الاختلاف في التعبير الجيني بين سطرين من الذرة الرفيعة ثنائي اللون يختلفان في استجابة المناعة الفطرية

خلاصة:

إن النمط الجزيئي المرتبط بالميكروب (MAMPs) الذي يحفز المناعة (MTI) هو عنصر أساسي في الاستجابة المناعية الفطرية للنبات للتعرف على الميكروبات. ومع ذلك ، فإن معظم معرفتنا الحالية بـ MTI تأتي من نباتات نموذجية (مثل Arabidopsis thaliana) مع عمل أقل نسبيًا باستخدام نباتات المحاصيل. في هذا العمل ، درسنا الانفجار التأكسدي الذي تسببه MAMP (ROS) والاستجابة النسخية في نمطين وراثيين من الذرة الرفيعة ثنائي اللون ، BTx623 و SC 155-14 E. SC 155-14 E هو الخط الذي يظهر مقاومة عالية لأنثراكنوز والخط BTx623 عرضة للإنتراكنوز. كشفت نتائجنا عن تباين واضح في التعبير الجيني و ROS استجابةً إما لسلاجلين (flg22) أو استنباط الكيتين بين الخطين. في حين أن استجابة النسخ لكل MAMP وفي كل سطر كانت فريدة من نوعها ، كان هناك درجة كبيرة من التداخل ، وتمكنا من تحديد مجموعة أساسية من الجينات المرتبطة باستجابة نسخ الذرة الرفيعة MAMP. اكتشف مصطلح GO وتحليل إثراء مسار KEGG المزيد من DEGs المرتبطة بالمناعة ومقاومة العوامل الممرضة في عينات SC 155-14 المعالجة بـ MAMP مقارنة بـ BTx623 بنفس العلاج. توفر النتائج أساسًا للدراسات المستقبلية للتحقيق في مسارات المناعة الفطرية في الذرة الرفيعة ، بما في ذلك الجهود المبذولة لتعزيز مقاومة الأمراض.

انقر لشراء ملفمنتج مناعة محسن

    For more information:1950477648nn@gmail.com

الكلمات الدالة:

الذرة الرفيعة ثنائية اللون روس ؛ مناعة فطرية مامبس. تسلسل الحمض النووي الريبي ؛ التعبير الجيني

1 المقدمة

تتعرض النباتات بشكل طبيعي لمجموعة متنوعة من الضغوط ، بما في ذلك العديد من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية والفيروسية [1]. تحمي النباتات نفسها من مسببات الأمراض باستخدام هياكل ومواد كيميائية مسبقة التكوين ، واستجابات الجهاز المناعي التي يسببها العدوى. يستخدم الجهاز المناعي للنبات نظام إدراك ثنائي الطبقات مع طبقتين مترابطتين من المستقبلات.

يتم تنشيط الطبقة الأولى عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط الموضعية السطحية (PRRs) ، والتي تستشعر الجزيئات خارج الخلية من خلال التعرف على العامل الممرض الغازي من خلال اكتشاف الزخارف الهيكلية المحفوظة ، والتي يطلق عليها الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروب (MAMPs) ، والتي تؤدي إلى اعتدال ، لكن استجابة دفاعية واسعة [2]. فلاجيلين ، الكيتين ، عديدات السكاريد الدهنية ، الببتيدوغليكان (PGNs) ، وعامل الاستطالة Tu هي أمثلة على MAMPs المدروسة جيدًا [3-5]. يُطلق على هذه الاستجابة الدفاعية اسم مناعة MAMP المزودة (MTI) [6]. تحدث الطبقة الدفاعية الثانية المعروفة باسم المناعة المستحثة (ETI) استجابةً لبروتينات مستجيبة مشتقة من مسببات الأمراض والتي يتعرف عليها النبات من خلال عمل بروتينات المقاومة ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية قوية ولكنها شديدة التحديد. غالبًا ما يمكن التعرف على ETI عن طريق تحريض موت الخلايا الموضعي الذي يطلق عليه استجابة شديدة الحساسية (HR) [7]. يستشعر كل من نظامي MTI و ETI مسببات الأمراض ويستجيبان عن طريق تنشيط الدفاعات المضادة للميكروبات في الخلية المصابة والخلايا المجاورة [3،8]. تحمل النباتات أيضًا مستقبلات مناعية تتعرف على العوامل الممرضة شديدة التغير ، والتي تشمل فئة البروتينات NBS-LRR [9].

بالإضافة إلى ذلك ، المقاومة النظامية المكتسبة (SAR) هي استجابة مقاومة "نبات كامل" تحدث بعد تعرض موضعي سابق لمسببات الأمراض. يرتبط SAR بتحريض مجموعة واسعة من الجينات (الجينات المرتبطة بالتسبب في المرض) ، ويتطلب تنشيط SAR تراكم حمض الساليسيليك الداخلي (SA) [10].

أظهرت الدراسات التي أجريت في المقام الأول باستخدام نبات الأرابيدوبسيس أن MTI يمكن أن تسبب مجموعة متنوعة من الاستجابات بما في ذلك التغييرات في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وإنتاج أنواع النيتروجين التفاعلي مثل أكسيد النيتريك (NO) ، وترسب الكالوز ، ومستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، وتدفق الأيونات عبر البلازما غشاء ، تحريض أو كبت التعبير عن العديد من الجينات المرتبطة بالدفاع عن النبات ، والتغيرات في جدار الخلية النباتية ، وتحريض المركبات المضادة للميكروبات ، وتوليف البروتينات المرتبطة بالتسبب في المرض [3،11].

على الرغم من أن العديد من استجابات MTI يمكن اعتبارها استجابات نباتية عامة ، إلا أن حجمها يمكن أن يكون خاصًا بنوع نباتي وحتى خاص بالأصناف المستنبتة [12-17]. تم تطوير طرق لتحديد استجابة MTI للمصنع. تتضمن هذه الطرق قياس إنتاج ROS أو NO ، فسفرة بروتين كيناز المنشط بالميتوجين ، التعبير الجيني المستحث بـ MAM ، تثبيط نمو الشتلات ، الفينولات المرتبطة بجدار الخلية واللجنين ، والمقاومة التي يسببها MAMP لمسببات الأمراض البكتيرية والفطرية [18-20].

الذرة الرفيعة ثنائية اللون (L.) Moench هو محصول حبوب عالمي رئيسي تم تكييفه مع مجموعة من الموائل ويتم تربيته لأغراض متنوعة [21]. من المتوقع أن تزداد زراعة الذرة الرفيعة بشكل كبير في جميع أنحاء العالم كأحد المحاصيل الرئيسية لإنتاج الغذاء والكتلة الحيوية [22].

مع زيادة الممارسات والمساحات الجغرافية لزراعة الذرة الرفيعة ، لا مفر من زيادة ضغط المرض. تتميز الذرة الرفيعة بين الحبوب الأخرى بمجموعة واسعة من الأمراض بشكل غير عادي ، والتي تعد واحدة من أهم المعوقات لإنتاجها. على الصعيد العالمي ، تعد الأمراض الفطرية المنتشرة على نطاق واسع من أكثر أمراض الذرة الرفيعة تدميراً وتؤدي إلى خسائر فادحة في المحصول من حيث كمية ونوعية الحبوب [23]. يعتبر الأنثراكنوز من أشد الأمراض الفطرية التي تصيب محصول حبوب الذرة الرفيعة وإنتاج الكتلة الحيوية. يمكن أن تتراوح خسائر المحصول بسبب هذا العامل الممرض من 50 إلى 70 في المائة في الأصناف الحساسة [24،25]. طورت النباتات استراتيجيات دفاعية مختلفة لمحاربة غزو مسببات الأمراض. في الذرة الرفيعة ، تتضمن هذه الاستراتيجيات تنشيط بروتينات PR [26] ، وتراكم بيروكسيد الهيدروجين [27] ، والتخليق الحيوي للفلافونويد phytoalexins [28]. تم استخدام طرق مختلفة لدراسة استجابات مقاومة الذرة الرفيعة ، وتحديد مركبات الدفاع ، وتحديد الحواجز المادية ضد أنثراكنوز (انظر المرجع [29 ، 30] للمراجعة). تم استخدام دراسات التعبير الجيني على نطاق واسع لتحديد جينات المقاومة المرشحة في النباتات بناءً على التعبير التفاضلي بين الأصناف المقاومة والقابلة للتأثر أو النباتات غير الملقحة والمُلقحة (على سبيل المثال ، المراجع [31-37]). قام وانج وزملاؤه [37] بإجراء تحليل نسخي لدراسة استجابة صنف الذرة الرفيعة BTx623 إلى C. subline-ola. وذكروا أن الجينات المشاركة في استقلاب فينيل بروبانويد ، والتخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية تم تحديدها على أنها معبر عنها تفاضليًا استجابةً للعدوى بمسببات الأمراض بالنسبة إلى نباتات التحكم غير الملقحة.

ومع ذلك ، أجريت هذه التجارب على شتلات الصنف الحساس BTx623. ستكون دراسات النسخ الإضافية لمقارنة استجابة التعبير الجيني للعامل الممرض في أصناف الذرة الرفيعة الحساسة والمقاومة ذات قيمة. وبالتالي ، من المهم فهم البنية الجينية التي تتحكم في مقاومة الأمراض القاعدية للذرة الرفيعة وعلاقتها بالمقاومة الكمية للأمراض.

كخطوة أولية في هذا الاتجاه ، قمنا مؤخرًا بفحص مجموعة متنوعة من الأصول الوراثية للذرة الرفيعة من أجل التباين في استجابتها لاستنباط flg22 والكيتين ، بالإضافة إلى مقاومة الأمراض الفطرية [38]. في هذه الحالة ، تم قياس كمية MTI عن طريق قياس إنتاج ROS بناءً على استنباط MAMP. من بين نتائج هذه الدراسة السابقة ، كان تحديد الأنماط الجينية للذرة الرفيعة التي أظهرت استجابة قوية أو ضعيفة لاستنباط MAMP.

يمكن أن يساعد التسلسل عالي الإنتاجية من الجيل التالي ودراسة الترانسكريبتومات في توضيح استجابات العدوى الفطرية في النباتات وزيادة فهم استجابات المضيف. تم استخدام تحليلات الترنسكريبتوم على نطاق واسع لدراسة استجابات النبات للعدوى الفطرية في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك محاصيل الحبوب (على سبيل المثال ، المراجع [31-37]).

ومع ذلك ، فقد ركزت البيانات المنشورة حول التحليل النسبي المقارن لمحاصيل الحبوب في المقام الأول على الاستجابة لمختلف مسببات الأمراض. في الذرة الرفيعة ، ركزت العديد من المنشورات على مقارنات ترانسكريبتوم للنباتات المعالجة بمسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الأنثراكنوز [35 ، 37]. اقترحت بعض المنشورات السابقة أنه لا توجد علاقة ارتباط ذات دلالة إحصائية بين الاستجابة لـ MAMPs والأمراض الفطرية. على سبيل المثال ، Zhang et al. [17] ذكرت وجود علاقة قوية بين الاستجابة لاثنين من MAMPs flg22 والكيتين في مجموعة رسم خرائط الذرة ولكن لا يوجد تطابق مع الاستجابة للأمراض الفطرية. Kimball et al. [38] أبلغ أيضًا عن ارتباط منخفض بين نتائج استجابة ROS المستحثة بـ flg 22- ودرجات مقاومة بقع الأوراق المستهدفة في مجموعتين من مجموعات الذرة الرفيعة RIL بما في ذلك مجموعة BTx623 / SC 155-14 E. لذلك ، نظرًا لندرة البيانات ، شعرنا أنه من المهم تحديد ملف تعريف استجابة الذرة الرفيعة لمعالجات MAMP بشكل نسخي.

في هذا التقرير الحالي ، قمنا بتوسيع تحليلنا السابق عن طريق قياس استجابة النسخ العالمية لاستنباط MAMP. استخدمنا تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي المستند إلى Illumina لمسح التغييرات النسخية استجابةً إما للعلاج flg22 أو الكيتين في الأنماط الجينية للذرة الرفيعة BTx623 و SC 155-14 E ، والتي وصفناها سابقًا بأنها ضعيفة وقوية على التوالي مستجيبات MTI ، على التوالي. BTx623 هو الخط المرجعي لجينوم الذرة الرفيعة ثنائي اللون [22] و SC 155-14 E هو خط يُظهر مقاومة أنثراكنوز مرتفعة [39]. باتيل وآخرون [39] ذكرت أن SC 155-14 أظهر مستوى عاليًا من المقاومة المستقرة (شبه خالية من الأمراض) لمرض أنثراكنوز في جميع البيئات التي تم اختبارها بينما يكون BTx623 عرضة لهذا المرض الفطري. حدد تحليل RNA-seq الخاص بنا 5252 و 8085 جينات معبرة تفاضلية (DEGs) في BTx623 تمت معالجتها بـ flg22 و chitin ، على التوالي ، و 3849 و 5786 DEGs في flg22 و chitin المعالجة SC 155-14 E ، على التوالي ، مقارنةً بعناصر التحكم الصورية غير المعالجة من هذين الطرز الوراثية.

علاوة على ذلك ، أظهرت مقارنة DEGs المختارة باستخدام خطي أنابيب مختلفين للمعلومات الحيوية نتائج متشابهة جدًا. أظهرت ملفات تعريف التعبير للجينات المعبر عنها تفاضليًا ، وتحليل إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) ، وتحليل إثراء مسار KEGG تباينًا واضحًا قائمًا على النمط الجيني في التعبير الجيني المرتبط بـ MTI. كشف مصطلح GO ونتائج إثراء مسار KEGG عن المزيد من DEGs المرتبطة بالمناعة ومقاومة العوامل الممرضة (جينات العلاقات العامة ، واستجابة الجينات للكيتين ، واستجابة الجينات لحمض الساليسيليك ، واستجابة الجينات للإجهاد ، وما إلى ذلك) المقدمة في SC المعالج بـ MAMP {4} } عينات E نسبة إلى BTx623 المعالجة بـ MAMP. توفر النتائج أساسًا لتحديد المكونات المختلفة لاستجابة الذرة الرفيعة MTI.

2. النتائج والمناقشة

2.1. تباين الانفجار التأكسدي في أوراق الذرة الرفيعة المختلفة

كشف تحليلنا السابق لاستجابة MTI للأنماط الجينية المتنوعة للذرة الرفيعة عن تباين كبير في الاندفاع التأكسدي المحفز بـ MAMP بين الأنماط الجينية BTx623 و SC 155-14 E [38]. علاوة على ذلك ، فإن SC 155-14 E عبارة عن خط يُظهر مقاومة عالية للإنتراكنوز ، بينما الخط BTx623 عرضة للإصابة بمرض أنثراكنوز [39]. ولهذه الأسباب ، تم اختيار هذين النوعين من الأنماط الجينية للمقارنة باستخدام RNA-seq.

أثناء إجراء قياسات ROS السابقة ، وجدنا تباينًا كبيرًا حتى داخل نفس المصنع ، مما دفعنا إلى التحقق من مصدر هذا الاختلاف بعناية أكبر. على وجه التحديد ، اختبرنا إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام ثلاث مجموعات من الأوراق ، بدءًا من أسفل إلى أعلى نباتات E. تم وضع علامة على الأوراق كـ # 1 و # 2 و # 3 ، من الأسفل إلى الأعلى كما هو موضح في الشكل 1 أ. كشفت نتائج اختبار ROS (الشكل 1 ب) أن: (1) كان مستوى إنتاج ROS أقل في الأوراق القديمة (الورقة رقم 1) ، بينما كانت أعلى مستويات إنتاج ROS استجابةً إما لـ flg22 أو الكيتين من أصغر الأوراق ( الورقة رقم 3). (2) أنتجت كل من BTx المعالجة وغير المعالجة بـ MAMP 623 2 والأوراق الأصغر سنًا (الورقة رقم 2) مستويات منخفضة نسبيًا من إنتاج ROS.

على النقيض من ذلك ، أنتجت ثاني أصغر أوراق SC 155-14 E التي تمت معالجتها بواسطة MAMP بشكل ملحوظ (عند مستوى 0. 01) مستويات أعلى من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنة بالنباتات الوهمية غير المعالجة ، بالإضافة إلى أوراق BTx المعالجة أو المزيفة { {5}} أصغر الأوراق. (3) تم اكتشاف الاندفاع التأكسدي الناجم عن تطبيقات flg22 ، أو الكيتين في أقراص الأوراق من الأوراق الأصغر (الورقة رقم 3) لكلا النوعين الجيني ، على الرغم من أنه ، كما لوحظ سابقًا ، كانت مستويات إنتاج ROS أعلى في SC المعالجة بـ MAMP 155-14 E متعلق بـ BTx623. كشف المسار الزمني لـ flg 22- عن إنتاج ROS المشغّل والمحفّز بالكيتين في SC 155-14 الورقة الثانية الأصغر سنًا أن إنتاج ROS المشغّل بالكيتين حدث قبل flg 22- الذي أدى إلى إنتاج ROS (الشكل 1C ). تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة بواسطة Zhang et al. [17] حيث ظهر إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المحفز بالكيتين قبل flg 22- مما أدى إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في flg22 وشتلات الذرة المعالجة بالكيتين. أفيد [40] أن إنتاج ROS استجابةً لـ flg22 أظهر أعلى إنتاج لـ ROS حوالي 12 دقيقة ، وكان الأدنى عند 30 دقيقة في Arabidopsis. أظهرت نتائج اختبار ROS الخاص بنا في الذرة الرفيعة أعلى إنتاج لـ ROS حوالي 13 دقيقة ، وأدنىها عند 30 دقيقة بعد علاج flg22 ، والتي تشبه إلى حد كبير النتائج في Arabidopsis. نظرًا لأن هدفنا كان العثور على الظروف المثلى للمقارنة بين استجابة MTI للنوعين الجينيين ، فقد اخترنا ثاني أصغر أوراق نباتات عمرها 15- يومًا لاستخراج الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي اللاحق. يعد الاختلاف بين أوراق نبات الذرة الرفيعة المنفردة بمثابة تذكير بأن النتائج يمكن أن تختلف بين التجارب اعتمادًا على المصدر والتوقيت والميزات الأخرى لتجربة معينة ، وبالتالي ، يجب التحكم بعناية في المعلمات التجريبية.

الاندفاع التأكسدي ، وهو إنتاج سريع وعابر لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، هو أحد أقدم الجوانب التي يمكن ملاحظتها للاستجابة الدفاعية للنبات [41]. بالنظر إلى أن انفجار ROS هو استجابة فورية ، فمن المتوقع استجابة نسخية متأخرة قليلاً للجينات المرتبطة بـ MTI. لقد حصدنا عينات بعد 60 دقيقة من علاج MAMPs لتحليل RNA-Seq.

2.2. الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) لـ BTx623 و SC 155-14 E استجابةً لعلاجات MAMP

لتقييم مستوى التعبير عن جينات ترميز بروتين الذرة ثنائية اللون المشروحة لكل عينة ، تم حساب عدد القراءات النظيفة لـ RNA-seq التي تم تعيينها لكل جين ثم تم تطبيعها في FPKM (شظايا لكل نموذج kb exon لكل مليون جزء معين). تم فحص تغيرات التعبير لكل جين في أقراص الأوراق المعالجة بـ MAMP لـ BTx623 و SC 155-14 E بالمقارنة مع المعالجات الوهمية (الماء). كان إجمالي الجينات المعبر عنها متشابهًا في جميع المعالجات لكلا النوعين: 27.171 و 27.283 و 27161 و 27.182 و 27.512 و 27175 جينًا تم التعبير عنها في صورة وهمية لـ BTx623 ، flg 22- BTx623 ، BTx623 المعالج بالكيتين ، نموذج من SC { {22}} E ، flg 22- معالجة SC 155-14 E ، و SC المعالجة بالكيتين 155-14 E ، على التوالي. استخدمنا الجينوم المرجعي BTx623 لتعيين القراءة في كلا السطرين نظرًا لأن المرجع المحدد لـ SC 155-14 E غير متاح. كشفت أرقام الجينات المعبر عنها التي تم استردادها من BTx623 و SC {{3 0} E مع جميع الشروط المذكورة أعلاه أن كلا الخطين يشتركان في أعداد مماثلة من الجينات المعبر عنها. معدلات قراءة الخرائط الإجمالية لعينات من SC 155- 14 E mock (3 مكررات) ، SC 155-14 E تعامل مع flg22 (3 مكررات) ، SC 155-14 E تعامل مع الكيتين (3 مكررات) ، BTx623 mock (3 مكررات) ، BTx623 تعامل مع flg22 (3 مكررات) ، BTx623 تعامل مع الكيتين (3 مكررات) كانت: 93.6 بالمائة ، 93.9 بالمائة ، 93.9 بالمائة ، 93.8 بالمائة ، 93.9 بالمائة ، 93.6 بالمائة ، 93.5 بالمائة ، 93.5 بالمائة ، 93.1 بالمائة ، 96.9 بالمائة ، 97. 0 بالمائة ، 97. 0 بالمائة ، 97.2 بالمائة ، 96.8 بالمائة ، 97. 0 بالمائة ، 96.9 بالمائة ، 97. 0 في المئة 97.0 في المئة على التوالي. أشارت هذه النتائج إلى أن التأثيرات المختلفة لعلاج MAMPs على النسخ من BTx623 و SC 155-14 E لم تكن بسبب اختلافات التسلسل الجيني بين النمطين الجينيين.

توفر مؤامرة PCA للتعبير الجيني نظرة ثاقبة على الارتباط بين العينات. لاستكشاف تشابه عيناتنا ، أجرينا تحليل PCA. أظهر نموذج التآمر على PC1 و PC2 (الشكل 2) أن أربعة شروط تجريبية (BTX 623_ flg22 ؛ SC 155-14 E _ flg22 flg22 ؛ BTX 623_ كيتين و SC { {10}} E _ الكيتين) تم فصلهما على نطاق واسع. على النقيض من ذلك ، تم تجميع التكرارات البيولوجية الثلاثة لكل خط من خطوط الذرة الرفيعة وكل معاملة MAMP ، بالإضافة إلى المعالجة الوهمية ، معًا بشكل وثيق ، على التوالي ، مما يشير إلى قابلية استنساخ جيدة بين التكرارات البيولوجية (الشكل 2).

تظهر قطع البركان في الشكل 3 التعبير الجيني في خطي الذرة الرفيعة المعالجين بـ flg22 أو الكيتين. مخطط البركان هو نوع من مخطط التشتت الذي يُظهر أهمية إحصائية (قيمة p) مقابل حجم التغيير (تغير الطية). إنه يتيح التعرف البصري السريع على الجينات ذات التغييرات الكبيرة التي تعتبر أيضًا ذات دلالة إحصائية. قد تكون هذه الجينات الأكثر أهمية من الناحية البيولوجية. في الشكل 3 ، تعتبر الجينات ذات −log1 0 (قيمة p) مساوية أو أكبر من 3 DEGs. تمثل نقاط اللون الأحمر DEGs وتمثل نقاط اللون الأسود غير DEGs. في كل قطعة ، الجينات التي لها سجل 2 (تغير _) أكبر من 0 هي جينات منظمة ، وبخلاف ذلك ، جينات خاضعة للتنظيم السفلي. تتجه الجينات الأكثر تنظيمًا نحو اليمين ، وتتجه أكثر الجينات انخفاضًا إلى اليسار ، وتتجه الجينات الأكثر أهمية من الناحية الإحصائية نحو الأعلى.

تم اختيار الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) من كل معاملة وفقًا لأهميتها في التعبير (القيمة p 0. 0 0 1). تجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا قيمة p لـ 0. 0 0 1 كحد أدنى لدينا ولكن ليس FDR (قيم q) لتحديد DEGs في هذا التقرير. كان FDR (قيم q) مهمًا أيضًا في هذا المستوى (الجداول S2 – S5). عند القيمة الاحتمالية لـ 0. 001 ، كانت قيم FDRs 0.0039 و 0.0051 و 0.0025 و 0.0035 لـ BTx623 مع علاج flg22 و SC 155-14 E مع علاج flg22 و BTx623 مع علاج الكيتين و SC {{ 26}} E مع العلاج بالكيتين ، على التوالي. يتم سرد قيم p وقيم q لجينات BTx623 و SC 155-14 E في جميع الظروف في الجداول S2 إلى S5. من خلال تحليل أنماط التعبير عن هذه الجينات في الأوراق المعالجة بـ MAMP لـ BTx623 و SC 155-14 E ، لاحظنا عددًا كبيرًا من الجينات (14-30 بالمائة من إجمالي الجينات المعبر عنها) التي أظهرت اختلافات كبيرة بعد flg22 أو الكيتين. العلاج في كلا خطي الذرة الرفيعة. كان العدد الإجمالي لـ DEGs من BTx623 المعالج بالكيتين (8085) قريبًا جدًا من ذلك المبلغ عنه في دراسة نسخ سابقة في BTx623 مصابًا بمرض الأنثراكنوز C. subline-ola (8078) [37]. كانت أعداد DEGs أعلى في flg22 (19 بالمائة) أو الكيتين (30 بالمائة) أوراق BTx623 المعالجة بالنسبة إلى SC 155-14 E (14 بالمائة و 21 بالمائة ، على التوالي).

على الرغم من أن العدد الأكبر من DEGs في BTx623 المعالج بـ MAMP مقارنةً بـ SC 155-14 كان عكس استجابة ROS لهذين النمطين الجينيين ، فقد لا يكون هذا مفاجئًا نظرًا لحدوث استجابة ROS واستجابة التعبير الجيني لعلاج MAMP في أوقات مختلفة ، مستقلة إلى حد كبير ، وتتوسطها آليات مختلفة [42 ، 43]. كشف مصطلح GO وإثراء مسار KEGG عن المزيد من DEGs المرتبطة بالمناعة ومقاومة العوامل الممرضة المقدمة في عينات SC 155-14 E المعالجة بـ MAMP. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أن أعداد DEG كانت أعلى في العينات المعالجة بالكيتين مقارنة بتلك المعالجة بـ flg22 تتطابق بشكل جيد مع مقايسات استجابة ROS (الشكل 1 ب) حيث رأينا استجابة ROS أقوى عند علاج الكيتين.

لاستكشاف إلى أي مدى يتم مشاركة الجينات والعمليات البيولوجية بين علاجات flg22 و chitin في BTx623 و SC 155-14 E ، قمنا بمقارنة DEGs الخاصة بهم بمزيد من التفصيل. تُظهر مخططات Venn في الشكل 4 أ التداخل في DEGs في المجموع ، حيث يحدد الجين المنظم لأعلى ولأسفل عند قيمة p تبلغ 0. 001. من بين إجمالي 10535 DEGs ، استجابت مجموعة أساسية من 2272 جينًا لكل من علاج flg22 والكيتين في كلا خطي الذرة الرفيعة. وبالمثل ، من إجمالي 5410 جينًا خاضعًا للتنظيم ، تم تنظيم مجموعة أساسية من 1778 جينًا في كلا الطرازين الجيني ، بينما ، من إجمالي 5125 جينًا خاضعًا للتنظيم ، تم تنظيم مجموعة أساسية مكونة من 474 جينًا في كلا النوعين. الأنماط الجينية.

تم تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المقدمة هنا باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية باستخدام أدوات Bowtie 2 2. 3.4.3 و TopHat 2.1.1 و Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge و Cuffdiff) مع المعلمات الافتراضية (خط الأنابيب رقم 1). لتأكيد نتائج الفحص بشكل أكبر ، استخدمنا خط أنابيب آخر (خط الأنابيب رقم 2) مع HiSat2 و HTSeq و edgeR لإجراء التحليل. HiSat2 هو التطوير التالي لـ TopHat2. قمنا بمقارنة DEGs لكل حالة (على سبيل المثال ، نمطين وراثيين معالجين بـ flg22 أو chitin ، جميع DEGs الخاضعة للتنظيم لأعلى أو لأسفل) تم تحديدهما باستخدام كلا خطي الأنابيب. أظهرت النتائج (الشكل 5) أن أرقام DEG المحددة باستخدام كلا خطي الأنابيب كانت قريبة جدًا.

إجمالي DEGs المحددة مع خط الأنابيب رقم 1 مقابل خط الأنابيب رقم 2 كانت BTx 623_ flg22: 5241 مقابل 5413 ؛ SC 155-14 E _ flg22: 3849 مقابل 3476 ؛ BTx 623_ كيتين: 8085 مقابل 8320 ؛ SC 155-14 E _ الكيتين: 5786 مقابل 5383. كانت DEGs المنتظمة التي تم تحديدها مع خط الأنابيب رقم 1 مقابل خط الأنابيب رقم 2 هي BTx 623_ flg22: 3074 مقابل 3076 ؛ SC 155-14 E _ flg22: 2591 مقابل 2483 ؛ BTx 623_ كيتين: 4156 مقابل 4583 ؛ SC 155-14 E _ الكيتين: 3486 مقابل 3346. كانت DEGs ذات التنظيم المنخفض المحددة مع خط الأنابيب رقم 1 مقابل خط الأنابيب رقم 2 هي BTx 623_ flg22: 2152 مقابل 2237 ؛ SC 155-14 E _ flg22: 1257 مقابل 993 ؛ BTx 623_ كيتين: 3919 مقابل 3757 ؛ SC 155-14 E _ الكيتين: 2296 مقابل 2037. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت النتائج في الشكل 5 أيضًا أن نسبة عالية من DEGs المحددة باستخدام خطي الأنابيب متداخلة في جميع الظروف. كانت النسبة المئوية لأرقام DEG / أرقام DEG المتداخلة المحددة باستخدام خط الأنابيب رقم 1 79.6 بالمائة و 73.7 بالمائة. 80.8 بالمائة و 74.4 بالمائة من إجمالي DEGs من BTx 623_ flg22 و SC 155-14 E _ flg22 و BTx 623_ كيتين و SC 155-14 شرق {{73} } الكيتين على التوالي؛ 83 بالمائة و 80.6 بالمائة و 85.3 بالمائة و 81.1 بالمائة من DEGs الخاضعة للتنظيم الأعلى من BTx 623_ flg22 و SC 155-14 E _ flg22 و BTx 623_ كيتين و SC {{ 88}} شرق _ كيتين ، على التوالي ؛ 75.1 بالمائة و 59.5 بالمائة و 75.8 بالمائة و 67.4 بالمائة من DEGs منخفضة التنظيم من BTx 623_ flg22 و SC 155-14 E _ flg22 و BTx 623_ كيتين و SC {{ 105}} شرق _ كيتين ، على التوالي. وبالتالي ، أثبتت هذه النتائج المقارنة أن بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المقدمة صحيحة بغض النظر عن أي من الطريقتين تستخدم للتحليل.

يظهر في الشكل 6. خريطة الحرارة لمحات التعبير المجمعة لـ DEGs لـ BTx623 و SC 155-14 E المعالجة بـ flg22 أو الكيتين للتكرارات البيولوجية الثلاثة. تم تطبيع قيم التعبير الجيني كدرجات z. يتحول اللون من اللون الأرجواني إلى الأحمر مع زيادة القيمة ، مما يشير إلى التعبير الجيني من الأقل إلى الأعلى. توضح هذه الخريطة الحرارية بوضوح التنظيم التفاضلي للجينات في BTx623 و SC 155-14 E استجابةً لمعاملة flg22 أو الكيتين. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت النتائج أيضًا أن خرائط الحرارة لثلاث مكررات بيولوجية في كل حالة كانت قريبة جدًا ، مما يشير إلى قابلية استنساخ جيدة بين التكرارات البيولوجية.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت المقارنات الزوجية (الشكل 7 أ) بين DEGs الخاضعة للتنظيم الأعلى والأسفل من علاجات flg22 و chitin أن هناك تداخلًا كبيرًا بين BTx623 و SC 155-14 E. من بين الجينات المستحثة 3074 flg 22- في BTx623 ، تم تحفيز 83.8 بالمائة أيضًا في BTx623 استجابةً للعلاج بالكيتين ، بينما من الجينات المستحثة 2591 flg 22- في SC 155-14 E ، {{ 16}}. استجاب 6 في المائة أيضًا إلى SC المعالج بالكيتين 155-14 E. ربما لا يكون هذا مفاجئًا لأن الأعمال السابقة في Arabidopsis thaliana أظهرت تداخلًا كبيرًا في الجينات التي تستجيب لمجموعة متنوعة من MAMPs المتميزة ، والتي تحدد مسارات MTI العامة [44-46].

علاوة على ذلك ، Zhang et al. [17] أبلغ أيضًا عن وجود ارتباط كبير بين flg22 واستجابة الكيتين في الذرة. لوحظ تداخل أقل بين أقراص أوراق BTx623 و SC 155-14 المعالجة بنفس MAMP (الشكل 7 أ). تم تحفيز 64.3 بالمائة من الجينات المستحثة flg 22- في BTx623 في flg 22- SC المعالج 155-14 E و 68.3 بالمائة من الجينات المستحثة بالكيتين في BTx623 تم تحفيزها في SC المعالج بالكيتين 155-14 E. وبالمثل ، من بين الجينات الـ 2152 التي تم تنظيمها عند معالجة flg22 لـ BTx623 ، تم أيضًا تقليل نسبة عالية (75.9 بالمائة) بواسطة الكيتين في BTx623. من بين 1257 جينًا تم تنظيمها بواسطة flg22 في SC 155-14 E ، تم أيضًا تنظيم 70.8 بالمائة بواسطة الكيتين في SC 155-14 E. ومع ذلك ، فإن 29 في المائة فقط من الجينات الخاضعة للتنظيم من flg22 في BTx623 خضعت للتنظيم المنخفض أيضًا في flg 22- معالجة SC 155-14 E و 45 بالمائة من الجينات الخاضعة للتنظيم الكيتين في BTx623 كانت خاضعة للتنظيم المنخفض في SC المعالجة بالكيتين 155-14 E (الشكل 7 أ). ومن ثم ، في حين كان هناك تقارب كبير في مسارات MTI إلى flg22 و chitin في النمطين الوراثيين اللذين تمت مقارنتهما ، فإن البيانات تشير أيضًا إلى تعقيد مثير للاهتمام حول كيفية استجابة هذين النمطين الجينيين إلى MAMPs المختلفة.

2.3 تحليل الإثراء الوظيفي الجيني الذي يقارن استجابة MTI لـ BTx623 و SC 155-14 E

لتحديد الفئات الوظيفية للجينات التي يتم تنظيمها استجابةً إما لـ flg22 أو الكيتين والاستجابة التفاضلية لخطي الذرة الرفيعة اللذين تم اختبارهما ، استخدمنا منصة PlantRegMap [47،48] لإجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات استنادًا إلى DEGs المكتشفة في المجال البيولوجي. فئة العملية. يوضح الشكل 8 أ و ب أعلى شروط GO للجينات المخصبة بالعملية البيولوجية مع DEGs المنظمة و DEGs الخاضعة للتنظيم من كل من BTx623 و SC 155-14 E. يتم توفير القائمة الكاملة لـ DEGs في الجداول من S6 إلى S13. ترتبط العديد من هذه الجينات بعمليات تشمل استجابة الإجهاد ، واستجابات دفاع النبات ، والاستجابة للمحفزات ، والاستجابة للمحفزات الحيوية ، والاستجابة للبكتيريا ، والاستجابة لكائن حي آخر ، والتواصل الخلوي ، وعملية التمثيل الغذائي للفوسفور ، وفسفرة البروتين.

تظهر النتائج في الشكل 8 أ و ب اختلافات واضحة في التعبير عن الجينات المرتبطة عادة بالمناعة الفطرية بين الطرز الوراثية للذرة الرفيعة. في مصطلحات GO المخصبة ، تم العثور على بعض DEGs الفريدة في كل حالة مع تداخل. على سبيل المثال ، استجابة دفاع مصطلح GO (GO 0006952): تم إثراء 91 و 84 من DEGs الخاضعة للتنظيم الأعلى في BTx623 أو SC 155-14 E مع flg22 ، على التوالي. ضمن تلك DEGs ، كانت 24 DEGs فريدة في BTx623 و 15 DEGs تم العثور عليها فقط في SC 155-14 E ، وتم تقديم الآخرين في كلا الأنماط الجينية للذرة الرفيعة. وبالمثل ، تم إثراء 102 و 93 من DEGs الخاضعة للتنظيم الأعلى في BTx623 أو SC 155-14 E وتم معالجته بالكيتين ، على التوالي. ضمن تلك DEGs ، كانت 20 DEGs فريدة في BTx623 و 14 DEGs كانت فريدة في SC 155-14 E ، وتم تقديم الآخرين في كلا الأنماط الجينية للذرة الرفيعة.

في مصطلح GO "الاستجابة للكيتين (GO: 0010200)" ، لاحظنا 18 DEGs منظمًا من إجمالي 779 جينًا في هذه الفئة المخصب في عينات SC المعالجة بالكيتين 155-14 E (الشكل 8 ) ، بينما لم يتم تخصيب أي جين في عينات BTx623 المعالجة بالكيتين. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء 16 DEGs خاضع للتنظيم في عينات 22- SC المعالجة 155-14 flg ، وتم إثراء 12 DEGs الخاضعة للتنظيم الأعلى في عينات BTx623 المعالجة 22- (الشكل 8). كشفت مقارنة قوائم DEG لمصطلح GO "الاستجابة للكيتين" في flg22 و BTX623 المعالج بالكيتين و SC 155-14 E (الجدول S9) أن DEGs المخصب في flg22 ، أو SC المعالج بالكيتين 155- 14 كانت E هي نفسها باستثناء الكيتين الذي تسبب في حدوث DEGs أكثر من flg22. على النقيض من ذلك ، كانت جميع الـ 12 DEGs المخصبة بـ BTX623 المعالجة بـ flg 22- مختلفة عن DEGs التي يسببها MAMPs في SC 155-14 E. قد تساهم DEGs التي يسببها MAMPs في استجابة مقاومة الأنثراكنوز في SC 155-14 E نظرًا لأن الكيتين هو جزيء MAMP نموذجي من جدران الخلايا الفطرية التي تثير استجابات مناعية للنبات. Stringlis et al. [49] ذكرت أيضًا أنه تم إثراء مجموعة من DEGs الخاضعة للتنظيم في مصطلح GO من "الاستجابة للكيتين" من الكيتين ، flg22 ، والبكتيريا الجذرية المفيدة للنباتات Pseudomonas simiae WCS417 المعالجة بنباتات الأرابيدوبسيس. ماتيتش وآخرون. [33] ذكرت أنه تم إثراء 21 DEGs في مصطلح GO من "الاستجابة للكيتين" من تحليل RNA-seq لأوراق الأرز لصنف مقاوم ولكن ليس من صنف حساس بعد الإصابة بمسببات الأمراض الفطرية Fusarium fujikuroi.

تشارك جينات PR (المرتبطة بالإمراض) في الاستجابة المناعية للنبات [50] ولها نشاط مضاد للفطريات ضد العديد من الفطريات المسببة للأمراض [51]. بروتينات PR -10 هي بروتينات صغيرة ، حمضية بشكل أساسي ، داخل الخلايا لها خصائص مضادة للفطريات ارتبطت بالاستجابات الدفاعية في الأنواع النباتية بما في ذلك الذرة الرفيعة [52]. تم تحفيز أفراد عائلة جين PR -10 من خلال هجمات العوامل الممرضة في مجموعة متنوعة من أنواع النباتات [53]. في الذرة الرفيعة ، Lo et al. [26] ذكر أن تعبير PR -10 تم استحداثه كجزء من دفاع المضيف النشط للذرة الرفيعة ضد مسببات الأمراض الفطرية الورقية C. heterostrophus و C. sublineolum. كاتي وآخرون [54] ذكرت أن العديد من أصناف الذرة الرفيعة أظهرت تحريضًا كبيرًا للكميات النسبية الطبيعية من PR -10 بعد التلقيح بأبواغ فطرية من C. lunata و F. capsicum في الاختبارات الميدانية. في حالة الاحتباس الحراري ، أظهرت حبات النباتات الملقحة تحريض PR -10 mRNA ، وكانت الاستجابة أكبر في صنفين مقاومين تم اختبارهما بالنسبة إلى صنفين حساسين.

كشفت نتائجنا أنه من بين DEGs التي تم تحديدها ، تم العثور على أربعة جينات PR -10 (SORBI _3001 G401300 ، SORBI _3001 G401200 ، SORBI _3001 G400800 ، SORBI _3001 G401000). في SC 155-14 E تم تنظيم جميع DEGs الأربعة من خلال معالجة flg22 أو الكيتين ، على النقيض من ذلك ، في BTx623 ، لم يتم العثور على SORBI _3001 G401000 في DEGs ، و SORBI {{15} } تم تقديم G401300 (منظم أعلى) فقط في BTx623 مع علاج الكيتين ولكن ليس مع علاج flg22. يشير هذا إلى أنه يمكن استخدام التعبير عن جينات العلاقات العامة استجابةً لمستويات منتجات ROS المرتفعة بعد علاج MAMPs ومقاومة الأنثراكنوز في SC 155-14 E.

حمض الساليسيليك (SA) هو إشارة مناعية نباتية ضرورية للاستجابة الدفاعية المحلية والمقاومة الجهازية المكتسبة. يلعب دورًا مهمًا في المقاومة والدفاع ضد هجمات مسببات الأمراض [55]. في الذرة الرفيعة ، توجيزيمانا وآخرون. [56] أبلغت عن تغيرات كمية في مستويات حمض الياسمين ، وحمض الساليسيليك المتقارن ، وحمض الأبسيسيك في الذرة الرفيعة المصابة بالفطريات C. subline-ola. C. subline-ola هو العامل المسبب لأنثراكنوز. كانت التراكيب الجينية للذرة الرفيعة ذات المستويات المحسنة من الأحماض الأمينية (التربتوفان والتيروزين) وحمض الياسمين وتقارن الساليسيليك والزيتين أكثر مقاومة لأنثراكنوز. في هذه الدراسة ، تم إثراء مصطلح GO "الاستجابة لحمض الساليسيليك" (GO: 0009751) بما في ذلك 19 DEGs المنظم بشكل خاص فقط في SC 155-14 E المعالج بالكيتين (الجدول S9). وبالتالي ، يمكن أن يلعب مسار إشارات الساليسيليك دورًا مهمًا في الاستجابة لمستويات إنتاج ROS المرتفعة بعد علاج MAMP ومقاومة الأنثراكنوز في SC 155-14 E.

علاوة على ذلك ، تم إثراء 169 من DEGs المنظمة في استجابة مصطلح GO للإجهاد فقط في SC 155-14 E المعالجة بالكيتين (الجدول S9). إن مصطلحات GO الأخرى الموجودة فقط في SC 155-14 المعالجة بـ MAMPs ، ولكن ليس في BTx623 بنفس العلاج هي عمليات التمثيل الغذائي الثانوية (GO: 0019748) ، عملية التخليق الحيوي للفوسفاتيديل كولين (GO: 0006656) ، وعملية التخليق الحيوي للدهون ( اذهب: 0008610).

علاوة على ذلك ، تم إثراء 169 من DEGs المنظمة في استجابة مصطلح GO للإجهاد فقط في SC 155-14 E المعالجة بالكيتين (الجدول S9). إن مصطلحات GO الأخرى الموجودة فقط في SC 155-14 المعالجة بـ MAMPs ، ولكن ليس في BTx623 بنفس العلاج هي عمليات التمثيل الغذائي الثانوية (GO: 0019748) ، عملية التخليق الحيوي للفوسفاتيديل كولين (GO: 0006656) ، وعملية التخليق الحيوي للدهون ( اذهب: 0008610).

قمنا أيضًا بفحص تكوين الجينات التي يتم تنظيمها بشكل مشترك بين الطرز الوراثية بعد معالجة flg22 أو الكيتين بالإضافة إلى المجموعات الأساسية من DEGs في جميع العلاجات ونوعين وراثيين عن طريق تحليل التخصيب GO (الشكلان 4 ب و 7 ب). يتم توفير القائمة الكاملة لـ DEGs في الجدولين S14 و S15. أظهر الشكل 4 ب شروط GO المخصبة للمجموعات الأساسية من DEGs الإجمالية والمنظمة لأعلى ولأسفل في BTx623 و SC 155-14 E مع جميع المعالجات. تم إثراء مصطلحات GO المتعلقة باستجابة MAMPs والدفاع عن النبات (على سبيل المثال ، ارتباط الكيتين ، الاستجابة الدفاعية ، نشاط البروتين كيناز ، فسفرة البروتين ، نشاط بروتين سيرين / ثريونين كيناز) بشكل كبير في DEGs المنظمة بينما شروط GO لعملية التمثيل الحيوي المستقلب الثانوي ، تم إثراء ارتباط أيون الحديد ونشاط أوكسيدوروكتاز فقط في DEGs الخاضع للتنظيم. كانت هذه النتيجة مشابهة للنتائج في Arabidopsis حيث تم إثراء مصطلحات GO المتعلقة بالاستجابة للمثيرات (flg22 peptides من P. simile WCS417 و P. aeruginosa PAO1 و chitin والخلايا البكتيرية لـ P. مجموعة أساسية من DEGs [49].

أظهر الشكل 7 ب شروط GO المخصبة بشكل كبير لمجموعات DEGs الخاضعة للتنظيم المشترك (أي ، الأعلى أو المنظم في كلا النوعين) من DEGs بين BTx623 و SC 155-14 E بعد flg22 أو العلاج بالكيتين. كشفت النتائج أن مصطلحات GO المتعلقة باستجابة MAMPs والدفاع النباتي (على سبيل المثال ، الاستجابة الدفاعية ، نشاط البروتين كيناز ، فسفرة البروتين ، نشاط بروتين سيرين / ثريونين كيناز) تم إثرائها فقط في flg22 أو DEGs عالي التنظيم في كلا الطرز الوراثية بينما شروط GO من عملية التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي ، ارتباط الهيم ، ارتباط أيون الحديد ، نشاط أوكسيدريدوكتاز لذرة واحدة من الأكسجين وعملية التخليق الحيوي فوسفاتيديل كولين فقط في مجموعات خاضعة للتنظيم المنخفض من DEGs.

2.4 تحليل إثراء مسار KEGG لاستجابة MTI لـ BTx623 و SC 155-14 E

يوضح الشكل 9 تحليل إثراء مسار KEGG لأدوات DEG المنظمة التي تم العثور عليها في عينات BTx623 و SC 155-14 E المعالجة باستخدام أداة DAVID عبر الإنترنت [57]. يتم توفير القائمة الكاملة لـ DEGs في الجداول من S16 إلى S20. تحدد النتائج مسارات KEGG العليا المحددة المخصبة نتيجة لتفعيل MTI في الطرز الوراثية للذرة الرفيعة. في مسار KEGG "تفاعل مسببات الأمراض النباتية" ، لاحظنا أنه تم إثراء 24 من DEGs المنتظم في عينات SC 155-14 المعالجة بالكيتين ، بينما لم يتم إثراء أي من DEGs في عينات BTx623 المعالجة بالكيتين. ترتبط استجابة الكيتين الأقوى للنمط الجيني SC 155-14 E بالمقاومة الأكبر لهذا النمط الجيني لمرض الأنثراكنوز الفطري [39]. علاوة على ذلك ، كشف إثراء مسار KEGG عن 28 جينًا متورطًا في التخليق الحيوي لفينيل بروبانويد المصطلح في SC 155-14 E المُعالج بـ flg22. يبدأ مسار التخليق الحيوي للفينيل بروبانويد بفينيل ألانين الذي يمكن تحويله إلى مركبات عطرية مثل مركبات الفلافونويد والبنزنويدات والكومارين والهيدروكسي سينامات واللجنين [58،59]. شارك العديد من مركبات الفينيل بروبانويد والفلافونويد في الاستجابة لمقاومة المرض [28 ، 60]. يعتبر إنتاج الفيتوالكسينات استجابة دفاعية رئيسية ضد مسببات الأمراض الأنثراكنوز C. subline-ola [28] في الذرة الرفيعة. 3- deoxy anthocyanidins هي مجموعة غير عادية من مركبات الفلافونويد المعروفة باسم phytoalexins في الذرة الرفيعة. Phytoalexins هي جزيئات صغيرة ذات نشاط مضاد للميكروبات يتم إنتاجها بعد عدوى الممرض [61]. وانغ وآخرون. [37] وجد أيضًا أن التخليق الحيوي لفينيل بروبانويد المصطلح KEGG قد تم إثرائه بشكل كبير في DEGs للنباتات المصابة بـ C. subline-ola المصابة في دراسة النسخ الخاصة بالذرة الرفيعة. يجب أن نلاحظ أن نتائج إثراء مسار KEGG (الشكل 9) أظهرت أيضًا استجابة أعلى لـ BTx623 بعد علاج MAMPs في بعض المسارات التي قد تلعب دورًا في تفاعلات مسببات الأمراض النباتية (على سبيل المثال ، في مسارات التخليق الحيوي للفينيل ألانين والتربتوفان ، التخليق الحيوي للمضادات الحيوية).

علاوة على ذلك ، كشفت نتائج تحليل إثراء مسار KEGG لـ DEGs الخاضعة للتنظيم السفلي أن عشرة DEGs خاضعة للتنظيم السفلي قد تم شرحها على أنها `` بروتينات هوائي التمثيل الضوئي '' وتم شرح 84 DEGs كما شاركت في `` التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية '' في معالجة flg22 BTx623. ومع ذلك ، يمكن لدراسات التعبير الجيني هذه تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا استجابةً لعلاج MAMPs أو عدوى الممرض ، ولكنها لا تُظهر بالضرورة أن هذه الجينات ضرورية لمقاومة مسببات الأمراض المحددة. وبالتالي ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم العلاقات السببية بين المقاومة الفطرية وتفعيل مسارات KEGG في كلا الطرازين الجيني ، كما يتضح من تحليل RNA-Seq.

أجرينا أيضًا تحليل تخصيب مسار KEGG للمجموعات الأساسية من DEGs في جميع الظروف (الشكل 4C) بالإضافة إلى DEGs المنظمة المشتركة بين الأنماط الجينية بعد معالجة flg22 أو الكيتين (الشكل 7C). كشفت النتائج أن ستة مسارات مهمة ، بما في ذلك مسار التفاعل الممرض للنبات ، تم إثرائها فقط في مجموعات أساسية منظمة من DEGs ولكن ليس في مجموعات أساسية خاضعة للتنظيم من DEGs. وبالمثل ، تم إثراء سبعة وثلاثة مسارات ، بما في ذلك مسار تفاعل مسببات الأمراض النباتية ، بشكل كبير في DEGs الخاضع للتنظيم الكيتين و flg22 أعلى التنظيم في BTx623 و SC 155-14 E ، على التوالي. على النقيض من ذلك ، تم إثراء التكوين الحيوي للريبوسوم فقط في مسار حقيقيات النوى في DEGs الخاضعة للتنظيم في الكيتين في كلا الطرز الوراثية.

2.5 التحقق من صحة بيانات RNA-Seq باستخدام RT-PCR الكمي لجينات مختارة

لتأكيد بيانات تعريف التعبير الجيني التي تم الحصول عليها بواسطة RNA-seq ، أجرينا تحليل qRT-PCR لتقييم التعبير عن تسعة جينات مرشحة مختارة. تم اختيار هذه الجينات التسعة بناءً على التعبير الذي لوحظ بواسطة RNA-seq في ثلاث فئات: (أ) معبر عنها بالمثل في BTx623 و SC 155-14 E مع flg22 أو علاج الكيتين ؛ (ب) معبرًا عنه فقط في MAMPs المعالجة بـ SC 155-14 E ولكن مع تعبير منخفض للغاية في BTx623 و (c) معبرًا عنه 2 - 21- أضعاف أعلى في MAMPs SC المعالج 155-14 مقارنة بـ BTx623 . كشفت نتائج تحليل qRT-PCR (الجدول 1) عن اتفاق كامل مع مستويات التعبير التي يحددها تحليل RNA-seq لكل من الجينات التسعة التي تم تقييمها. تمنحنا هذه النتائج الثقة في أن القياسات التي تم إجراؤها بواسطة RNA-seq تعكس الاستجابة النسخية لخطوط الذرة الرفيعة لعلاج MAMP

2.6. الاستنتاجات

في هذه الدراسة ، وجدنا أولاً الظروف المثلى لمقارنة استجابة MTI للنوعين الجينيين عن طريق اختبار إنتاج ROS باستخدام ثلاث مجموعات من الأوراق واخترنا ثاني أصغر أوراق نباتات عمرها خمسة عشر يومًا لاستخراج الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي اللاحق. كشفت الدورة الزمنية لـ flg 22- التي تم تشغيلها وتحفيز الكيتين في إنتاج ROS في خط الذرة الرفيعة SC 155-14 E (الشكل 1C) أن إنتاج ROS الناجم عن الكيتين حدث قبل ذلك الناتج عن العلاج flg22. حصلنا على ملفات تعريف التعبير عن النمط الجيني للذرة الرفيعة ذو اللونين SC 155-14 E للمرض الفطري المقاوم للأنثراكنوز مع استجابة عالية للعلاج MAMPs على إنتاج ROS والنمط الجيني الحساس BTx623 مع استجابة منخفضة على منتج ROS لعلاج MAMP خلال المراحل المبكرة من استجابة المناعة الفطرية.

أظهرت النتائج تباينًا واضحًا في التعبير الجيني في الأنماط الجينية للذرة الرفيعة BTx623 و SC 155-14 E استجابةً لعلاج MAMP. بينما أظهرت الردود على MAMPs تداخلًا كبيرًا داخل كل سطر (86 .6-70.8 في المائة) ، كانت متميزة. ولوحظ أيضًا تداخل ، وإن كان أقل ، (68.3 - 29 بالمائة) بين استجابات الخطين لنفس MAMP. تم تحديد عدد كبير من DEGs ، 2272 من أصل 10535 DEGs ، في جميع الظروف الأربعة وحدد مبدئيًا استجابة MAMP الأساسية. يجب أن تكون قائمة الجينات هذه مفيدة لتلك المختبرات التي ترغب في تحديد استجابة التعبير الجيني لعلاج MAMP. حدد تحليل RNA-seq مجموعات كبيرة من الجينات المعبر عنها تفاضليًا في BTx623 و SC 155-14 E تعامل مع flg22 أو chitin مقارنة بعناصر تحكم وهمية غير معالجة لهذين الخطين. علاوة على ذلك ، أظهرت مقارنة DEGs المختارة باستخدام خطي أنابيب مختلفين للمعلومات الحيوية نتائج متشابهة جدًا. كشف تحليل ملف تعريف التعبير التفصيلي لهذه DEGs وتحليل التخصيب GO وتحليل مسار KEGG عن تباين واضح في استجابة التعبير الجيني للنوعين الجينيين. اكتشف مصطلح GO وتخصيب مسار KEGG المزيد من DEGs المرتبطة بالمناعة ومقاومة العوامل الممرضة (جينات العلاقات العامة ، واستجابة الجينات للكيتين ، واستجابة الجينات لحمض الساليسيليك ، والاستجابة للإجهاد ، والتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد ، وما إلى ذلك) في SC المعالج بـ MAMP {{18} } عينات E نسبة إلى BTx623 بنفس المعاملة. توفر هذه المعلومات معلومات أساسية مهمة حول كيفية استجابة الجهاز المناعي الفطري لهذا النبات المحصول الرئيسي لاستنباط MAMPs. نظرًا للنقص العام في المعلومات حول الاستجابة المناعية الفطرية لنباتات المحاصيل ، بالنسبة لنموذج نبات الأرابيدوبسيس ، فإن قوائم الجينات والطرق الموصوفة توفر موردًا لمزيد من الاستكشاف لاستجابة الذرة الرفيعة لمسببات الأمراض وينبغي أن تسهل الجهود المبذولة لتحسين مقاومة المرض في نهاية المطاف في هذا الغذاء المهم ومحصول الكتلة الحيوية.

3. المواد والطرق

3.1. المواد النباتية

تم استخدام خطين من الذرة الرفيعة من قبل الدكتور ويليام روني (جامعة تكساس إيه آند إم ، كوليدج ستيشن ، الولايات المتحدة الأمريكية) والدكتور ستيفن كريسوفيتش (جامعة كليمسون ، كليمسون ، الولايات المتحدة الأمريكية) في هذه الدراسة. BTx623 عبارة عن خط قياسي للذرة الرفيعة مع تسلسل جينوم كامل متاح [22] ، و SC 155-14 E عبارة عن خط تم تطويره لمقاومة الأنثراكنوز [39].

3.2 فحوصات ROS

تم تعقيم سطح بذور الذرة الرفيعة من BTx623 و SC {1}} E (70 في المائة من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة ثم 10 في المائة من المبيض لمدة 10 دقائق ، وشطفها باستخدام ddH2O المعقم بالبخار) وزُرعت في مزيج تأصيص من الشمس المشرقة المعقم ، وتنبت في غرف النمو ( 16 ساعة / 8 ساعات فاتحة / داكنة ، 28/26 درجة مئوية ، رطوبة 60-70٪). تم استخدام نباتات عمرها خمسة عشر يومًا لإجراء التجارب.

تم استخدام اثنين من MAMPs ، flg22 (كتالوج Genscript # RP19986) و chitin من قشرة السلطعون (Sigma-Aldrich ، كتالوج # C3641) في هذه الدراسة. Flg22 عبارة عن ببتيد مشتق من الطرف N من فلاجيلين للبكتيريا المسببة للأمراض النباتية ومن المعروف جيدًا أنه يثير استجابة مناعية فطرية معينة في النباتات [62]. الكيتين هو جزيء MAMP نموذجي مشتق من جدران الخلايا الفطرية ، والذي يثير استجابات مناعية نباتية [3]. تم إجراء فحوصات ROS وفقًا لـ Kimball et al. [38]. لتقييم التباين في استجابة MAMP داخل الأنماط الجينية الفردية ، بالإضافة إلى موضع الأوراق ، تم تقييم الأوراق الثلاثة الموسعة بالكامل للنباتات لكل نمط وراثي بشكل فردي. تم تمييز الأوراق من أسفل إلى أعلى نباتات الذرة الرفيعة التي يبلغ عمرها خمسة عشر يومًا من كل نمط وراثي على أنها الورقة رقم 1 ورقم 2 ورقم 3. استخدمنا فقط الجزء الأوسط من الورقة لأخذ العينات لقياس إنتاج ROS. مباشرة بعد العلاج ، تم تسجيل إشارة الإشعاع الكيميائي لكل عينة لمدة 30 دقيقة باستخدام كاميرا Photek CCD (Photek Ltd. ، East Sussex UK). ثمانية آبار تتألف من معالجة وهمية (بدون MAMP) وثمانية آبار تتكون من معالجة (مع MAMPs). في كل حالة ، تمت مقارنة ثلاث مكررات بيولوجية بإجمالي 8 عينات لكل معاملة.

3.3 عينة من العلاج باستخدام MAMPs

تم استخدام نباتات عمرها خمسة عشر يومًا لإجراء التجارب. تم إجراء علاجات MAMPs على النحو الموصوف في Valdes-Lopez et al. [12] مع تعديلات طفيفة. باختصار ، تم فصل الورقة الثانية (من أعلى ، أي ثاني أصغر ورقة) من خمسة نباتات لكل سطر من الذرة الرفيعة ، ثم تم رشها بالمكنسة الكهربائية باستخدام ddH2O المعقم لمدة دقيقتين. تم قطع حوالي خمسين قرصًا من الأوراق بقطر 1 سم من الأوراق المتسربة من الماء لكل تركيب وراثي وتم تجميعها. تم نقل خمسة وأربعين قرصًا من كل نمط وراثي إلى ثلاثة أطباق بتري مختلفة (15 قرصًا في كل طبق بتري) ثم طفت طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على ddH2O المعقم مع الألواح المغطاة بورق الألمنيوم. في اليوم التالي ، تمت إزالة الماء من جميع أطباق بتري واستبداله بـ 10 مل من ddH2O (وهمي) ، أو 10 مل 1 ميكرومتر flg22 ، أو 10 مل من محلول الكيتين 20 مجم / مل. بعد علاج مدته 60- دقيقة ، تم حصاد شرائح الأوراق المعالجة بـ MAMP و MAMP في أنابيب مختلفة وتم تجميدها على الفور في النيتروجين السائل. تم تخزين عينات شرائح الأوراق (لـ 101 نوعًا من الذباب -11272) مناعة BTx623 و SC 155-14 E باستخدام معالجات وهمية أو flg22 أو كيتين ، ثلاث مكررات بيولوجية) عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي. تم تنفيذ الإجراءات الموضحة أعلاه في ظل ظروف مظلمة للتخلص من أي تأثير محتمل لعملية التمثيل الضوئي.

3.4. استخراج الحمض النووي الريبي ، التسلسل ، وبناء المكتبة

تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة Direct-zol RNA Miniprep Plus من Zymoresearch (كتالوج # R2071) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة

تم إجراء تسلسل عالي الإنتاجية في مرفق الحمض النووي الأساسي بجامعة ميسوري. تم إنشاء ثمانية عشر مكتبة باتباع بروتوكول الشركة المصنعة مع الكواشف المتوفرة في مجموعة إعداد عينة TruSeq mRNA التي تقطعت بها السبل من Illumina. تم تحديد تركيز العينة بواسطة Qubit fluorometer (Invitrogen) باستخدام مجموعة Qubit HS RNA ، وتم فحص سلامة RNA باستخدام نظام التحليل الكهربائي الآلي. باختصار ، تمت تنقية poly-A المحتوي على mRNA من إجمالي الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام) ، وتم تجزئة الحمض النووي الريبي ، وتم إنشاء (كدنا) مزدوج الشريطة من الحمض النووي الريبي المجزأ ، والفهرس الذي يحتوي على محولات مرتبطة بالأطراف. تمت تنقية بنيات (كدنا) المضخمة عن طريق إضافة حبات تنظيف Axyprep Mag PCR. تم تقييم البنية النهائية لكل مكتبة تمت تنقيتها باستخدام نظام الرحلان الكهربي الآلي لمحلل الشظايا ، والذي تم تحديده كمياً باستخدام مقياس التألق Qubit باستخدام مجموعة مقايسة Qubit HS dsDNA ، وتم تخفيفه وفقًا لبروتوكول التسلسل القياسي لشركة Illumina للتسلسل على NextSeq 500. كان طول التسلسل مفردًا اقرأ في 75 قاعدة.

3.5 رسم الخرائط ومعالجة قراءات RNA-Seq

تمثل بيانات التسلسل ستة شروط مختلفة: BTx623 مع معالجة وهمية أو flg22 أو chitin ، و SC 155-14 E مع معالجة وهمية أو flg22 أو chitin. تم تمثيل كل حالة بثلاث مكررات بيولوجية ، مما أدى إلى 18 عينة إجمالية. أولاً ، تم "اقتطاع" نهايات القراءات الثلاثة 0 لمهايئات Illumina ، والنيوكليوتيدات الغامضة (N) ، و (بسبب تقنية NextSeq) لـ poly-G الاصطناعي (ممثلة كـ G {100}) باستخدام cutadapt الإصدار 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200 ، تم الوصول إليه في 21 أغسطس 2019) للقراءات التي تتداخل نهاياتها الثلاثين مع المحول بحد أدنى 3 قواعد بهوية 90 بالمائة. إذا احتوت القراءة بعد هذا التشذيب على أقل من عشرة قواعد ، فقد تم تجاهلها (جنبًا إلى جنب مع قراءتها المزدوجة ، إن أمكن). تم فحص درجات الجودة لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي بعد التشذيب باستخدام FASTQC (الإصدار 0.11.9) [63]. بالنسبة لجميع المواضع في القراءات ، يبلغ متوسط ​​نقاط الجودة حوالي 34 ، مما يشير إلى أن دقة الاتصال الأساسية أعلى من 99.9 بالمائة. تمت محاذاة قراءات كل عينة مع الجينوم المرجعي (Sorghum _ bicolor _ NCBIv3.dna. top-level. fa) مع Tophat 2.1.1. تم توفير ملفات المحاذاة الناتجة إلى Cufflinks 2.2.1 لتجميع النصوص لكل عينة. نسخة الشرح المستخدمة في هذا البحث كانت Sorghum _ bicolor _ NCBIv3.38.gff3. تم دمج عينات من نفس الحالة باستخدام Cuffmerge. كان الغرض هو توفير أساس موحد لحساب تعبير الجين والنسخة في كل حالة.

3.6 تحليل المعلومات الحيوية لبيانات RNA-Seq

تم تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية Bowtie {0}. 3.4.3 و TopHat 2.1.1 و Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge و Cuffdiff) مع المعلمات الافتراضية. استخدمنا نفس خط الأنابيب مع هذه الأدوات كما هو موضح في Trapnell et al. [64]. لتأكيد نتائج الفحص بشكل أكبر ، استخدمنا خط أنابيب آخر مع HiSat2 (الإصدار 2.1. 0) و HTSeq (الإصدار 0.12.4) و edgeR (الإصدار 3.26.8) لإجراء التحليل. HiSat2 هو التطوير التالي لـ TopHat2. أولاً ، استخدمنا HiSat2 لإجراء المحاذاة باستخدام الجينوم المرجعي للذرة الرفيعة. ثم استخدمنا HTSeq لحساب عدد القراءات التي تم تعيينها لكل جين. لهذا ، احتجنا إلى ملفات bam التي تم إنشاؤها من الخطوة السابقة وتعليقات الجينوم (ملف gif). لاحظ أن الجينوم المرجعي وملفات التعليقات التوضيحية هي نفسها التي استخدمناها في خط الأنابيب الأصلي. أخيرًا ، استخدمنا حافة الحزمة R لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا في كل حالة

3.7 تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا
تمت تغذية التجميع المدمج إلى Cuffdiff ، والذي يحسب مستويات التعبير ويختبر الأهمية الإحصائية للتغييرات الملحوظة بين شرطين. قارنا الشروط بين mock مقابل flg22 و mock مقابل chitin لـ BTx623 و SC 155-14 E على التوالي. تم استخراج الجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام 0. 0 01 عتبات قيمة p. تم إجراء مخططات البركان باستخدام الحزمة R (ggplot2 V3.3.0) لإظهار أهمية تغيير التعبير الجيني في الظروف BTx623 المعالجة بـ flg22 أو الكيتين و SC 155- 14 E تعامل مع flg22 أو الكيتين ، على التوالي. تم اعتبار النقاط الجينية التي تحتوي على −log10 (قيمة p) تساوي أو تزيد عن ثلاثة DEG. في كل قطعة ، كانت نقاط الجين التي تحتوي على log2 (تغير _ أضعاف) أكبر من الصفر جينات منظمة ، وإلا فإنها قللت من تنظيم الجينات.

3.8 قطعة أرض PCA

لفحص العلاقة بين قيم التعبير الجيني لثلاث مكررات بيولوجية لكل سطر من الذرة الرفيعة وكل معاملة MAMP ، تم إنشاء مخططات تحليل المكون الرئيسي (PCA) باستخدام حزم R (ggfortify V {0}}. 4.10، ggplot2 V3 .3.0). تمثل كل نقطة شرطًا بعد التعيين من مساحة الميزة الأصلية (التعبير الجيني) إلى المكونين الأساسيين الأولين. تميل النقاط التي تنتمي إلى نفس الحالة إلى التجمع معًا

3.9 خريطة الحرارة من DEGs

1 قسم علوم وتكنولوجيا النبات والكيمياء الحيوية ، مركز علوم الحياة CS Bond ، جامعة ميسوري ، كولومبيا ، MO 65211 ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ cuiy@missouri.edu (YC) ، chendq@cau.edu.cn (العاصمة)

2 قسم الهندسة الكهربائية وعلوم الكمبيوتر ، مركز علوم الحياة بوند CS ، جامعة ميسوري ، كولومبيا ، MO 65211 ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ yjm85@mail.missouri.edu (YJ) ؛ xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 وحدة أبحاث علوم النبات ، وزارة الزراعة الأمريكية - ARS ، رالي ، نورث كارولاينا 27695 ، الولايات المتحدة الأمريكية

* Correspondence: staceyg@missouri.edu