تأثير الطب العشبي الصيني على التطور المبكر للجنين
Mar 08, 2022
جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1 و Xu Qinwei 2 و Zhang Li 2 و Zhang Wenchang 2 و Feng Shutang 3 *
[الملخص]استخدم الخنزيرالأجنةمن الإخصاب في المختبر للبحث والمقارنة. تأثير إضافةصينىدواءمكوناتسيستانشو Astragalus لتطويرالأجنة المبكرةفي المتوسط NCSU تم إثبات {{0}}. أثبتت التجربة أن: (1) نسبة الحجم 0.10 بالمائةسيستانشو 0. تمت إضافة 10 بالمائة Astragalus إلى مرق الثقافة ، وسيستانشمجموعة إضافة كان معدل الكيسة الأريمية (15.76 في المائة) أعلى بكثير من معدل الكيسة الأريمية (9.26 في المائة) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0. 05) ، مشيرًا إلى ذلكسيستانشالصحراءيمكن أن تعزز بشكل كبيرالجنين المبكرتطوير. (2) عند تركيز (V / V) منسيستانشهو {0}}. 0 5 بالمائة و 0.10 بالمائة ، معدل الكيسة الأريمية (17.02 بالمائة و 16.75 بالمائة) أعلى بكثير من المجموعة الفارغة (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">صينىدواءسيستانشفي وسط المزرعة في 2- مرحلة الخلية ، كان معدل تطور الكيسة الأريمية (13.81 بالمائة) أعلى بشكل ملحوظ منه في 4- مرحلة الخلية (7.53 بالمائة) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">سيستانشbefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
بسبب الاختلافات في البيئة التنموية في الجسم الحي وفي المختبر ، فإنالأجنةسوف تتضرر من الجذور الحرة أثناء الاستنبات في المختبر للخنازير المبكرةالأجنة، مما يسبب اضطرابات التمثيل الغذائي للخلايا ، أو تلف الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتينات [1]. من أجل زيادة تحسين معدل تطور الإخصاب في المختبر عن طريق السائل المنوي المجمد ، استكشفت هذه التجربة إضافة تركيز معين منسيستانشو Astragalus لتحسينالجنينبيئة التطوير في المختبر.
1. المواد والأساليب
1. 1 شروط الثقافة:
تم إجراء النضج المختبري لبويضات الخنازير والتخصيب في المختبر وزراعة الأجنة المبكرة في المختبر في حاضنة تحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة تبلغ 39 درجة.
1.2 الكواشف ووسط الثقافة:
السائل الأساسي لنضج البويضات هو NCSU {0} ، سائل غسيل البويضات هو سائل PVA-TL-HEPES ، سائل الإخصاب هو Tris buffer (mTBM) يحتوي على 0. 1٪ BSA ، و سائل غسيل الحيوانات المنوية هو Dubecco's مع 0. 1٪ BSA. المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) ، سائل إذابة الحيوانات المنوية هو BTS ، سائل الركام هو 1 مجم / مل هيالورونيداز PBS ، سائل عملية البويضة هو NCSU المخزن بواسطة HEPES -23 ، ويتم تكميل سائل المزرعة الأساسي للأجنة المبكرة بـ 0 .4 بالمائة BSA NCSU -23 ، أضف (V / V) 0. 05 بالمائة ~ 0.15 بالمائة Cistanche حسب الحاجة ، استخدم BTS لإذابة السائل المنوي. قبل الاستخدام ، قم بالتسخين المسبق والمعايرة لأكثر من 4 ساعات في حاضنة تحتوي على 5 بالمائة من هواء ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة تبلغ 39 درجة [2].
1.3 طريقة الغليان للطب الصيني:
محلول القسطرة: خذ 5 جرام وضعه في دورق بسعة 1 0 0 مل ، أضف الماء عالي النقاوة واغمره في ماء عالي النقاوة ، واتركه يغلي على نار عالية ، واتركه يغلي لمدة 20 دقيقة ، ثم اجمعه الحساء؛ كرر العملية المذكورة أعلاه ، اجمع 3 مرات متتالية ، حجم ثابت إلى 100 مل ، 0.22 ميكرومتر احتياطي. محلول استراغالوس: خذ 5 جم وضعيه في دورق سعة 100 مل ، وأضف الماء عالي النقاوة واغمره ، واغليه على نار عالية ، واتركه يغلي لمدة 20 دقيقة ، ثم اجمع الحساء الطبي ؛ كرر العملية المذكورة أعلاه ، اجمع 3 مرات متتالية ، اضبط الحجم على 100 مل ، مرشح 0.22 ميكرومتر احتياطي.
دواء صينيعشبي:سيستانش
1.4 نضوج بويضات الخنازير في المختبر:
تم جمع المبايض من الخنازير من مسلخ بكين Pengcheng للأغذية ، ووضعها في 0. 9٪ من محلول ملحي عادي يحتوي على مضادات حيوية عند حوالي 38 درجة ، ونقلها مرة أخرى إلى المختبر في غضون 4 ساعات ، وغسلها بمحلول ملحي عادي ثلاث مرات. استخدم حقنة 10 مل مع إبرة قياس 12- لاستخراج البويضات التي يبلغ قطرها 2-6 مم على سطح المبيض. اغسل 3 إلى 4 مرات في محلول TL-HEPES و 3 ~ 4 مرات في NCSU -23 الذي تمت معايرته في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لأكثر من 4 ساعات. انقل 20 ~ 30 بويضة كمجموعة إلى 100 ميكرولتر ، أضف 10 بالمائة PFF ، 10 IU / mL HCG ، 10 IU / mL PMSG ، 10 نانوغرام / مل EGF NCSU -23 قطرات وثقافة لحوالي 22 ساعة ، قم بتغيير قطرات متوسطة إلى NCSU -23 مع 10 بالمائة PFF و 10 نانوغرام / مل من EGF وتستمر في الثقافة لمدة 44 ~ 46 ساعة [3].
1.5 سعة الحيوانات المنوية والتخصيب في المختبر:
قم بإعداد محلول mTBM بدون كافيين و BSA وقم بمعايرته لمدة 48 ساعة في حاضنة بنسبة 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة تبلغ 39 درجة ، وضبط قيمة الأس الهيدروجيني في نطاق 7.2 ~ 7.8 ؛ أضف الكافيين و BSA 44 ساعة قبل الاستخدام ، واستمر في الموازنة. تم اختبار السائل المنوي للتأكد من جودته ، وتم طرد 1 0 مل مركزًا عند 9 0 0 دورة / دقيقة لمدة 3 دقائق ، وأضيف 10 مل من محلول DPBS يحتوي على 0.1 بالمائة من مساحة سطح الجسم للتعليق ، وطرده عند 900 ص / دقيقة لمدة 3 دقائق [3] ؛ بعد تعليق 1 مل من محلول TBM ، تم إمالته 60 درجة ، يتم إجراء معالجة تجميع الطاقة الأولية في حاضنة مع 5 بالمائة من هواء ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة تبلغ 39 درجة لمدة ساعة واحدة [3 ~ 5]. يتم وضع مجمع خلايا البويضات الركامية الذي ينضج حتى 44 ~ 46 في محلول غسيل البويضات الذي يحتوي على 0.1 بالمائة هيالورونيداز ، وتتم إزالة الخلايا الركامية عن طريق الماصات ، ثم يتم تعريض البويضات. اغسل ثلاث مرات في TBM المتوازن ، وأخيراً ضع كل 10-15 قطعة في مجموعة من 50 ميكرولتر من TBM ، وانتظر الحيوانات المنوية [6 ، 7]. حقن 50 ميكرولتر من السائل المنوي المنبع من السعة في قطرة من البويضات المحتوية على TBM ، وإجراء الإخصاب لمدة 6 ساعات في حاضنة مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة 39 درجة كحد أقصى.
1.6 التطور المبكر والكشف عن البويضات المخصبة:
بعد 6 ساعات من الإخصاب ، عولجت البويضات بـ NCSU -23 مخزنة بسائل التشغيل HEPES أو NCSU - 23 مع 0 .4٪ من مساحة سطح الجسم في سائل زراعة الأجنة. 23 شطف 3 مرات ، غيّر الوسط إلى قطرة متوازنة 0. 4٪ من BSA NCSU -23 واحتضنها لأكثر من 8 أيام. تحقق من معدل انقسام البويضات الملقحة الافتراضية في اليوم الثاني ، وتحقق من معدل التورم (بالإضافة إلى معدل الكيسة الأريمية) في اليوم السادس ، وتحقق من معدل الكيسة الأريمية في اليوم الثامن [8]. تم فحصهم جميعًا وتسجيلهم تحت مرآة الجسم.
1.7 التصميم التجريبي:
1.7.1 تأثير مكونات الطب الصيني التقليدي على تطور الجنين المبكر.
خنزير Wuzhishan [8] بعد السعة ، الإخصاب في المختبر ، يكتمل الإخصاب ، وبعد حدوث الانقسام ، يتم استبدال الأجنة حتى تتم إضافتها إلى 0. 1٪ (V / V). تمت زراعة Cistanche و 0. 1٪ استراغالوس و NCSU -23 (0. 4٪ BSA) بدون مكونات مهمة (مجموعة فارغة) لمراقبة تطور البويضات المخصبة والأجنة المبكرة ، والحكم على آثار اثنين من مكونات الطب الصيني التقليدي على تأثير تطور الجنين في وقت مبكر في المختبر.
1.7.2 تأثير تركيز Cistanche على التطور المبكر للأجنة.
يتم تكثيف السائل المنوي لخنزير Wuzhishan ويخضع للإخصاب في المختبر. بعد اكتمال الإخصاب ، يتم تغيير السائل إلى {{0} بالمائة (مجموعة فارغة) ، 0. 0 5 بالمائة ، 0. 1 بالمائة ، و 0.1 في المائة على التوالي. في 15 بالمائة Cistanche NCSU -23 (0.4 بالمائة BSA) ، راقب تطور البويضات المخصبة واحكم على تأثير التركيزات المختلفة لمكون الطب الصيني Cistanche على التطور المبكر للجنين في المختبر.
1.7.3 تأثير فترة إضافة Cistanche على التطور المبكر للجنين.
السائل المنوي Wuzhishan خنزير هو السعة ويخضع للإخصاب في المختبر. بعد نهاية الإخصاب ، تنقسم البويضة المخصبة إلى مرحلة الخلية {0} ، وتنقسم البويضة المخصبة إلى مرحلة الخلية 4- ، ويتم تبادل السائل وإضافته بشكل منفصل. 0. 1٪ Cistanche NCSU -23 (0.4٪ BSA) ، يراقب تطور البويضات المخصبة ويحكم على تأثير إضافة cistanche على التطور المبكر للجنين في المختبر في مراحل مختلفة.
1.8 التحليل الإحصائي:
استخدم SPSS13. 0 اختبار مربع كاي (χ2) وتحليل التباين أحادي الاتجاه.
2. نتيجة في التحليل
2. 1 تأثير مكونات الطب الصيني التقليدي على التطور الجنيني المبكر
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0 05). كان معدل الكيسة الأريمية في المجموعتين أعلى من معدل المجموعة الفارغة ، وكان معدل الكيسة الأريمية لمجموعة Cistanche مختلفًا عن معدل المجموعة الفارغة. هام (ص<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 تأثير تركيز مكون الطب الصيني Cistanche على التطور الجنيني المبكر
كما هو موضح في الجدول 2 ، فإن إضافة Cistanche بتركيز حجمي قدره 0. 0 5 في المائة إلى 0.10 في المائة في سائل زراعة الأجنة له تأثير تعزيز أفضل على سائل الحيوانات المنوية المجمدة في أجنة الإخصاب في المختبر من WZSP ، ومعدل تطور الكيسات الأريمية يختلف اختلافًا كبيرًا عن معدل تطور المجموعة الفارغة (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 تأثير إضافة فترة من مكون الطب الصيني Cistanche على التطور الجنيني المبكر
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0 05). ومع ذلك ، كان هناك فرق كبير مقارنة بإضافة 4 خلايا (P.<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. مناقشة
بالمقارنة مع التطور الطبيعيالأجنةفي الجسم الحي ، البيئة التنموية لأطفال الأنابيب المخصبةالأجنةيختلف اختلافًا كبيرًا. خلال عمليةالجنينالنمو والانقسام ، يتم إنتاج كمية كبيرة من الجذور الحرة ، وبعض المواد السامة ، وهو أمر غير مواتٍ لنمو الجنين. يمكن للأجنة النامية بشكل طبيعي في الجسم القضاء على هذه العوامل غير المواتية من خلال التمثيل الغذائي في البيئة الداخلية ؛ سوف تتراكم هذه العوامل غير المواتية دائمًا في بيئة نمو الجنين في الإخصاب في المختبر. التقليديةصينىدواءالمكوناتسيستانشقد يكون لها وظيفة تقليل عدم التركيز والقضاء على بعض الجذور الحرة ، من أجل زيادة تحسين معدل تطور الإخصاب في المختبر عن طريق السائل المنوي المجمد. استكشفت التجربة إضافة تركيز معين منسيستانشو استراغالوس. أكدت النتائج أن استراغالوس ليس له تأثير فعال في تحسين بيئة الاستزراع في المختبر. تركيز مناسب لـسيستانشله تأثير ترويجي معين علىالجنين المبكرالتنمية ، ولكن عند تركيزسيستانشيتجاوز تركيزًا معينًا ، وله أيضًا تأثير مثبط علىالجنينتطوير.
استكشفنا أيضًا التأثيرات المختلفة لـسيستانش، وهو تقليديصينىدواءالمكون ، في مراحل مختلفة ، ووجدت التجربة أنالأجنة المبكرةلديك معدل تطوير أعلى في المرحلة اللاحقة عندماcistancheتمت إضافته في مرحلة الخلية 2-. السبب المحتمل يرجع إلى البيئة الخارجية للمستقبل. أكسيد النيتريك (NO) هو جزيء إشارة وعامل سام للخلايا مع مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية. تأثير NO onالجنين المبكرالتنمية ينبغي أن ترجع إلىالجنين المبكرمرحلة التطور ، والتي قد تكون ناجمة عن أحد أسباب 2- كتلة الخلايا (2- كتلة الخلايا) في زراعة أجنة الثدييات ، وتحدث إحصار الخنازير في المختبر في 4- مرحلة الخلية [ 9]. إضافة التقليديةصينىدواءقد تقضي المكونات على الجذور الحرة لـ NO إلى حد معين وتخفيف العوامل غير المواتية لـالجنيننمو [10].
سيستانش
مراجع
[1] Comport M. ثلاثة نماذج من احتشاء الخلية بفعل الجذور الحرة [J]. تفاعل بيول ، 1989 ، 72 (1/2): 1- 56.
[2] بان دنجكي. دراسة عن العوامل المؤثرة على نمو الخلايا الجسدية المستنسخةالأجنة[د]. بكين: جامعة الصين الزراعية ، 2005.
[3] تشانغ يونهاي. بحث عن انتاج الخنازير المستنسخةالأجنةباستخدام تقنية نقل نواة الخلية الجسدية [D]. بكين: جامعة الصين الزراعية ، 2005.
[4] لو شنغ شنغ ، تشانغ يانلينج ، شي ديشون ، وآخرون. آثار إضافة مصل الأبقار والسائل الجريبي الخنازير أثناء النضج على النضج النووي لبويضات الخنازير والجنين المبكرالتنمية بعد التلقيح الصناعي [J]. هيلونغجيانغ تربية الحيوان والطب البيطري ، 2002 ، (8): 1- 3.