه لأنه لا يقلل من معدل نقل مجموعات ناقلات AAV8 وAAV2 في خلايا HEK293T؛ و(4) يمكن أن تشتمل مجموعات ناقلات AAV على جزيئات DNA خارج الفيروس والتي يمكن إزالتها عن طريق معالجة مجموعة المتجهات باستخدام DNase. يشير هذا إلى أن مستحضرات AAV المشتقة من خلايا HEK وSf9- يمكن أن تحتوي على شوائب الحمض النووي خارج الفيروس التي تحفز الاستجابة المناعية الفطرية. في دراسة حديثة، تم إجراء تحليل مقارن باستخدام ناقلات AAV من مختلف أنواع الخلايا المضيفة (خلايا HEK وخلايا Sf9)11. وجد الباحثون أن النواقل المشتقة من HEK وSf9-تختلف من حيث PTMs وشوائب بروتين الخلية المضيفة المتبقية في جميع الأنماط المصلية AAV والشركات المصنعة التي اختبروها. علاوة على ذلك، قاموا بتحليل استجابة السيتوكينات للخلايا الليفية البشرية الأولية لنقل AAV ووجدوا أن النواقل المشتقة من HEK وSf9- قد تختلف في خصائصها المناعية. في دراستنا، قمنا أيضًا بمقارنة نظامي الإنتاج الرئيسيين هذين باستخدام مجموعات مختلفة من نفس بنية AAV من شركات مصنعة مختلفة ونوعين مصليين مختلفين. ومع ذلك، فإن الاستجابات المناعية الناجمة عن ناقلات الأمراض التي لاحظناها في نموذج pDC البشري الخاص بنا لم تكن مرتبطة على وجه التحديد بنظام إنتاج أو مصنع أو نمط مصلي معين، بل كانت محددة كثيرًا. أفادت الدراسات السابقة قبل السريرية والسريرية للعلاج الجيني لشبكية العين أن الاستجابات المناعية لنواقل AAV، مثل التهاب العين أو تسلل الخلايا المناعية، قد تتأثر بالاختلافات في نسب القفيصة/vg أو اختلافات الجرعة. أظهر تيمرز وآخرون 18 أن إزالة كبسولات AAV الفارغة من المعلق الفيروسي قللت من الالتهاب وحسّنت انتقال الفيروس في دراسة ما قبل السريرية على الرئيسيات غير البشرية. ومع ذلك، أظهرت نتائجنا أن نسب القفيصة/vg المرتفعة كانت موجودة بين كل من مجموعات ناقلات AAV "المناعة" و"غير المناعية"، مما يعني أن العدد الأكبر من الكبسولات (الكبسولات الفارغة) في المعلق الفيروسي لم يكن مسؤولاً عن تحريض الكبسولات. الاستجابات المناعية الخاصة بناقلات الأمراض في نموذج pDC البشري لدينا. علاوة على ذلك، فقد أظهرنا سابقًا أن AAV8 يحفز الاستجابات المناعية بطريقة تعتمد على الجرعة لدى الرئيسيات غير البشرية. ومع ذلك، فإن زيادة جرعة نواقل AAV "غير المناعية" في هذه الدراسة لم تكن كافية لتحفيز الاستجابة المناعية في pDCs البشرية. لذلك، لفهم سبب الاختلافات في الخواص المناعية للناقلات، قمنا بدراسة الآلية المستخدمة في التعرف على مجموعات AAV "المناعية". إن استخدام نماذج الخلايا ذات الكفاءة المناعية في المختبر قد سمح للعلماء بدراسة دور مسارات TLR في الاستجابات المناعية الفطرية الناتجة عن ناقلات AAV9،10 بدقة أكبر. وصف Zhu et al.9frst أن pDCs، ولكن ليس DCs التقليدية أو غير pDCs، تطلق كميات كبيرة من النوع I IFN والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات استجابةً لتحفيز AAV وأثبتت تورط مسار TLR9 في التعرف على AAV8 وAAV2 باستخدام pDCs الماوس. لاحظ المؤلفون أيضًا أن AAV2 يُحدث استجابات مناعية تعتمد على TLR9-في الخلايا pDC البشرية. في دراستنا، باستخدام أحد مضادات TLR9 الأكثر تحديدًا، H1549,21–24، أظهرنا بشكل غير مباشر أنه ليس فقط AAV2، ولكن أيضًا ناقلات AAV8 تحفز الاستجابات المناعية الفطرية المعتمدة على TLR9- في pDCs البشرية، ولكن بطريقة محددة كثيرًا. نظرًا لأن TLR9 هو مستقبل الحمض النووي، فإن هذا يشير إلى أن الاستجابات المناعية للكثير من ناقلات AAV "المناعية" كانت ناجمة عن مكونات الحمض النووي. ومع ذلك، على الرغم من أن قياسات ddPCR الخاصة بنا قد أكدت أن نفس مكونات الحمض النووي المعبأة كانت موجودة في كل من مجموعات المتجهات "المناعة" و"غير المناعية"، فإن المجموعات "غير المناعية" لم تثير استجابات مناعية في pDCs. بالإضافة إلى ذلك، أدى علاج DNase إما إلى تقليل أو إلغاء خصائص التحفيز المناعي لمجموعة ناقلات AAV "المناعية"، لكنه لم يقلل من فعالية نقل هذه النواقل في خلايا HEK، مما يشير إلى أن علاج DNase لـ AAV استهدف الحمض النووي خارج الفيروس غير المغلف في تعليق الناقل ولكنه لم يؤثر على سلامة الجينوم الناقل داخل القفيصة السليمة. تم تأكيد ذلك أيضًا من خلال تحليلات الحمض النووي المقارنة لعدد ناقلات المتجهات "المناعة" و"غير المناعية" المعالجة بالـ DNase والمعاملة الصورية.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

بشكل جماعي، تشير كل هذه التجارب إلى أن الاستجابة المناعية لمجموعات المتجهات "المناعية" في pDCs لم يتم تنسيقها بواسطة الحمض النووي الموجود في جزيئات AAV (أي الجينوم المتجه أو شوائب الحمض النووي المحتملة المعبأة في كبسولات AAV) ولكن عن طريق الحمض النووي خارج الفيروس الذي يمكن الوصول إليه المكونات الموجودة في المعلقات الفيروسية (أي الحمض النووي خارج أو غير محمي بواسطة القفيصة الفيروسية). لاحظنا أيضًا أنه عندما تم تعريض الحمض النووي الموجود في الكبسولات الفيروسية لمجموعة ناقلات "مناعية" للخلايا عن طريق المعالجة الحرارية للناقل، كانت هناك زيادة في الاستجابة المناعية. ليس من الواضح ما إذا كانت الزيادة في نشاط التحفيز المناعي بعد فتح الكبسولات ترجع إلى الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل للناقل أو بسبب الشوائب المحتملة المعبأة في كبسولات AAV مثل الأحماض النووية المتبقية للخلية المضيفة، وتسلسل الحمض النووي المساعد المتبقي، وتسلسل العمود الفقري الأجزاء المعبأة مع الكاسيت أو التحضير العكسي من ITRs مما يؤدي إلى أجزاء صغيرة من العمود الفقري معبأة في AAV12،25. لا تزال الآلية الدقيقة لاستيعاب الحمض النووي خارج الفيروس بواسطة pDCs غير معروفة. توضح استجابة pDCs لأليغنوكليوتيدات CpG أن pDCs يمكن أن تتفاعل مع DNA26 الحر. يشير هذا إلى أن الاستجابة المناعية في pDCs قد تكون ناجمة عن امتصاص الحمض النووي الملوث الحر الموجود في تعليق الناقل. بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أن pDCs يمكن أن تتناول نواقل AAV27 مما يشير بدلاً من ذلك إلى إمكانية نقل الحمض النووي المرتبط بالقفيصة إلى الخلية أثناء امتصاص جزيئات AAV. يمكن أن يكون وجود تلوث الحمض النووي خارج الفيروس في مستحضرات ناقلات AAV إما خاصية متأصلة في مجموعة المتجهات المعنية الناتجة عن عملية إنتاج وتنقية النواقل، أو قد يكون بسبب إطلاق الحمض النووي المغلف بسبب ظروف التخزين غير المناسبة . تم الحصول على جميع مجموعات المتجهات التي تم فحصها في هذه التجارب خلال نفس الفترة الزمنية (5 من 8 مجموعات ناقلات AAV8 التي تم فحصها، منها اثنتان كانتا "مناعية" (A-HEK-2; A-HEK-3) وثلاثة كانت "غير مناعية" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) تم إنتاجها بالتوازي خصيصًا لهذه الدراسة)، والدفعات من تم شحن كل مصنع في نفس صناديق النقل، وعند الاستلام، تم تخزين جميع الدفعات جنبًا إلى جنب في نفس درج الفريزر المحمي بإنذار درجة الحرارة -80 درجة قبل إذابة قسامات جميع الدفعات في وقت واحد وتطبيقها على وحدات pDC في التجارب جنبا إلى جنب. يشير هذا بقوة إلى أن عملية إنتاج وتنقية AAV، وليس التخزين غير المناسب، كانت مسؤولة عن الاختلافات في محتوى الحمض النووي خارج الفيروس وخصائص التحفيز المناعي لهذه الدفعات. في الماضي، لم يعد مسموحًا بدفع ناقلات AAV من الدرجة السريرية المنتجة للعلاج الجيني (alipogene Tiparvovec، Glybera) بسبب وجود كميات كبيرة من الشوائب بما في ذلك الخلية المضيفة المتبقية التي يحتمل أن تكون مناعية DNA28. عادةً ما يتم إجراء إزالة شوائب الحمض النووي من المعلقات الفيروسية أثناء عملية الإنتاج. هنا يتم تطبيق علاج Benzonase29 أو DNase30 بشكل روتيني من أجل إزالة الحمض النووي المتبقي من التعليق الفيروسي النهائي. يستمر هذا العلاج، اعتمادًا على البروتوكول، ما بين 30 دقيقة و3 ساعات ثم يتم تعطيل الإنزيم بواسطة مواد كيميائية مثل أملاح كلوريد السيزيوم. في تجاربنا، تم العثور على أربع من مجموعات AAV8 الخمسة المستمدة من المنشأة الأساسية لناقلات الفيروسات بجامعة أيوا، وكلا مجموعة ناقلات AAV2 من Virovek لتكون مناعة في pDCs. كما هو موضح في قسم "المواد والأساليب"، فإن عملية تنقية كميات المتجهات من كلا المصنعين تتضمن عدة خطوات تنقية، بعضها يختلف بشكل كبير عن بعضها البعض. وبالتالي، فإن عملية التنقية في المنشأة الأساسية في ولاية أيوا تشمل معالجة توربونوكلياز، يليها الطرد المركزي الفائق المتدرج لليوديكسانول، وكروماتوغرافيا عمود التبادل الأنيوني، وتعقيم الرفرفة، والتبادل العازل باستخدام مرشحات الطرد المركزي. في المقابل، يطبق فيروفيك علاج البنزوناز، والطرد المركزي الفائق في CsCl متبوعًا بتحلية المياه وتعقيم المرشح. من ناحية أخرى، لا تشتمل عملية تنقية Vigene على معالجة DNase، ولكن، كما يتم استخدامها من قبل Core Facility في ولاية أيوا، تتضمن الطرد المركزي الفائق المتدرج لليوديكسانول. ومع ذلك، من المثير للدهشة أن أيًا من مجموعات المتجهات الثلاثة المشتقة من Vigene (AAV8: C-HEK-1؛ AAV2: C-HEK-1 و2) لم يتسبب في استجابات مناعية في pDCs، مما يشير إلى أن "الخلايا غير المناعية "يمكن أيضًا إنشاء مجموعات المتجهات من خلال عمليات الإنتاج التي لا تتضمن معالجة DNase.

فوائد ملحق cistanche-كيفية تقوية جهاز المناعة

بشكل عام، فإن خطوات التنقية المتشابهة والمختلفة جزئيًا التي تستخدمها الشركات المصنعة الثلاثة تجعل من الصعب ربط الخصائص المناعية للناقلات التي لوحظت في pDC بخطوة واحدة في عملية التصنيع. تستخدم التجارب السريرية ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) التي تخضع لضوابط الجودة الصارمة. لا يتمتع أي من النواقل من الشركات المصنعة الثلاثة المستخدمة في هذه الدراسة بدرجة الممارسة المعملية الجيدة (GLP)، وبالتالي قد يكون أقل نقاءً من النواقل ذات الدرجة السريرية. وبالتالي، من المهم أن ندرك أن نواقل GMP المستخدمة في التجارب السريرية على البشر قد تظهر أو لا تظهر الاختلافات التي لاحظناها في الدراسة الحالية وأن أهمية النتائج التي توصلنا إليها للاستخدام السريري للعلاجات الجينية ليست واضحة. ومع ذلك، في تجربتنا الخاصة، يمكن أن تحدث اختلافات كبيرة محددة في تركيز المكونات الملوثة مثل بروتينات الخلية المضيفة حتى مع نواقل من درجة GMP، وحتى في نواقل من درجة GMP لا توجد مواصفات متفق عليها بشكل موحد فيما يتعلق بالمستويات التي يتم تحديدها مقبول5. بشكل جماعي، يعد تحسين عملية تصنيع ناقلات AAV أمرًا أساسيًا لتجنب وجود الشوائب المتبقية في المعلقات الفيروسية من أجل تقليل احتمالية الاستجابات المناعية غير المقصودة. في الختام، أثبتنا أن شوائب الحمض النووي خارج الفيروسية يمكن أن تؤثر على الخواص المناعية لنواقل AAV في pDCs البشرية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاستقصاء آثار هذه النتائج على سلامة العلاج الجيني بوساطة AAV في النماذج الحيوانية أو المرضى من البشر.

مراجع

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV هندسة الجينوم باستخدام الفيروسات المرتبطة بـ Adeno: تطبيقات البحوث الأساسية والسريرية. مول. ثالثا. 24، 458-464 (2016).

2. غاريتا هيرنانديز، م. وآخرون. تسليم الجينات بوساطة AAV إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد مستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 21، 994 (2020).

3. راسل، س وآخرون. فعالية وسلامة voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) في المرضى الذين يعانون من ضمور الشبكية الوراثي RPE65-: تجربة المرحلة 3 العشوائية والمضبوطة والمفتوحة. لانسيت 390، 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. تطور العلاجات التي تقدمها AAV نحو العلاج النهائي. جيه مول. ميد. 99، 1-25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher، K.، Rodríguez-Bocanegra، E.، Dauletbekov، D. & Fischer، MD الاستجابات المناعية للعلاج الجيني لشبكية العين باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة - الآثار المترتبة على نجاح العلاج وسلامته. بروغ. ريتين. دقة العين. 83، 100915 (2020).

6. رايشيل، FF وآخرون. يمكن أن يحفز AAV8 الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية في عين الرئيسيات. مول. ثالثا. 25، 2648–2660 (2017).

7. بويد، الترددات اللاسلكية وآخرون. انخفاض تنبيغ الشبكية وتعزيز المناعة الموجهة بالجينات مع التسليم داخل الجسم الزجاجي لـ rAAV بعد استئصال الزجاجية الخلفي في الكلاب. جين تير. 23، 548-556 (2016).

8. رودريغيز بوكانيجرا، إي وآخرون. التقييم الطولي للبؤر شديدة الانعكاس في شبكية العين بعد الولادة تحت الشبكية للفيروس المرتبط بالغدة في الرئيسيات غير البشرية. ترجمة. فيس. الخيال العلمي. تكنول. 10، 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9- يعد مسار MyD88 أمرًا بالغ الأهمية للاستجابات المناعية التكيفية لنواقل العلاج الجيني للفيروسات المرتبطة بالفيروسات الغدية في الفئران. جيه كلين. تحقيق. 119، 2388-2398 (2009).

10. هوسل، م. وآخرون. يتوسط مستقبل Toll-like 2- الاستجابة المناعية الفطرية في خلايا الكبد البشرية غير المتني تجاه النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة. أمراض الكبد 55، 287-297 (2012).

11. روماشيك، NG وآخرون. الأساليب مهمة: تنتج منصات الإنتاج القياسية للمركبات AAV المؤتلفة نواقل متميزة كيميائيًا ووظيفيًا. مول. ثالثا. طرق كلين. ديف. 18، 98-118 (2020).

12. رايت، JF الشوائب ذات الصلة بالمنتج في ناقلات AAV المؤتلفة من الدرجة السريرية: التوصيف وتقييم المخاطر. الأدوية الحيوية 2، 80-97 (2014).

13. كليمنت، ن. وجريجر، جي سي تصنيع النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة المؤتلفة للتجارب السريرية. مول. ثالثا. طرق كلين. ديف. 3، 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo، M.، François، A.، Clément، N. & Ayuso، E. علم العقاقير لإنتاج الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلفة. مول. ثالثا. طرق كلين. ديف. 8، 166-180 (2018).

15. Ye، Y.، Gaugler، B.، Mohty، M. & Malard، F. Plasmacytoid dendritic cell Biology ودورها في الأمراض المناعية. كلين. ترجمة. إيمونول. 9، هـ1139 (2020).

16. فيشر، دكتوراه في الطب وآخرون. فعالية وسلامة العلاج الجيني لشبكية العين باستخدام ناقل الفيروس المرتبط بالغدد الصماء للمرضى الذين يعانون من المشيمية في الدم: تجربة سريرية عشوائية. جاما العيون. 137، 1247-1254 (2019).

17. ويليبر، RG وآخرون. النتائج بعد عامين من العلاج الجيني لنقص RPE 65-كمنة ليبر الخلقية وضمور الشبكية الشديد في مرحلة الطفولة المبكرة. طب العيون 123، 1606-1620 (2016).

18. تيمرز، AM وآخرون. الاستجابة الالتهابية العينية للحقن داخل الجسم الزجاجي لنواقل الفيروس المرتبطة بالغدة: المساهمة النسبية للجينوم والقفيصة. همم. جين تير. 31، 80-89 (2020).

19. ران، ج. وآخرون. تعمل الطفرات الموجهة نحو الموقع على تحسين كفاءة نقل ناقلات AAV المؤتلفة المشتقة من مكتبة القفيصة. مول. ثالثا. طرق كلين. ديف. 17، 545-555 (2020).

20. إليس، بي إل وآخرون. دراسة استقصائية لكفاءة النقل خارج الجسم الحي / في المختبر للخلايا الأولية للثدييات وخطوط الخلايا مع تسعة فيروسات طبيعية مرتبطة بالغدة الدرقية (AAV 1-9) ونمط مصلي واحد مرتبط بالفيروسات الغدية. فيرول. ج. 10، 1-10 (2013).

21. يامادا، هـ. وآخرون. تأثير الحمض النووي القمعي على تنشيط المناعة الناجم عن CpG. جي إمونول. 169، 5590-5594 (2002).

22. تشانغ، P. وآخرون. يقوم مضادات مستقبلات Toll-like 9 بقمع المناعة الخلطية في الوهن العضلي الوبيل التجريبي للمناعة الذاتية. مول. إيمونول. 94، 200-208 (2018).

23. تشان، YK وآخرون. هندسة النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة لتجنب الاستجابات المناعية والالتهابية الفطرية. الخيال العلمي. ترجمة. ميد. 13، eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM هيكل وآلية وفائدة علاجية لأليغنوكليوتيدات المثبطة للمناعة. فارماكول. الدقة. 105، 216-225 (2016).

25. بريمبل، MA وآخرون. 547- تحتوي مستحضرات AAV على تلوث من تسلسل الحمض النووي في بلازميدات الإنتاج مباشرة خارج لوائح الاتصالات الدولية. مول. ثالثا. 24، S218 – S219 (2016).

26. لاتز، E. وآخرون. إشارات TLR9 بعد الانتقال من ER إلى CpG DNA في الليزوزوم. نات. إيمونول. 5، 190-198 (2004).

27. فيرون، P. وآخرون. يتم نقل مجموعات فرعية رئيسية من الخلايا الجذعية البشرية بكفاءة عن طريق نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة الذاتية التكميلية 1 و 2. J. Virol. 81، 5385-5394 (2007).

28. تقرير التقييم: جليبيرا. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. تم الوصول إليه في 03 مارس 2022 (2012)

29. Arden، E. & Metzger، J. بروتوكول غير مكلف ومستقل عن النمط المصلي لتنقية الفيروسات المرتبطة بالأدينو المؤتلف والهندسة الحيوية. جي بيول. الطرق 3، e38 (2016).

30. Grieger، JC، Choi، VW & Samulski، RJ إنتاج وتوصيف النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة. نات. بروتوك. 1، 1412–1428 (2006).

31. كيمورا، T. وآخرون. إنتاج نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة للتطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي. الخيال العلمي. النائب 9، 13601 (2019).

32. أيوسو، إي وآخرون. يؤدي ارتفاع نقاء ناقل AAV إلى تحسين كفاءة النقل بشكل مستقل عن النمط المصلي والأنسجة. جين تير. 17، 503-510 (2010).