آثار تبييض البشرة للإكتوين عن طريق قمع تكوين الميلانين المحفز ب MSH وتفعيل مسارات مضادات الأكسدة Nrf2 في الخلايا الكيراتينية المشعّة بأشعة UVA

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1،2،3،4 و Xuan-Zao Chen 1 و Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1 و Hung-Rong Yen 3،4،5،6 و Jing-Yuan Chuang 7 و Hsin-Ling Yang 8 ، *

الملخص:الأشعة فوق البنفسجية أ (UVA) - أنواع الأكسجين التفاعلي المستحثة بالإشعاع (ROS) تتوسط الإنتاج المفرطتكون الميلانينفي خلايا الجلد مما يؤدي إلى تصبغ. لقد أظهرنا تأثيرات التصبغ والمضادة للميلانوجين لـ Ectoine ، وهو أسموليت بكتيري طبيعي ، في الخلايا الكيراتينية البشرية المشعة UVA (HaCaT) ، وتم توضيح الآليات الجزيئية الأساسية. عولجت خلايا HaCaTs مسبقًا بتركيزات منخفضة من Ectoine (0. 5-1.5 ميكرومتر) وتم فحصها من أجل عوامل تصبغ مختلفة ومضادة لتكوين الميلانين. هذا العلاج المسبق يقلل بشكل كبير من إنتاج ROS ، وإنتاج الهرمون المنبه للخلايا الصباغية (-MSH) ، وتعبير proopiomelanocortin (POMC) في خلايا HaCaT المشعة للأشعة فوق البنفسجية. ايضا،مضادات الأكسدةالهيم أوكسيجيناز -1 (HO -1) ، NAD (P) H نازعة الهيدروجين [كينون 1] (NQO -1) ، و -جلوتامات-سيستين ليغاز المحفز للوحدة الفرعية (-GCLC) كانت تعبيرات البروتين عن طريق الانتقال النووي للعامل النووي الكريات الحمر 2- العامل المرتبط 2 (Nrf2) الذي أعاقت ضربة قاضية بالفعل هذا التأثير مما يدل على أهمية مسار Nrf2. كان Ectoine يتوسط في تنشيط Nrf2 عبر مسارات p38 ، وبروتين كيناز B (المعروف أيضًا باسم AKT) ، وبروتين كيناز C (PKC) ، وكازين كيناز II بروتين كيناز (CKII). أدى الوسط المكيف الذي تم الحصول عليه من خلايا HaCaT المعالجة مسبقًا والمُشعَّعة بالأشعة فوق البنفسجية UVA إلى تقليل تنظيمالتيروزيناز، البروتين المرتبط بالتيروزيناز -1 و -2 (TRP -1 / -2) ، بروتين كيناز دوري AMP (c-AMP) ، بروتين ربط عنصر c-AMPresponse (CREB ) ، وتعبيرات عامل النسخ (MITF) المرتبط بالميكروفيلم المؤدية إلى خلايا الورم الميلانيني B16F1 0 التي تثبط تخليق الميلانين. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا التأثير المضاد للميلانين في خلايا B16F10 المحفزة MSH كان يمكن ملاحظته فقط عند تركيزات 50-400 ميكرومتر من Ectoine ، مما يدل على الدور الرئيسي الذي يلعبه Ectoine (0.5-1 ميكرومتر) - جلد الكيراتين المعالجتبييضتأثيرات. خلصنا إلى أنه يمكن استخدام Ectoine كعامل تجميلي طبيعي موضعي فعال مع فعالية في إزالة التصبغ ومضادة لتكوين الميلانين.

الكلمات الدالة:إكتوين. الخلايا الكيراتينية.تكون الميلانين; التيروزيناز؛ -MSH ؛ Nrf2

Cistanche له تأثير مضاد للأكسدة.

1 المقدمة

يؤدي تعريض جلد الإنسان لأشعة UVA إلى توليد ROS وكذلك إنتاج الميلانين في خلايا الجلد بشكل مفرط. يمكن أن يؤدي الإنتاج غير المنضبط لـ ROS إلى حالات سرطان الجلد أيضًا. تستهدف عوامل تبييض البشرة الأكثر شيوعًا وتحاول تقليلتكون الميلانينعملية من خلال تثبيط -MSH والتيروزينازإنتاجات [1]. تتكون معظم كريمات تفتيح لون البشرة من الهيدروكينون [2] أو الهيدروكورتيزون [3] ، والتي من المعروف أنها تقلل من تكوين الميلانين ولكن ترتبط أيضًا بآثار جانبية شديدة. على سبيل المثال ، حب الشباب ، الجلد المتقشر والحكة ، تلون الجلد باللونين الأزرق والأسود ، الترقق ، تهيج الجلد والحرقان ، وحتى الالتهاب.تبييضالعوامل من مصادر طبيعية ، على سبيل المثال ، حمض كوجيك (مشتق فطري يتم الحصول عليه من نوعي البنسليوم والرشاشيات) تم الإبلاغ عنه أيضًا أنه يسبب "التهاب الجلد التماسي" للأفراد الذين لديهم بشرة حساسة. في هؤلاء الأفراد ، يمكن أن يتسبب أكثر من 1٪ من حمض الكوجيك في حدوث آثار جانبية شديدة الحساسية [4،5]. لذلك ، فقط عدد قليل من الجلد المشتق بشكل طبيعيتبييضالمنتجات (الأوليوسين ، مستخلص عرق السوس ، حمض الأسكوربيك ، بروتين الصويا ، N-acetyl glucosamine ، إلخ) تُستخدم حاليًا في صناعة مستحضرات التجميل [6]. ومع ذلك ، فإن منتجات العناية بالبشرة التي تستهدف بشكل أساسي خصائص تصبغ البشرة قد فشلت في بعض الأحيان في التركيز على مواجهة الآثار الضارة التي يسببها إنتاج ROS الناجم عن الإشعاع فوق البنفسجيتكون الميلانينفي خلايا الجلد.

Ectoine هو "نقي طبيعي" ينتج من عدة أنواع من الكائنات الحية الدقيقة ظروف مخففة للضغط [7،8]. تم عزل هذا المركب لأول مرة من أنواع البكتيريا التي تعيش في الصحراء المصرية Ectothiorhodospira. تشارك سلسلة جينات الأوبرون (ectA أو ectB أو ectC أو ectD) في إنتاج هذا المركب. تم تعيين Ectoine كيميائيًا على أنه 1،4،5 ، 6- رباعي هيدرو -2- ميثيل -4- حمض بيريميدين كربوكسيل [9]. باعتباره مادة رابطة للرطوبة ، يساعد Ectoine في إعادة هيكلة غشاء خلايا الجلد [10] ، والحماية من أضرار الأشعة فوق البنفسجية والتلوث [11،12] ، وترطيب البشرة [13] ، وتأخير شيخوخة الجلد المبكرة [14] ، وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك بالنسبة لوقاية الجلد ، فقد ثبت أن Ectoine مفيد في علاج التهاب الجلد التأتبي [15] ، ومرض الزهايمر [16] ، بالإضافة إلى تثبيط تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية [17] ، والعلاج الإشعاعي والكيميائي [18] ، وتليف الكبد [ 19]. يُعتقد أن الإكتوين يُظهر خصائصه في إزالة التصبغ وتبييض البشرة دون التسبب في آثار جانبية مرغوبة [20]. على النقيض من ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي أثارها Ectoine غير معروفة. لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد آليات إزالة التصبغ Ectoine بوساطة والآليات المضادة للميلانين التي تم استنباطها في الخلايا الكيراتينية البشرية المشععة بالأشعة فوق البنفسجية (HaCaT) كنظام النموذج الخلوي. تم أيضًا اختبار تأثير إفرازات عوامل حماية الجلد المستحثة بالإيكتوين من خلايا HaCaT إلى وسط المزرعة (وسط مكيف) باستخدام خط خلية سرطان الجلد النموذجي (B16F10) أيضًا.

2. المواد والأساليب

2.1. الكواشف والأجسام المضادة

تم شراء Ectoine (رقم المنتج: 81619 ، نقاء أكبر من أو يساوي 95 في المائة) من Sigma-Aldrich (Taufkichen ، ألمانيا). تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) ، والبنسلين / الستربتومايسين ، و Eagle'smedium المعدل من Dulbecco (DMEM) و L-glutamine من Invitrogen / Gibco BRL (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). l-DOPA و melanin و 3-4 و 5- dimethyl -2- yl -2 و 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) و -MS تم شراؤها من شركة Sigma Chemical Co (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء N-acetylcysteine ​​(NAC) و 20 ، 70- dichlorofluorescein-diacetate (DCFH 2- DA) من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على جميع المثبطات الدوائية المطلوبة لـ JNK (SP600125) و ERK1 / 2 (PD98059) و p38 (SB203580) و PKC (GF109203X) و CKII من Calbiochem (لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم الحصول على مثبط PI3K / AKT (LY294002) من سيجما الدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). جميع الأجسام المضادة لـ POMC و CREB و -actin والتيروزينازو Nrf2 و p-CREB و NQO -1 و PKC والبروتين المرتبط بـ Kelch-like ECH -1 (Keap -1) وTRP -1 و TRP -2 تم الحصول عليها من شركة Santa Cruz Biotechnology Inc. (هايدلبرغ ، ألمانيا). تم شراء الأجسام المضادة ضد -GCLC و HO -1 من شركة Gene Tex Inc. (سان أنطونيو ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). حصلنا على الأجسام المضادة ضد بروتين c-AMP كيناز و CKII من Abcam (كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على Histones و MITF و p-p38 و p38 و p-AKT و AKT من تقنية إشارة الخلية (بيفرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على كواشف الكشف عن اللمعان الكيميائي المحسن (ECL) من ميليبور ، (بيليريكا ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء جميع الكواشف الأخرى (بدرجة HPLC) إما من Sigma-Aldrich أو Merck & Co. ، Inc. (دارمشتات ، ألمانيا).

2.2. زراعة الخلايا

لقد حصلنا على خلايا HaCaT الكيراتينية لجلد الإنسان الخالد وخلايا سرطان الجلد من الفئران B16F10 من كل من Cell Line Services (CLS ، Eppelheim ، ألمانيا) ومجموعة American Type Culture Collection (ATCC ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة الخلايا في DMEM مع 10 في المائة من FBS المنشط بالحرارة ، و 1 في المائة من الستربتومايسين / البنسلين ، و 2 ملي مولار من الجلوتامين في حاضنة مرطبة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

2.3 علاجات الخلايا والأشعة فوق البنفسجية

قبل تشعيع UVA ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا بـ Ectoine (0. 5-1.5 ميكرومتر لمدة 24 ساعة) أو بالمركبة (PBS). بعد الحضانة ، تعرضت الخلايا المغسولة بـ PBS إلى إشعاعات UVA 3 J / cm2 (لمدة 27 دقيقة ، max ، 365 نانومتر ، لا توجد انبعاثات قابلة للاكتشاف أقل من 320 نانومتر) باستخدام UV CROSS-LINKER CL -508 (UVItec ، Cambridge ، المملكة المتحدة) [21].

2.4 فحص ROS داخل الخلايا

تم زرع خلايا HaCaT بكثافة 1.5 × 105 في 8- غرفة مختبر بئر تحتوي على DMEM مدعوم بنسبة 10 بالمائة من FBS ونمت حتى نقطة التقاء 80 بالمائة. عولجت هذه الخلايا لأول مرة بـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine ، متبوعًا بالتعرض لإشعاع UVA 3 J / cm2 للمدة المحددة من الوقت. تم غسل الخلايا باستخدام PBS واستخدمت طريقة DCFH 2- DA لتحديد إنتاج ROS داخل الخلايا باستخدام برنامج حل برنامج Olympus لكل حالة [21].

2.5 الكمي الميلانين

في 6- صفيحة بئر ، تم زرع خلايا سرطان الجلد B16F10 بكثافة 2.5 × 105 خلية / بئر. تمت معالجتها مسبقًا بـ 100 و 200 و 400 ميكرومتر من Ectoine لمدة ساعتين في غياب أو وجود -MSH (1 ميكرومتر). يتبع البروتوكول المستخدم لتقدير الميلانين الطريقة الموصوفة سابقًا [21]. قمنا بقياس محتوى الميلانين باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة ELISA بطول موجة امتصاص يبلغ 470 نانومتر.

cistanche يمنع الميلانين.

2.7. لطخة ويسترن

تمت معالجة خلايا HaCaT (طبق 1 × 1 0 6 خلايا / 10 سم) أو B16F10 (1 × 106 خلايا / طبق 10 سم) مسبقًا بتركيزات مختلفة من Ectoine (0.5 ، 1 ، و 1.5 ميكرومتر) أو -MSH (1 µM) متبوعًا بالإشعاع في غياب أو وجود UVA للفترة الزمنية المحددة. تم حصاد الخلايا المغسولة PBS ، وعزل محتوى البروتين (النووي والخلوي) بعد العلاج. بعد ذلك ، تم إخضاع الخلايا لطريقة اللطخة الغربية المستخدمة سابقًا لتحديد تعبيرات مختلف البروتينات النووية والخلوية [21].

2.8. استخراج الحمض النووي الريبي و RT-PCR

Ectoine المعالجة مسبقًا (1.5 ميكرومتر ، 24 ساعة) تعرضت خلايا HaCaT إلى كاشف TRIzol (Invitrogen ، Carlsbad) لعزل الحمض النووي الريبي الكلي من هذه الخلايا. تم استخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي والكواشف التي توفرها مجموعة SuperScript-III One-Step RT-PCR البلاتينية Taq (Invitrogen ، Carlsbad) في تجربة PCR مع أداة Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة). البادئات الأمامية والخلفية المستخدمة لـ Nrf2 هي: F: 50- AAACCAGTGGATCTGCCAAC -30 ، R -50- GCAATGAAGACTGGGCTCTC -30. كانت البادئات الأمامية والخلفية المستخدمة لـ GAPDH هي: F: 50- GCATCCTGGGCTACACTGA -30 ، R: 50- CCACCACCCTGTTGCTGTA -30. في نهاية التجربة ، تم تحليل منتج PCR باستخدام 1 في المائة من هلام الاغاروز. ثم تم تصورها مع تلطيخ إيثيديوم بروميد. كرقابة داخلية ، استخدمنا GAPDH [22].

2.9 فحص التألق المناعي

تمت زراعة خلايا HaCaT بكثافة 1 × 104 خلية / بئر في مكمل DMEM مع 10 بالمائة FBS في غرفة 8- well Lab Tek (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). لقد عالجنا الخلايا بـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine للوقت المحدد متبوعًا بالإشعاع في غياب أو وجود UVA. خضعت الخلايا لمقايسة التألق المناعي ، والتي تستخدم طريقة موصوفة سابقًا [21].

2.10. تحليل احصائي

استخدمنا متوسط ​​الانحراف المعياري (يعني ± SD) لجميع النتائج المستخدمة في هذه الدراسة. تم تحليل جميع البيانات مع تحليل التباين (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Dunnett لمقارنات الزوجين وتم تقديمه على أنه متوسط ​​± SD لثلاثة أو المزيد من التجارب المستقلة. تم تعيين الدلالة الإحصائية عند * p <0. 0="" 5؛="" **="" p=""><0. 0="" 1="" ؛="" ***="" p=""><0. 0="" 01="" مقارنة="" بخلايا="" التحكم="" غير="" المعالجة="" ،="" و="" #="" p=""><0.05 ؛="" ##="" p=""><0.01 ؛="" ###="" p=""><0.001 عند="" مقارنتها="" بخلايا="" hacat="" المعرضة="" للأشعة="" فوق="" البنفسجية="" أو="" خلايا="" b16f10="" المعالجة="" بـ="">

3. النتائج

3.1. Ectoine المانع للأشعة فوق البنفسجية المستحثة بتوليد ROS في خلايا HaCaT

أولاً ، اختبرنا التأثيرات السامة للخلايا لـ Ectoine (الشكل 1 أ) على خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية. أشارت بيانات MTT الخاصة بنا إلى أنه عند مقارنتها بخلايا التحكم غير المعالجة ، تمت معالجة Ectoine مسبقًا (0 .5-1.5 ميكرومتر) و 3 J / cm2 UVA المكشوفة لم تكن خلايا HaCaT قادرة على إظهار انخفاض كبير في cellviability (الشكل 1B). علاوة على ذلك ، خففت المعالجة Ectoine من موت الخلايا الناجم عن UVA (3 J / cm2) بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1B). بالإضافة إلى بيانات الفلورة لدينا ، والتي أشارت إلى أنه عند مقارنتها بخلايا التحكم ، فإن 3 J / cm2 من الأشعة فوق البنفسجية وعلاجات Ectoine وحدها (1.5 ميكرومتر) أدت إلى زيادة تنظيم مستويات ROS بنسبة 5- و 2- أضعاف ، على التوالى. ومع ذلك ، في حالة معالجة Ectoin ، تم تقليل مستويات ROS بشكل كبير ويمكننا أن نستنتج أن Ectoine لديهمضادات الأكسدةتأثير ضد أشعة UVA. يؤدي هذا أيضًا إلى تحفيز المستويات القاعدية لـ ROS في خلايا HaCaT (الشكل 1C ، D).

3.2 قام Ectoine بقمع تعبيرات POMC و -MSH في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية

تم تحفيز الخلايا الكيراتينية المكشوفة للأشعة فوق البنفسجية من أجل ROS-p53 بوساطة POMC وأيضًا هرمون الببتيد الصغير -MSH المشتق من POMC [23]. لذلك ، حددنا التغييرات في أنماط التعبير عن -MSH و POMC والبروتينات الأخرى المرتبطة في خلايا Ectoine المعالجة مسبقًا HaCaT ثم عرّضناها لـ UVA (3 J / cm2). أشارت بيانات اللطخة الغربية إلى أن الانتفاخ الناجم عن UVA لتعبيرات -MSH و POMC قد تم تنظيمه بواسطة المعالجة Ectoine ؛ في حين أن معالجة Ectoinetreatment بدون تشعيع UVA قد أعاقت تمامًا تعبيرات -MSH و POMC لخلايا HaCaT غير المشععة (الشكل 2 أ). في وقت لاحق ، اختبرنا تأثير "الوسط المكيف" (لوح 10 مل / 100 مم) ، الذي تم الحصول عليه من خلايا HaCaT المعالجة مسبقًا و UVA من Ectoine ، علىتكون الميلانينمن خلايا سرطان الجلد B16F10. يوضح الشكل 2 ب هذه الوسيلة المكيفة التي تخضع للتنظيمالتيروزينازو TRP -1 و TRP -2 و c-AMP protein kinase و p-CREB و CREB و MITF في خلايا B16F10.

3.3 Ectoine Downregulated Melanin and Tyrosinase Expression في خلايا B16F10 محفزة MSH

تعرضت خلايا سرطان الجلد B16F10 لأول مرة لتركيزات أعلى من Ectoine وتم تحديد تأثير السمية الخلوية باستخدام اختبار MTT. يوضح الشكل 3 أ أن Ectoine لم يكن له تأثير كبير على صلاحية خلايا B16F10 بتركيزات أعلى (100-400 ميكرومتر لمدة 72 ساعة). ومع ذلك ، لم تتأثر صلاحية الخلية في 24 و 48 ساعة من علاج Ectoine (البيانات غير معروضة). لذلك ، تم استخدام هذه التركيزات لتحديد تأثير Ectoine على تحفيز MSHتكون الميلانينفي خلايا B16F10. أظهرت بيانات قياس الميلانين الكمي أنه ، مقارنة بخلايا التحكم ، أدى العلاج باستخدام -MH (1 ميكرومتر) وحده إلى زيادة تنظيم مستويات الميلانين بنسبة تزيد عن 25 بالمائة. ومع ذلك ، مقارنة بمعالجة -MSH وحدها ، تتعرض الخلايا لتركيزات متزايدة من Ectoine (100-400 ميكرومتر عند 72 ساعة) اعتمادًا على الجرعة وخفضت بشكل كبير النسبة المئوية لمحتوى الميلانين مع الحد الأقصى للتنظيم بنسبة 85 في المائة فقط (أو 15 في المائة من غير المعالجة التحكم) في 400 ميكرومتر من المعالجة Ectoine (الشكل 3B). علاوة على ذلك ، أظهرت بيانات لطخة غربية أيضًا أن -MSH تم تحفيزهاالتيروزينازتم تقليل تعابير (24 ساعة) و p-CREB (2 h) بشكل كبير مع زيادة تركيزات المعالجات Ectoine في خلايا سرطان الجلد هذه (الشكل 3C).

3.4. قام Ectoine بتنظيم تعبير HO -1 و NQO -1 و -GCLC في خلايا HaCaT

لتحديد تأثير الوقت على الانتقال النووي بوساطة Ectoine لـ Nrf2 والتعبير اللاحق المصب لبروتينات HO -1 و NQO -1 و -GCLC ، تم تعريض خلايا HaCaT لـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine وتم حصاد البروتينات الخلوية 0. 5 ، 1 ، 2 ، 4 ، 8 ، أو 12 ساعة بعد المعالجة بالصدمات الكهربائية. أشارت بيانات اللطخة الغربية إلى أنه باستثناء بروتين -GCLC ، تسبب 1.5 ميكرومتر من Ectoine في أقصى تعبير لبروتينات HO -1 و Nrf2 و NQO -1 في النقطة الزمنية 4 ساعات. تم عرض -GCLC في نقطة زمنية 8 ساعات (الشكل 5 أ). تقودنا البيانات التي تم الحصول عليها من منحنى الوقت إلى اختبار تأثير تركيز Ectoine على التعبير عنمضادات الأكسدةالبروتينات في 4 ساعات. يوضح الشكل 5 ب أن جميع البروتينات الثلاثة المضادة للأكسدة أظهرت أقصى تعبير عند 1.5 ميكرومتر من تركيز Ectoine. في وقت لاحق ، تم اختبار تأثيرات العلاج المسبق لـ Ectoine على التعبير عن نسبة Nrf2 و Keap -1 في خلايا HaCaT المشعة UVA. أشار تحليل البيانات الغربية إلى أن المعالجة المسبقة بـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine أظهرت زيادة في نسبة Nrf2 / Keap -1 في خلايا HaCaT المشعة بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 5C) ، كما رأينا بيانات متسقة مع زيادة التعبير عن NQO بروتينات -1 و HO -1 و -GCLC في خلايا HaCaT المعالَجة مسبقًا من Ectoine والتي تم تشعيعها بـ 3 J / cm2 UVA (الشكل 5D). تشير هذه البيانات إلى أن المعالجة المسبقة لـ Ectoine تلعب دورًا وقائيًا في خلايا HaCaT المشعة فوق البنفسجية.

3.5 تم إشراك العديد من مسارات الإشارات في تنشيط Nrf2 في خلايا HaCaT المعالجة بإيكتوين

لقد حددنا مسارات الإشارات المشاركة في النقل النووي بوساطة Ectoine لـ Nrf2. تمت معالجة خلايا HaCaT مسبقًا بمثبطات دوائية من مسارات إشارات PI3K / AKT و ERK و p38 و JNK و PKC و ROS و CKII ، تليها 1.5 ميكرومتر من Ectoine. أظهرت بيانات اللطخة الغربية الخاصة بـ Nrf2 النووي أن مسارات p38 MAPK و PI3K / AKT و PKC و CKII كانت متورطة في هذه الآلية (الشكل 6 أ). من المعلومات التي تم الحصول عليها ، حددنا أيضًا تأثير المعالجة المسبقة لـ Ectoine على الدور الذي تلعبه هذه المسارات في التعبير عن البروتينات المضادة للأكسدة. يوضح الشكل 6 ب أن التثبيط الدوائي لمسارات MAPK و p38 و PI3K / AKT و CKII و PKC أدى إلى تنظيم تعبير NQO -1 و HO -1 و -GCLCمضادات الأكسدةالبروتينات في خلايا HaCaT. علاوة على ذلك ، يشير الوقت المستغرق لفسفرة AKT ، p38 ، والتعبير عن PKC و CKII أثناء تعرضهما لـ Ectoine ، إلى أنه ، باستثناء p-AKT ، حدثت فسفرة p38 وتعبيرات PKC و CKII في وقت لاحق. النقاط الزمنية فقط (بعد 30 دقيقة) (الشكل 6 ج). في حالة AKT ، لوحظ الفسفرة من النقطة الزمنية 15 دقيقة التي وصلت إلى ذروتها في 30 دقيقة (الشكل 6 ج). في حالة AKT ، لوحظ وجود الفسفرة من النقطة الزمنية 15 دقيقة التي وصلت إلى ذروتها في 30 دقيقة (الشكل 6C). اقترحت هذه النتائج التراكمية أن مسارات الإشارات p38 و AKT و PKC و CKII قامت بتنشيط مضادات الأكسدة Ectoine بوساطة الانتقال النووي لـ Nrf2 مما يؤدي إلى التعبير عن البروتينات المضادة للأكسدة.

3.6 تم قمع التأثير المضاد للميلانوجينيك بوساطة Ectoine بسبب ضربة قاضية لـ Nrf2

دور Nrf2 في مضاد Ectoine بوساطةتكون الميلانينتم تحديده من خلال إسكات Nrf2 في خلايا HaCaT. أشارت البيانات من اللطخة الغربية إلى أن خلايا ضربة قاضية Nrf2 التي تعرضت لـ 1.5 ميكرومتر Ectoine أظهرت الحد الأدنى من التعبير عن NQO -1 و HO -1 و -GCLCمضادات الأكسدةالبروتينات (الشكل 7 أ). في وقت لاحق ، اختبرنا تأثير ضربة قاضية Nrf2 على التعبير عن مستويات -MSH في خلايا HaCaT المشععة (3 J / cm2) UVA. أشارت نتائج اللطخة الغربية إلى أنه للتحكم في الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة من siRNA ، كان تشعيع UVA مهمًا في تنظيم التعبير عن مستويات MSH في الخلايا غير المعرضة لـ Ectoine (الشكل 7B). ومع ذلك ، فقد قام 1.5 ميكرومتر Ectoine بقمع هذا التأثير. بالنسبة للحالة الأخرى ، أظهرت الخلايا المنقولة بواسطة siNrf2 انخفاضًا في التعبير عن مستويات -MSH في كل من الخلايا غير المعالجة والمعالجة (الشكل 7 ب). على غرار بيانات MSH ، أشارت بيانات الفلورة لدينا أيضًا إلى أن إشعاع UVA قام بتنظيم إنتاج ROS بشكل كبير في خلايا siRNA للتحكم غير المعالجة Ectoine (الشكل 7C ، D) ، ومع ذلك ، تم قمع هذا التأثير بشكل كبير عندما تعرضت الخلايا لـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine. من ناحية أخرى ، أظهرت خلايا HaCaT المنقولة من Nrf2 والمعرضة للإشعاع UVA 8- ضعفًا تقريبًا في مستويات ROS مقارنة بالخلايا المنقولة Nrf2 التي لم تتعرض للإشعاع باستخدام UVA ولكنها تعرضت للعلاج بالأكتوين (الشكل 7C ، D). تشير جميع هذه البيانات إلى الدور الوقائي بوساطة Ectoine الذي يلعبه Nrf2 في تقليل إنتاج الميلانين في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية. . تشير كل هذه البيانات إلى الدور الوقائي بوساطة Ectoine الذي يلعبه Nrf2 في تقليل إنتاج الميلانين في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية.

فائدة cistanche: تبييض البشرة

4. مناقشة

بشرة مختلفةتبييضوكلاء قيد الاستخدام في صناعة مستحضرات التجميل. العديد من هذه العوامل من أصل كيميائي وتعاني من قيود التسبب في آثار جانبية مختلفة بما في ذلك السرطانات [24-26]. لذلك ، فإن تحديد عوامل تبييض البشرة الآمنة والطبيعية يمثل حاجة الساعة. من المعروف أن Ectoine (الشكل 1 أ) يُستخدم كعنصر نشط في كريمات الوجه وعوامل التجميل الأخرى. يعمل هذا كعامل ترطيب للبشرة ، كما أنه يؤخر شيخوخة الجلد المبكرة أيضًا [27]. تستهدف جميع عوامل تبييض البشرة المعروفة تقريبًا التقليل من التنظيمالتيروزينازنشاط الإنزيم في الخلايا المشعة بالأشعة فوق البنفسجية الذي يقلل منتكون الميلانينفي خلايا الجلد. Yao et al. أظهرتبييضخصائص Ectoine المركب حيوياً واقترح أنه عامل تبييض مبتذل. في دراستهم ، اختبروا التركيز العالي (5 0 0 ميكرومتر) من Ectoine لتأثيره التبييض على سرطان الجلد في الفئران (B16F0) وسرطان الجلد البشري (A2058) وخلصوا إلى أن Ectoine آمن و عامل محتمل للتطبيق التجميلي والسريري [20]. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا باختبار التأثيرات المفيدة لتركيزات منخفضة من Ectoine (0.5-1.5 ميكرومتر) على خلايا HaCaT المشععة بالأشعة فوق البنفسجية وتم فك شفرة الآليات الجزيئية الكامنة. في دراستنا ، تبين أن Ectoine ، من خلال مسار Nrf2 / ARE ، لم يتسبب فقط في التعبير عن التعبير الجيني المضاد للأكسدة ولكن أيضًا قلل من تنظيم مستويات -MSH في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية من خلال قمع POMC. ارتبط الانخفاض في مستويات -MSH بانخفاض تنظيم نشاط إنزيم التيروزيناز مما أدى إلى انخفاض إنتاج الميلانين. من معرفتنا ، هذا هو التقرير الأول الذي تم إثباته من خلال الآلية التي أثارها Ectoine في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية. حددت هذه الدراسة الآليات الجزيئية التي أظهرها Ectoine في خلايا HaCaT في نظام النموذج الخلوي.

حددنا أولاً التركيزات شبه المميتة لـ Ectoine بالإضافة إلى تأثير إشعاع UVA على قابلية خلايا HaCaT للحياة. أشارت بيانات MTT الخاصة بنا إلى أن التركيزات المنخفضة من Ectoine (0 .5-1.5 ميكرومتر) لم يكن لها تأثير كبير على صلاحية خلايا HaCaT (الشكل 1B). زاد العلاج المسبق لـ Ectoine من قابلية 3 J / cm2 من خلايا HaCaT المشعّة للأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1 ب). بناءً على هذه الملاحظات ، واصلنا تجاربنا الإضافية باستخدام 1.5 ميكرومتر من المعالجة المسبقة لـ Ectoine وتشعيع UVA بجرعات 3 J / cm2.

يعتبر إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المحرض بالإشعاع في الخلايا الكيراتينية للجلد حقيقة معروفة [28]. لذلك ، قمنا أيضًا باختبار أي آثار مفيدة من المعالجة المسبقة لـ Ectoine في إنتاج ROS المستحث بالأشعة فوق البنفسجية في خلايا HaCaT. أشارت بيانات شدة التألق DCF الخاصة بنا إلى أن المعالجة المسبقة بـ 1.5 ميكرومتر من Ectoine قللت بشكل كبير من إنتاج الخلايا الكيراتينية الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية UVA. كان من الملاحظ أيضًا أن 1.5 ميكرومتر من Ectoine يمكن أن يتسبب في زيادة المستوى الأساسي في مستويات ROS في خلايا HaCaT التي ثبت أنها ذات دلالة إحصائية (الشكل 1D ، E).

روسو وآخرون ذكرت أن POMC تفرزها الخلايا الكيراتينية البشرية والخلايا الصباغية البشرية وقد حفزتتكون الميلانين[29]. من خلال الحفاظ على هذا في الاعتبار ، قمنا أيضًا باختبار تأثير تشعيع UVA والمعالجات المسبقة لـ Ectoine على البروتينات المرتبطة بتكوين الميلانين في خلايا HaCaT. أشارت بيانات اللطخة الغربية الخاصة بنا إلى أن التنظيم المعتمد على الجرعة للتعبير عن بروتينات -MSH و POMC في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية كان ناتجًا عن المعالجة المسبقة بواسطة Ectoine.تكون الميلانينالبروتينات المرتبطة. والجدير بالذكر أن جميع البروتينات المختبرة تقريبًا (تيروزينازو TRP -1 و TRP -2 و c-AMP proteininkinase و CREB و MITF) أظهرت انخفاضًا في التعبيرات مع زيادة تركيزات العلاج المسبق Ectoinepre في خلايا HaCaT المشعة بأشعة UVA (الشكل 2 أ ، ب). تشير هذه البيانات إلى حقيقة أن Ectoin تمتلك خصائص مضادة للميلانين في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية.

تم اختبار الفعالية المضادة للميلانوجين لـ Ectoine في خلايا B16F10 ، وهو خط خلايا سرطان الميلانوما المعروف والمستخدم فيتكون الميلانيندراسات [30]. كانت إحدى الملاحظات البارزة في دراستنا أنه ، على عكس خلايا HaCaT ، كانت التركيزات العالية من Ectoine (100-400 ميكرومتر) ضرورية لقمع تخليق الميلانين في خلايا B16F10 المحفزة بـ MSH (الشكل 3 ب). أشارت بياناتنا الغربية إلى أن جرعة Ectoine التي تعتمد على الجرعة قللت من التعبير عنالتيروزينازوالبروتينات p-CREB في خلايا B16F10 المحفزة MSH ، مما يؤدي إلى التأثير المذكور أعلاه (الشكل 3C). لذلك ، تم أيضًا اختبار ما إذا كانت هذه التركيزات العالية من Ectoine يمكن أن تؤثر على صلاحية خلايا B16F10. أشارت نتائج MTTres إلى أن التركيزات العالية من Ectoine (100-400 ميكرومتر) لم يكن لها أي تأثير على صلاحية خلايا B16F10 (الشكل 3 أ). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا الكيراتينية تلعب دورًا رئيسيًا فيتكون الميلانينوآثار إزالة الصباغ.

تم توثيق دور عامل النسخ Nrf2 في استقلاب خلايا الجلد بشكل جيد [31]. لذلك ، اختبرنا الآليات التي يلعبها مسار Nrf2 / Keap -1 في التأثيرات Ectoine بوساطة في الخلايا الكيراتينية. يوضح الشكل 4 أ أن Ectoine يعتمد على الجرعة بشكل كبير ويزيد نسبة Nrf2 / Keap -1 مع أقصى تأثير لوحظ عند تركيز 1.5 ميكرومتر من Ectoine. لوحظ أيضًا أن 1.5 ميكرومتر Ectoine فضل الانتقال النووي لبروتين Nrf2 مع أقصى تعبير لـ Nrf2 من جزء البروتين النووي الذي لوحظ في النقطة الزمنية 2 ساعة (الشكل 4 ب). (الشكل 4 د).

في الخلايا الصباغية البشرية والخلايا الكيراتينية ، ماروت وآخرون. وشرح آخرون أهمية المسار الدفاعي Nrf2 في استجابات الإجهاد التأكسدي الضوئي [32]. لقد درسنا أيضًا تأثير تعبير البروتين المضاد للأكسدة Ectoinemeded في خلايا HaCaT. أشارت بيانات منحنى الوقت لدينا إلى أن التعبير Ectoinemeded لجميع البروتينات الثلاثة المضادة للأكسدة (HO -1 ، NQO -1 ، -GCLC) ، و Nrf2 تم عرضها للتعبير بطريقة ثنائية الطور مع الوقت المتزايد ({{ 8}}. 5-12 ساعة) مع تأثير ملحوظ لوحظ في 4 ساعات النقطة الزمنية (الشكل 5A). من هذا ، منحنى التركيز الذي يقيس تأثير تركيز الإيكتوين علىمضادات الأكسدةتم تحديد تعبير البروتين أيضًا في نقطة زمنية تبلغ 4 ساعات. يوضح الشكل 5 ب أنه بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة ، فإن علاج Ectoine زاد من تعبير البروتينات HO -1 و NQO -1 و -GCLC اعتمادًا على الجرعة. قمنا أيضًا بقياس كيف أظهر تركيز Ectoine تأثيرات وقائية في خلايا HaCaT التي تعرضت لأشعة UVA. أظهرت بيانات اللطخة الغربية أن Ectoine - اعتمادًا على الجرعة - زاد من التعبير عن البروتينات المضادة للأكسدة مع تنظيم دراماتيكي في نسبة Nrf2 / Keap -1 أيضًا (الشكل 5C ، D). أشارت هذه النتائج إلى أن معالجة Ectoinepretress (1.5 ميكرومتر ، 4 ساعات) لها تأثير محتمل على تحفيز تعبير البروتين المضاد للأكسدة في خلايا HaCaT التي يمكن أن تقاوم الآثار الضارة التي يسببها التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

مضادات الأكسدة

5. الاستنتاجات

من البيانات أعلاه ، خلصنا إلى أن التركيزات المنخفضة من Ectoine ({0}}. 5-1.5 ميكرومتر) يمكن أن تنظم إنتاج -MSH والميلانين عن طريق قمع POMC والتيروزينازpathwayin خلايا HaCaT المشعة للأشعة فوق البنفسجية ، مما يشير إلى مضاداتتكون الميلانينفعالية. بالإضافة إلى ذلك ، شارك Ectoine أيضًا في قمع إنتاج ROS داخل الخلايا في خلايا HaCaT. على عكس خلايا HaCaT ، كانت التركيزات العالية من Ectoine (50-400 ميكرومتر) قادرة على إظهار تأثير مماثل في الخلايا الصباغية B16F10 التي تشير إلى حقيقة أن الخلايا الكيراتينية يمكن أن تلعب دورًا رئيسيًا في Ectoine الوسيط.تكون الميلانينوالجلد-تبييضتأثيرات في خلايا الجلد. الأهم من ذلك ، تأثيرات مفيدة بوساطة Ectoine عن طريق تنشيط مسار Nrf2 ، الذي يحفز التعبير عنمضادات الأكسدةالبروتينات HO -1 و NQO -1 و -GCLC. تم إثبات أن AKT هو أول مسار إشارات يبدأ تنشيط Nrf2 متبوعًا بالمسارات الأخرى (p38 و PKC و CKII). أخيرًا ، قدم إسكات Nrf2 دليلًا مباشرًا على أن Nrf2 يلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم ROS داخل الخلايا وكذلك إنتاج -MSH. خلصنا إلى أن آلية التبييض الرئيسية لـ Ectoine يجب أن تكون سببًا في تثبيط مسار ROS-p53 / POMC - - MSH في خلايا HaCaT المشعّة بالأشعة فوق البنفسجية ، لذلك يمكن أن يكون Ectoine أو مشتقاته مكونًا نشطًا في المرطبات والمستحضرات التي تستخدم كبشرة محتملة وطبيعيةتبييضوكلاء في صناعة مستحضرات التجميل.

مكمل مضاد للأكسدة