العلاقة بين سيكلو أوكسيجيناز (كوكس -2) والأمراض التي يسببها نقص الأكسجة

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

يساهم البروستاغلاندين E2 داخل الخلايا في موت الخلايا الأنبوبية القريبة الناجم عن نقص الأكسجة

كورال جارسيا باستورل ، سيلما بينيتو مارتينيز ، ريكاردو جيه بوش 1 ، آنا بي فرنانديز مارتينيز ، فرانسيسكو جيه لوسيو-كازانا

الخلايا الأنبوبية القريبة (PTC) معرضة بشكل خاص لموت الخلايا المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة ، وهو عامل ذو صلة بـمرض كلوي. افترضنا هنا أن موت PTC في ظل نقص الأكسجة يتم بواسطة سيكلو أوكسيجيناز (COX -2) - الإنتاج المعتمد للبروستاغلاندين E ، (PGE ،) ، والذي تم تأكيده في خلايا HK -2 الأنبوبية القريبة البشرية بسبب نقص الأكسجة (1٪ O،) - تم منع الاستماتة المستحثة (i) بواسطة COX -2 (cyclo-أوكسيجيناز) وبواسطة مضادات مستقبلات البروستاغلاندين (EP) و (2) كان مرتبطًا بزيادة في PGE داخل الخلايا ، (iPGE ،) بسبب العامل المحرض بنقص الأكسجة -1 - المعتمد على التنظيم النسخي لـ COX {{3 }}(سيكلو-أوكسجيناز). تم منع موت الخلايا المبرمج أيضًا عن طريق مثبطات ناقل امتصاص البروستاجلاندين PGT ، مما يشير إلى أن iPGE ، يساهم في موت الخلايا المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة (على العكس من ذلك ، كان موت PTC الناجم عن نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة ناتجًا حصريًا عن PGE خارج الخلية). وبالتالي ، فإن iPGE هو فاعل جديد في التسبب في الإصابة الأنبوبية التي يسببها نقص الأكسجة وقد يكون PGT هدفًا علاجيًا جديدًا للوقاية من الآفات التي تعتمد على نقص الأكسجة في أمراض الكلى.

ثبت جيدًا أن نقص الأكسجة الأنبوبي هو عامل مهم لكل من الحالات الحادة والمزمنةمرض كلوي'2 الخلايا الأنبوبية القريبة (PTC) نشطة للغاية من حيث استهلاك الأكسجين نظرًا لأنشطتها التي تتطلب الطاقة لإعادة الامتصاص ، وبالتالي فهي عرضة لنقص الأكسجة. لقد ثبت أن موت الخلايا المبرمج يلعب دورًا مهمًا في PTC المزروع المعرض لنقص الأكسجة ، ولكن لم يتم التحقيق في مسارات الإشارات المسؤولة عن تنشيط آلية موت الخلايا المبرمج. لقد وجدنا نحن وآخرون أن البروستاغلاندين E ، (PGE ،) ، وسيط دهني مهم للعديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية فيالكلى، يلعب دورًا مهمًا في إرسال الإشارات المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج PTC عند العلاج باستخدام سيسبلاتين 7 ، وألبومين 8 أو ليبتين ، وجنتاميسين. في جميع الحالات ، تم العثور على أن الزيادة في PGE تعتمد على التعبير المحسن لـ cyclo-Oxygenase -2 (COX -2)(سيكلو أوكسيجيناز)، وهو إنزيم محفز يمثل ، جنبًا إلى جنب مع COX -1 ، الخطوة المحددة للمعدل في تخليق البروستاجلاندين. في الإنسانالكلى، كوكس القاعدية -2(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير أقل حدة من تعبير COX -1. كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)تم التعرف عليه في خلايا الأرجل وأجزاء من حلقة Henle والأوعية الدموية الكلوية في ظل ظروف فسيولوجية .10. ومع ذلك ، في الحالات المرضية ، يمكن العثور على نشاط مناعي COX -2 في العديد من أنواع الخلايا الأخرى داخلالكلىبما في ذلك PTC ، وربما يساهم في إصابة الكلى. ومن المثير للاهتمام أن نقص الأكسجين يزيد من تعبير كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)و / أو إنتاج PGE ، 12- i7 في العديد من أنواع الخلايا. في الواقع ، وجدنا سابقًا أن نقص الأكسجة يعزز المحتوى داخل الخلايا في PGE ، وكذلك إطلاقه إلى الوسط خارج الخلية. لذلك ، من الممكن نظريًا أن يتوسط PGE التأثير المبرمج لنقص الأكسجة على PTC.

ركزت معظم الدراسات التي أجريت على PGE ، موت الخلايا المبرمج المعتمد بشكل أساسي على الآليات التي تتضمن PGE خارج الخلية لأنه من المقبول على نطاق واسع أن PGE ، تمارس آثارها البيولوجية من خلال تنشيط غشاء البلازما G- البروتين المقترن PGE ، مستقبلات (سلسلة E مستقبلات البروستاجلاندين EP 1-4) 1. ومع ذلك ، في بعض النماذج ، يكون PGE ، (iPGE ،) مناسبًا لموت الخلايا المبرمج 720-22. هذا يعني أنه للحث على موت الخلايا المبرمج ، يجب على PGE الوصول إلى الوسط داخل الخلايا مرة أخرى وتنشيط مجموعة فرعية من مستقبلات EP ، الموجودة داخل الخلية (مستقبلات iEP). نظرًا لأن مهمة التقاط PGE يتم إجراؤها بشكل أساسي بواسطة ناقل امتصاص البروستاجلاندين (PGT) 23-26 ، يؤدي تثبيط PGT إلى الوقاية من iPGE ، موت الخلايا المبرمج بوساطة.

مع الأخذ في الاعتبار هذه الخلفية ، في العمل الحالي ، درسنا ما إذا كان COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- الزيادة المعتمدة في iPGE ، تتوسط المستويات في موت الخلايا المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة في PTC.

انقر فوق Cistanche العضوي لمرض الكلى

طُرق

الكواشف.

AG1478، Bromocresolgreen (BG)، PGE، AH6809، GW627368X، Crystal violet، trypan blue solutions، Bromosulfophthalein (BRS)، 3- (5'-Hydroxymethyl2'-furyl) -1- benzyl indazole (YC1) ، و actinomycin D تم شراؤها من Sigma (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). كان Z-VAD-FMK و celecoxib من Calbiochem (دارمشتات ، ألمانيا) و Cayman Chemical (Ann Arbor ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على التوالي. تم شراء TriReagent من Vitro (مدريد ، إسبانيا) ، وتم الحصول على أغشية PVDF وكاشف اللومينول الغربي النشاف من Santa Cruz Biotechnology (سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). كاشف ProLong Gold مع 4 ، 6- ديميدينو {{14 }} تم شراء مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج فينيل إندول (DAPI) ، و Annexin-V-FITC (fluorescein isothiocyanate) / بروبيديوم يوديد (PI) و 2 '، 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) من Invitrogen (Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والمجسات الجزيئية (أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على التوالي. تم الحصول على الأجسام المضادة من المصادر التالية: anti-PGE و anti-COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)كانت الأجسام المضادة من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة) ؛ كانت anti-Bax و anti-Bcl -2 من Santa Cruz Technologies (سانتا كروز ، CA.USA) ؛ كان الجسم المضاد لـ HIF-la و -rabbit-Alexa-Fluor 488 من BD Biosciences (بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) و Invitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على التوالي ؛ تم شراء اتحاد بيروكسيداز المضاد - - للأكتين والأرانب ضد الفئران من سيجما (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).

ثقافة الخلية والظروف التجريبية.

تم شراء الخلايا الأنبوبية البشرية القريبة من HK -2 من American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحفاظ على الخلايا في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، عند 37 درجة Cin DMEM / F12 مع 10 بالمائة من الأبقار الجنينية مصل (FBS) ، 1 في المائة بنسلين / ستربتومايسين / أمفوتيريسين ب و 1 في المائة جلوتامين (إنفيتروجين. كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 في المائة أنسولين - ترانسفيرين - سيلينيوم (ثيرموفيشر. جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). في جميع التجارب ، الخلايا كانت مطلية بنسبة 70-90 في المائة عند التقاء ، وعندما تعلق تمامًا ، تمت تربيتها تحت ظروف ناقصة التأكسج (1 في المائة أكسجين) أو ظروف سامة (21 في المائة أكسجين).نقص الأكسجةأجريت التجارب في In vivo200نقص الأكسجةمحطة العمل (Ruskin Technology ، West Yorkshire ، المملكة المتحدة). إلى عن علىنقص الأكسجة/ تجارب إعادة الأكسجة ، تعرضت الخلايا لهانقص الأكسجةلمدة 24 ساعة ، وبعد ذلك ، تم تحضين الخلايا في ظروف سامة لمدة تصل إلى 3 ساعات (فترة إعادة الأكسجة).

تحليل التألق المناعي لـ iPGE وتحليل اللطخة الغربية لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)و HIF -1.

تم تقسيم خلايا تحليل التألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية على التوالي على أغطية زجاجية (4 × 104 خلايا / غطاء زجاجي) أو إلى ستة ألواح (15 × 104 خلية / بئر) واحتضانها كما هو موضح في "النتائج". بعد ذلك ، تم إجراء تحليل التألق المناعي والتحليل المناعي بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا. كانت تخفيف العمل ضد الجسم: 1/50 لـ PGE ،، 1/1000 لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)/ HIF {{0} a / a-rabbit-Alexa-Fluor 568 و 1/5000 لـ -actin. تم إجراء الكشف عن التألق المناعي باستخدام مجهر متحد البؤر Leica SP5 (Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا) ، من خلال خدمة الفحص المجهري متحد البؤر (ICTS 'NANBIOSIS'U17) لمركز شبكات البحوث الطبية الحيوية حول الهندسة الحيوية والمواد الحيوية والطب النانوي (CIBER-BBN في جامعة الكال ، مدريد ، إسبانيا)

تعداء عابرة.

تعداء عابرة باستخدام siRNA PGT (التكنولوجيا الحيوية في سانتا كروز ، سانتا كروز ، كاليفورنيا) ، ناقل تعبير الثدييات pcDNA3 الذي يحتوي على cDNA من النوع البري 15- هيدروكسي بروستاغلاندين ديهيدروجينيز (ع 15- PGDH) أو تراكيب البلازميد لمراسل لوسيفيراز لـ COX البشري -2(سيكلو أوكسيجيناز)phPES 2- لوك ، إنساننقص الأكسجةتم إجراء عنصر الاستجابة (HRE) p9HIF 1- Luc and R. reniformis pRL-CMV (Promega ، Madison ، WI) وتحديد نشاط luciferase كما هو موضح في مكان آخر.

عدد الخلايا ومورفولوجيا الخلية / النواة.

تم تحديد عدد الخلايا الملتصقة بالطيف الضوئي باستخدام طريقة تلطيخ البنفسجي البلوري المعدل 2. للكشف عن دليل على موت الخلايا المبرمج ، لوحظ مورفولوجيا الخلية باستخدام الفحص المجهري الطوري. تم تصور نوى الخلية بعد تلطيخ الحمض النووي باستخدام DAPI كما هو موصوف سابقًا 0 ، وتشتمل مورفولوجيا موت الخلايا المبرمج النموذجية التي تم فحصها على الانكماش الخلوي والتكثيف والتفتت النووي وتشكيل أجسام موت الخلايا المبرمج. للتقدير الكمي ، تم فحص ستة مجالات في كل حالة تجريبية بطريقة عمياء لتقدير نسبة النوى ذات المظهر الشبيه بالاستماتة.

فحص موت الخلايا المبرمج للتدفق الخلوي ومقايسة جدوى الخلية عن طريق اختبار استبعاد صبغة التربان الزرقاء.

تم فصل الخلايا الملتصقة باللوحة عن طريق التربسين ، واستخدمت مع الخلايا المنفصلة التي تم استردادها سابقًا من وسط المزرعة ، للمقايسة.

سمحت مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج Annexin-V-FITC / PI بالكشف عن قياس التدفق الخلوي لخلايا HK -2 الأبوطوزية والنخرية ، كما هو موصوف سابقًا. تلطيخ. كانت الخلايا الميتة موجبة فقط للخلايا PI ولم تظهر خلايا HK -2 أي تلطيخ.

تم استخدام اختبار استبعاد صبغة التريبان الزرقاء لتقييم صلاحية الخلية. تم حساب الخلايا القابلة للحياة (البيضاء) والخلايا الميتة (الزرقاء) باستخدام مجهر ضوئي ومقياس الكريات.

تحليل احصائي.

تم تكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SEM. تم إخضاعهم لتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار Bonferroni للمقارنات المتعددة. تم تعيين مستوى الأهمية عند P أقل من أو يساوي 0. 05.

نتائج

يتسبب نقص الأكسجة في موت خلايا HK {{0} الأنبوبية القريبة.

نقص الأكسجةقلل عدد خلايا HK -2 ، كما تم تقييمه بواسطة مقايسة البنفسج البلوري (الشكل la) ، وأيضًا استحثاث تقريب الخلية وانفصالها عن اللوحة (الشكل رطل ، اللوحة العلوية). كما هو متوقع،نقص الأكسجةأثار نموذجًا لموت الخلايا بخصائص مورفولوجية واضحة لموت الخلايا المبرمج (انظر التلوين النووي باستخدام DAPI في الشكل lb ، اللوحة السفلية ، اليسار) مثل انكماش الخلية مع تكاثف نووي كبير ، وتفتت ، وتشكيل أجسام شبيهة بالاستماتة.نقص الأكسجة- تم تأكيد موت الخلايا المبرمج الناتج عن طريق زيادة الملحق في V-FITCstaining ، كما تم تقييمه بواسطة قياس التدفق الخلوي ، والوقاية منه باستخدام مثبط عموم كاسباس Z-VAD-FMK (الشكل 1 ج).نقص الأكسجةحدد أيضًا انخفاضًا في عدد الخلايا القابلة للحياة ولكن لم يحدث تغييرات ذات دلالة إحصائية في عدد الخلايا النخرية (الشكل 1 ج ، داخلي).

الشكل 1. يسبب نقص الأكسجة موت الخلايا الأنبوبية القريبة -2.(أ) تناقص عدد الخلايا (مقايسة البنفسج البلوري). (ب) الخصائص المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج. صور مجهرية تمثيلية على النقيض من الطور (اللوحة العلوية ، التكبير الأصلي ، 10 ×) صور مجهرية تلطيخ DAPI (اللوحة السفلية ، التكبير الأصلي ، 40 ×). (ج) زيادة في موت الخلايا المبرمج (دراسات قياس التدفق الخلوي). تشتمل خلايا Annexin V plus على خلايا يوديد Annexin V plus / propidium (أي خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة مع سلامة غشاء البلازما المحفوظة) وخلايا الملحق V plus / propidium iodide plus (أي خلايا موت الخلايا المبرمج المتأخرة). أقحم: أنواع مجموعات الخلايا (خلايا أنكسين V- / بروبيديوم يوديد زائد هي خلايا نخرية وملحق في V- / بروبيديوم يوديد - خلايا حية). يتم التعبير عن النتائج كنسب مئوية فيما يتعلق بإجمالي عدد الأحداث. معلومات عامة: (1) تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة في حالة طبيعية (21 بالمائة O2) أو ناقصة التأكسج 1 بالمائة O ، ، كما هو موضح في "الطرق؟ تمت إضافة ساعة واحدة قبل بدء التعرض لـنقص الأكسجة. (2) الصور المجهرية هي أمثلة تمثيلية لثلاث تجارب مستقلة. الأشرطة وأشرطة الخطأ في الرسوم البيانية: يمثل كل شريط متوسط ​​± SEM لـ 3 تجارب مختلفة * P.<0.01 vs.=""><0.01 vs="">نقص الأكسجة;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">نقص الأكسجةبالإضافة إلى ZVAD.

كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)يتوسط مسار مستقبلات / iPGE، / EP موت الخلايا الأنبوبي القريب HK -2 الناجم عن نقص الأكسجة.

من أجل تقييم دور COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)/ مسار مستقبلات iPGE2 / EP فينقص الأكسجةبسبب موت الخلية هونج كونج -2 ، قمنا أولاً باحتضان الخلايا مسبقًا باستخدام celecoxib ، وهو COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)مثبط 1 ؛ AH6809 ، مضاد لمستقبلات EP1 و EP2 و EP3 أو GW627368X ، وهو مضاد لمستقبلات EP4 ؛ أو مع bromocresol green أو bromosul-fophthale في كلاهما من مثبطات PGT435. كما تم التخلص من PGT من خلال تعداء مع siRNA.

الشكل 2. كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)يتوسط مسار مستقبلات / iPGE، / EP موت الخلايا الأنبوبي القريب الناجم عن نقص الأكسجة في HK -2.(أ) منع موت الخلايا بواسطة مثبطات المسار. اللوحة العلوية تظهر الأشرطة النسبة المئوية لموت الخلية الإجمالي (على اليسار) أو النسبة المئوية للملحق الأبوطوتيكي في الخلايا V plus (على اليمين). قبل التعرض لنقص الأكسجة، تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام 3 ميكرومتر من celecoxib （COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)مثبط） ؛ 10 ميكرومتر AH6809 ، （EP 1-3 مستقبلات مناهضة） ، 10 ميكرومتر GW627368X （EP4 مضادات مستقبلات） ؛ أو مع 50 ميكرومتر من البروموكريزول الأخضر （BG） أو 25 ميكرومتر من بروموسولفوفثالين (BrS) ، اثنان من مثبطات PGT. اللوحة السفلية: على اليسار: الوقاية من موت الخلايا عن طريق هدم PGT من خلال تعداء باستخدام siRNA (اختبار استبعاد التريبان الأزرق للغوص). الشكل الداخلي: فاعلية ضربة قاضية لـ PGT (تحليل لطخة غربية) يمينًا: اعتماد التركيز على التأثير الوقائي لمادة البروموكريسول الخضراء (BG). (ب) منع موت الخلايا عن طريق تعداء مع ناقل تعبير للثدييات يحتوي على إنزيم البروستاغلاندين المعطل 15- هيدروكسي بروستاغلاندين ديهيدروجينيز (15- PGDH) cDNA (اختبار استبعاد صبغة التريبان الزرقاء). البداية: التعبير عن {{ 11}} PGDH (تحليل لطخة غربية) في الخلايا المنقولة. (ج)نقص الأكسجةيحث على زيادة حساسة لـ PGT في iPGE ، يسار: PGE ، تألق مناعي مستقل وحده أو مدمج مع تلطيخ نووي مع DAPI يظهر (التكبير الأصلي ، 40 ×) إلى اليمين: النهج الكمي للصور المعروضة في اللوحة اليسرى باستخدام برنامج Image J. (د) لا يمنع مثبط تنشيط EGFR AG1478 موت خلية HK -2 EGFR. تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام L ميكرومتر AG1478 قبل تعريضهانقص الأكسجة. لا يعدل مثبط （e） PGT BG تعبير Bax و Bcl -2 في خلايا HK -2 ضمننقص الأكسجة(تحليل لطخة غربية). (و) منعنقص الأكسجة/ موت الخلايا الناجم عن إعادة الأكسجة بواسطة مثبطات المسار (اختبار استبعاد صبغة التريبان الزرقاء). تم تحضين الخلايا مسبقًا بمثبطات المسار وتعريضهانقص الأكسجةمثل كلمة (أ). بعد ذلك ، تم تعريض الخلايا للنورموكسيا لمدة 3 ساعات. معلومات عامة: (1) تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة في ظروف سامة (21 بالمائة O ،) أو نقص الأكسجين (1 بالمائة O ،) ، كما هو موضح في "الطرق". (2) الصور المجهرية هي أمثلة تمثيلية لثلاث تجارب مستقلة. (3) لم تعدل مذيبات المثبطات (وسط luL / mL) من تأثيرنقص الأكسجةعلى موت الخلية (لا تظهر النتائج). (4) تحليل البقعة الغربية: تم تأكيد البروتين المتساوي عن طريق التحقيق باستخدام أكتين مضاد - - أو جسم مضاد لـ GAPDH. (5) الأشرطة وشريط الخطأ في الرسوم البيانية: يمثل كل شريط متوسط ​​± SEM لثلاث تجارب مختلفة<0.01><0.01>نقص الأكسجةأونقص الأكسجة/ إعادة الأكسجة.

كما هو مبين في الشكل 2 أ ،نقص الأكسجةتم منع موت الخلايا الأنبوبية القريبة المستحثة في جميع الحالات. أشار تثبيط موت الخلايا المبرمج بواسطة السيليكوكسيب إلى أن كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)يلعب دورًا مهمًا فينقص الأكسجة- موت الخلايا المبرمج (الشكل 2 أ ، اللوحة العلوية ، اليمين). وبشكل أكثر تحديدًا ، فإن حقيقة أنه تم منع موت الخلايا المبرمج عن طريق معاداة مستقبلات EP تشير إلى أن موت الخلايا المبرمج يتم توسطه بواسطة COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- الإنتاج المعتمد لـ PGE ، ومن ناحية أخرى ، من المرجح أن تساهم iPGE فينقص الأكسجة- ناتج عن موت الخلية HK -2 لأنه تم منعه بواسطة ؛ (1) تثبيط PGT (الشكل 2 أ) أو (1) الإفراط في التعبير عن 15- PGDH (الشكل 2 ب) ، والذي يعطل iPGE2 من خلال الأكسدة 25 (من الملاحظ أن إجراء تعداء العدوى نفسه زاد من حساسية خلايا HK -2 لـنقص الأكسجة: موت الخلية كان 45-55 في المائة للترنسفكأيشن في ظروف التحكم مقارنة بـ 15-20 في المائة في الخلايا غير المنقولة). مزيد من الدعم لمساهمة iPGE ، لنقص الأكسجةناتج عن موت خلية هونج كونج -2 ، هي النتائج السابقة التي توصلنا إليهانقص الأكسجةيحدد زيادة في محتوى الخلية لـ iPGE ، 1 وأن ​​هذه الزيادة تم منعها بواسطة مثبطات PGT (الشكل 2 ج).

قد تؤدي مسارات إشارات MAPK إلى موت الخلايا المبرمج ، نظرًا لأن مستقبلات iEP تتعامل مع مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) 36 ، مما يؤدي إلى تنشيط MAP kinases ERK1 / 2 و p38 في HK -2 خلايا 0 ، سألنا ما إذا كان - منع احتضان خلايا HK -2 مع مثبط تنشيط EGFR AG1478نقص الأكسجة- موت الخلايا الناجم. لقد وجدنا نتائج سلبية (الشكل 2 د) ، وبالتالي ، فمن غير المرجح أن تتوسط معاملات EGFR موت الخلايا في HK -2 تحتنقص الأكسجة.

في العديد من النماذج التجريبية ، تم تقليل ATP المشتق من الميتوكوندريا أثناءنقص الأكسجةيسبب زيادة في البروتين المؤيد للاستماتة Bax إلى نسبة التعبير عن البروتين المضاد للاستماتة Bcl -2 ، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكروم C في العصارة الخلوية ، وتفعيل كاسباس 9 ، والانقسام اللاحق وتفعيل التيار السفلي ، المستجيب الكاسبات ، 37،38. ومع ذلك ، قبل الحضانة مع BG مثبط PGT في HK -2 الخلايا تحتنقص الأكسجةلم ينتج عنه تغييرات متوافقة مع تحول مضاد للاستماتة في التوازن بين تعبير Bc -2 و Bax (الشكل 2 هـ) ، والذي لا يدعم دور هذه البروتينات في خلية HK -2 الموت تحتنقص الأكسجة.

بعد التعرض لنقص الأكسجين ، يمكن أن تؤدي نوبات إعادة الأكسجة (إصابة نقص التروية / ضخه) إلى تلف الخلايا الإضافي. يمكن فهم "مفارقة" إصابة إعادة الأكسجة مع الأخذ في الاعتبار أن الخلايا تخضع لتغييرات محددة في أنشطة الإنزيم ، ووظيفة الميتوكوندريا ، وهيكل الهيكل الخلوي ، ونقل الغشاء ، والدفاعات المضادة للأكسدة استجابةً لـنقص الأكسجة، والتي تهيئ بعد ذلك بشكل جماعي لإصابة إعادة الأكسجة. يساهم إعادة الأكسجين في إصابة الكلى الحادة أثناء السكتة الدماغية ، أو زرع الكلى ، أو فشل الدورة الدموية ، أو جراحة الكلى والقلب والأوعية الدموية. في هذا السياق ، القيمة العلاجية المحتملة لتثبيطنقص الأكسجة/ موت الخلايا الأنبوبية القريب الناجم عن إعادة الأكسجة من خلال التدخل في COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)مسار مستقبلات / iPGE / iEP واضح. لذلك ، سألنا عما إذا كانت iPGE تتوسط على وجه التحديدنقص الأكسجة- موت الخلايا الناجم أو يتوسط أيضًانقص الأكسجة/ موت الخلايا الناجم عن إعادة الأكسجة (نموذج في المختبر يحاكي نقص التروية الكلوي / إصابة إعادة التروية). كما هو مبين في الشكل 2f ، تم منع موت الخلايا (كما تم تقييمه بواسطة اختبار استبعاد الغوص الأزرق التريبان) بواسطة COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)مثبط السيليكوكسيب وكذلك بمضادات مستقبلات EP AH6809 أو GW627368X. كما هو الحال في الشكل 2 أ ، تشير هذه النتائج إلى أن COX -2 يلعب دورًا ذا صلة فينقص الأكسجة/ موت الخلايا الناجم عن إعادة الأكسجة ، وبشكل أكثر تحديدًا ، يتم توسط موت الخلية بواسطة COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- الإنتاج المعتمد لـ PGE ، حيث تم منعه عن طريق عداء مستقبلات EP. ومع ذلك ، نظرًا لأن موت الخلايا لم يتم منعه بواسطة مثبطات PGT ، بروموكريسول أخضر أو ​​برو-موسولفوفثالين (الشكل 2f والشكل التكميلي 2 د) ، فمن المرجح أننقص الأكسجة/ إعادة الأكسجين الناجم عن موت الخلايا HK -2 يتم توسطه حصريًا عن طريق PGE خارج الخلية.

تنظيم النسخ HIF -1 - التابع لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)يساهم التعبير الجيني في أنقص الأكسجة- الزيادة الناتجة في iPGE ، في خلايا HK -2 الأنبوبية القريبة. PGE ، يتضمن التخليق الحيوي إطلاق حمض الأراكيدونيك من غشاء الجلسيروفوسفوليبيدات عن طريق فسفوليباز أ ، متبوعًا بتحويل أنزيمات كوكس لحمض الأراكيدونيك إلى البروستاجلاندين H ، وأخيراً عن طريق أزمرة غدة البروستا في H ، إلى PGE ، بواسطة البروستاجلاندين سينثاس. مثل microsomal synthase PGE -1 (mPGES -1) 19. لقد وجدنا ذلكنقص الأكسجة- الاستماتة المستحثة في خلايا HK -2 يتم توسطها على الأرجح بواسطة COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- الزيادة المعتمدة في إنتاج PGE (الشكل 2). بالنظر إلى أن كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)هو إنزيم يمكن أن يحدث تعبيره بواسطةنقص الأكسجة، افترضنا أن أنقص الأكسجة- الزيادة الناتجة في PGE ، قد يكون الإنتاج في خلايا HK -2 نتيجة لزيادة التعبير عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز). من أجل تأكيد فرضيتنا ، درسنا (1) تأثيرنقص الأكسجةعلى تعبير كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)البروتين و mRNA و (2) تأثير كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)مثبط celecoxib علىنقص الأكسجة- الزيادة الناتجة في iPGE ، أشارت نتائجنا إلى ذلكنقص الأكسجةمحددة بطريقة عابرة تنظيم النسخ من COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير (الشكل 3 أ ، ب) وهذا COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)منع التثبيط من الزيادة في iPGE ، في HK -2 من الخلايا الأقلنقص الأكسجة(الشكل 3 ج). ومن المثير للاهتمام،نقص الأكسجةحدد أيضًا التنظيم الأعلى العابر لـ mPGES -1 تعبير البروتين (الشكل ، 3 أ ، داخلي) ، لكنه لم يؤثر على تعبير mRNA mPGES -1 (الشكل ، 3 ب. داخلي). أشارت هذه النتائج إلى زيادة التعبير عن كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)و mPGES -1 مسؤول عننقص الأكسجة- الزيادة الناتجة في iPGE.

الشكل 3. تنظيم النسخ المعتمد على HIF-la لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)يساهم التعبير الجيني في الزيادة التي يسببها نقص الأكسجة في iPGE ، في خلايا HK -2 الأنبوبية القريبة.(أ) التعبير عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)يتم زيادة البروتين بشكل عابر بواسطةنقص الأكسجة(تحليل لطخة غربية). داخلي: يتم أيضًا تنظيم بروتين التعبير mPGES -1 بشكل مؤقت بواسطةنقص الأكسجة. (ب) التعبير كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)يتم زيادة مرنا بشكل عابر بواسطةنقص الأكسجة. داخلي: لا يتأثر التعبير عن mRNA بـ mPGES -1نقص الأكسجة. (ج) الوقاية بواسطة celecoxib ، وهو COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)مثبط ، من الزيادة في iPGE ، التي يسببهانقص الأكسجة. تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام 3 ميكرومتر من السيليكوكسيب. يظهر Left∶PGE ، التألق المناعي المعتمد بمفرده أو مدمج مع تلطيخ نووي مع DAPI (التكبير الأصلي ، 40 ×). يمينًا: نهج كمي للصور المعروضة في اللوحة اليسرى باستخدام برنامج Image J. (د) مساهمة آليات النسخ. اليسار: يمنع الأكتينوميسين D المثبط للنسخ (قانون د) أنقص الأكسجةزيادة ناتجة عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير البروتين (تحليل لطخة غربية). تم معالجة الخلايا مسبقًا لـ lh بـ 1 ميكروغرام / مل. د قبل التعرض لنقص الأكسجةلمدة 3 ساعات إلى اليمين: زيادة نشاط COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)بناء المراسل. (هـ) يمنع مانع HIF-la YC -1نقص الأكسجةمستحثة كوكس النسخي -2(سيكلو أوكسيجيناز)حتى التنظيم. تم احتضان الخلايا مسبقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام 0. 5 uM YC -1. على اليسار: الوقاية من كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)حتى التنظيم. تعرضت الخلايا لنقص الأكسجةلمدة 8 ساعات. المركز: منع الزيادة في نشاط COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)بناء المراسل. على اليمين: منع نشاط بناء المراسل الذي تحركه التربية على حقوق الإنسان. تعرضت الخلايا لنقص الأكسجةلمدة 8 ساعات (و) مثبط HIF-la YC -1 يزيد من موت الخلايا المبرمج (دراسات قياس التدفق الخلوي). قبل التعرض لنقص الأكسجة، تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة ساعة واحدة باستخدام 0 .5 ميكرومتر YC -1. Inset∶ YC -1 يثبطنقص الأكسجةناتج عن الزيادة في تعبير HIF -1 (تحليل اللطخة الغربية). معلومات عامة: (1) تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة في ظروف سامة (21 بالمائة O ،) أو نقص الأكسجين (1 بالمائة O ،) ، كما هو موضح في "الطرق". (2) الصور المجهرية هي أمثلة تمثيلية لثلاث تجارب مستقلة. (3) تحليل البقعة الغربية: تم تأكيد البروتين المتساوي عن طريق التحقيق باستخدام جسم مضاد أكتين - - (4) أشرطة وأشرطة خطأ في الرسوم البيانية: يمثل كل شريط متوسط ​​± SEM لثلاث تجارب مختلفة * P<0.01 vs.="" other="">

لمزيد من البحث في مساهمة آليات النسخ في زيادة COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير البروتين تحتنقص الأكسجة، تعبير عن كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)تم تقييمه في خلايا HK {{0} ، والتي تم تحضينها مسبقًا باستخدام مثبط النسخ أكتينوميسين D قبل تعريضهانقص الأكسجةلمدة 5 ساعات. كما هو مبين في الشكل ثلاثي الأبعاد ،نقص الأكسجةزيادة ناتجة عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تم منع التعبير البروتيني بواسطة الأكتينوميسين د. علاوة على ذلك ،نقص الأكسجةقرر أيضًا زيادة نشاط COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)بناء مروج تم نقله سابقًا في خلايا HK -2 (الشكل ثلاثي الأبعاد على اليمين). مجتمعة ، تشير النتائج الموضحة في الشكل ثلاثي الأبعاد إلى أن آليات النسخ تساهم في أنقص الأكسجةزيادة ناتجة عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير البروتين. ومع ذلك ، كان هناك تناقض بين توقيت تنشيط مروج COX -2 وتوقيت الحد الأقصى من COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير mRNA: بينما الزيادة العابرة في COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)كان تعبير mRNA في أقصى حد بعد ساعتين (الشكل 3 ب) ، تم تنشيط مروج COX -2 بعد 3 ساعات (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، والذي ربما يعكس مساهمة آليات ما بعد النسخ في الزيادة في COX {{6}. }}(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير 4. وفقًا لذلك ، نتوقع أن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)استقر مرنا تحتنقص الأكسجة، مما قد يؤدي إلى زيادة مستويات COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير mRNA بدون أي مساهمة (في تلك اللحظة) بزيادة نشاط COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)المروجين. ومع ذلك ، من الممكن أيضًا أن الفارق الزمني بين تنشيط المروج وتراكم الركيزة القابلة للقياس قد يساهم أيضًا في التناقض بين توقيت تنشيط مروج COX -2 وتوقيت الحد الأقصى من COX {{1} }}(سيكلو أوكسيجيناز)تعبير مرنا.

HIF -1 هو عامل نسخ مغاير يتكون من الوحدة الفرعية المعتمدة على الأكسجين والوحدة الفرعية المعبر عنها بشكل أساسي. تحتنقص الأكسجة، HIF-l يتراكم ويدخل إلى النواة ، حيث يولد عامل النسخ HIF -1 بعد dimerizing باستخدام HIF -1. ثم يروج HIF -1 للتعبير عن الجينات المستهدفة من خلال الارتباط بـنقص الأكسجة-العناصر المستجيبة (HREs) الموجودة في منطقتها التنظيمية وبالتالي تنسق الاستجابات التكيفية الخلوية للقتالنقص الأكسجة 3. بشرطنقص الأكسجةقد ينشط كوكس -2(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير بطريقة تعتمد على HIF -1- من خلال HRE وظيفي موجود في تسلسل مروج COX -2 ، درسنا دور HIF-l فينقص الأكسجةزيادة ناتجة عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير. نظرنا أيضًا في نشاط -2 بناء محفز COX الذي تم نقله في خلايا HK -2. كما هو مبين في الشكل 3 هـ ، فإن الحضانة المسبقة باستخدام HIF -1 مثبط YC -1 ، والذي أضعفنقص الأكسجة- أدت الزيادة المستحثة في تعبير HIF-la ونشاط بناء مراسل HRE إلى منع الزيادة في كلا التعبيرين عن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)ونشاط COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)بناء المروج في هونج كونج -2 يخضع لنقص الأكسجة. باختصار ، النتائج موضحة في الشكل 3 أ-هـ تدعم الفكرة القائلة بأن HIF -1 - يعتمد على التنظيم النسخي لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)هو المسؤول عننقص الأكسجة- الزيادة الناتجة في iPGE2.

على الرغم من أن عواقب تفعيل HIF {0}} علىنقص الأكسجة- الاستماتة المستحثة مثيرة للجدل (ربما لأنها قد تكون معتمدة على السياق) ، قمنا بتحليل (بطريقة أولية) دور HIF -1 في نظامنا التجريبي. منذ أن اكتشفنا سابقًا هذا التدخل في COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)/ مسار مستقبلات EPGE ، EP يثبط الزيادة في تعبير HIF-la الناتج عننقص الأكسجة8.56 سألنا عما إذا كان تثبيط HIF-la يؤدي إلى الوقاية مننقص الأكسجةناتج عن موت الخلايا المبرمج HK -2. كما هو مبين في الشكل 3f ، فإن الحضانة المسبقة باستخدام YC -1 ، وهو مثبط HIF-l ، قد زاد بالفعلنقص الأكسجةالناجم عن موت الخلايا المبرمج. لذلك ، من غير المحتمل أن يكون HlF-la

مناقشة

الانسجةنقص الأكسجةيُعتقد أنه ذو صلة وثيقة بالفيزيولوجيا المرضية لكل من مرض الكلى المزمن وإصابة الكلى الحادة ، كون PTC الجزء الأكثر حساسية من الأنابيب الكلوية ضدنقص الأكسجة. درسنا هنا دور PGE في الضرر الذي تسببهنقص الأكسجةإلى PTC ووجدوا أن زيادة إنتاج iPGE نشأت من تنظيم HIF-la المعتمد على COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)التعبير الجيني وزيادة التعبير عن mPGES -1 ، يساهم فينقص الأكسجة-موت الخلايا المبرمج في خلايا HK -2. بالنظر إلى أن نقص الأكسجة الأنبوبي هو عامل وثيق الصلة بكل من أمراض الكلى الحادة والمزمنة -2 ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن ناقل البروستاجلاندين PGT هو هدف علاجي جديد في أمراض الكلى.

نقص الأكسجةلا يؤدي ذلك إلى زيادة iPGE فحسب ، بل يؤدي أيضًا إلى إطلاقه إلى الوسط خارج الخلية 8 بحيث يؤدي إفراز PGE (خارج الخلية) ، قد يلعب أيضًا دورًا فينقص الأكسجة- الاستماتة المستحثة (على سبيل المثال ، إطلاق شلالات موت الخلايا المبرمج من خلال التنشيط الكنسي لمستقبلات EP الموجودة في غشاء الخلية). أظهرت دراستان سابقتان أن موت الخلايا تحتنقص الأكسجةكان أيضًا بسبب COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- إنتاج مستقل لـ PGE ، 1345. من ناحية أخرى ، في أنواع معينة من الخلايا (الخلايا الليفية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية وخطوط خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد) ، يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج الناجم عن PGE بواسطة PGE ، التنشيط المعتمد على مستقبلات EP 46-48. لقد وجدنا هنا ذلكنقص الأكسجةالناجم عن موت الخلايا المبرمج HK -2 تم منعه عن طريق عداء مستقبلات EP أيضًا (الشكل 2 أ ، اللوحة العلوية ، اليمين). ولكن نظرًا لأنه تم وصف مستقبلات EP بشكل كلاسيكي على أنها مستقبلات غشاء البلازما ، لذلك لا يمكن الوصول إليها من أجل iPGE 2- ، فإننا نتوقع أن مستقبلات EP التي تتوسط التأثير المبرمج لـ iPGE ، في خلايا HK {4} التي تعاني من نقص الأكسجة مجموعة فرعية تقع داخل الخلايا (أي مستقبلات iEP).

على عكس دور iPGE2 فينقص الأكسجة- الاستماتة المستحثة في خلايا HK -2 ، وجدنا أن PGE خارج الخلية فقط يتوسطنقص الأكسجة/ موت خلايا HK -2 الناجم عن إعادة الأكسجة لأنه لم يتم منعه بواسطة مثبطات PGT (الشكل 2f). على الرغم من أن الآليات المرضية للإصابة الخلوية بعدنقص الأكسجة/ إعادة الأكسجة ليست مفهومة تمامًا ، فمن المقبول أن موت الخلايا يحدث إلى حد كبير من خلال إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS). هذا صحيح بشكل خاص لخلايا HK -2 49،50. بالرغم من ذلكنقص الأكسجةقد يزيد أيضًا من إنتاج ROS ، على حد علمنا لا يوجد دليل على أن ROS يلعب دورًا ذا صلة بـنقص الأكسجةناتج عن موت خلايا HK -2. يشير هذا إلى أن التأثيرات المميتة لنقص الأكسجة ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجة في خلايا HK -2 يتم توسطها بواسطة آليات مختلفة ، مما قد يفسر سبب حماية BG و BS ضدنقص الأكسجةولكن ليس ضدنقص الأكسجة/ إعادة الأكسجة. وبالتالي ، قد يوفر تثبيط PGT فوائد علاجية في PTC ضد إصابة الخلايا التي يسببها نقص الأكسجة ولكن ليس ضد التأثير الضار لـنقص الأكسجة/ إعادة الأكسجة.

HIF -1 - يعتمد على التنظيم الأعلى لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)كان حدثًا حاسمًا لـنقص الأكسجةناتج عن موت الخلايا المبرمج للخلايا HK -2 (الشكل 3 هـ). ومع ذلك ، فإن ملاحظتنا أن مثبط HIF YC -1 المحسن لموت الخلايا المبرمج (الشكل 3f) محير ، على الرغم من أن التقارير السابقة أظهرت بالفعل نتائج مماثلة 1. أحد التفسيرات المحتملة هو سيناريو افتراضي لا يتوسط فيه HIF-la فقط التنظيم المؤيد للاستماتة لـ COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)ولكن أيضًا تنظيم الجزيئات الواقية. في الواقع ، HIF -1- ينظم التعبير عن الجزيئات الواقية ضدنقص الأكسجةمثل RNA DARS-AS1 و microRNA -2103 غير المشفر على وجه التحديد في خلايا HK -2. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه الأدلة تدعم السيناريو الافتراضي الخاص بنا ، يجب إجراء تجارب محددة لتأكيد ذلك.

التحقيق في استجابة خلايا الكلى لنقص الأكسجةقد يحسن فهمنا لأمراض الكلى. لقد درسنا ، على الرغم من أنه بطريقة أولية ، دور الزيادة في نسبة التعبير عن البروتين المؤيد للاستماتة Bax إلى البروتين المضاد للاستماتة Bcl -2 فينقص الأكسجة- الاستماتة المستحثة في خلايا HK -2. أشارت نتائجنا إلى أن تثبيط PGL لم ينتج عنه تغييرات متوافقة مع تحول مضاد للاستماتة في التوازن بين تعبير Bcl -2 و Bax (الشكل 2 هـ) ، والذي لا يدعم دور هذه البروتينات في موت الخلية HK -2 المعتمد على iPGE تحتنقص الأكسجة. على حد علمنا ، هناك دراستان فقط حول الآثار المترتبة على محور Bcl {0} / Bax في موت الخلايا المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة في PTC وكلاهما يحتوي على تركيزات نقص الأكسجين "أو نقص الأكسجين تقريبًا ، 5 . عندما تعرض PTC لـ0.2 بالمائة O. ، ظل تعبير Bax بدون تغيير وتم ربط موت الخلايا المبرمج بانخفاض درجة تعبير Bcl -2. ومع ذلك ، لم يتأثر تعبير Bcl -2 بنسبة 1 بالمائة O ، على الرغم من وجود موت الخلايا المبرمج ، والذي يتطابق مع نتائجنا. لذلك ، يجب مراعاة الآليات الأخرى التي لا تتضمن بالضرورة تغييرات كمية في تعبير Bcl -2 أو Bax: على سبيل المثال ، لا يتطلب تحريض موت الخلايا المبرمج في خلايا الورم الدبقي المستنبت بواسطة iPGE2 سوى ارتباطه المادي بـ Bax ، والذي يؤدي إلى انتقال Bax إلى ميتوكوندريا 202. وبالتالي ، فإن الآلية التي يساهم من خلالها iPGE في موت الخلايا المبرمج HK -2 تستحق مزيدًا من الدراسة.

اكتشفت مجموعتنا أن COX -2(سيكلو أوكسيجيناز)- الزيادة المعتمدة في iPGE ، تتوسط الموت المبرمج في خلايا HK {{1} التي تتعرض لأجسام السيسبلاتين الأبوطوزية 7 "ونقص الأكسجة(نتائجنا الحالية). نظرًا لأن PGE ، يتم إطلاقه سريعًا إلى خارج الخلية بعد أن يتم نقله إلى الخلية 2 ، فإن نقله إلى الداخل بواسطة PG يلعب دورًا مهمًا في موت الخلايا المبرمج الناجم عن iPGE في خلايا HK -2. لذلك ، عندما يتم التوسط في ضرر PTC بواسطة iPGE ، قد يكون العلاج بمثبطات PGT نهجًا علاجيًا مفيدًا مع التطبيقات المحتملة مثل الوقاية من تلف PTC الناجم عن السيسبلاتين ، أو تثبيط انتشار الإصابة الأنبوبية من خلال الأجسام الأبوطوزية ، أو الحد من تأثير ضارنقص الأكسجةعلى PTC.