التأثير الوقائي لعقار Herba Cistanches على السمية العضلية التي يسببها الستاتين في المختبر
Mar 24, 2022
جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com
إيلين وات أ ، ب ، 1 ، تشون فاي نغ أ ، ب ، 1 ، تشي مان كون أ ، ب ، إريك تشون واي وونج أ ، ب ، برايان توملينسون ج ، كلارا بيك سان لاو أ ، ب ، ن
معهد الطب الصيني ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ
ب مختبر الدولة الرئيسي للكيمياء النباتية والموارد النباتية في غرب الصين ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ
ج قسم الصيدلة السريرية ، قسم الطب والعلاج ، الجامعة الصينية في هونغ كونغ ، شاتين ، الأقاليم الجديدة ، هونغ كونغ
الملخص:
أهمية الإثنوفارماكولوجي: هيرباسيستانش(HC ،سيستانشالصحراء، أوسيستانشتوبولوسا) هو عشب صيني يستخدم تقليديا لمشاكل العضلات. أظهرت الدراسات السابقة أن مستخلص HC يمكن أن يقلل من تلف العضلات ويحسن تخزين ATP في الفئران بعد التمرين. ومع ذلك ، لم يتم التحقيق في تأثيره على سمية العضلات التي يسببها الستاتين.
هدف:كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كان المستخلص المائي لـ HC (HCE) يمكن أن يمنع السمية التي يسببها سيمفاستاتين في خلايا العضلات الهيكلية للجرذ L6 وما إذا كان فيرباسكوزيد هو المكون الحيوي النشط الذي يساهم في التأثيرات.
المواد والأساليب:تم إجراء MTT لتحديد تأثيرات HCE ({0} - 2000 مجم / مل) أو فيرباسكوسايد (0-160 ملي مولار) على خلايا L6 المعالجة بسيمفاستاتين (10 ملي مولار). تم إجراء مقايسة موت الخلايا المبرمج في Annexin V-FITC / PI ومقايسة Caspase 3 لتحديد الدور الوقائي لـ HCE على موت الخلايا الناجم عن سيمفاستاتين ، ولتقييم ما إذا كان HCE قد مارس تأثيره الوقائي من خلال مسار كاسباس. تم قياس إنتاج ATP للتحقق مما إذا كان HCE يمكن أن يمنع التخفيض الناجم عن simvastatin في إنتاج ATP في المختبر.
نتائج:زاد سيمفاستاتين بشكل كبير من موت الخلايا المبرمج في خلايا L6. قامت HCE بشكل ملحوظ بتخفيض يعتمد على الجرعة في الخلايا المبرمجة التي يسببها سيمفاستاتين ، ربما عبر مسار -3 كاسباس. خفض Simvastatin إنتاج ATP في خلايا L6 ، والذي تم منعه بالاعتماد على الجرعة بواسطة HCE. لم يكن هناك سوى اتجاه ولكن ليس تأثيرًا كبيرًا (باستثناء الجرعات العالية) من فيرباسكوسايد على حماية سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين.
الاستنتاجات:في الختام ، أظهرنا لأول مرة أن HCE يمكن أن تمارس تأثيرًا وقائيًا يعتمد على الجرعة على السمية التي يسببها سيمفاستاتين في المختبر ، وهو أمر غير مرجح بسبب وجود فيرباسكوسيد. اقترحت دراستنا الاستخدام المحتمل لـ HC في ظل حالة سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين.
الكلمات الدالة:هيرباسيستانش، StatinCholesterol ، فرط شحميات الدم ، تسمم العضلات ، فيرباسكوسايد ، كاسباس -3
1 المقدمة
مثبطات اختزال HMG-CoA (الستاتينات) ، باعتبارها فئة الأدوية الموصوفة الأكثر مبيعًا في العالم في التاريخ ، موثقة جيدًا لتكون مفيدة للمرضى من كلا الجنسين في مختلف الأعمار الذين يعانون من مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية المتوسطة والعالية (غولومب) إيفانز ، 2008). ثم تم تطوير مختلف الستاتينات واعتمادها سريريًا بما في ذلك برافاستاتين وأتورفاستاتين وفلوفاستاتين ولوفاستاتين وبيتافاستاتين وروسيوفاستاتين وسيمفاستاتين. بشكل عام ، تعمل جميع الستاتينات عن طريق تثبيط اختزال HMG-CoA إلى حمض الميفالونيك خلال المرحلة المبكرة من مسار الميفالونات لتقليل إنتاج الكوليسترول (Kromer and Moosmann، 2009؛ Thompson et al.، 2003). على الرغم من أن العقاقير المخفضة للكوليسترول عادة ما تكون جيدة التحمل ، فإن أحد أهم وأشهر الآثار الضارة السريرية هو تسمم العضلات الهيكلية (انحلال الربيدات) (كوباياشي وآخرون ، 2008). يمكن أن تتراوح تشوهات العضلات الهيكلية من ألم عضلي حميد إلى اعتلال عضلي شديد. في حين تم اقتراح مجموعة متنوعة من الآليات والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن الآثار الضارة للعضلات لعقار الستاتين ، يُعتقد أن آليات الميتوكوندريا تلعب دورًا مهمًا (Golomb and Evans ، 2008). ميفالونات ليس فقط مقدمة للكوليسترول ، ولكن أيضًا لمركبات أخرى بما في ذلك بروتينات السيلينو ، والدوليكول ، والأوبيكوينون (كوفمان وآخرون ، 2006 ؛ فاكلافاس وآخرون ، 2009). وبالتالي فإن قدرة الستاتينات على تثبيط الميفالونات ستثبط أيضًا إنتاج بروتينات السلين مثل الجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx) ، وهي إنزيمات مهمة في الحفاظ على آلية الدفاع المضادة للأكسدة (Kromer and Moosmann ، 2009). يمكن أن تؤدي الستاتينات أيضًا إلى استنفاد يوبيكوينون ، مما يتسبب في تقليل استهلاك الأكسجين وتوليف ATP (بيلتوفسكي وآخرون ، 2009). علاوة على ذلك ، أظهرت زيادة الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي أن الستاتين يمكن أن يعمل أيضًا بشكل مباشر على ميتوكوندريا الأنسجة للحث على انتقال نفاذية الغشاء المعتمد على Ca2þ (MPT) بطريقة تعتمد على الجرعة (Beltowski et al. ، 2009 ؛ Velho et al. ، 2006 ). يرتبط أيضًا بزيادة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا وبالتالي يساهم في إصابة الكبد والعضلات (Beltowski et al. ، 2009 ؛ Velho et al. ، 2006).
هيرباسيستانش، النبات المجفف بالكامل من Cistanche deserticola YC Ma ، أو Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (عائلة Orobanchaceae) ، هي نباتات طفيلية تنمو في الغالب في المناطق الصحراوية في شمال وشمال شرق الصين (Siu and Ko ، 2010).هيرباسيستانشهو عشب منشط صيني ينشط اليانغ ويستخدم في المقام الأول لعلاج قصور الكلى مع أعراض مثل العجز الجنسي والعقم وسرعة القذف. كما أن الطبيعة الثقيلة والرائعة للعشب تعمل على ترطيب الأمعاء وتساعد على تخفيف الإمساك. وهو أيضًا عشب صيني يتم وصفه تقليديًا للمرضى لألم الخاصرة والركبتين وهو عشب شائع الاستخدام في التركيبات الصينية لعلاج مشاكل العضلات (Siu and Ko، 2010؛ Xiong et al.، 1998). ومن المثير للاهتمام ، أن هذا يتوافق أيضًا مع الدراسات العلمية الحديثة التي أظهرت الأنشطة المضادة للإرهاق لمستخلص غني بالسكريات وغني بالفينيلثانويد.هيرباسيستانشفي الجرذان بعد التمرين عن طريق تقليل تلف العضلات وتحسين تخزين ATP (Cai et al. ، 2010). أظهر العمل الأخير أن مستخلص الميثانول من Herba Cistanches يمكن أن يعزز إنتاج ATP في الميتوكوندريا (Leung and Ko ، 2008). أثبت سيو وكو (2010) ذلكهيرباسيستانشيمكن أيضًا أن يعزز حالة الجلوتاثيون في الميتوكوندريا عن طريق التوسط في مستويات تخليق الجلوتاثيون و GPx ، وبالتالي حماية الأنسجة من الإجهاد التأكسدي في قلوب الفئران. أظهر سيو وكو (2010) ذلك أيضًاهيرباسيستانشيمكن أن يقلل محتوى الكالسيوم في الميتوكوندريا ، وبالتالي تقليل MPT المعتمد على Ca2þ. بالإضافة إلى،هيرباسيستانشثبت أيضًا أنه مضاد قوي للأكسدة وكاسح للجذور الحرة في أعضاء مختلفة ، مما يقلل من الإجهاد التأكسدي وأنشطة ROS في دراسات الجسم الحي (Lu et al. ، 1995 ؛ Sui et al. ، 2011). الأكثر إثارة للاهتمام ، في محاولة لتحديد الجزء النشط الذي يساهم في نشاط مكافحة التعب منهيرباسيستانش، فقد وجد أن فيرباسكوسايد كان المكون الرئيسي في الجزء النشط (Cai et al. ، 2010). وقد ثبت أيضًا أن فيرباسكوسايد يقلل من إجهاد العضلات في الضفادع ، ربما بسبب أنشطته المضادة للأكسدة (Liao et al. ، 1999) ، مما يشير إلى أن فيرباسكوزيد يمكن أن يكون العنصر النشط بيولوجيًا الذي يساهم في التأثيرات المفيدة لـ Herba Cistanches.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كان استخدام مستخلص ماء سيستانش العشبي (HCE) يمكن أن يقلل من سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين في المختبر. كان من المفترض أن استخدام HCE يمكن أن يصحح الآثار الجانبية لتسمم العضلات الناجم عن سيمفاستاتين. جرت محاولة أيضًا لتحديد ما إذا كانت الآثار المفيدة لـهيرباسيستانشإلى وجود فيرباسكوسايد.
2. المواد والأساليب
2.1. توثيق وتحضير المواد العشبية
المواد العشبية الخامهيرباسيستانشتم شراؤها من مورد مشهور في قوانغتشو ، الصين.هيرباسيستانشتم توثيقه كيميائيًا باستخدام كروماتوجرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) وفقًا لدستور الأدوية الصيني (CP) ، 2010 ، مع استخدام فيرباسكوسايد وإشنكوسايد كواسمات كيميائية (البيانات غير معروضة). بناء على المصادقة الكيميائية ، عينة قسيمة المعشبةهيرباسيستانشتم إيداعه في متحف معهد الطب الصيني في الجامعة الصينية في هونغ كونغ (CUHK) ، مع رقم عينة القسيمة 2014–3434.
باختصار ، تم نقع 1 كجم من العشب الخام لمدة ساعة واحدة ، متبوعًا بالاستخلاص مرتين بالتسخين لمدة ساعة واحدة تحت التدفق الراجع عند 100 درجة باستخدام 10 ماء مقطر لكل عملية استخلاص. تم الجمع بين المستخلصات المائية (HCE) وترشيحها. تم تركيز ناتج الترشيح تحت ضغط مخفض عند 60 درجة. تم تجفيف المستخلص المركز حتى يجف. كانت النسبة المئوية للإنتاج 50.1 بالمائة وزن / وزن. تم استخدام كمية صغيرة لتحديد كمية فيرباسكوسايد وإشنكوسايد باستخدام كروماتوجرافيا سائلة فائقة الأداء (UPLC). تم تعبئة المسحوق المستخرج بالكامل وتخزينه حتى الاستخدام.
2.2. تحليل UPLC للمستخلص المائي
تم إجراء تحليلات UPLC باستخدام نظام Waters Acquity Ultra Performance LC (ووترز ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء جميع المذيبات المطلوبة لتحليلات UPLC من قسم الكيمياء في جامعة هونغ كونغ الصينية. تم شراء Verbascoside و echinacoside من المعهد الوطني للتحكم في المنتجات الصيدلانية والبيولوجية ، الصين. تم حقن محلول العينة في عمود Waters Acquity UPLC BEH C18 (1 0 {{2 {22}}} معرف 2.1 مم 2 ، حجم الجسيمات 1.7 مم) مع Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column ( 5-2. معرف 1 مم 2 ، حجم الجسيمات 1.7 مم). تم ترشيح جميع المذيبات مسبقًا باستخدام 0. 45 ملم قرص مرشح Millipore (Millipore) وإزالة الغازات. تم إجراء شطف التدرج باستخدام أنظمة المذيبات التالية: المرحلة المتنقلة أ - أسيتونيتريل ؛ المرحلة المتنقلة ب - الماء المقطر المزدوج / حمض الفورميك (99.9 / 0. 1 ؛ ت / ت). تم إجراء الشطف باستخدام إجراء متدرج على النحو التالي: 0-5 دقائق ، 88 بالمائة ب ؛ 5-10 دقائق ، من 88 بالمائة ب إلى 83 بالمائة ب. كان معدل التدفق المستخدم 0.4 مل / دقيقة وتم إجراء الكشف عند 331 نانومتر وفقًا لـ CP (2010). تم حقن كل عينة (5 ميكرولتر) في العمود بعد الترشيح من خلال قرص مرشح 0.2 مم. تم التعرف على الواسمات الكيميائية بمقارنة فترات الاستبقاء وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية للقمم المجهولة مع تلك الخاصة بالمعايير. تم رسم منحنى المعايرة بسلسلة من تركيزات فيرباسكوسايد وإشنكوسايد (40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، و 1.25 مجم / مل) للتقدير الكمي. تم إجراء القياس الكمي لفيرباسكوسايد وإشنكوسايد داخل المستخلص العشبي في ثلاث نسخ. تمت مراقبة النظام بواسطة جهاز كمبيوتر مزود ببرنامج Waters MassLynx لجمع البيانات وتكاملها وتحليلها.
2.3 زراعة الخلايا
تم شراء خط خلايا العضلات الهيكلية للجرذ L6 من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassa ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحفاظ على الخلايا بكثافة شبه متقاربة في Dulbecco'sModifified Eagle's Medium (DMEM ، ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 10 في المائة من المصل البقري الجنيني (FBS) و 1 في المائة من البنسلين الستربتومايسين (P / S) ، و محتضنة عند 37 درجة في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون و 95 في المائة من الهواء.
لتحديد تأثيرات HCE على سمية العضلات التي يسببها الستاتين ، عولجت خلايا L6 بسيمفاستاتين عند 1 0 ميكرومتر لمدة 48 ساعة للحث على السمية. تمت إضافة HCE (بتركيزات 0 و 250 و 500 و 1000 و 2000 ميكروغرام / مل) أو فيرباسكوسايد (بتركيزات 0 و 20 و 40 و 80 و 160 ميكرومتر) كعلاج مشترك مع الستاتين لتحديد ما إذا كان يمكن أن يمنع المستخلص العشبي سمية الستاتين التي يسببها في خلايا العضلات الهيكلية وأنه إذا كان فيرباسكوسايد يمكن أن يمارس تأثيرات وقائية مماثلة للمستخلص المائي العشبي.
مستخلص Herba Cistanche له تأثير وقائي على السمية التي يسببها سيمفاستاتين في المختبر
2.4 السمية الخلوية في المختبر
خلايا L6 (1x105/ بئر) في {0} أطباق مستنبتة جيدًا ذات قاع مسطح (إيواكي ، اليابان) طوال الليل ، متبوعة بالمعالجة بـ1 0 ميكرومتر من سيمفاستاتين ، مع أو بدون جرعات مختلفة من HCE ( صفر - 2000 ميكروجرام / مل) أو فيرباسكوسايد (0–160 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة. تمت إضافة الوسط العادي (DMEM) إلى آبار التحكم. تم إذابة المسالك والمركبات العشبية في DMEM.
بعد العلاج لمدة 48 ساعة ، تم التخلص من الوسيط من جميع الخلايا و 30 مايكرولتر من 5 مجم / مل 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- yl) -2 ، {{ تمت إضافة 8}} بروميد ثنائي الفينيل رباعي (MTT ، سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية) في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) إلى كل بئر وتم تحضين الصفائح لمدة 3 ساعات عند 37 درجة. تمت إزالة المادة الطافية بعد ذلك وإضافة 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات فورمازان الأرجواني (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت قراءة امتصاص كل عينة عند 540 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Biotek μ-Quant ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من امتصاص MTT فيما يتعلق بخلايا التحكم.
2.5 فحص تلطيخ Annexin-V FITC / PI
خلايا L6 (3 × 105/ بئر) بسيمفاستاتين ، مع أو بدون جرعات مختلفة من HCE أو فيرباسكوسايد. تم جمع الخلايا وغسلها وتلطيخها باستخدام مجموعة الملحق V FITC المتوافقة مع بروتوكول الشركة المصنعة (Trevigen ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ربط 1 × ومكعب في محلول وضع العلامات 100 ul يحتوي على 1 ul Annexin-V FITCconjugate و 10 ul PI في الظلام لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن مضان العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (Becton Dickinson FACSCanto II ، الولايات المتحدة الأمريكية).
2.6. مقايسة نشاط Caspase 3
تم تحديد نشاط Caspase 3 باستخدام مقايسة إنزيم فلورومتري وممتص مناعي (Sigma) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم تحليل خلايا L6 (3 105 / بئر) مع سيمفاستاتين ، مع أو بدون جرعات مختلفة من فيرباسكوسيد HCE باستخدام محلول التحلل. تم قياس كمية 7- amino -4- methylcoumarin (AMC) الحرة الناتجة عن الانقسام البروتيني للركيزة بواسطة Caspase 3 وتحديدها كموميًا فلورومتريًا مع طول موجة الإثارة عند 360 نانومتر ، وطول موجة الانبعاث عند 460 نانومتر باستخدام BMG FLUOstarOptimamicroplate قارئ (BMG LABTECH GmbH ، ألمانيا).
2.7. فحص ATP الخلوي
خلايا L6 (3x105/ بئر) بسيمفاستاتين ، مع أو بدون جرعات مختلفة من HCE أو فيرباسكوسايد. بعد العلاج ، تم جمع الخلايا وقياس محتوى ATP باستخدام مجموعة الألوان المتاحة تجاريًا (Abcam ، المملكة المتحدة) عن طريق قياس محتوى فوسفات الجلسرين في الخلايا المتحللة والقراءة عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Biotek μ-Quant ، الولايات المتحدة الأمريكية) ). تم التعبير عن قياس إنتاج ATP كنسبة مئوية مقارنة بمجموعة التحكم.
2.8. تحليل احصائي
تم تقديم البيانات كوسائل 7SD ، تم استخدام Prism 5 لـ Window (الإصدار 5. 0 ج ، GraphPad Software ، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية) للتحليل الإحصائي. تم تقييم فروق ذات دلالة إحصائية بين جميع المجموعات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه ، متبوعًا باختبار المقارنة المتعددة من Bonferroni. تم اعتبار احتمال po 0. 05 ذو دلالة إحصائية.
3. النتائج
3.1. تحليل UPLC لمستخلص Herba Cistanches المائي
أظهر الشكل S1A المظهر الجانبي UPLC لخليط قياسي يحتوي على إشنكوسايد وفيرباسكوسايد. تمت مقارنة نقاط وقت الاحتفاظ لكل من هذه العلامات بملف تعريف UPLC الخاص بـهيرباسيستانشمستخلص مائي (الشكل S1B). كمية إشنكوسايد وفيرباسكوسايد في الداخلهيرباسيستانشوجد أن المستخلص المائي هو {{0}. 45 بالمائة وزن / وزن و 0.085 بالمائة وزن / وزن على التوالي.
3.2 تأثير HCE و verbascoside على السمية الخلوية في المختبر لسيمفاستاتين في خلايا العضلات الهيكلية L6
كما هو مبين في الشكل 1 أ ، تسبب سيمفاستاتين في سمية خلوية كبيرة لخلايا L6 كما يتضح من الانخفاض الكبير في قابلية خلايا L6 للحياة عند 10 ملي مولار سيمفاستاتين. علاج HCE يعتمد على الجرعة وبشكل كبير في منع السمية الخلوية التي يسببها سيمفاستاتين عند 500 و 1000 و 2000 مجم / مل. مارس فيرباسكوسايد اتجاهًا لتحسين قابلية خلايا L6 المعالجة بالاشتراك مع سيمفاستاتين. ومع ذلك ، لم يصل أي من التركيزات إلى دلالة إحصائية (الشكل 1 ب).
الشكل 1. التأثير الوقائي لـ (أ) HCE ؛ و (ب) فيرباسكوسايد على السمية الخلوية التي يسببها سيمفاستاتين في خلايا L6. تمثل القيم الوسائل 7SD (n¼3). فرق كبير بين علاج سيمفاستاتين وحده ومجموعة التحكم باستخدام اختبار الطالب: ### po 0. {{1 0}} 01. فرق كبير بين جميع المجموعات المعالجة بسيمفاستاتين مع أو بدون علاج مشترك فيرباسكوسايد HCE باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه: ** po0.01، *** po0.001.
3.3 تأثير HCE و verbascoside على موت الخلايا الناجم عن سيمفاستاتين في خلايا العضلات الهيكلية L6
لفحص طريقة موت الخلايا الناجم عن سيمفاستاتين وتحديد الدور الوقائي لـ HCE أو فيرباسكوزيد على موت الخلية الناجم عن سيمفاستاتين ، تم الكشف عن نسبة الخلايا المبرمج بواسطة تلطيخ بروبيديوم يوديد (PI). أظهرت النتائج أن سيمفاستاتين تسبب في زيادة معنوية في نسبة خلايا موت الخلايا المبرمج المبكر (Annexin V-FITC إيجابية وسلبية PI ، Q4-2) ، وخلايا موت الخلايا المبرمج المتأخرة (Annexin V-FITC إيجابية وإيجابية PI ، Q2- 2) مقارنة بمجموعة التحكم. خفضت المعالجة المشتركة مع HCE نسبة الخلايا المبرمج المبكر ، والخلايا الميتة المتأخرة بطريقة تعتمد على الجرعة حتى 1000 مجم / مل (الشكل 2 أ). لوحظ هذا التأثير الوقائي أيضًا في مجموعات العلاج المشترك فيرباسكوزيد. ومع ذلك ، لم يصل أي من التركيزات المختبرة إلى دلالة إحصائية (الشكل 2 ب).
الشكل 2. تأثير سيمفاستاتين مع أو بدون المعالجة المشتركة HCE أو فيرباسكوسايد على خارجية فسفاتيديل سيرين في خلايا L6. كانت الخلايا ملطخة بـ Annexin-V FITC و I وتم اكتشافها بواسطة قياس التدفق الخلوي
3.4. تأثير HCE و verbascoside على نشاط كاسباس 3 في خلايا العضلات الهيكلية L6 المعالجة بسيمفاستاتين
كما هو مبين في الشكل 3 أ ، تسبب 10 ملي مولار من سيمفاستاتين بشكل كبير في نشاط كاسباس 3 في خلايا L6 ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج الناجم عن سيمفاستاتين إلى خلايا L6 من خلال سلسلة كاسباس. ومع ذلك ، في الخلايا L6 التي تمت معالجتها بالاشتراك مع simvastatin و HCE ، قلل HCE بشكل كبير من نشاط كاسباس 3 ، مما يشير إلى قدرة HCE على منع موت الخلايا المبرمج الناجم عن سيمفاستاتين من خلال سلسلة كاسباس. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن فيرباسكوسايد مارس أيضًا اتجاهًا لتقليل الزيادة التي يسببها سيمفاستاتين في نشاط إنزيم كاسباس 3 ، إلا أن التركيز عند 160 ملي مولار بلغ دلالة إحصائية (الشكل 3 ب).
الشكل 3. التأثير الوقائي لـ (أ) HCE ؛ و (ب) فيرباسكوسايد على النشاط الأنزيمي الذي يسببه سيمفاستاتين في خلايا L6. تمثل القيم Mean7SD (n¼3–5). فرق كبير بين معاملة simvastatin وحدها ومجموعات التحكم باستخدام اختبار الطالب t: ### po 0. 0 0 1. فرق كبير بين جميع المجموعات المعالجة بسيمفاستاتين مع أو بدون HCE أو المعالجة المشتركة فيرباسكوسايد باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه: * po 0. 05، ** p o0.01، *** po0.001.
3.5 تأثير HCE على الحد من إنتاج سيمفاستاتين في إنتاج ATP في خلايا العضلات الهيكلية L6
قلل Simvastatin (10 ملي مولار) بشكل كبير من إنتاج ATP في خلايا L6 بحوالي 60 بالمائة مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 4 أ). خففت جرعة العلاج المشترك HCE اعتمادًا على انخفاض إنتاج ATP في الخلايا المعالجة بسيمفاستاتين ، والتي وصلت فقط التركيزات عند 500 و 1000 و 2000 مجم / مل إلى دلالة إحصائية. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن verbascoside مارس اتجاهًا لاستعادة إنتاج ATP عند 50 مجم / مل ، إلا أنه لم يصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 4 ب).
الشكل 4. التأثير الوقائي لـ (أ) HCE و (ب) فيرباسكوسايد على التخفيض الناجم عن سيمفاستاتين في إنتاج ATP في خلايا L6. تمثل القيم Mean7SD (n¼3–5). فرق كبير بين معاملة simvastatin وحدها ومجموعات التحكم باستخدام اختبار الطالب t: ### po 0. 0 0 1. فرق كبير بين جميع المجموعات المعالجة بسيمفاستاتين مع أو بدون HCE أو العلاج المشترك فيرباسكوسايد باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه: * po0.05، ** po0.01.
4. مناقشة
مع تزايد انتشار أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) والمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بفرط كوليسترول الدم على مستوى العالم ، أصبح استخدام العقاقير المخفضة للكوليسترول أكثر شيوعًا. على الرغم من أن العقاقير المخفضة للكوليسترول جيدة التحمل بشكل عام ، فإن إصابة العضلات هي أحد الآثار الجانبية التي يتم الإبلاغ عنها بشكل متكرر والمرتبطة باستخدام الستاتين والتي يمكن أن تحدث بشكل حاد بعد أسابيع أو أشهر من بدء تناول الدواء (فاين ، 2003). قد تختلف أعراض العضلات من مشاكل خفيفة ، على سبيل المثال ، الألم ، والحنان ، أو الضعف مع أو بدون ارتفاع الكرياتين كيناز (CK) ، إلى أشد حالات انحلال الربيدات (Armitage، 2007؛ Hu et al.، 2012). بسبب حدوث هذه الآثار الجانبية ، وعدم وجود علاج فعال لتسمم العضلات الناجم عن الستاتين ، تظل العقاقير المخفضة للكوليسترول قليلة الاستخدام. في دراسة استقصائية واسعة النطاق أجريت على 10409 شخصًا فرنسيًا من خلال مقابلة هاتفية ، أفاد 10 بالمائة من المرضى الذين يتلقون علاج الستاتين بأعراض عضلية ، منها 30 بالمائة من هؤلاء المرضى الذين يعانون من الأعراض نتج عنهم توقف العلاج (روزنباوم وآخرون ، 2013).
أظهرنا لأول مرة أن مستخلص المياه منهيرباسيستانش، عشب صيني تقليدي شائع الاستخدام ، يمكن أن يمارس تأثير وقائي ضد السمية التي يسببها سيمفاستاتين في المختبر في خلايا العضلات الهيكلية L6 ، مما يشير إلى إمكاناتهيرباسيستانشالمستخلص المائي (HCE) لدوره الوقائي في التسمم العضلي الناجم عن الستاتين ، وهو أحد الآثار الجانبية الشائعة المعترف بها لدى المرضى الذين يتناولون الستاتينات. وبالتالي فإن القدرة القوية لـ HCE على الحماية من سمية العضلات التي يسببها الستاتين ستكون ذات إمكانات كبيرة.
وفقًا للنظرية التقليدية في الطب الصيني التقليدي ، يرتبط Yang بعملية التمثيل الغذائي لطاقة الميتوكوندريا في الجسم ، وقد وُجد أن وصفة الأعشاب المنشطة لليانغ تعزز توليد ATP في الميتوكوندريا (كو وليونغ ، 2007). ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا انخفاضًا في إنتاج ATP في خلايا العضلات الهيكلية L6 المعالجة بسيمفاستاتين ، وقد تحسن هذا الانخفاض في إنتاج ATP بشكل كبير مع العلاج المشترك HCE. في دراستنا ، باستخدام خلايا العضلات الهيكلية للجرذ L6 ، أظهرنا انخفاضًا في قابلية بقاء الخلية بسبب سيمفاستاتين. تم تحسين هذا الانخفاض في حيوية الخلية بشكل كبير مع العلاج المشترك لـهيرباسيستانشبطريقة تعتمد على الجرعة. على الرغم من أن الآلية الدقيقة للتسمم العضلي الناجم عن الستاتين لم يتم توضيحها بالكامل ، فقد تم اقتراح أن يكون موت الخلايا المبرمج الناتج عن الستاتين من الخلايا العضلية الهيكلية الصحية عاملاً مساهماً في حدوث اعتلال عضلي ، وهو التأثير الجانبي الأكثر شيوعًا الذي يعاني منه مستخدمو الستاتين (ديركس وجونز ، 2006) . في دراستنا ، لاحظنا زيادة كبيرة في الخلايا المبرمجة التي يسببها سيمفاستاتين ، والتي ارتبطت بنشاط كاسباس 3 المرتفع بشكل ملحوظ. تتوافق هذه البيانات أيضًا مع الدراسات السابقة ، التي أظهرت أن العديد من العقاقير المخفضة للكوليسترول يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا العضلية الهيكلية والأنابيب العضلية وفي خلايا العضلات الهيكلية البشرية الأولية المتمايزة من خلال تنشيط أنشطة كاسباس -9 وكاسبيز -3 (ديركس وجونز ، 2006). كان HCE الخاص بنا قادرًا على منع هذه الزيادة التي يسببها سيمفاستاتين في موت الخلايا المبرمج المنشط لـ caspase -3 بطريقة تعتمد على الجرعة.
هيرباسيستانش
إلى جانب ذلك ، أشارت الأدبيات السابقة إلى أن فيرباسكوسايد هو أحد المكونات النشطة الرئيسية في الداخلهيرباسيستانش. ينتمي فيرباسكوزيد ، المعروف أيضًا باسم أكتيوسيد ، إلى عضو في جليكوسيدات فينيل إيثانويد ، وهي مجموعة تحدث بشكل طبيعي من مركبات البوليفينوليك القابلة للذوبان في الماء (Liao et al. ، 1999). في السابق ، تم إثبات أن فيرباسكوسايد هو أحد مضادات الأكسدة القوية التي يمكن أن تظهر أنشطة قوية في إزالة أنواع الأكسجين التفاعلية ومضادات الأكسدة (Liao et al. ، 1999). في دراستنا ، لتحديد ما إذا كان verbascoside هو المكون الرئيسي داخل HCE لدينا والذي يساهم في التأثيرات المفيدة المرصودة ، قمنا باختبار تأثيرات verbascoside بتركيزات 0 - 16 0 ملي مولار. نظرًا لأننا أوضحنا أن HCE الخاص بنا نشط في نطاق تركيز 25 0 - 2 0 00 مجم / مل ، بناءً على نتائج HPLC التي تشير إلى أن HCE يحتوي على فيرباسكوسايد بتركيز 0.085 بالمائة بالوزن / بالوزن ، يجب أن يتراوح التركيز النشط لفيرباسكوسايد بين 0.2125-1.7 مجم / مل (أي 0.34-2.72 ملي مول) ، هل يجب أن يكون فيرباسكوسايد هو المكون النشط؟ ومع ذلك ، فشلنا في ملاحظة تأثير مفيد كبير لفيرباسكوسايد مع نطاق التركيز الذي تم اختباره ، على الرغم من أننا لاحظنا اتجاهًا يعتمد على الجرعة للحصول على تأثير مفيد لفيرباسكوسايد على خلايا العضلات الهيكلية L6. تشير هذه البيانات إلى أن التأثير المفيد لـ HCE الذي لوحظ في الخلايا الهيكلية L6 من غير المحتمل أن يُعزى إلى تأثير فيرباسكوسايد وحده ، مما يشير إلى أن المكونات الأخرى غير فيرباسكوسايد يمكن أن تكون مسؤولة عن الآثار المفيدة المرصودة. من الممكن أيضًا أن يتفاعل فيرباسكوسايد مع المركبات النشطة بيولوجيًا الأخرى داخل المستخلص للمساهمة في التأثيرات المفيدة. ستكون التجارب الإضافية التي تستخدم التجزئة الموجهة بالمقايسة الحيوية مفيدة في توفير مزيد من المعلومات حول اكتشاف المكونات النشطة بيولوجيًا المسؤولة عن المساهمة في التأثيرات الوقائية المرصودة لـ HCE على سمية العضلات التي يسببها سيمفاستاتين.
في الختام ، تشير الدراسة الحالية إلى أن HCE يمكن أن تمارس تأثيرات وقائية قوية على التقليل الذي يسببه سيمفاستاتين في حيوية خلايا العضلات في المختبر. توفر هذه النتائج الدليل الأولي الذي يشير إلى أن المستخلص المائي الخاص بنا قد يكون ذا قيمة علاجية كغذاء وظيفي أو مغذٍ لمرضى فرط شحميات الدم الذين يتعين عليهم الانسحاب من علاج الستاتين بسبب السمية العضلية التي يسببها الستاتين.
تم دعم هذه الدراسة مالياً من قبل مكتب الغذاء والصحة في منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة ، وصندوق الصحة والبحوث الطبية رقم. 11120831.
مراجع
أرميتاج ، ج. ، 2007. سلامة العقاقير المخفضة للكوليسترول في الممارسة السريرية. لانسيت 370 ، 1781-1790.
بيلتوفسكي ، ج. ، وجسيكا ، ج. ، جامروز-ويسنيوسكا ، أ. ، 2009. الآثار الضارة للعقاقير المخفضة للكوليسترول - الآليات والعواقب. بالعملة. المخدرات Saf. 4 ، 209 - 228.
Cai، RL، Yang، MH، Shi، Y.، Chen، J.، Li، YC، Qi، Y.، 2010. النشاط المضاد للإجهاد من المستخلص الغني بالفينيلثانويد من Cistanche deserticola. فيتوثر. الدقة. 24 ، 313-315.
ديركس ، AJ ، جونز ، KM ، 2006. موت الخلايا المبرمج الناتج عن الستاتين والاعتلال العضلي الهيكلي. أكون. J. Physiol. خلية فيسيول. 291 ، C1208-C1212.
غرامة ، DM ، 2003. سمية العضلات المرتبطة الستاتين. كلين. فارماكول. 3 ، 554.
غولومب ، بكالوريوس ، إيفانز ، ماساتشوستس ، 2008. التأثيرات الضائرة للستاتين: مراجعة الأدبيات والأدلة الخاصة بآلية الميتوكوندريا. أكون. J. كارديوفاسك. المخدرات 8 ، 373-418.
Hu، M.، Cheung، BM، Tomlinson، B.، 2012. سلامة العقاقير المخفضة للكوليسترول: تحديث. هناك. حال. المخدرات Saf. 3 ، 133 - 144.
Kaufmann، P.، Torok، M.، Zahno، A.، Waldhauser، KM، Brecht، K.، Krahenbuhl، S.، 2006. سمية الستاتينات على ميتوكوندريا العضلات الهيكلية للفئران. خلية. مول. علوم الحياة. 63 ، 2415-2425.
Ko، KM، Leung، HY، 2007. تعزيز قدرة التوليد ATP ، النشاط المضاد للأكسدة ، وأنشطة تعديل المناعة بواسطة أعشاب يانغ الصينية ويين المقوية. ذقن. ميد. 2 ، 3.
Kobayashi، M.، Kagawa، T.، Narumi، K.، Itagaki، S.، Hirano، T.، Iseki، K.، 2008. مكملات البيكربونات كطريقة وقائية في تلف العضلات الناجم عن الستاتينات. J. فارم. فارم. علوم. 11 ، -8.
كرومر ، أ ، موسمان ، ب. ، 2009. تتضمن إصابة الكبد التي يسببها الستاتين الحديث المتبادل بين مسارات التخليق الحيوي للكوليسترول والسيلينوبروتين. مول. فارم. 75 ، 1421-1429.
Leung، HY، Ko، KM، 2008. يعمل مستخلص Herba Cistanche على تحسين إنتاج ATP في الميتوكوندريا في قلوب الفئران وخلايا H9C2. فارم. بيول. 46 ، 418.
Liao، F.، Zheng، RL، Gao، JJ، Jia، ZJ، 1999. تأخر إجهاد العضلات الهيكلية بواسطة جليكوسيدات فينيل بروبانويد: verbascoside و martensite من Pedicularis plicata Maxim. فيتوثر. الدقة. 13 ، 621-623.
Lu، KG، Liu، HB، Gu، QQ، 1995. دراسة عن المكونات الكيميائية لـ Cistanche deserticola Ma. و Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. ذقن. التقليد. عشب. المخدرات 26 ، 143.
لجنة دستور الأدوية ، 2010. دستور الأدوية لجمهورية الصين الشعبية. مطبعة الصناعة الكيميائية ، بكين.
Rosenbaum، D.، Dallongeville، J.، Sabouret، P.، Bruckert، E.، 2013. وقف العلاج بالستاتين بسبب الآثار الجانبية العضلية: دراسة استقصائية في الحياة الواقعية. نوتر. متعب. كارديوفاسك. ديس. 23 ، 871-875.
Siu ، AH ، Ko ، KM ، 2010. يعزز مستخلص Herba Cistanche حالة الجلوتاثيون في الميتوكوندريا والتنفس في قلوب الفئران ، مع إمكانية تحريض البروتينات المنفصلة. فارم. بيول. 48 ، 512-517.
Sui، ZF، Gua، TM، Liu، B.، Peng، SW، Zhao، ZL، Li، L.، Shi، DF، Yang، RY، 2011. مركب كربوهيدراتي قابل للذوبان في الماء من أجسامهيرباسيستانش: العزل وتأثيره الكاسح على الجذور الحرة في الجلد. الكربوهيدرات. بوليم. 85 ، 75.
Thompson، PD، Clarkson، P.، Karas، RH، 2003. الاعتلال العضلي المرتبط بالستاتين. جاما 289 ، 1681–1690.
Vaklavas، C.، Chatzizisis، YS، Ziakas، A.، Zamboulis، C.، Giannoglou، GD، 2009. الأساس الجزيئي للاعتلال العضلي المرتبط بالستاتين. تصلب الشرايين 202 ، 18-28.
Velho، JA، Okanobo، H.، Degasperi، GR، Matsumoto، MY، Alberici، LC، Cosso، RG، Oliveira، HC، Vercesi، AE، 2006. الستاتينات تحفز انتقال نفاذية الميتوكوندريا المعتمدة على الكالسيوم. علم السموم 219 ، 124-132.
Xiong، Q.، Hase، K.، Tezuka، Y.، Tani، T.، Namba، T.، Kadota، S.، 1998. بلانتا ميد. 64 ، 120-125.
