تفشل الخلايا السرطانية في تقديم الحواتم المقيدة بـ MHC-II المشتقة من الجينات المسرطنة إلى الخلايا التائية CD4+
Oct 09, 2023
تلعب الخلايا التائية CD4+ دورًا حاسمًا في المناعة المضادة للأورام من خلال التعرف على مستضدات الببتيد المقدمة في MHC من الدرجة II (MHC-II). على الرغم من أنه يمكن تحفيز بعض أنواع السرطان الصلبة للتعبير عن MHC-II، إلا أن مدى تمكين ذلك من التعرف المباشر بواسطة الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالورم غير واضح. قمنا بعزل وتمييز مستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCRs) من الخلايا التائية المضغوطة 4+ المعدة بشكل طبيعي والمخصصة لاثنين من البروتينات الورمية، فيروس الورم الحليمي البشري -16 E6، وطفرة KRASG12V المنشطة، من المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. والسرطان الغدي القنوي البنكرياسي، على التوالي، وتحديد قدرتهم على التعرف على الخلايا السرطانية المعبرة عن المستضد الذاتي أو البشري. لقد وجدنا في كلتا الحالتين أن TCRs كانت قادرة على التعرف على الخلايا المستهدفة المحملة بالببتيد والتي تعبر عن الخلايا ذات الصلة التي تقدم مستضد MHC-II أو B (APCs) عندما يتم التعبير عن المستضدات داخليًا وتوجيهها إلى المسار الاندوسومال ولكنها فشلت في التعرف على الورم الخلايا التي تعبر عن البروتين المصدر حتى بعد تحفيز التعبير السطحي MHC-II بواسطة IFN- أو التحويل مع CIITA. تشير هذه النتائج إلى أن التعرف التمهيدي والوظيفي لكل من البروتين النووي (E6) والبروتين المرتبط بالغشاء (KRAS) يقتصر في الغالب على الـ APCs ذات العرض المتقاطع بدلاً من التعرف المباشر على الخلايا السرطانية المستحثة للتعبير عن MHC-II.
فوائد cistanche tubulosa-Antitumor
مقدمة
يبدأ التحول الخبيث للخلايا الجسدية من خلال عمل الجينات المسرطنة المنشطة التي تعمل على خلل تنظيم مسارات نمو الخلايا وتؤدي إلى تكاثر غير مراقب (1). في حالة السرطانات المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري، يساهم التعبير عن الجينات المبكرة لفيروس الورم الحليمي البشري E6 وE7 في تكوين الأورام عن طريق تثبيط الجينات الكابتة للورم p53 وRb، على التوالي (2). وبدلاً من ذلك، قد يحدث تنشيط الجين الورمي التأسيسي من خلال طفرة جسدية في الجينات التي تنظم نمو الخلايا ومسارات الانتشار، مثل عائلة RAS. في الواقع، يتم تنشيط طفرات KRAS مثل KRASG12V بشكل شائع في المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس والقولون والرئة (3). على الرغم من أن الجينات المسرطنة تعزز المرض، إلا أنها يمكنها أيضًا توفير أهداف للجهاز المناعي المضيف. في السنوات الأخيرة، أصبح دور الجهاز المناعي في السيطرة على السرطانات المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري معروفًا على نطاق واسع. تم التعرف على الخلايا التائية CD8+ وCD4+ T التي تتعرف على فيروس الورم الحليمي البشري E6 وE7، بالإضافة إلى بروتينات فيروس الورم الحليمي البشري الأخرى، في كل من الدم المحيطي والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) من المرضى المصابين بفيروس الورم الحليمي البشري المرتبط السرطان (4-6). تعد العلاجات المناعية التي تستهدف هذه المستضدات، بما في ذلك لقاحات السرطان العلاجية والعلاج الخلوي بالتبني (ACT) مع TILs أو الخلايا التائية المهندسة TCR، مجالًا نشطًا للتحقيقات قبل السريرية والسريرية (2). كما تم وصف استجابات الخلايا التائية ضد الطفرات الجينية على نطاق واسع (7-9). علاوة على ذلك، هناك أدلة سريرية مباشرة على أن العلاج بالمركب ACT مع TILs الذي يستهدف KRAS المتحولة يمكن أن يعزز الاستجابات الموضوعية (10). على الرغم من أن الخلايا التائية CD8+ التي تتعرف على الحواتم المستمدة من الجينات المسرطنة تتوسط في السمية الخلوية المباشرة ضد الخلايا السرطانية (11-13)، إلا أن دور الخلايا التائية CD4+ في المناعة المضادة للأورام ليس مفهومًا جيدًا. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على مجموعة فرعية من الخلايا التائية CD4+ التي تعبر عن علامات سامة للخلايا، مثل الجرانزيم B (GrzmB)، في السرطانات البشرية (14، 15). ومع ذلك، فإن خصوصيات المستضد لهذه الخلايا، وبالتالي إمكاناتها العلاجية، لا تزال مجهولة إلى حد كبير. علاوة على ذلك، لكي تتعرف الخلايا التائية CD4+ السامة للخلايا على الخلايا السرطانية وتقتلها، لا يجب فقط أن تعبر خلية الورم عن MHC-II، ولكن يجب أيضًا توجيه المستضدات ذات الصلة إلى مسار العرض المناسب. في هذه الدراسة، قمنا بدراسة قدرة الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالبروتينات الورمية HPV-16 E6 وKRASG12V على التعرف على الخلايا السرطانية التي تعبر عن المستضد. على الرغم من أن كلا TCRs كانا قادرين على التعرف بشكل مباشر على المستضدات المعالجة داخليًا والمقدمة الموجهة إلى الحيز الاندوسومال للخلايا B المتطابقة مع HLA، لم يكن أي منهما قادرًا على التعرف على الخلايا السرطانية التي تعبر عن المستضد مع التعبير المستحث لـ MHC-II. بشكل عام، تشير نتائجنا إلى أن مستضدات معينة فقط يتم تقديمها مباشرة على الخلايا السرطانية MHC-II+، مما قد يحد من تجمع الخلايا التائية CD4+ القادرة على التعرف بشكل مباشر على الخلايا السرطانية والقضاء عليها.
فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة
انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity
【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
نتائج
التعرف على فيروس الورم الحليمي البشري -16 E6-استجابات الخلايا التائية المحددة 4+ والقرص المضغوط 8+ من TILs لسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة. قمنا بفحص سلسلة من ثقافات TIL الفردية المعزولة من شظايا الورم من 2 إلى 4 مم من مريض (Hu -56) المصاب بسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) -16+ (الجدول التكميلي 1؛ مادة تكميلية). متاح عبر الإنترنت مع هذه المقالة؛ https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) بواسطة فحوصات IFN-ELISPOT لتحديد استجابات الخلايا التائية الموجهة ضد فيروس الورم الحليمي البشري -16 البروتينات الورمية الفيروسية E6 وE7، باستخدام تجمعات الببتيد التي تشتمل على تداخل 15- يمتد على طول بروتينات E6 وE7. على وجه الخصوص، أنتجت شظايا TIL 12 و29 عددًا كبيرًا من البقع على الخلفية عند إعادة تحفيزها باستخدام مجموعة الببتيد E6 وتحتوي على كل من خلايا CD 4+ وCD 8+ T (الشكل 1A والشكل التكميلي 1A). لتحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية ذات الصلة، قمنا بتحليل ثقافات TIL هذه باستخدام اختبار إفراز السيتوكين. تم الكشف عن جزء TIL 29 (F29) الذي يحتوي على خلايا E6- CD التفاعلية 8+ T، في حين أن الجزء 12 (F12) يحتوي على كل من خلايا CD 4+ وCD 8+ T القادرة على التعرف على تجمع الببتيد E6 (الشكل 1B). لم تنتج أي من خلايا CD4+ T IL-5 استجابة لإعادة التحفيز E6، مما يؤكد صحة النمط الظاهري الذي يشبه Th1-. لتحديد استنساخ TCR لـ TILs الخاصة بـ E6-، قمنا بفرز خلايا T المفردة التي تفرز IFN--CD4+ من خلايا F12 وCD8+ T من F12 وF29. كشف تسلسل TCR عن TCR واحد تم التعبير عنه بواسطة IFN- - خلايا CD 4+ T المفرزة (ن=31 من 31 خلية متسلسلة)، بالإضافة إلى استنساخ TCR واحد مشترك بواسطة IFN- - قرص مضغوط مفرز {{53 }} الخلايا التائية من كل من F12 وF29 (ن=40 من 41 و37 من 38 خلية متسلسلة، على التوالي) (الجدول الإضافي 2). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا التائية وحيدة النسيلة CD 4+ وCD 8+ المتفاعلة مع E6 موجودة داخل TILs من هذا المريض. HLA-A*02:01–القرص المضغوط المقيد 8+ تتعرف الخلايا التائية من TILs على E6 المقدم بواسطة خط الخلايا السرطانية المشتق من المريض. أنتجت TILs من F29 IFN- عند إعادة تحفيزها باستخدام الببتيد E629-38، مما يشير إلى أن F29 TCR تعرف على الحاتمة المقيدة HLA-A*02:01 الموصوفة مسبقًا (الشكل التكميلي 1B) (11). تم تأكيد ذلك من خلال دراسات ربط رباعيات باستخدام E 629-38 / HLA-A * 02:01 لتسمية خلايا J76 التي تعاني من نقص TCR والتي تعبر عن CD8 البشري واستخدام TCR الموصوف مسبقًا E 628-38 كـ إيجابي. التحكم (الشكل 2A) (11). أظهر كلا TCRs مستويات مماثلة من الجشع الوظيفي، كما يتضح من تنظيم علامة التنشيط الحاد CD69 على J76 بعد التحفيز باستخدام خطوط الخلايا اللمفاوية B الذاتية (B-LCLs) النابضة بتركيزات معاير من E 629-38 الببتيد (الشكل 2، ب و ج). تتحقق هذه البيانات من وجود CD8+ استنساخ خلية T محدد لحلقة معروفة من E6 ذات خصائص وظيفية مماثلة لـ TCR الذي تم اختباره في بيئة سريرية (16). سعينا بعد ذلك إلى تحديد ما إذا كان القرص المضغوط الخاص بـ E6- TCR يمكنه التعرف على المستضدات المعبر عنها داخليًا وبالتالي التوسط في السمية الخلوية المضادة للورم. وللقيام بذلك، استخدمنا خط الورم HLA-A*02 جيد التوصيف:01+ فيروس الورم الحليمي البشري-16+، CaSki، بالإضافة إلى خط خلايا الورم الذاتي، HNSCC-56، الذي تم إنشاؤه من خلال إعادة البرمجة الخلوية لأنسجة الورم الأولية كما هو موضح سابقًا (17) لفحوصات السمية الخلوية في المختبر. أثبت تحليل RNA-Seq صحة تعبير الجينات المبكرة لفيروس الورم الحليمي البشري -16، بما في ذلك E6، من خلال كل من عينة الورم الأولية وخط الخلية الذاتية (الشكل التكميلي 1C). يمكن للخلايا التائية البشرية المضغوطة 8+ التي تعبر عن F29 TCR أن تتوسط في قتل الخلايا لكل من CaSki وHNSCC -56 في مجموعة من نسب المستجيب إلى الهدف في المختبر (الشكل 2 وD وE). تؤكد هذه البيانات معًا أن F29 TCR يتعرف على مستضد E6 المعبر عنه داخليًا. تحديد خلية T من TILs مقيدة بـ HLA-DQ وE6-محددة. لتوسيع TILs المحددة لـ E 6- لمزيد من التحليل الوظيفي، استخدمنا بروتوكول ثقافة التوسع السريع الموصوف مسبقًا مع OKT -3 وPBMCs الخيفي المشعع لتوسيع TILs من F12. على الرغم من أن ثقافة F12 الأولية تحتوي في الأصل على كل من الخلايا التائية CD8+ وCD4+ مع تفاعل E6، فإن منتج الخلية النهائي بعد التوسع السريع يحتوي على 99% من الخلايا التائية CD4+، منها حوالي 38.33 أظهر ٪ التفاعل ضد E6، كما يتضح من تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا لـ IFN- (الشكل 3A).
نبات السيستانش الصيني – مضاد للأورام
بالإضافة إلى IFN-، يمكن لـ E6- TILs المضغوطة المحددة 4+ أن تفرز TNF- ولكن ليس IL-2 (الشكل التكميلي 2A). على الرغم من أن التردد الإجمالي لخلايا GrzmB+ لم يزد مع تحفيز المستضد، إلا أن البوابات على الخلايا المفرزة لـ TNF كشفت أن أقراص TIL الخاصة بـ E6- محددة 4+ تحتوي على المزيد من GrzmB المخزنة داخل الخلايا مقارنة بـ TILs غير المحددة (الشكل التكميلي 2B) ). IFN- - القرص المضغوط المفرز 4+ TILs يعبر أيضًا عن علامة التثبيط المبرمج لموت الخلايا 1 (PD-1)، بما يتوافق مع التوقيعات المنشورة للقرص المضغوط التفاعلي للورم 4+ TILs (الشكل التكميلي 2C) ( 18، 19). أظهرت E 6- CD محددة 4+ TILs رغبة وظيفية عالية لأن هذه الخلايا يمكن أن تفرز السيتوكينات بتركيزات الببتيد أقل من 1 ميكروغرام / مل (الشكل 3B). لتحديد خصوصية ثقافة F12 TIL، قمنا بنبض B-LCLs ذاتيًا مع الببتيدات الفردية المقابلة لكل من الببتيدات الـ 37 الموجودة في تجمع E6 الأصلي (الجدول الإضافي 3). يفرز القرص المضغوط 4+ TILs من F12 IFN- عند تحفيزه بالببتيدات E 61-15 و E 65-19، والتي تشترك في تسلسل أساسي من الأحماض الأمينية 11 (الشكل التكميلي 2D). كشفت تجارب الاستزراع النباتي في وجود Abs المانع لـ HLA عن تناقص ملحوظ في إفراز IFN بواسطة TILs عندما تم حظر B-LCLs باستخدام مضادات HLA-DQ Abs ولكن ليس مضادات HLA-DR أو التحكم النظيري Abs (الشكل 3C). لتحديد أليلات HLA-DQ المسؤولة عن عرض هذه الحاتمة، قمنا بنبض أليلات B-LCL التي تعبر عن أليلات HLA-DQ المعروفة (الجدول الإضافي 4) مع E61-15 ووجدنا أن خلايا KAS011 تعبر عن HLA-DQA1*01 :02 وDQB1*05:02، ولكن ليس Hu-195 B-LCLs التي تعبر عن DQA1*05:05 وDQB1*03:01، يمكن أن تقدم مستضدًا إلى TILs بطريقة قابلة للمقارنة مع Hu الذاتي{{63} } B-LCLs (الشكل 3D). أخيرًا، سعينا إلى التحقق من أن تسلسل TCR الذي تم تحديده مسبقًا كان مسؤولاً بالفعل عن التعرف على E6. كان التعبير عن F12 TCR في الخلايا التائية CD 4+ الأولية للمانحين الأصحاء كافياً لتعزيز التعرف على الببتيد E61-15، كما يتضح من تنظيم CD69 وPD-1 (الشكل 3E ). مجتمعة، توضح هذه النتائج تحديد الحلقة المقيدة بـ HLA-DQ لـ E6 والتي تم التعرف عليها بواسطة القرص المضغوط أحادي النسيلة 4+ TILs. لا تتعرف الخلايا التائية الخاصة بـ E6-CD4+ على الخلايا السرطانية الذاتية التي تعبر عن MHC-II أو تقتلها. حددت الدراسات الحديثة التوقيعات الجينية لـ CD 4+ TILs السامة للخلايا في بعض أنواع السرطان البشرية (14، 15). ومع ذلك، ما إذا كانت الخلايا التائية CD4+ السامة للخلايا تلعب دورًا في السرطانات التي يحركها فيروس الورم الحليمي البشري غير معروف. لتحديد ما إذا كانت خلايا E 6- CD 4+ T المحددة من TILs يمكنها التعرف مباشرة على HNSCC -56، قمنا أولاً بالتحقق من حالة تعبير MHC-II الخاصة بها. على الرغم من أن الخلايا السرطانية لم تعبر عن أي سطح يمكن اكتشافه في الثقافة، إلا أن العلاج بـ IFN- لمدة 72 ساعة كان كافياً للحث على تنظيم MHC-II (الشكل 4A). بعد ذلك، قمنا بزراعة HNSCC-56 باستخدام القرص المضغوط 4+ F12 TILs. الأهم من ذلك، أن الخلايا السرطانية MHC-II+ المشروطة مسبقًا بـ IFN- لم تكن قادرة على تحفيز CD4+ TILs كما تم قياسها بإفراز IFN- (الشكل 4B).
الشكل 1. تحديد E6-القرص المضغوط التفاعلي4+ والقرص المضغوط8+ TILs من فيروس الورم الحليمي البشري -16+ HNSCC. (أ)
الشكل 2. الخصائص الوظيفية لـ HLA-A*02:01 – TCR مقيد بـ E6- محدد من Hu-56 TILs. (أ)
ومع ذلك، كانت خطوط الخلايا السرطانية المعالجة بالإنترفيرون والنبض بـ E61-15 قبل إضافة TILs قادرة على تحفيز استجابة الخلايا التائية، مما يشير إلى أن التعبير السطحي للأليلات HLA-DQ المقيدة في خط الخلية الذي يعبر داخليًا عن لم يكن E6 كافيًا للتعرف على الورم ولكنه يتطلب تحميلًا خارجيًا للببتيد المستهدف. وقد لوحظ نفس الشرط لتحميل الببتيد المستهدف الخارجي مع الخلايا السرطانية التي تنتقل عن طريق CIITA (HNSCC -56 CIITA)، والتي تعبر بشكل أساسي عن مستويات عالية من MHC-II السطحي (الشكل 4B). لاختبار ما إذا كان بإمكان CD4+ TILs التعرف على النسخة المعالجة داخليًا والمقدمة من حلقة E6 على APC، قمنا بنقل B-LCLs ذاتيًا باستخدام بنية تعبيرية تشفر أول 50 من الأحماض الأمينية من E6 مدمجة في MHC- مجال الغشاء I (E6-MITD)، الذي يحفز توطين تسلسل الأحماض الأمينية المندمجة في غشاء البلازما ويدعم العرض على MHC-II عبر الاتجار الاندوسومال (20). يمكن لـ B-LCLs التي تعبر عن بنية E6-MITD أن تحفز E6-أقراص مضغوطة محددة4+ TILs، مما يشير إلى أن الحاتمة الببتيدية المعترف بها بواسطة TILs هذه يمكن معالجتها بشكل طبيعي وتقديمها على MHC-II عندما موجهة إلى المسار المناسب (الشكل 4C).
الشكل 3. الخصائص الوظيفية للأقراص المضغوطة الموسعة استنساخيًا والمقيدة بـ HLA-DQ وE 6- المحددة 4+ TILs. (أ)
بعد ذلك، سعينا إلى تحديد ما إذا كانت أقراص TILs المضغوطة الخاصة بـ F12 E6-المحددة4+ قادرة على التسبب في السمية الخلوية المباشرة للورم. بما يتوافق مع البيانات المستمدة من فحوصات التعرف لدينا، لم تتمكن أقراص TILs المضغوطة الخاصة بـ E6- من الحد من نمو الخلايا السرطانية HNSCC-56، والتي لا تعبر عن MHC-II (الشكل 4D) . علاوة على ذلك، نمت الخلايا السرطانية HNSCC-56 CIITA أيضًا دون عوائق في وجود CD4+ TILs. ومع ذلك، تم تثبيط نمو الخلايا السرطانية HNSCC-56 CIITA النبضية مع الببتيد E61-15 بطريقة تعتمد على جرعة الخلية المؤثرة. بشكل عام، تشير هذه البيانات إلى أنه على الرغم من أن HNSCC-56 يمكن أن يقدم حلقات E6 إلى خلايا CD8+ T، فإن أقراص TIL الخاصة بـ E6-أقراص مضغوطة محددة4+ غير قادرة على التعرف بشكل مباشر على MHC- II+ الخلايا السرطانية الذاتية. الجينات المشاركة في عرض المستضد تتعرض في كثير من الأحيان إلى طفرة في السرطانات، مما قد يمنع التعرف عليها من قبل الخلايا التائية (21). لتحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية HNSCC-56 تحتوي على أي طفرات جسدية تمنع عرض المستضد على MHC-II، أجرينا تسلسل إكسوم كامل للخلايا السرطانية وPBMCs من Hu-56 كعينة مرجعية. من بين 104 طفرات جسدية غير معروفة تم تحديدها، لم تكن هناك طفرات واضحة في مكونات مسار العرض MHC-II، بما في ذلك HLADMA وHLADMB وCD74 (الجدول التكميلي 5). تحديد HLA-DRB5*01:01 – TCR خاص بـ KRASG12V من دم مريض مصاب بسرطان غدي في الأقنية البنكرياسية. بعد هذه النتائج، شرعنا في تحديد ما إذا كان عدم قدرة الخلايا السرطانية على تقديم المستضد في MHC-II صحيحًا بالنسبة للجينات المسرطنة الأخرى. نظرًا لأنه تم تحديد الخلايا التائية الخاصة بالورم في المرضى المصابين بالسرطان (8 ، 22) ، فقد قمنا بتحفيز PBMCs من مريض (Hu -66) مصاب بسرطان غدي قنوي البنكرياس (الجدول التكميلي 1) مع مجموعة من الببتيدات المقابلة للطفرات المسرطنة الشائعة (الجدول التكميلي 6) لمدة 14 يومًا قبل إعادة التحفيز باستخدام الببتيدات الفردية لتحديد استجابات الخلايا التائية ذات الصلة بواسطة ELISPOT. أشارت هذه النتائج إلى وجود استجابة الخلايا التائية الموجهة ضد KRASG12V، كما يتضح من زيادة عدد بقع IFN على الخلفية استجابة للأحماض الأمينية KRASG12V 1-15 (الشكل 5A). لتحديد TCRs ذات الصلة المرتبطة بهذه الاستجابة، استخدمنا مرة أخرى مقايسة إفراز السيتوكين لفرز الخلايا المفرزة للإنترفيرون. كشف اختبار إفراز السيتوكين عن إنتاج محدد لـ IFN- بواسطة خلايا CD 4+ T استجابة لإعادة التحفيز باستخدام KRASG12V (الشكل 5B). كشفت مقارنة سلاسل TCR من الخلايا المفرزة لـ IFN مع تلك الموجودة في PBMCs غير الموسعة من هذا المريض عن نمط مستنسخ TCR واحد موجود على أعلى تردد بين كلا المجموعتين (الشكل 5C والجدول الإضافي 2). تشير هذه النتائج إلى أن وتيرة استنساخ الخلايا التائية هذه قد تم توسيعها عند خط الأساس في PBMCs، مما يشير إلى حدوث استجابة طبيعية في الجسم الحي بدلاً من التحضير في المختبر في ثقافة التوسع لدينا. للتحقق من خصوصية المستضد لـ TCR، عبرنا عنها في خلايا CD 4+ T البشرية الأولية عن طريق نقل الفيروس القهقري وقمنا بزراعة هذه الخلايا باستخدام B-LCLs ذاتية نابضة إما باستخدام KRASG12V المتحول أو الببتيد WT المقابل. تفرز الخلايا التائية المهندسة IFN- عندما يتم تحفيزها باستخدام الببتيد المتحول، ولكن ليس WT، KRAS، مما يؤكد أن هذا TCR خاص بـ KRASG12V (الشكل 5D). تمشيا مع نتائجنا من E6 TCR، تمكنت الخلايا التائية المهندسة التي تعبر عن TCR الخاص بـ KRASG12V أيضًا من التعرف على B-LCLs التي تعبر عن جزء من KRASG12V، ولكن ليس WT KRAS، الموجه إلى الإندوسوم عن طريق تضمين MITD، مما يشير إلى أن هذا يتعرف TCR على المستضد المعالج داخليًا والمقدم (الشكل 5D).
الشكل 4. لا تظهر الخلايا السرطانية الذاتية E61-15 الذاتية على MHC-II إلى CD4+ الخلايا التائية. (أ)
الشكل 5. تحديد TCR الخاص بـ HLA-DRB5*01:01 والمقيد بـ KRASG12V من دم مريض مصاب بسرطان غدي في الأقنية البنكرياسية. (أ)
لتحديد أليل HLA المقيد، كررنا تجارب تحفيز الببتيد هذه باستخدام B-LCLs التي تعبر عن مجموعات مختلفة من جينات HLA. يمكن لـ B-LCLs التي تعبر عن النمط الفرداني HLA-B7-DR15-DQ6 المشترك أن تحفز الخلايا التائية المهندسة، في حين أن B-LCLs التي لا تحتوي على هذه الأليلات لا تستطيع ذلك (الشكل 5E). في النهاية، تم التحقق من تحفيز هذه الخلايا بواسطة IHW03304 الببتيد النبضي، وهو خط خلية DAP3 الفأري المنقول بواسطة HLA-DRB5 البشري*01:01، هذا باعتباره جزيء HLA المقيد (الشكل 5F). لا تقدم الخلايا السرطانية MHC-II+ NCI-H2444 وDAN-G الحاتمة المشتقة من KRASG12V إلى الخلايا التائية CD4+. بعد ذلك، قمنا بدراسة قدرة الخلايا السرطانية على تقديم الحواتم المشتقة من KRASG12V مباشرة على MHC-II. لإنشاء خطوط خلايا MHC-II+ متطابقة مع HLA لهذه الدراسات، قمنا بنقل خطوط الخلايا KRASG12V+ NCI-H2444 وDAN-G، المستمدة من سرطانات الرئة والبنكرياس البشرية، على التوالي، باستخدام CIITA وترميز البناء HLA-DRB5*01: 01 مع جين مراسل CD34 المقطوع (الشكل 6A). تمشيا مع نتائجنا السابقة، لم تكن الخلايا السرطانية MHC-II + التي تعبر عن أليل HLA المقيد قادرة على تحفيز الخلايا التائية المهندسة بواسطة TCR ما لم يتم نبض الخلايا المستهدفة لأول مرة مع الببتيد الخارجي (الشكل 6B). الأهم من ذلك، لم تكن هناك طفرات جسدية مدرجة في جينات العرض MHC-II (وهي HLADMA، HLADMB، CD74) إما لـ NCI-H2444 أو DAN-G في بيانات التسلسل المتاحة للجمهور (23). نمت خلايا NCI-H2444 CIITA دون عوائق في وجود خلايا T المهندسة TCR، في حين شهدت خلايا NCI-H2444 CIITA النابضة مع الببتيد KRASG12V تأخر نمو الورم (الشكل 6C). تمشيا مع النتائج التي تم الحصول عليها لخلايا HNSCC -56، CD 8+ T التي تعبر عن HLA-A * 03:01 – مقيدة، تمكنت TCR (24) الخاصة بـ KRASG12V من التعرف على خلايا NCI-H2444 ولكن لا خلايا CaSki، التي تعبر عن HLA-A*03:01 ولكن ليس KRASG12V (الشكل 6D). توضح هذه النتائج أن الجين الورمي المتميز الموجود في العصارة الخلوية لا يمكن أيضًا تقديمه بواسطة الخلايا السرطانية MHC-II + على الرغم من تقديمه بشكل فعال على MHC-I. إن التعبير عن الروابط المثبطة مثل رابطة موت الخلايا المبرمج 1 (PD-L1) بواسطة الخلايا السرطانية يحد من إشارات TCR في الخلايا التائية (25). لتحديد ما إذا كانت هذه الآلية تمنع التعرف على الخلايا السرطانية MHC-II+ بواسطة خلايا CD4+ T، قمنا بزراعة خلايا CD4+ T التي تعبر عن TCR الخاص بـ KRASG12V أو TCR الخاص بـ E6- F12 TCR مع NCI-H2444 CIITA وHNSCC-56 CIITA، على التوالي، مع أو بدون مكافحة PD-L1-blocking Abs. لم يكن حظر تفاعلات PD-L1/PD-1 كافيًا لتعزيز التعرف على الخلايا السرطانية (الشكل التكميلي 3). وبالمثل، فإن إضافة الناهض المضاد لـ CD28 Ab لم يعدل التعرف على الخلايا السرطانية. تشير هذه النتائج إلى أن نقص عرض المستضد، وليس وجود أو عدم وجود إشارات مثبطة أو تقديرية، على التوالي، هو المسؤول عن هذا النمط الظاهري. تشير بعض الدراسات إلى أن البروتينات الداخلية المنشأ من غشاء البلازما يتم تحميلها بشكل تفضيلي على MHC-II لعرضها، مقارنة بالأجزاء التحت خلوية الأخرى (26). على الرغم من أن بروتينات KRAS ترتبط بشكل متكرر بالأغشية عبر تعديلات الدهون، إلا أنها لا تعبر عن مجال الغشاء، وهذه التفاعلات ليست مستقرة (3، 27). ولذلك، فقد فكرنا في أن تثبيت الجزء المناعي لـ KRASG12V في الغشاء البلازمي للخلايا السرطانية قد يمكّن من التعرف المباشر على المستضد بواسطة الخلايا التائية CD4+. ومع ذلك، فإن الخلايا السرطانية التي تعبر عن بنية KRASG12V-MITD، كما يتضح من تعبير مراسل EGFP المرتبط بـ P2A، لم تكن قادرة بالمثل على تحفيز الخلايا التائية CD 4+ المصممة بواسطة TCR (الشكل التكميلي 4). تشير هذه النتائج إلى أن توطين الجين الورمي تحت الخلوي ليس هو المحدد الوحيد للعرض المباشر لـ MHC-II بواسطة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، تشير هذه النتائج إلى أن الإفراط في التعبير عن المستضد ليس كافيًا لتعزيز عرض MHC-II. تشير نتائجنا حتى الآن إلى أن الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالورم قد تكون أكثر عرضة للتعرف على المستضدات التي تقدمها الخلايا APCs مقارنة بالخلايا السرطانية نفسها. لذلك، قمنا بتقييم قدرة HLADRB5*01:01+ DC على تقديم المستضدات المشتقة من البروتينات الخارجية. كانت الخلايا DC المطابقة لـ HLA والتي تم إنشاؤها في المختبر قادرة على تحفيز الخلايا التائية المضغوطة 4+ المهندسة بواسطة TCR والتي تعبر عن TCR الخاص بـ KRASG12V عندما تم نبض DC غير الناضجة باستخدام الببتيد KRASG12V 20- Mer أو تغذية بروتين KRASG12V الكامل ولكن ليس بروتين KRAS WT (الشكل 6E). تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من أن TCR لا يمكنه التعرف على المستضدات الداخلية التي تقدمها الخلايا السرطانية، إلا أنه يمكنه التعرف على المستضدات الخارجية المقدمة في سياق البلدان النامية.
cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي
مناقشة
كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد ما إذا كانت TCRs المعزولة من الخلايا التائية المجهزة بشكل طبيعي والتي تم الحصول عليها من مرضى السرطان يمكنها التعرف على الخلايا السرطانية التي تعبر عن الجينات المسرطنة. فيما يتعلق بالفئة الأولى (HLA-A*02:01) - المقيدة، فيروس الورم الحليمي البشري -16 E 629-38 TCR الذي تم الحصول عليه من HNSCC TILs، ربما لم يكن من المستغرب أن يتم تأكيد التعرف على كل من خط الخلايا السرطانية الذاتية وخلايا الورم HLA المطابقة جيدًا وE6- المعبرة عن الخلايا السرطانية، CaSki (الأهم من ذلك، انظر الشكل 2). تحتوي نفس TILs (الشكل 1) أيضًا على أعداد كبيرة من الخلايا التائية المضغوطة الخاصة بـ E6- المنتجة للإنترفيرون (الشكل 3) (الشكل 3)، والتي، على النقيض من ذلك، لم تتعرف على E6- التعبير عن الخلايا السرطانية، حتى عندما تم حثها للتعبير عن سطح وافر من فئة MHC II من أليل العرض الصحيح (DQA1*01:02/DQB1*05:02) عن طريق معالجة IFN أو نقل CIITA (الشكل 4). لا يؤدي تعبير CIITA إلى تحفيز التعبير السطحي لبروتينات MHC-II فحسب، بل أيضًا HLA-DM وجزيئات السلسلة الثابتة، المطلوبة لمعالجة المستضد وعرضه (28). في المقابل، تم التعرف على الخلايا B المتطابقة مع HLA بواسطة TCR عندما تم توجيه المستضد إلى مسار MHC-II. وقد لوحظ موقف مماثل في حالة TCR الخاصة بـ KRASG12V، والمقيدة بـ HLA-DRB5*01:01، والتي يمكنها التعرف على الخلايا B المتطابقة مع HLA، ولكن ليس الخلايا السرطانية المعبرة عن MHC-II، عندما تم توجيه المستضد إلى الخلايا السرطانية. مسار العرض MHC-II. يمتلك كلا TCRs جشعًا وظيفيًا كافيًا للتوسط في التعرف على المستضدات المعبر عنها داخليًا في ظل الظروف الموصوفة أعلاه، وكلاهما يمكن أن يتوسط في السمية الخلوية للخلايا المستهدفة المحملة بالببتيد. تعكس هذه الملاحظة الأخيرة الظروف المعروضة في العديد من التقارير حول الخلايا التائية CD4+ السامة للخلايا، على الرغم من أن بياناتنا توسع سياق هذه الملاحظة من خلال إظهار أن التعبير الداخلي لمستضد المصدر وتحريض MHC-II بواسطة IFN- غير مرجح للحصول على هدف فسيولوجي على الخلايا السرطانية المشتقة من الظهارة لـ TCRs ضد المستضدات النووية أو المرتبطة بالغشاء. حددت الدراسات الحديثة لسرطان المثانة البشرية والورم الميلانيني التوقيعات الجينية المقابلة للخلايا التائية CD 4+ السامة للخلايا بين TILs (14، 15). من الناحية الوظيفية، فإن هذه الأقراص المضغوطة السامة للخلايا 4+ TILs قادرة على التعرف المباشر على الورم المعتمد على MHC-II، مما يؤدي في النهاية إلى تحلل الهدف بواسطة الجرانيمات بطريقة مشابهة لنظيراتها من الأقراص المضغوطة8+. ومع ذلك، فإن الترجمة العلاجية لهذه النتائج قد تكون محدودة بسبب حقيقة أن عددًا قليلاً من الأورام الصلبة تعبر عن MHC-II. في الواقع، أشارت نتائج دراستين مستقلتين إلى أن ما يقرب من ثلث المرضى الذين يعانون من سرطان الجلد فقط لديهم أي خلايا ورم MHC-II +، وغالبًا ما يكون تواتر هذه الخلايا داخل الورم أقل من 10٪ (15، 29). بدلاً من ذلك، يبدو أن المصدر الخلوي السائد لـ MHC-II في البيئة الدقيقة للورم يتسلل إلى كريات الدم البيضاء (26).
الشكل 6. لا تقدم الخلايا السرطانية MHC-II+ KRASG12V+ الحواتم المشتقة من KRASG12V إلى الخلايا التائية CD4+. (أ)
على الرغم من أن بعض الخلايا السرطانية الصلبة تعبر إما عن MHC-II التأسيسي أو المحفز، تشير نتائجنا إلى أنه على الرغم من وجود خلايا CD4+ T خاصة بالجين الورمي بين TILs وPBMCs، فإن هذه الخلايا لا يمكنها التعرف مباشرة على مولد الضد والتعبير عنه الخلايا السرطانية MHC-II+، في حين يمكن تقديم الحواتم من نفس البروتين بشكل فعال إلى الخلايا التائية CD8+ على MHC-I (13). يشير هذا إلى أن مجرد التعبير عن مستضد مستهدف قد لا يكون كافيًا لمنح التعرف بواسطة الخلايا التائية CD4+ لمجموعة فرعية من الأورام التي تعبر عن MHC-II. علاوة على ذلك، يبدو أن هذه النتائج متسقة عبر أنواع الأورام المتعددة، لأن خطوط الخلايا التي تم الاستعلام عنها في هذه الدراسة تشمل تلك المستمدة من HNSCC، وسرطان الرئة الغدي، وسرطان البنكرياس. تم الإبلاغ عن التعرف المباشر على الخلايا التائية CD 4+ لخطوط خلايا سرطان الجلد التي تعبر عن MHC-II بشكل طبيعي أو بعد نقل CIITA في دراستين (30، 31). ومع ذلك، في كلتا الدراستين، لم يتعرف جزء كبير من TCRs التي تم اختبارها على الخلايا السرطانية مباشرة. ليس من الواضح ما إذا كانت TCRs هذه تمثل أنماطًا مستنسخة "متفرجة" لا تتعرف على مستضدات الورم أو TCRs الخاصة بالورم والتي لا تستطيع التعرف على المستضد المشابه لها بسبب قصور عرض المستضد مثل تلك التي تم إبرازها في هذه الدراسة. أوليفيرا وآخرون. (31) أثبت أن التعرف المباشر بواسطة الخلايا التائية CD4+ كان مقصورًا على اثنين من الأورام الميلانينية ذات الأعباء الطفرية العالية للغاية للورم، مما يشير إلى أن هذا النمط الظاهري قد يمنح تعديلات ضرورية إضافية تسمح بعرض MHC-II لمستضدات الورم. على الرغم من أن ربط MITD بالجزء المناعي لـ KRASG12V لم يؤدي إلى التعرف المباشر على الخلايا السرطانية بواسطة خلايا CD 4+ T، فقد وصفت الدراسات انحيازًا للببتيدات الداخلية المشتقة من البروتينات المرتبطة بالغشاء المستخرج من MHC-II، ويفترض بسبب إعادة تدوير الأغشية (26، 32). يوجد مستضد سرطان الجلد Trp1 في غشاء البلازما، مما قد يسهل العرض المباشر للخلايا التائية CD4+ بواسطة الخلايا السرطانية B16 (33). يتم تقديم مستضد آخر مرتبط بالورم الميلانيني، gp100، بواسطة الخلايا السرطانية إلى الخلايا التائية CD4+ بطريقة تعتمد على مجال الغشاء gp100 (34). في العمل الأخير الذي يدرس دور الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالمستضد الجديد في نموذج ساركوما الفئران، تمت إزالة الحواتم المشتقة من وحدة فرعية متحولة من الإنتجرين، وهي أيضًا بروتين مرتبط بغشاء، من MHC-II على الورم المنقول بواسطة CIITA الخلايا (35). تشير نتائجنا إلى أنه على الرغم من أن البروتينات المرتبطة بالغشاء قد يتم نقلها بشكل تفضيلي إلى الإندوسومات لعرضها بشكل مباشر على MHC-II، إلا أن وجود بروتين غشائي مناعي وحده لا يكفي لتعزيز هذا العرض. تم وصف مسارات العرض غير الكلاسيكية الأخرى التي قد تسمح للبروتينات الخلوية أو النووية بالوصول إلى MHC-II، بما في ذلك العرض المرتبط بالالتهام الذاتي للبروتينات داخل الخلايا والناقل المرتبط بمعالجة المستضد - العرض المعتمد على الخلايا التائية CD4+، حيث تكون المستضدات من المفترض أن يتم نقل الببتيدات من MHC-I إلى MHC-II أثناء إعادة تدوير الغشاء (36، 37). تم الإبلاغ عن التعرف المباشر المعتمد على MHC-II على الخلايا السرطانية الذاتية بواسطة CD 4+ الخلايا التائية الخاصة بالحلقات E7 (38، 39)؛ ومع ذلك، فإن هذه الدراسات تتعلق ببروتينات E7 التي يتم التعبير عنها بواسطة أنواع فرعية من فيروس الورم الحليمي البشري الورمي الأقل انتشارًا (وهي فيروس الورم الحليمي البشري -33 وفيروس الورم الحليمي البشري -59) المقدمة بواسطة خلايا سرطان عنق الرحم على جزيئات HLA-DR. لذلك، من الممكن أن يكون النوع الفرعي لفيروس الورم الحليمي البشري، وأنسجة الورم، وأليلات HLA المقيدة أيضًا عوامل ذات صلة في العرض التفاضلي لمستضدات فيروس الورم الحليمي البشري النووي على الخلايا السرطانية MHC-II+. على الرغم من أن بياناتنا تشير إلى أن السمية الخلوية المباشرة للورم ليست آلية محتملة لخلايا CD4+ T الخاصة بـ E6- وKRASG12V، فقد تم وصف آليات أخرى مضادة للورم في خلايا CD4+ T، و أظهر النقل بالتبني للخلايا التائية CD4+ الخاصة بالورم في المرضى المصابين بالسرطان نشاطًا مضادًا للورم (7، 40، 41). لذلك، فإن TCRs المقيدة بـ MHC-II مثل تلك التي تم تحديدها في هذه الدراسة قد تكون مفيدة لـ ACT في المرضى من البشر، بالنظر إلى استهداف TCRs للحواتم المشتقة من البروتينات الورمية المحركة المقيدة بأنماط HLA الفردية المقدرة بـ 1.27٪ و16.10٪ من الولايات المتحدة البيضاء. السكان، على التوالي، لـ HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 وHLA-DRB5*01:01 (42). والجدير بالذكر أن خلايا CD 4+ T تساعد في تحضير خلايا CD 8+ T الخاصة بالورم عن طريق ترخيص DC الحاملة للمستضد بطريقة تعتمد على CD40L (43-45). لقد أثبتنا أن TCR الخاص بـ KRASG12V المحدد في هذه الدراسة يتعرف على المستضدات المقدمة في سياق البلدان النامية، مما يشير إلى أن هذه الخلايا قد تكون قادرة على المساهمة في المناعة المضادة للأورام عبر هذه الوظيفة. قد توفر الخلايا التائية CD4+ أيضًا مساعدة موضعية للخلايا التائية CD8+ داخل الأورام عن طريق إفراز السيتوكينات مثل IL-2 وIFN-، مما يدعم بقاء الخلايا التائية CD8+ وبقاءها تجنيد للورم (46). بالإضافة إلى ذلك، قد تتعرف الأقراص المضغوطة4+ TILs على المستضدات في البيئة الدقيقة للورم على الخلايا النقوية مثل الخلايا البلعمية. في الواقع، أظهرت الدراسات قبل السريرية أنه في غياب MHC-II على الخلايا السرطانية، لا تزال الخلايا التائية Trp1 CD4+ المنقولة بالتبني قادرة على ممارسة مناعة مضادة للأورام تعتمد على IFN وترتبط بزيادة النشاط السام للخلايا في البلاعم (47). ومع ذلك، يبدو أن هذه الظاهرة تعتمد على إفراز مستضد الورم، والذي نتوقع أيضًا أنه ضئيل في حالة معظم الجينات المسرطنة. بشكل عام، تسلط دراستنا الضوء على انتقائية العرض المباشر للمستضدات الداخلية بواسطة الخلايا السرطانية MHC-II+ وتوضح أنه لا تعبير CIITA ولا وجود مستضد مرتبط بالغشاء كافٍ وحده لتعزيز التعرف المباشر على الخلايا السرطانية بواسطة القرص المضغوط {{115} } الخلايا التائية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد المستضدات التي قد يتم تقديمها مباشرة بواسطة الخلايا السرطانية MHC-II+ تحت أي ظروف لفهم الأدوار المعتمدة على السياق للخلايا التائية CD4+ في السرطان.
نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة
طُرق
زراعة الخلايا. تم حصاد TILs وزراعتها كما هو موضح سابقًا (48). باختصار، تم تشريح أنسجة الورم الأولية إلى أجزاء بحجم 2-3 مم، والتي تم وضعها في 24-صفيحة بئر وتم زراعتها في RPMI-1640 مكملة بـ 1{{102}}% مصل AB البشري، البنسلين-ستربتوميسين، HEPES، جنتاميسين، و6،000 IU/ mL IL-2. تمت زراعة TILs المتضخمة عن طريق استبدال نصف الوسائط كل 2-3 أيام. تمت زراعة الخلايا التائية البشرية الأولية من الدم المحيطي في وسط 50:50 يتكون من 50% AIM V بالإضافة إلى 50% RPMI-1640 مكمل بـ 10% مصل AB بشري، بنسلين-ستربتوميسين (100 وحدة/ مل لكل منهما؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific)، 300 وحدة دولية / مل IL -2، 5 نانوغرام / مل IL -7، و 5 نانوغرام / مل IL -15. تم إنشاء خطوط الخلايا السرطانية المشتقة من المريض وزراعتها كما هو موضح سابقًا (17). باختصار، تم قطع أنسجة الورم الأولية إلى أجزاء أصغر من 2 مم وتم فصلها باستخدام GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). تمت إعادة تعليق الخلايا السرطانية في F-Media التي تحتوي على مثبط كيناز Rho 5 ميكرومتر ومطلية على سرير من الخلايا الليفية 3T3 المشععة (30 غراي). بعد الاستزراع الأولي، تم نشر الخلايا السرطانية في مزيج 3:1 من الوسط المشعع 3T3- المكيف وF-Media الذي يحتوي على 5 ميكرومتر من مثبط Rho كيناز. تمت المحافظة على CaSki (ATCC)، وNCI-H2444 (ATCC)، وDAN-G (ATCC)، وJ76 Jurkat (ATCC)، و3T3-CD40L، وB-LCLs في وسط RPMI مكمل بـ l-glutamine وHEPES ( 10 ملم جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتفيك، 10٪ FBS، 1 ملم بيروفات صوديوم (جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتفيك)، 1 × MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية (جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتفيك)، والبنسلين-ستربتوميسين (100 وحدة / مل لكل منهما؛ جيبكو). حافظنا على 293GP (ATCC) في ملحق متوسط DMEM مع 10% FBS والبنسلين-ستربتوميسين (100 وحدة/مل لكل منهما؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific). كانت خلايا IHW03304 وGM3107 وKAS011 وD8 وD66 هدايا من أليساندرو سيت (معهد لا جولا لعلم المناعة). فحوصات إليسبوت. تم طلاء TILs أو PBMCs عند 100، 000 خلية لكل بئر في ألواح ELISPOT المغلفة بـ antiIFN– Abs (1-D1K، Mabtech). تمت إعادة تحفيز الخلايا باستخدام تجمعات الببتيد HPV -16 E6 وE7 PepMix (JPT)، أو تجمعات الببتيد التي تمثل طفرات سرطانية مختارة، أو الببتيدات الفردية المشار إليها عند 5 ميكروغرام / مل للمسابح أو 10 ميكروغرام / مل للببتيدات لمدة 22 ساعة قبل التطور. لوحات ELISPOT حسب تعليمات الشركة المصنعة (Mabtech). للتحكم الإيجابي، تم استخدام 5 ميكروغرام/مل من الراصة الدموية النباتية-L. ثقافة التوسع خارج الجسم الحي تم طلاء PBMCs ببركة الببتيد التي تمثل طفرات سرطانية مختارة عند 5 ميكروغرام / مل. تمت إضافة وسط جديد يحتوي على 10 وحدة دولية/مل IL-2 في الأيام 4 و7 و10. في اليوم 14، تمت إعادة تحفيز PBMCs لاستخدامها في فحوصات ELISPOT أو إفراز السيتوكينات. تسلسل TCR. تمت إعادة تشكيل TILs أو PBMCs باستخدام 5 ميكروغرام/مل HPV -16 E6 PepMix (JPT) أو ببتيد KRASG12V، وتم وضع علامة على الخلايا المفرزة لـ IFN باستخدام مجموعة فحص إفراز IFN البشرية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Miltenyi Biotec) . تم فرز خلايا IFN - + المنفردة في 96- لوحة بئر باستخدام FACSAria (BD Biosciences) وتم إجراء RNA-Seq باستخدام Illumina Miseq لتحديد TCR المقترنة والسلاسل. للتعرف على استنساخ E 6- CD 4+ TCR المحدد، تم فرز الخلايا المفرزة لـ IFN على النحو الوارد أعلاه وتم تضخيم تسلسلات TCR وTCR بواسطة PCR متداخل ومتعدد الإرسال، كما هو موضح سابقًا (49). تم تقديم منتجات PCR لتسلسل Sanger (ETON Biosciences). بالنسبة لتحليل تردد TCR، تم إرسال PBMCs قبل وبعد 14- يوم من التوسع خارج الجسم الحي مع الببتيدات المشار إليها إلى التقنيات الحيوية التكيفية. تحليل التعبير فيروس الورم الحليمي البشري. تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) من خلايا الورم الأولية Hu -56 وخط الخلايا السرطانية وتم تقديمه بكميات كبيرة من RNA-Seq. تم تعيين قراءات التسلسل المزدوج باستخدام BWA (الإصدار 0.7.12) (50) للجينوم الكامل لفيروس الورم الحليمي البشري (رقم وصول GenBank. NC_001526.2) والنسخة المقابلة له. تم تحويل ملف خريطة محاذاة التسلسل الناتج إلى خريطة محاذاة ثنائية مرتبة وفهرستها، متبوعًا بإحصاء القراءات المعينة باستخدام SAMtools (v1.2) (50). التسلسل الكامل للإكسوم. تم إجراء تسلسل الإكسوم الكامل وتسلسل RNA-Seq في معهد لا جولا للتسلسل الأساسي لعلم المناعة باستخدام مجموعة Agilent لالتقاط الإكسوم الكامل ومجموعات Illumina، على التوالي. تم توزيع العينات الحيوية FFPE بواسطة مركز موريس للسرطان على تيمبوس لتسلسل الجيل التالي جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي المرجعي المطابق باستخدام عينات الدم المحيطية. يقرأ التسلسل من تسلسل إكسوم للورم وتمت محاذاة العينات الطبيعية مع الجينوم المرجعي GRCh38 باستخدام SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). تم تحديد متغيرات Exome باستخدام SpeedSeq Somatic، وتم شرح المتغيرات باستخدام SNPeff (v4.3i) (52). تم تحميل بيانات RNA-Seq وتسلسل exome الكامل لهذه المخطوطة إلى NCBI BioProject، رقم الانضمام PRJNA924789. نقل الخلايا التائية الفيروسية الرجعية. تم تصنيع تسلسلات نيوكليوتيدات TCR واستنساخها في العمود الفقري للفيروس القهقري MSGV1 باستخدام BioXP 3200 (Codex). تم تحسين ترميز التسلسل للتعبير في الخلايا البشرية. تم استبدال مناطق TCR الثابتة البشرية بمناطق TCR الثابتة للماوس مع بدائل لتعزيز التعبير السطحي وتعزيز الاقتران التفضيلي (53، 54). تم عزل PBMCs البشرية من المعاطف الشهباء. تمت إزالة الخلايا التائية CD 4+ أو CD 8+ عن طريق الانتقاء المغناطيسي، وتم زراعة الجزء السلبي الذي يحتوي على جميع الخلايا الليمفاوية المتبقية في وسط خلية T مع 50 نانوغرام / مل مضاد لـ CD3 Ab (OKT3) لمدة 2 أيام.
فوائد cistanche tubulosa-Antitumor
تم إنشاء المواد الطافية للفيروسات القهقرية TCR عن طريق النقل المشترك لخلايا 293GP مع ناقل MSGV1 الذي يحتوي على تسلسل TCR ذي الصلة والبلازميد RD113. بعد يومين من ترنسفكأيشن، تم حصاد المواد الطافية للفيروسات القهقرية واستخدامها إما طازجة أو مجمدة عند -80 درجة. تم إجراء عمليات النقل على الصفائح المطلية بـ RetroNectin (تاكارا)، كما هو موضح سابقًا (5). تم تقييم تعبير المنطقة الثابتة لـ Murine TCR عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد كفاءة النقل. تم استخدام الخلايا التائية المهندسة بواسطة TCR في موعد لا يتجاوز اليوم السابع بعد التحفيز الأولي. المقايسات الوظيفية للخلايا التائية. قمنا بزراعة 5 × 1 0 4 TILs أو خلايا T transduced أو خلايا J76 Jurkat مع 1 × 105 B-LCLs نابضة طوال الليل مع تركيزات محددة من الببتيد أو 5 × 103 خلايا سرطانية تم زرعها في اليوم السابق في {{16} } جيد لوحات U-القاع أو مسطحة القاع، على التوالي. عند الإشارة إلى ذلك، تمت إضافة ناهض مضاد لـ CD28 (استنساخ CD28.2، BioLegend) أو حظر مضاد PD-L1 (استنساخ 29E.2A3، BioLegend) Abs إلى الخلايا التائية والخلايا السرطانية عند 5 و10 ميكروغرام / مل، على التوالي. بالنسبة لفحوصات السيتوكين وعلامة التنشيط، تم استخدام 1 × كوكتيل تنشيط الخلية (BioLegend) الذي يحتوي على PMA والأيونوميسين كعنصر تحكم إيجابي. بالنسبة لدراسات حجب HLA، تمت إضافة 20 ميكروغرام/مل من عناصر Abs التالية إلى B-LCLs ذات النبض الببتيد قبل ساعتين على الأقل من إضافة الخلايا التائية: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend)، anti-HLA-DR (L243، BioLegend)، أو التحكم في نظير IgG2a بالماوس (MOPC-173، BioLegend). عند الإشارة إلى ذلك، تم زراعة الخلايا السرطانية لمدة 72 ساعة باستخدام 10 نانوجرام/مل من الإنترفيرون المؤتلف قبل إضافة الخلايا التائية. تم حصاد المواد الطافية بعد 18-24 ساعة، وتم قياس IFN- بواسطة ELISA (Thermo Fisher Scientific)، وتم تلوين كريات الخلايا لقياس التدفق الخلوي. تم إجراء فحوصات السمية الخلوية عن طريق زراعة الخلايا التائية مع الخلايا السرطانية بنسب المستجيب إلى الهدف المشار إليها. باختصار، تم زرع 5 × 10 خلايا ورم وزراعتها طوال الليل قبل إضافة الخلايا التائية بالنسب المشار إليها. تم تحديد تحلل الخلية المستهدفة باستخدام محلل الخلايا في الوقت الحقيقي xCELLigence (ACEA Biosciences)، الذي قام بتقييم المعاوقة الكهربائية بسبب التصاق الخلية كل 30 دقيقة حتى نهاية التجربة. تم تحليل البيانات باستخدام حزمة برامج xCELLigence RTCA، وتم الإبلاغ عن النتائج كمؤشر خلية تم تطبيعه إلى 1 في وقت إضافة الخلايا التائية. فحص العرض MHC-II. تم إنشاء بنيات الحمض النووي الاصطناعية التي تشفر ما يلي واستنساخها في MSGV1 باستخدام BioXP 3200 (Codex): 25 من الأحماض الأمينية N-terminal لجين HLA-B البشري، متبوعة بأول 50 من الأحماض الأمينية لفيروس الورم الحليمي البشري -16 E6 أو 25 من الأحماض الأمينية من KRASG12V مدمجة في 55 من الأحماض الأمينية للمحطة C لـ HLA-B البشري، وعنصر التشذيب الذاتي T2A، وتسلسل ترميز EGFP. تم إنشاء المواد الطافية الفيروسية كما هو موضح أعلاه، وتم نقل B-LCLs ذاتيًا على الصفائح المطلية بـ RetroNectin بعد التحفيز طوال الليل على سرير من خلايا 3T3 المشععة (0.5 غراي) التي تعبر عن CD40L البشري (3T3-CD40L). تم تقييم كفاءة النقل عن طريق القياس الكمي للتدفق الخلوي للتعبير EGFP. تم تحفيز B-LCLs المنقولة باستخدام 3T 3- CD40L في وجود 200 وحدة دولية / مل من IL البشري المؤتلف -4 (PeproTech) لمدة جولتين متتاليتين لمدة 2-3 أيام قبل الزراعة مع TILs ذاتي. جيل من البلدان النامية لفحوصات عرض المستضد. تم إنشاء وحدات تحكم المجال DC باستخدام طريقة الالتزام بالبلاستيك. تمت إذابة مركبات PBMC المجمدة وطلائها في وسط DC (RPMI -1640 مكمل بـ l- الجلوتامين، و5٪ من مصل AB البشري المعطل بالحرارة، و100 وحدة / مل لكل بنسلين - ستربتومايسين) لمدة ساعتين عند 37 درجة. تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ، وتم زراعة الخلايا الملتصقة في وسط DC مكمل بـ 800 U / mL GM-CSF (Tonbo، Cytek Biosciences) و 500 U / mL IL -4 (PeproTech) لمدة 6 أيام . أضفنا 1 ميكروغرام/مل من الببتيد KRASG12V أو 20 ميكروغرام/مل من بروتين KRASG12V أو WT KRAS (Abcam) مباشرة إلى البلدان النامية غير الناضجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تم حصاد البلدان النامية وزراعتها باستخدام خلايا T المصممة بواسطة TCR بنسبة 1: 1 طوال الليل قبل تقييم تنظيم CD137 عن طريق قياس التدفق الخلوي. انتقال الفيروس العكسي للخلايا السرطانية. تم تصنيع تسلسل ترميز CIITA البشري (تقنيات DNA المتكاملة) وتم استنساخه في MSGV1 بواسطة Gibson Assembly. تم تصنيع تسلسلات التشفير لـ HLADRB5*01:01 والسلاسل المفصولة بتسلسل P2A (تقنيات الحمض النووي المتكاملة) وتم استنساخها في ناقل pHAGE lentiviral معدَّل في المراحل الأولى من تسلسل T2A متبوعًا بتسلسل مراسل CD34 مبتور بواسطة Gibson Assembly. تم إنشاء المواد الطافية للفيروسات القهقرية باستخدام MSGV1، كما هو موضح أعلاه. تم إنشاء المواد الطافية Lentiviral عن طريق النقل المشترك للخلايا 293T مع البلازميدات pHAGE و tat و rev و gag / pol و vsv-g. تم جمع المواد الطافية الفيروسية بعد 24 ساعة وتركيزها بواسطة الطرد المركزي في أنابيب Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). تم طلاء الخلايا السرطانية، وبعد يوم واحد، تم استبدال الوسيط بمادة طافية من الفيروسات القهقرية أو الفيروسة البطيئة مكملة بـ 10 ميكروغرام/مل من البوليبرين. وبعد أربع ساعات، تم سحب المادة الطافية المحتوية على الفيروس واستبدالها بوسيط زرع. تم فرز الخلايا السرطانية MHC-II+ وCD34+ باستخدام فارز خلايا FACS Fusion (BD Biosciences). التدفق الخلوي. تمت تسمية الخلايا بـ Abs أحادية النسيلة مترافقة مع المستضدات التالية: CD3 – PE المضادة للإنسان (OKT3، Tonbo، Cytek Biosciences)، CD4 – PE – Cyanine7 (SK3، Tonbo، Cytek Biosciences)، CD8 – APC (Hit8a، Tonbo). ، Cytek Biosciences)، CD34 – Alexa Fluor 647 (581، BioLegend)، CD69 – PerCP – Cyanine5.5 (FN50، BioLegend)، CD137 – PE (4B 4-1، Miltenyi Biotec)، PD -1 –BV650 (EH12.2H7، BioLegend)، HLA-II –APC (Tü39، BioLegend)، ومضاد الماوس TCR -APC (H57-597، Tonbo، Cytek Biosciences). تم تلوين الخلايا الميتة باستخدام DAPI أو LIVE / DEAD Fixable Aqua (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–تم تجميع tetramer PE ووضع علامة عليه بواسطة NIH Tetramer Core Facility. كانت الخلايا ملطخة بـ 1 ميكروغرام/مل رباعي لمدة ساعة واحدة على الجليد. تم إجراء تلطيخ Ab للمستضدات السطحية لمدة 15 دقيقة على الجليد. بالنسبة لتلوين السيتوكينات داخل الخلايا (ICS)، تمت زراعة الخلايا التائية باستخدام APCs النبضية الببتيدية لمدة 4-6 ساعات في وجود Brefeldin A. وتم نفاذ الخلايا وتلطيخها للسيتوكينات داخل الخلايا باستخدام Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) بعد تلطيخ السطح ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام القيمة المطلقة التالية المرتبطة بالفلوروكروم لتلوين السيتوكين: IFN- –APC (4S.B3، BioLegend)، IL-2–FITC (MQ1- 17H12، BioLegend)، TNF- –BV785 (Mab11) و BioLegend) و Granzyme B – PE (QA16A02، BioLegend). تم الحصول على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي FACSCelesta (BD Biosciences) وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo v10.7. إحصائيات. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام Prism 8 (برنامج GraphPad). بالنسبة لمقارنات ICS، تم استخدام 2-اختبار t غير مقترن. لمقارنة قمع HLA الذي يحجب إشارات الخلايا التائية بوساطة Ab-Ab، تم استخدام 2-طريقة ANOVA. اعتبرت P <0.05 ذات دلالة إحصائية. الموافقة على الدراسة. تم الحصول على العينات البشرية التي تم تحديد هويتها والمستخدمة في هذه الدراسة بموجب موافقة مستنيرة من خلال بروتوكول UCSD IRB رقم 101391CX، "التنميط الظاهري لبيئة الورم وعزل الخلايا". تم تقديم موافقة خطية مستنيرة من قبل الأفراد في الدراسة.
مراجع
1. هاناهان د، واينبرغ ر.أ. السمات المميزة للسرطان: الجيل القادم. خلية. 201؛144(5):646-674.
2. شمس الدين أ.أ، وآخرون. مناعة الورم والعلاج المناعي للسرطانات المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري. اكتشاف السرطان. 2021;11(8):1896-1912.
3. سيمانشو دي كيه، وآخرون. مراجعة رائدة لبروتينات RAS ومنظميها في الأمراض التي تصيب الإنسان. خلية. 2017;170(1):17–33. 4. دي فوس فان ستينويجك بي جيه، وآخرون. هناك ذخيرة كبيرة بشكل غير متوقع من الخلايا التائية الخاصة بفيروس الورم الحليمي البشري (HPV) مهيأة للعمل في المرضى الذين يعانون من سرطان عنق الرحم. الدقة السرطان. 2010;70(7):2707-2717.
5. ستيفانوفيتش إس، وآخرون. منظر طبيعي لمستضدات الورم المناعية في العلاج المناعي الناجح للسرطان الظهاري الناجم عن الفيروس. علوم. 2017;356(6334):200-205.
6. بهات خ، وآخرون. يكشف تحديد ملامح استجابات الخلايا التائية الخاصة بفيروس الورم الحليمي البشري -16- عن تفاعلات مستضد واسعة النطاق لدى مرضى سرطان الفم والبلعوم. J إكسب ميد. 2020;217(10):e20200389.
7. فيتش جي آر، وآخرون. الخلايا التائية المتسللة للورم BRAF V600E - CD 4 + المرتبطة بالاستجابة السريرية الكاملة في سرطان الجلد. جي كلين انفست. 2018;128(4):1563–1568.
8. فيتش جي آر، وآخرون. تتعرف الخلايا التائية CD4+ الذاتية على المستضدات المستحدثة لدى مرضى سرطان الرئة، بما في ذلك طفرات KRAS وERBB2 (Her2) المسببة للسرطان المتكررة. السرطان Immunol الدقة. 2019;2(13):910-922.
9. كافري جي، وآخرون. تستهدف خلايا الذاكرة التائية الطفرات الجينية المكتشفة في الدم المحيطي لمرضى سرطان الظهارة. نات كومون. 2019;10(1):449.
10. تران إي، وآخرون. علاج نقل الخلايا التائية الذي يستهدف KRAS المتحول في السرطان. ن إنجل ي ميد. 2016;375(23):2255–2262.
11. دريبر LM، وآخرون. استهداف الخلايا السرطانية الظهارية HPV -16+ بواسطة الخلايا التائية المهندسة جينيًا TCR والموجهة ضد E6. الدقة السريرية للسرطان. 2015;21(19):4431-4439.
12. جين بي، وآخرون. الخلايا التائية المهندسة التي تستهدف E7 تتوسط في انحدار سرطانات فيروس الورم الحليمي البشري في نموذج الفئران. JCI انسايت. 2018;3(8):e99488.
13. الدب AS، وآخرون. إن التوصيف الكيميائي والوظيفي لحواتم KRAS المتحولة يؤكد صحة هذا البروتين الورمي للاستهداف المناعي. نات كومون. 2021;12(1):4365.
14. أوه دي واي، وآخرون. تتوسط الخلايا التائية CD 4+ داخل الفم في السمية الخلوية المضادة للورم في سرطان المثانة البشري. خلية. 2020;181(7):1612–1625.
15. كاشوت أ، وآخرون. تتوسط خلايا CD4 T المحللة للخلايا الخاصة بالورم مناعة وقائية ضد سرطان الإنسان. متقدم الخيال العلمي. 2021;7(9):eabe3348.
16. دوران إس إل، وآخرون. العلاج الجيني لمستقبلات الخلايا التائية للسرطانات الظهارية المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري: دراسة المرحلة الأولى والثانية على الإنسان. J كلين أونكول. 2019;37(30):2759–2768.
17. ليو العاشر، وآخرون. إعادة البرمجة المشروطة والتوسع على المدى الطويل للخلايا الطبيعية والورم من العينات الحيوية البشرية. نات بروتوك. 2017;12(2):439-451.
18. فيتش جي آر، وآخرون. تحتوي الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالمستضد الجديد في سرطان الجلد البشري على حالات تمايز متنوعة وترتبط بوظيفة الخلايا التائية CD8+ والبلاعم والخلايا البائية. الخلايا السرطانية. 2022;40(4):393–409.
19. لوري FJ، وآخرون. التواقيع الجزيئية للخلايا التائية المتفاعلة مع المستضدات الجديدة المضادة للأورام من السرطانات البشرية النقيلية. علوم. 2022;375(6583):877–884.
20. كريتر إس، وآخرون. زيادة كفاءة عرض المستضد عن طريق اقتران المستضدات بإشارات الاتجار من الدرجة الأولى MHC. ي إيمونول. 2008;180(1):309–318.
21. زاريتسكي جي إم، وآخرون. الطفرات المرتبطة بالمقاومة المكتسبة لحصار PD-1 في سرطان الجلد. ن إنجل ي ميد. 2016;375(9):819-829.
22. جروس أ، وآخرون. التعرف على المستضدات الجديدة لسرطان الجهاز الهضمي البشري عن طريق تعميم الخلايا الليمفاوية PD -1+. جي كلين انفست. 2019;129(11):4992–5004.
23. شولتالبرز جي، وآخرون. TCLP: كتالوج لخطوط الخلايا السرطانية عبر الإنترنت يدمج نوع HLA والحواتم الجديدة المتوقعة والفيروسات والتعبير الجيني. الجينوم ميد. 2015;7(1):118.
24. جونيجا في، تشوي جي، مخترعون؛ شركة BioNTech US Inc.، المحال إليها. مستقبلات الخلايا التائية تبنيها وتستخدمها. براءة الاختراع الأمريكية رقم US202103040215A1. 4 نوفمبر 2021.
25. شارب آه، باوكين كيه. الوظائف المتنوعة للمسار المثبط PD1. نات القس إيمونول. 2018;18(3):153–167.
26. أبيلين جي جي، وآخرون. تحديد معالجة يجند HLA-II وقواعد الربط باستخدام قياس الطيف الكتلي يعزز التنبؤ بحلقة السرطان. حصانة. 2019;51(4):766–779.
27. سيلفيوس جي آر، وآخرون. ترتبط بروتينات K-ras4B والبروتينات سابقة الإنشاء التي تفتقر إلى "الإشارات الثانية" ديناميكيًا بالأغشية الخلوية. خلية مول بيول. 2006;17(1):192–202.
28. تشانغ تش، فلافيل را. ينظم معامل المعاملات من الدرجة الثانية التعبير عن الجينات المتعددة المشاركة في عرض المستضد. J إكسب ميد. 199؛181(2):765-767.
29. روديج إس جيه، وآخرون. تمنح بروتينات MHC حساسية تفاضلية لحصار CTLA -4 و PD -1 في سرطان الجلد النقيلي غير المعالج. ترجمة العلوم ميد. 2018;10(450):ear3342.
30. أحمدزاده م، وآخرون. تعرض الخلايا التائية التنظيمية CD 4+ البشرية المتسللة للورم ذخيرة TCR متميزة وتظهر تفاعل الورم والمستضد الجديد. الخيال العلمي Immunol. 2019;4(31):eaao4310.
31. أوليفيرا جي، وآخرون. منظر طبيعي للخلايا التائية المساعدة والتنظيمية المضادة للأورام 4+ في سرطان الجلد. طبيعة. 2022;605(7910):532-538.
32. روك كوالالمبور، وآخرون. قدم نفسك! بواسطة جزيئات MHC من الدرجة الأولى و MHC من الدرجة الثانية. اتجاهات إيمونول. 2016;37(11):724-737.
33. تاكيشي واي، وآخرون. يعد بروتين الغشاء الميلانوزومي هدفًا لسطح الخلية لعلاج سرطان الجلد. الدقة السريرية للسرطان. 199؛2(11):1837-1842.
34. Lepage S، Lapointe R. تعد تسلسلات الاستهداف الميلانوسومية من gp100 ضرورية لعرض الحاتمة الداخلية المقيدة من الفئة MHC والتعبئة إلى الأجزاء الاندوسومية. الدقة السرطان. 2006;66(4):2423-2432.
35. ألسباتش إي، وآخرون. تشكل المستضدات الجديدة MHC-II مناعة الورم والاستجابة للعلاج المناعي. طبيعة. 2019;574(7780):696–701.
36. دينجيل جي، وآخرون. تعمل الالتهام الذاتي على تعزيز عرض MHC من الدرجة الثانية للببتيدات من بروتينات المصدر داخل الخلايا. Proc Natl Acad Sci US A. 200;102(22):7922–7927.
37. ماتسوزاكي ج، وآخرون. تعد مسارات معالجة المستضد غير الكلاسيكية مطلوبة للتعرف المباشر على الورم المقيد من الفئة MHC من الدرجة II بواسطة خلايا T الخاصة بـ NY-ESO -1- CD 4+ T. السرطان Immunol الدقة. 2009;2(4):341-350.
38. هوهن ه، وآخرون. تتعرف الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم CD4+ في سرطان عنق الرحم على الببتيدات المقيدة لـ HLA-DR التي يوفرها فيروس الورم الحليمي البشري-E7. ي إيمونول. 199؛163(10):5715-5722.
39. هوهن ه، وآخرون. فيروس الورم الحليمي البشري من النوع 33 E7 الببتيدات المقدمة بواسطة HLA-DR*0402 إلى الخلايا التائية المتسللة للورم في سرطان عنق الرحم. جي فيرول. 2000;74(14):6632–6636.
40. لو واي سي، وآخرون. علاج المرضى الذين يعانون من السرطان النقيلي باستخدام مستقبلات الخلايا التائية الرئيسية المقيدة للتوافق النسيجي من الدرجة الثانية والتي تستهدف مستضد جرثومة السرطان MAGE-A3. J كلين أونكول. 2017;35(29):3322–3329.
41. تران إي، وآخرون. العلاج المناعي للسرطان على أساس الخلايا التائية CD4+ الخاصة بالطفرة لدى مريض مصاب بسرطان الظهارة. علوم. 2014;344(6184):641-645.
42. غونزاليس-غالارزا إف إف، وآخرون. تحديث قاعدة بيانات شبكة ترددات الأليل (AFND) لعام 2020: تصنيف البيانات المعياري الذهبي، وبيانات النمط الجيني ذات الوصول المفتوح، وأدوات الاستعلام الجديدة. الدقة الأحماض النووية. 2020;48(د1): د783-د788.
43. شوينبرجر إس بي، وآخرون. يتم دعم الخلايا التائية للخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا عن طريق تفاعلات CD40-CD40L. طبيعة. 199؛393(6684):480-483.
44. أهرندز تي، وآخرون. تساعد الخلايا التائية CD4+ في توفير برنامج مؤثر للخلايا التائية السامة للخلايا، بما في ذلك تقليل تنظيم المستقبلات المثبطة وزيادة غزو الأنسجة. حصانة. 2017;47(5):848–861.
45. فيريس ST، وآخرون. cDC1 Prime ومرخص بواسطة خلايا CD4+ T للحث على المناعة المضادة للورم. طبيعة. 2020;584(7822):624-629.
46. بوس آر، شيرمان لوس أنجلوس. إن مساعدة الخلايا التائية CD4+ في بيئة الورم مطلوبة للتوظيف والوظيفة الخلوية للخلايا الليمفاوية CD8+ T. الدقة السرطان. 2010;70(21):8368–8377.
47. هابث أوو، وآخرون. CD4+ الخلايا التائية - يعتمد الرفض الوسيط للخلايا السرطانية الإيجابية من فئة MHC من الدرجة II على إفراز المستضد والعرض غير المباشر على APCs المضيفة. الدقة السرطان. 2018;78(16):4573-4585.
48. دودلي مي، وآخرون. توليد ثقافات الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم لاستخدامها في علاج النقل بالتبني لمرضى سرطان الجلد. ي المناعية. 2003;26(4):332-342.
49. داش ف، وآخرون. تحليل خلية واحدة لمرجع مستقبلات الخلايا التائية. طرق مول بيول. 2015;1343:181–197.
50. لي ح، وآخرون. محاذاة التسلسل/تنسيق الخريطة وأدوات SAM. المعلوماتية الحيوية. 2009;25(16):2078–2079.
51. شيانج سي، وآخرون. SpeedSeq: تحليل وتفسير الجينوم الشخصي فائق السرعة. طرق نات. 2015;12(10):966-968.
52. سينجولاني ف، وآخرون. برنامج للتعليق والتنبؤ بآثار تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة، SnpEff: SNPs في جينوم سلالة Drosophila melanogaster w1118؛ ايزو -2; ايزو -3. يطير (أوستن). 2012;6(2):80-92.
53. هاجا فريدمان أ، وآخرون. إن دمج الطفرات الكارهة للماء عبر الغشاء في TCR يعزز التعبير السطحي والجشع الوظيفي للخلايا التائية. ي إيمونول. 2012;188(11):5538-5546.
54. كوهين سي جيه، وآخرون. نشاط مضاد للأورام معزز للخلايا التائية المصممة للتعبير عن مستقبلات الخلايا التائية برابطة ثاني كبريتيد ثانية. الدقة السرطان. 2007;67(8):3898–3903.
