تسلسل الجينوم الكامل لتشخيص اضطرابات التوسع المتكرر العصبي في المملكة المتحدة: دقة التشخيص بأثر رجعي ودراسة التحقق السريرية المحتملة

للمزيد من المعلومات:ali.ma@wecistanche.com

ملخص

خلفية

تؤثر اضطرابات التوسيع المتكررة على حوالي 1 من كل 3000 فرد وهي أمراض غير متجانسة سريريًا ناتجة عن تمدد تكرارات الحمض النووي القصيرة الترادفية. غالبًا ما يكون الاختبار الجيني محددًا بالموقع ، مما يؤدي إلى نقص التشخيص للأشخاص الذين لديهم عروض سريرية غير نمطية ، خاصة في مرضى الأطفال الذين ليس لديهم تاريخ عائلي إيجابي سابق. يتم استخدام تسلسل الجينوم الكامل بشكل متزايد كاختبار أول للاضطرابات الوراثية النادرة الأخرى ، ونهدف إلى تقييم أدائه في تشخيص المرضى الذين يعانون منالعصبيةتكرار اضطرابات التوسع.

طُرق

قمنا بتقييم بأثر رجعي الدقة التشخيصية لتسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف مواقع التكرار الأكثر شيوعًا المرتبطة بـالعصبيةالنتائج (AR و ATN1 و ATXN1 و ATXN2 و ATXN3 و ATXN7 و C9orf72 و CACNA1A و DMPK و FMR1 و FXN و HTT و TBP) باستخدام عينات تم الحصول عليها داخل الخدمة الصحية الوطنية في إنجلترا من المرضى المشتبه في إصابتهمالعصبيةالاضطرابات. تم استخدام نتائج اختبار PCR السابقة كمعيار مرجعي. تم فحص الدقة السريرية لتسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف التوسعات المتكررة بشكل مستقبلي في المرضى الذين تم اختبارهم وراثيًا سابقًا ولم يتم تشخيصهم والذين تم تجنيدهم في 2013–17 في مشروع الجينوم 100 000 في المملكة المتحدة ، والذين كان يُشتبه في امتلاكهم لجينات وراثيةالعصبيةاضطراب (أشكال عائلية أو مبكرة من الرنح ، اعتلال الأعصاب ، الشلل النصفي التشنجي ، الخرف ، مرض العصبون الحركي ،مرض باركنسونحركةالاضطرابات أو الإعاقة الذهنية أو الاضطرابات العصبية العضلية). إذا تم إجراء مكالمة توسيع متكررة باستخدام تسلسل الجينوم الكامل ، فقد تم استخدام PCR لتأكيد النتيجة.

الموجودات

تم تقييم الدقة التشخيصية لتسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف التوسعات المتكررة مقابل 793 اختبارًا من اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم إجراؤها سابقًا داخل NHS من 4 0 4 مرضى. تصنيف تسلسل الجينوم الكامل بشكل صحيح 215 من 221 أليلات موسعة و 1316 من 1321 أليلات غير موسعة ، تظهر 97 · 3 بالمائة حساسية (95 بالمائة CI 94 · 2-99 · 0) و 99.6 بالمائة خصوصية (99 · 1-99 · 9) عبر 13 موقعًا مرتبطًا بالمرض عند مقارنتها بنتائج اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل. في عينات من 11 631 مرضى في مشروع الجينوم 100 000 ، حدد تسلسل الجينوم الكامل 81 توسيعًا متكررًا ، تم اختبارها أيضًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل: 68 تم تأكيدها على أنها توسعات متكررة في النطاق الممرض الكامل ، و 11 منها غير - توسعات أو تباديل وسيطة ممرضة ، واثنتان كانتا تكرارات غير موسعة (معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 16 بالمائة).

ترجمة

في دراستنا ، أظهر تسلسل الجينوم الكامل للكشف عن التوسعات المتكررة حساسية وخصوصية عالية ، وأدى إلى تحديدالعصبيةتكرار اضطرابات التوسع في المرضى الذين لم يتم تشخيصهم من قبل. تدعم هذه النتائج تنفيذ تسلسل الجينوم الكامل في المختبرات السريرية لتشخيص المرضى الذين لديهمالعصبيةالعرض التقديمي المتوافق مع اضطراب التوسع المتكرر.

التمويل

مجلس البحوث الطبية ، قسم الصحة والرعاية الاجتماعية ، الخدمة الصحية الوطنية في إنجلترا ، المعهد الوطني للبحوث الصحية ، وشركة Illumina.

مقدمة

على الرغم من التطورات الحديثة في فهمنا للأسس الجينية النادرةالعصبيةالاضطرابات ، ما يصل إلى 70 في المائة من المرضى الذين يعانون من مثل هذه الاضطرابات يظلون غير مشخصين وراثيًا. تشير التقديرات إلى أن هذه التوسعات تؤثر على حوالي 1 من كل 3000 شخص (الملحق ص 1) وهي السبب الرئيسي لأكثر من 40 اضطرابًا عصبيًا وراثيًا ، 4 بما في ذلك مرض هنتنغتون ومتلازمة إكس الهش. اضطرابات التوسيع المتكررة غير متجانسة سريريًا ووراثيًا ، ويمكن أن يرتبط التوسيع المتكرر بأمراض مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تظهر التوسعات في C9orf72 إما على شكل تصلب جانبي ضموري أو خرف جبهي صدغي. يمكن أن يسبب كلا من ترنح الخلايا الصفراوية 6 وتلك الموجودة في C9orf72 و AR مرض الخلايا العصبية الحركية

تحدث اضطرابات التوسيع المتكررة بسبب زيادة عدد سلاسل الحمض النووي الترادفية القصيرة المتكررة ، وتكون عتبات الإمراضية لكل اضطراب خاصة بالموقع. يختلف حجم التوسيع من أقل من 30 تكرارًا (على سبيل المثال ، في CACNA1A) إلى عدة آلاف من وحدات التكرار (على سبيل المثال ، في FMR1 و DMPK و C9orf72 و FXN ، والتي يمكن أن تمتد حتى 5 كيلو بايت في الحجم). يُظهر التمدد المتكرر عدم استقرار جزيئي ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تغيرات في حجم التكرار (يزداد بشكل عام في الطول) عبر الأجيال والأنسجة. يمكن أن تظهر بداية اضطرابات التوسع المتكرر لدى الأطفال على شكل متلازمات متعددة الأجهزة بدون إشارات نمطية محددة ، 9 وبالتالي فإن الأطفال الذين يعانون من هذه الاضطرابات يكونون أكثر عرضة للتشخيص الناقص عندما يكون التاريخ العائلي لاضطراب التوسع المتكرر غائبًا عن وجوده. 12

عادةً ما يقتصر التقييم المختبري للتوسعات المتكررة على التقييم الجزيئي المستهدف لموضع فردي يسترشد بالتشخيص السريري المشتبه به باستخدام أساليب اللطخة الجنوبية أو المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، 13 والتي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا للسمات المظهرية المتنوعة والمتداخلة لهذه الاضطرابات ، يمكن أن تظل مواقع التمدد المتكررة المرتبطة بالمرض غير مختبرة.

يظهر تسلسل الجينوم الكامل كأداة تشخيصية من الخط الأول في المرضى الذين يعانون من مرض نادر ، ولكن حتى وقت قريب ، كان يُعتقد أن لديها قدرة محدودة على تقييم المواقع التي تحتوي على توسعات متكررة. - التسبب في التوسعات المتكررة من بيانات التسلسل من الجيل التالي .17-22 هنا ، نقدم تقريرًا عن التقييم التشخيصي لنهج تسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف التوسعات المتكررة باستخدام بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل بأثر رجعي ، والتحقق من صحتها السريرية في المرضى في مشروع 100000 جينوم الذين كان لديه اضطراب عصبي مشتبه به ، لم يتم تشخيصه باختبارات جينية سابقة.

طُرق

تصميم الدراسة والمشاركين

تضمن هذا التقييم لتسلسل الجينوم الكامل للكشف عن التوسعات المتكررة كلاً من دقة التشخيص وتقييمات الدقة السريرية. تم تقييم دقة التشخيص باستخدام بيانات من المرضى الذين سبق اختبارهم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتكرار التوسعات المعروف أنها تسبب أمراضًا عصبية. 4 تم تحديد المرضى من مصدرين: 100 000 مشروع الجينوم ومختبر الجينوم في مستشفيات جامعة كامبريدج ( كامبريدج ، المملكة المتحدة). لكلتا المجموعتين من المرضى ، تم إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل على عينات المرضى من قبل المختبرات في الخدمة الصحية الوطنية (NHS) كجزء من التقييم السريري الروتيني: بالنسبة للعينات في مشروع جينوم 100000 ، تم إجراء اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل التوظيف في المشروع بواسطة مختبر علم الوراثة العصبية بمستشفى جامعة كوليدج لندن (لندن ، المملكة المتحدة) ؛ تم الحصول على عينات مع التوسعات المتكررة المؤكدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل من المرضى الذين تم اختبارهم بواسطة مختبر الجينوم في كامبريدج. تم تحديد المرضى الذين يعانون من نتائج اختبار PCR إيجابية وسلبية PCR لاضطرابات التوسع المتكرر لإدراجهم في دراستنا من خلال أنظمة السجلات المختبرية ؛ أعطى جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة لاستخدام العينة الخاصة بهم لضمان الجودة ولأغراض البحث والتدريب ، كجزء من تحسين الخدمة السريرية والتحقق من صحتها.

تم إجراء تسلسل الجينوم الكامل لكل عينة في واحد من مختبرين: جينومكس إنجلترا (هينكستون ، المملكة المتحدة) لعينات مشروع الجينوم 100000 (ن =254) ومختبر الخدمات السريرية إلومينا (ICSL ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، USA) للعينات التي حصل عليها مختبر الجينوم في كامبريدج (ن =150). بشكل عام ، تم استخدام مجموعة البيانات هذه لجزء الدقة التشخيصية من الدراسة ، وتألفت من PCR وبيانات تسلسل الجينوم الكامل من 404 مريضًا ، تغطي 13 موقعًا تمثل اضطرابات التمدد العصبي الأكثر شيوعًا: 11 موقعًا مرتبطًا بترنح ومتأخر- بداية الاضطرابات العصبية التنكسية (HTT ، AR ، ATN1 ، ATXN1 ، ATXN2 ، ATXN3 ، ATXN7 ، CACNA1A ، TBP ، C9orf72 ، و FXN) ، موضع واحد مرتبط بالإعاقة الذهنية (FMR1) ، وموضع واحد مرتبط بضمور التوتر العضلي (DMPK). لكل موضع ، كانت بيانات اختبار PCR متاحة لأليل واحد على الأقل موسع (الملحق ص 24).

تم تقييم الدقة السريرية من خلال فحص توافق التوسعات المتكررة ، كما تم اكتشافها مع تسلسل الجينوم الكامل ، مع التشخيص السريري المشتبه به بعد تأكيد PCR في المرضى الذين يشتبه في إصابتهم باضطرابات عصبية وراثية (أشكال عائلية أو بداية مبكرة من الرنح ، اعتلال الأعصاب ، الشلل النصفي التشنجي ، الخرف ، مرض العصبون الحركي ،مرض باركنسوناضطرابات الحركة أو الإعاقة الذهنية أو الاضطرابات العصبية العضلية) تم تجنيدهم في مشروع 100000 جينوم في 2013-17. مشروع 100000 جينوم هو برنامج بريطاني لتقييم قيمة تسلسل الجينوم الكامل في المرضى الذين يعانون من احتياجات تشخيصية غير مستوفاة في الأمراض النادرة والسرطان. بعد الموافقة الأخلاقية على مشروع 100000 جينوم من قبل لجنة أخلاقيات البحث في شرق إنجلترا كامبريدج الجنوبية (المرجع 14 / EE / 1112) ، بما في ذلك تحليل البيانات وإعادة نتائج التشخيص إلى المرضى ، تم تجنيد هؤلاء المرضى من قبل المتخصصين في الرعاية الصحية والباحثين من تم تسجيل 13 مركزًا للطب الجيني في إنجلترا وتم تسجيلهم في المشروع إذا قدموا هم أو الوصي عليهم موافقة كتابية على عيناتهم وبياناتهم لاستخدامها في البحث ، بما في ذلك هذه الدراسة. تم تسجيل البروتوكولات ، وإذا أمكن ، أفراد الأسرة الآخرين ، وفقًا لمعايير الأهلية المحددة لحالات مرض نادر معين (الملحق ص 5-11). تم تجنيد المرضى في مشروع 100000 جينوم بعد الاختبار الجيني المعياري للرعاية في NHS ، كما هو مبين في معايير الأهلية. تم تسجيل البيانات السريرية الأساسية المعيارية باستخدام علم الوجود الظاهر البشري (HPO) 23 مقابل نماذج البيانات الخاصة بالمرض .24 كما تم جمع حالة المرض لأفراد الأسرة ، فيما يتعلق بالمؤشر السريري للاختبار.

لتحديد التوسعات المتكررة المسببة في المرضى الذين يعانون من مرض غير مشخص وراثيًا ، قمنا باختبار المرضى الذين يشتبه في إصابتهم باضطرابات وراثية متوافقة مع مرض التوسيع المتكرر. تم اختيار المرضى على أساس توافق مرضهم وشروط HPO مع تكرار الاضطرابات المرتبطة بالتوسع. تم استجواب بيانات تسلسل الجينوم الكامل للمرضى للبحث عن التوسعات في مجموعات معينة من التكرارات باستخدام أربع لوحات تمدد متكررة مختلفة وفقًا لخصائصهم السريرية (الملحق ص 5). التوسعات المتكررة المختارة لتضمينها في هذه اللوحات هي أكثر مواقع التمدد المتكررة المسببة للأمراض العصبية شيوعًا. تم اختبار المرضى الذين لديهم سمات سريرية يحتمل أن تكون متوافقة مع أكثر من اضطراب توسع متكرر على لوحات متعددة. إذا تم إجراء مكالمة توسيع متكررة باستخدام تسلسل الجينوم الكامل ، فقد تم إجراء اختبار تأكيدي بواسطة PCR.

لكل مريض مع تكرار توسع مؤكد ، تم إبلاغ الطبيب المحلي بنتيجة التشخيص المحتملة ، وتم تقييم مساهمة التوسيع المتكرر في السمات السريرية للمريض. بالنسبة للتوسعات المتكررة التي تشرح بشكل كامل أو جزئي السمات السريرية للمريض ، تم إصدار تقرير تشخيصي وفقًا للإجراءات القياسية المحلية.

إجراءات

بالنسبة للعينات التاريخية من NHS المستخدمة في جزء دقة التشخيص من دراستنا ، تم اختبار التوسعات المتكررة مسبقًا باستخدام تضخيم PCR وتحليل الشظايا. تم إجراء النشاف الجنوبي لتوسعات C9orf72 الكبيرة. في جزء الدقة السريرية من دراستنا ، تم اختبار التوسعات المتكررة التي تم اكتشافها بواسطة تسلسل الجينوم الكامل في المرضى من 100 000 مشروع الجينوم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في عينات مخزنة في مختبرات NHS الجينية. يتم توفير تفاصيل إضافية ، بما في ذلك متواليات التمهيدي ، في الملحق (الصفحات 2-3 ، 25-26).

تم تحضير الحمض النووي لتسلسل الجينوم الكامل باستخدام إعداد مكتبة TruSeq DNA PCR-Free ، وتم إجراء تسلسل نهاية مزدوج بمقدار 150 نقطة أساس أو 125 نقطة أساس على منصات HiSeq 2000 أو HiSeq X في منشأة الجينومات عالية الإنتاجية لـ Genomics England ، وفي ICSL . تم تسلسل الجينوم بمتوسط ​​عمق 35 × (31 × إلى 37 × ؛ الملحق ص 27). تم إجراء التنميط الجيني قصير الترادف المتكرر باستخدام إصدار حزمة برنامج ExpansionHunter 3.1.2.25،26 باختصار ، تعيد ExpansionHunter تنظيم قراءات التسلسل عبر مجموعة محددة مسبقًا من التكرارات الترادفية القصيرة لتقدير حجم كلا الأليلين من فرد (الملحق ص 3).

التوسع يتضمن مخرجات الصياد تقديرًا لعدد عناصر التكرار والحجم الكلي وحد الثقة لكل موقع تم تقييمه. توصي المبادئ التوجيهية الصادرة عن جمعية علم الأمراض الطبية وكلية علماء الأمراض الأمريكية بإجراء فحص بصري للمكالمات المتغيرة أثناء التقييم الروتيني لمتغيرات التسلسل عالية الإنتاجية.

ومع ذلك ، لا يمكن تصور متغيرات التكرار الترادفي القصيرة بشكل كافٍ من خلال أدوات التصور الشائعة مثل عارض الجينوم التكاملي .28 لفحص بيانات تسلسل الجينوم بالكامل الكامنة وراء كل استدعاء للنمط الجيني ، تم استخدام أداة تصور الرسم البياني ، والتي تتيح التصور المباشر للأنماط الفردية وتراكم القراءة المقابل التوسع الجيني الصياد (الملحق ص 3 ، 15). تم إجراء فحص مرئي للرسم البياني pileup على جميع مكالمات التكرار الترادفية القصيرة لتسلسل الجينوم الكامل للتأكد من أن توقع ExpansionHunter للأليلات تم احتوائه بالكامل في كل قراءة (أي أن تسلسل التكرار كان أصغر من طول قراءة التسلسل) ؛ لتأكيد وجود توسع أحادي أو ثنائي ؛ لاكتشاف المكالمات الإيجابية الكاذبة المفترضة ؛ وللكشف عن الأليلات السلبية الكاذبة في التوسعات المتكررة ثنائية النواة ، مثل FXN (الملحق ص 4 ، 16).

ExpansionHunter تقدر حجم التكرار من بيانات تسلسل الجينوم الكامل عن طريق تحليل قراءات التسلسل التي تحتوي كليًا أو جزئيًا على تكرار ترادفي قصير. إذا كان أليل التكرار الترادفي القصير أقصر من طول القراءة ، يتنبأ ExpansionHunter بالحجم الدقيق ؛ إذا كان أليل التكرار الترادفي القصير أطول من طول القراءة ، فإن ExpansionHunter تقدر حجم التكرار داخل CI ، اعتمادًا على تكوين تسلسل الموضع وعمق التسلسل وجودة التسلسل.

تحليل احصائي

قمنا بتصنيف التكرارات على أنها موسعة من خلال تسلسل الجينوم الكامل إذا كان الحجم الذي تنبأ به ExpansionHunter أعلى من الحد السابق للتشغيل ، أو غير موسع إذا كان الحجم المتوقع أقل من القطع (الملحق ص 28).

تم حساب الحساسية و CIs للكشف عن التوسيع المتكرر لتسلسل الجينوم الكامل كنسبة من الأليلات ذات التكرارات الموسعة بين الأليلات المؤكدة مسبقًا بواسطة PCR مع التكرارات الموسعة. تم تقدير الخصوصية كنسبة من الأليلات غير الموسعة بين التكرارات غير الممتدة التي تم اختبارها مسبقًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويرد وصف كامل للصيغ الإحصائية في الملحق (ص 1).

لمقارنة أحجام التكرار بواسطة PCR مع تقديرات حجم التكرار من خلال تسلسل الجينوم الكامل ، تمت مقارنة الأليلات التي تم تحديدها بواسطة PCR بأحجام التكرار التي تنبأت بها ExpansionHunter للأليلات الأقصر من طول القراءة عبر جميع مواقع التكرار الترادفي القصيرة البالغ عددها 13. تم حساب التوافق من خلال النسبة المئوية لأحجام التكرار التي تنبأت بها ExpansionHunter والتي كانت متوافقة مع الحجم الكمي لـ PCR ، مع الأخذ في الاعتبار خطأ PCR الذي يزيد أو ينقص تكرار واحد. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام إصدار البرنامج الإحصائي R 3.6.3.

دور مصدر التمويل

قاد تصميم الدراسة ، وتسجيل المرضى ، وجمع البيانات ، والتسلسل موظفو جينومكس إنجلترا وباحثون أكاديميون. أجرى موظفو Illumina تسلسل 150 عينة مريض كمكون مخطط له في دراسة دقة تشخيص تسلسل الجينوم بالكامل وطوروا ExpansionHunter. أجرى موظفو Genomics England والباحثون الأكاديميون والمؤلفون المشاركون RTH و ED و MAE تحليل وتفسير التوسعات المتكررة في المرضى المعينين في مشروع الجينوم 100 000. لم يكن لمصادر التمويل دور في تفسير البيانات أو كتابة التقرير.

نتائج

تم تقييم الدقة التشخيصية لتسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف التوسعات المتكررة مقابل 793 اختبارًا من اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي أجريت سابقًا داخل NHS من 4 0 4 مرضى (تم اختبار 64 مريضًا لأكثر من تكرار واحد ؛ الشكل 1). من هذه الاختبارات ، تم تصنيف 183 على أنها ذات تكرار موسع و 610 على أنها لا تحتوي على توسع متكرر بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما أسفر عن إجمالي 221 ألليلًا فرديًا موسعًا و 1321 أليلاً فرديًا غير موسع عبر 13 موقعًا مرضيًا (الملحق ص 24 ، 28). تصنيف تسلسل الجينوم الكامل بشكل صحيح 215 من 221 أليلات موسعة و 1316 من 1321 أليلات غير موسعة مقارنة بنتائج اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (الملحق ص 27 ، 29) ، مما يُظهر حساسية أولية تبلغ 97 · 3 بالمائة (95 بالمائة CI 94 · 2–99) · 0) وخصوصية 99 · 6 بالمائة (99 · 1-99 · 9 ؛ الجدول 1). بعد التصحيح المرئي لجميع المكالمات بناءً على جودة القراءات ، زادت الحساسية إلى 99 1 في المائة (96 8 - 99 9) والنوعية إلى 100 في المائة (99 7 - 100 ؛ الشكل 2 أ ، الجدول 1). مكّن تصور الأليلات الموسعة من اكتشاف النتائج الإيجابية الخاطئة وإعادة تصنيف جميع الأليلات السلبية الكاذبة في FXN ، والتي تم تصنيف أليل واحد منها فقط بشكل صحيح على أنه موسع في العينات ذات التوسعات biallelic (الملحق ص 17 ، 18).

تم قياس طول التكرار بواسطة PCR في 509 اختبارات PCR استجوبت 945 أليلاً عبر 13 موضع تمدد متكرر. تظهر الارتباطات بين ExpansionHunter و PCR لأحجام التكرار الأقصر والأكبر من طول قراءة التسلسل (أي 150 نقطة أساس) في الملحق (الملحق ص 19). لوحظ توافق عالي مع التكرارات الأقصر من طول القراءة ، مع 92 · 7 بالمائة (836 من 902) اتفاق بين PCR و ExpansionHunter. لوحظ تباين التركيز ، مع التوافق العالي بين ExpansionHunter و PCR لـ ATXN2 و ATXN7 و CACNA1A و HTT ، وتوافق منخفض لـ DMPK أو TBP (الملحق ص 30). تم التقليل من أطوال الأليلات الأكبر من طول القراءة بواسطة ExpansionHunter ، مما أثر على دقة الاتصال في DMPK و FMR1 و FXN (الشكل 2 ب ، الملحق ص 19 ، 31).

على الرغم من أن ExpansionHunter كان قادرًا على تحديد الأليلات الكبيرة الموسعة بشكل صحيح في FMR1 و DMPK و C9orf72 و FXN (الملحق ص 29) ، إلا أن تقديرات الحجم المتوقعة تميل إلى أن تكون أقل من تلك التي تم الحصول عليها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زيادة حجم التكرار ضمن النطاق الممرض ، مما أثر على القدرة على التمييز بين التوسعات الكبيرة والصغيرة في DMPK و C9orf72 و FXN ، أو بين التوسعات والتبديلات الكاملة في FMR1 (الملحق ص 31). على سبيل المثال ، كان للمواضع ذات الطول المتكرر المقدر بواسطة PCR أكبر من 200 تكرار في FMR1 والمصنفة كطفرة كاملة كان متوسط ​​حجم التكرار المقدّر بواسطة ExpansionHunter يبلغ 92 6 (SD 17.8 ؛ الملحق ص 31).

لاختبار القدرة على اكتشاف التوسيع المتكرر من خلال تسلسل الجينوم الكامل لحل تشخيص المرضى الذين تم اختبارهم مسبقًا والذين لم يتم تشخيصهم جينيًا ، قمنا باختبار 11 631 المرضى الذين يشتبه في إصابتهم باضطراب عصبي وراثي تم تجنيدهم في مشروع 100000 جينوم (الشكل 1). تم تقييم بيانات تسلسل الجينوم الكامل باستخدام أربع لوحات تمديد متكررة مختلفة وفقًا للسمات السريرية للمريض. يتم عرض عدد المرضى الذين تم اختبارهم مع كل لوحة من اللوحات الأربعة في الجدول 2.

بشكل عام ، اكتشفنا التوسعات المتكررة وأكدناها بصريًا في عينات من 1 0 5 مرضى (الجدول 2 ، الملحق ص 2 0 ، 33). من بين هذه العينات ، كان هناك 81 عينة متاحة للاختبار التأكيدي بواسطة PCR ، وتم تأكيد 68 عينة على أنها تحتوي على توسيع متكرر (0 · محصول 6 بالمائة): 45 (1 · 2 بالمائة) من 3692 في اللوحة أ ، ثمانية ({ {18}} · 3 بالمائة) من 2743 في اللوحة "ب" ، وخمسة (0 · 6 بالمائة) من 860 في اللوحة "ج" ، وعشرة (0 · 1 بالمائة) من 6731 في اللوحة "د". ثلاثة عشر من أصل 81 مكالمة توسعة لم يتم تأكيدها على أنها توسعات متكررة مسببة للأمراض (معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 16 بالمائة). من بين هؤلاء ، كان اثنان من الأليلات غير الموسعة في ATXN1 و ATXN2 ، وأربعة كانت عبارة عن مكالمات متوسطة الحجم FMR1 (الملحق ص 21) ، وسبعة كانت عبارة عن تباديل FMR1.

التفاصيل السريرية لـ 68 مريضًا مع التوسعات المتكررة التي أكدها تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بما في ذلك عروضهم السريرية ، والتوسع المتكرر المحدد ، ومساهمة التوسيع المتكرر في السمات السريرية للمريض في الجدول 3 ؛ يتم سرد شروط HPO ، حجم التكرار المقدّر بواسطة ExpansionHunter ، وما إذا كان قد تم إصدار تقرير تشخيصي في الملحق (ص 33).

لوحظت التوسعات في المرضى الذين قدموا مع مجموعة متنوعة من العروض السريرية المتداخلة التي تم اختبارها مع اللوحة A (الجدول 3 ، الملحق ص 22) ، بما في ذلك التوسيع المتكرر ATXN2 في مريض مصاب بمرض باركنسون المستجيب للليفودوبا مبكرًا وتاريخ من الرنح المخيخي التدريجي ، والتوسع في AR في أربعة مرضى تم تشخيصهم إكلينيكيًا بمرض شاركو ماري توث ، بما في ذلك واحد مصاب باعتلال عصبي مؤكد وراثيًا ومزيل للميالين (مثل مرض شاركو ماري توث من النوع 1 ، المريض 42 ؛ الملحق ص 33). لوحظت مجموعة واسعة من التشخيصات السريرية السابقة في المرضى الذين يعانون من التوسعات المتكررة المسببة للأمراض.

على سبيل المثال ، في سبعة مرضى يعانون من التصلب الجانبي الضموري أو مرض عصبي حركي آخر ، تم تحديد التوسعات في AR (n =4) و C9orf72 (n =3). في المرضى الذين يعانون من ترنح وراثي مشتبه به ، حددنا التوسعات في المواقع التي لم يتم تقييمها كجزء من العمل التشخيصي الروتيني داخل NHS في وقت التوظيف ، بما في ذلك ATN1 و ATXN2 و ATXN3 و ATXN7 و CACNA1A و FXN و TBP و HTT ( الجدول 3). اكتشفنا أيضًا توسعًا متكررًا في المرضى الذين يعانون من سمات إكلينيكية متوافقة مع اضطرابات التوسع المتكررة البديلة ، بما في ذلك توسع C9orf72 في البداية المبكرة ومرض باركنسون العائلي (المريض 24 ، الجدول 3) وتكرار التوسعات في نطاق الاختراق المنخفض في HTT (38 تكرارًا) لدى شقيقتين تعانيان من اضطراب حركي ، وخرف ، واكتئاب ، وصعوبات في النطق (المرضى 44 و 45) ، مما يؤكد التحدي التشخيصي الذي تمثله اضطرابات التوسع المتكررة هذه.

تم العثور على ثمانية أطفال تم اختبارهم باستخدام اللوحة B لديهم توسعات كبيرة في تكرار CAG (الشكل 3) ، وشرح سبعة منهم تمامًا السمات السريرية للمريض. ستة مرضى لم يكن لديهم تاريخ عائلي غني بالمعلومات ولم يُعرض عليهم اختبار توسع متكرر كجزء من تقييمهم السريري في وقت التوظيف (المرضى 48-53 ؛ الجدول 3 ، الملحق ص 33). حمل اثنان من هؤلاء الأطفال توسعات HTT كبيرة (90-100 تكرار CAG). من الجدير بالذكر أن أحد الأطفال قد ورث التكرار من والد غير مصاب وليس له تاريخ عائلي للإصابة بمرض هنتنغتون. اختبار الأسرة مستمر ، ولكن تم تحديد أليل اختراق منخفض في الأسرة الممتدة ، مما يشير إلى أن التكرار قد توسع بأكثر من 60 وحدة متكررة في جيل واحد (المريض 52). في وقت كتابة هذا التقرير ، لم يُظهر أي شخص في الأسرة أي علامات لمرض هنتنغتون ، والاستشارات والاختبارات الوراثية مستمرة للوالدين. حمل طفلان أصغر من 5 سنوات توسعات متكررة كبيرة في ATXN7 وتعرضوا لمرض معقد متعدد الأنظمة. بالنسبة لأحد هؤلاء الأطفال (المريض 50) ، أظهر والدهم مشاكل في المشي بعد عامين من التسجيل في مشروع 100000 Genomes. وبالمثل ، وُجد أن الفتاة التي تبلغ من العمر 10 سنوات من ذوي الإعاقة الذهنية لديها 99- توسع متكرر في ATXN2 ، على الرغم من حقيقة أن كلا الوالدين تم تصنيفهما على أنهما غير متأثرين ، ووجد أن فتاة تبلغ من العمر 18 عامًا مصابة بالخرف تحمل { {19}} كرر التوسيع في ATN1 (الملحق ص 33).

تم الكشف عن خمسة توسعات في DMPK (اللوحة C) ، بما في ذلك في طفل وأم مع تشخيص سريري للحثل العضلي ، في شقيقين يشتبه في اعتلال عضلي بعيد ، وفي مراهق مصاب باعتلال عضلي خلقي (المرضى 54-58). تم الكشف عن توسعات FMR1 (اللوحة D) في تسعة أولاد وفتاة واحدة ، وشرح تشخيص متلازمة X الهش كليًا أو جزئيًا السمات السريرية الحالية (المرضى 59-68).

مناقشة

يعد تشخيص اضطرابات التوسع المتكرر أمرًا صعبًا في الرعاية الصحية بسبب السمات السريرية غير المتجانسة والمتداخلة والنتائج السريرية غير المحددة ، والتي يمكن أن تزداد شدتها مع تقدم العمر وفي كل جيل لاحق. تعد اضطرابات التوسع المتكرر من أكثر الأسباب شيوعًا للأمراض العصبية الوراثية. طرق الاختبار مجزأة حاليًا ، وقد يكون لدى المرضى موضع تمدد غير صحيح تم اختباره 29 أو يتلقون اختبارًا جزيئيًا لفئة مختلفة من المتغيرات بسبب تداخل السمات السريرية مع الاضطرابات الوراثية العصبية الأخرى.

تم استخدام تسلسل الجينوم الكامل في أماكن متعددة كاختبار تشخيصي للخط الأول للاضطرابات العصبية النادرة ، ولكن كان يُعتقد سابقًا أن لديه قدرة منخفضة على اكتشاف التوسعات المتكررة .16 تم تطوير العديد من الأدوات لتحديد التوسعات المتكررة من الجينوم الكامل التسلسل في إعداد البحث ، ولكن لم يتم تطبيق أي من هذه الأساليب على بيانات تسلسل الجينوم الكامل التي تم جمعها من عدد كبير من المرضى في خدمة رعاية صحية واحدة. نقدم دليلًا على أن الخوارزمية المصممة لاكتشاف التوسعات المتكررة من تسلسل الجينوم الكامل يمكن أن تقيم بشكل موثوق التوسعات المتكررة المسببة للأمراض الأكثر شيوعًا وتحل الحالات التي لم يتم تشخيصها وراثيًا سابقًا في مجموعة كبيرة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية. تشير نتائجنا إلى أن تسلسل الجينوم الكامل يمكن أن يميز بين الأليلات غير الموسعة والموسعة ذات الحساسية والنوعية العالية عبر 13 موقعًا للتوسع المتكرر (والتي يمكن تحسينها بشكل أكبر عن طريق الفحص البصري) ، ويمكنها حساب حجم الأليلات الأصغر من طول القراءة بدقة. ، وقد يقلل من حجم التوسعات الكبيرة في FMR1 و DMPK و FXN و C9orf72.

عندما تم تقييم اكتشاف التوسعات المتكررة بواسطة تسلسل الجينوم الكامل مقابل النتائج الإيجابية والسلبية التي تم الحصول عليها سابقًا في مختبرات التشخيص الجينومي السريري باستخدام طرق قياسية ذهبية ، وجدنا حساسية بنسبة 97 3 في المائة على الأقل وخصوصية بنسبة 99.6 في المائة. علاوة على ذلك ، أظهرنا أنه يمكن تحسين كل من الخصوصية والحساسية من خلال المعالجة اليدوية لتراكم القراءة ، مما يتيح الكشف عن النتائج الإيجابية الخاطئة وإعادة تصنيف الأليلات السلبية الكاذبة في العينات ذات التوسعات biallelic. من بين 6731 مريضًا تم اختبارهم من أجل FMR1 (اللوحة D) ، تم التنبؤ بتوسيع 124 مكالمة. تمكنا من استبعاد 97 من خلال الفحص البصري كإيجابيات خاطئة محتملة. يشير هذا إلى أن 1 من 54 اختبارًا لتسلسل الجينوم الكامل سيكون له مكالمة FMR1 تحتاج إلى فحص بصري لتجاهل مكالمة إيجابية كاذبة محتملة. العمل مستمر لتحسين طريقة التنميط الجيني ExpansionHunter لتقليل عدد المكالمات الإيجابية الكاذبة لـ FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 تكرار) يسبب مرضًا أكثر شدة ، ورنح مخيخي من النوع 36 (NOP56) ، حيث تعتبر التوسعات الأكبر من 650 تكرارًا مسببة للأمراض ، وتعتبر أحجام التكرار 15-650 وسيطة ومتغيرات ذات أهمية غير مؤكدة.

تم تحديد أكثر من 40 موقع توسيع متكرر ؛ تم تحديد العديد من هذه المواقع مؤخرًا فقط وهي مرتبطة الآن بحالات غير مفسرة سابقًا ، بما في ذلك ترنح المخيخ مع اعتلال الأعصاب ومتلازمة المنعكسات الدهليزي (RFC1) 32 والصرع الرمعي (SAMD12). تم اختيارها لدراستنا بناءً على توافر عينات التحكم الإيجابية والسلبية.

تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن ExpansionHunter يجب أن تكون قادرة على تصنيف الأليلات غير الموسعة والموسعة بدقة في أي موضع تمدد متكرر إذا كانت الأليلات غير الموسعة أصغر من طول القراءة (أي 150 نقطة أساس). على الرغم من أن معظم مواضع التوسيع المتكررة تحتوي على أليلات أصغر من 150 نقطة أساس عند عدم التمدد ، إلا أن بعض المواقع التي يكون حجم الأليل غير الممتد فيها قريبًا من 150 نقطة أساس (على سبيل المثال ، NOTCH2NLC) 34 قد يكون أكثر صعوبة في التركيب الوراثي باستخدام هذا النهج. بالنسبة للمواقع حيث يكون التكرار الموسع أكبر بكثير من طول القراءة ، يمكن لتسلسل الجينوم الكامل اكتشاف التوسعات المسببة للأمراض (على سبيل المثال ، NOP56 ، 35 RFC120 ، 32). قد تقدم تقنيات التسلسل طويل القراءة الناشئة نهجًا تكميلية عند التنميط الجيني للتوسعات الكبيرة

أسفر تقييم التوسعات المتكررة باستخدام تسلسل الجينوم الكامل في 11 631 من المرضى غير المشخصين الذين تم تجنيدهم في مشروع الجينوم 100 000 عن 68 مريضًا بنتائج تفسيرية. تم تجنيد المرضى في مشروع الجينوم 100 000 بعد الاختبارات الجينية القياسية للرعاية ؛ لذلك ، فإن نسبة التوسعات المتكررة المحددة في هذه المجموعة تمثل زيادة في العائد التشخيصي من اختبار NHS القياسي ، والذي يتضمن اختبارًا خاصًا بالموقع لاضطرابات التوسع المتكررة مثل FXN أو DMPK. تجدر الإشارة إلى أنه لم يتم الاشتباه في بعض التشخيصات بناءً على السمات السريرية للمريض ، بما في ذلك ستة مرضى من الأطفال ليس لديهم تاريخ عائلي معروف لاضطراب التوسع المتكرر. متوسط ​​أحجام التوسع المتكرر التي تنبأ بها تسلسل الجينوم الكامل في مرضى الأطفال الموصوفين في هذه الدراسة أكبر بكثير من المتوسط ​​عند البالغين ، بما يتوافق مع توقع أن التوسعات الأكبر مرتبطة ببداية مبكرة وأكثر خطورة ، حتى عند الأطفال. هناك حاجة إلى مزيد من العمل ، ولكن هذه النتيجة تشير إلى أن تقييم الإمراضية المعتمد على العمر والمتكرر المعتمد على الحجم قد يدعم تشخيص الأطفال عن طريق الحد من المخاطر المحتملة لتحديد أليلات الخطر التي تظهر عند البالغين ، مما يؤدي إلى اختبار تنبؤي غير مرغوب فيه عند الأطفال.

تمكن النتائج التي توصلنا إليها من إنشاء سير عمل التشخيص السريري لتسلسل الجينوم الكامل (الملحق ص 23). نقترح أن يتم إجراء الفحص البصري لجميع المكالمات المصنفة على أنها موسعة لاكتشاف الإيجابيات الخاطئة ، وللتوسعات biallelic التي تم اكتشاف أليل واحد فقط موسع لها (على سبيل المثال ، FXN). نوصي بأن تستخدم المختبرات ExpansionHunter لتقييم وجود توسع دون التقيد بتقدير الحجم وإجراء اختبار PCR التأكيدي كمكون قياسي لسير عمل الاختبار.

تشمل الأمراض الوراثية النادرة مجموعة واسعة من السمات السريرية ، مما يجعل الاختبارات الجينومية الخاصة بالموقع غير فعالة وشاقة ومكلفة. نقدم دليلًا على أن تسلسل الجينوم الكامل من الدرجة السريرية مع إمكانية تشخيص مجموعة من الأمراض العصبية النادرة التي تظهر عادةً مع متغيرات رقم قاعدة واحدة أو indel أو نسخ يمكن الآن توسيعها لتكرار التوسعات. نظرًا لأن تسلسل الجينوم الكامل يوفر اختبارًا واحدًا يمكنه تحديد التوسعات المتكررة الأكثر شيوعًا ، بالإضافة إلى تمكين اختبار الطفرات النقطية ومتغيرات رقم النسخ في الجينات المرتبطة بهذه الحالات في وقت واحد ، فإنه يوفر فرصة لتحديد معظم المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات غير المتجانسة الذين لم يتم تشخيصهم باستخدام الاختبارات الخاصة بالموقع. في عصر العلاجات الناشئة لهذه الاضطرابات ، قد يصبح الاكتشاف المبكر أمرًا حاسمًا. 37 تدعم هذه النتائج تنفيذ تسلسل الجينوم الكامل لاكتشاف التوسعات المتكررة في مختبرات التشخيص الإكلينيكي ، وهو نهج تم تضمينه بالفعل في NHS England National Genomic دليل الاختبار ، 38 للتحقيق في مرض عصبي نادر غير مشخص.

مراجع

1 Ngo KJ و Rexach JE و Lee H وآخرون. سقف تشخيصي لتسلسل الإكسوم في الرنح المخيخي والاضطرابات العصبية ذات الصلة. هموم موتات 2020 ؛ 41: 487-501.

2 لينش دس ، كوتسيس جي ، توتشي أ ، وآخرون. الشلل النصفي التشنجي الوراثي في ​​اليونان: توصيف السكان غير المستكشفين سابقًا باستخدام تسلسل الجيل التالي. Eur J Hum Genet 2016 ؛ 24: 857-63.

3 Graziola F ، Garone G ، Stregapede F ، وآخرون. العائد التشخيصي للجيل التالي المستهدف من لوحة الجينات التسلسلية لاضطرابات الحركة التي تبدأ عند الأطفال: دراسة جماعية مدتها 3- سنة. الجبهة جينيت 2019 ؛ 10: 1026.

4 بولسون هـ. كرر أمراض التوسع. هاندب كلين نيورول 2018 ؛ 147: 105 - 23.

5 Gossye H و Engelborghs S و Van Broeckhoven C و van der Zee J. C9orf72 الخرف الجبهي الصدغي و / أو التصلب الجانبي الضموري. سياتل ، واشنطن: جامعة واشنطن ، 2015.

6 Klockgether T، Mariotti C، Paulson HL. رنح مخيخي شوكي. نات ريف ديس برايمرز 2019 ؛ 5:24.

7 Shakkottai VG، Fogel BL. علم الوراثة العصبية السريرية: رنح مخيخي جسمي سائد. نيورول كلين 2013 ؛ 31: 987-1007.

8 لاسبادا أ. ضمور العضلات الشوكي والصدلي. في: Adam MP ، Ardinger HH ، Pagon RA ، et al ، eds. المراجعات الجينية. سياتل ، واشنطن: جامعة واشنطن ، 1999.

9 Gousse G ، Natural H ، Touraine R ، et al. شكل مميت من الرنح النخاعي المخيخي من النوع 7 مع بداية مبكرة في الطفولة. قوس بيدياتر 2018 ؛ 25: 42-44.

10 Ansorge O ، Giunti P ، Michalik A ، وآخرون. -7 تجمع Ataxin وانتشاره في كل مكان في SCA7 الطفولي مع تكرار 180 CAG. آن نيورول 2004 ؛ 56: 448-52.

11 Ramocki MB، Chapieski L، McDonald RO، Fernandez F، Malphrus AD. رنح مخيخي شوكي من النوع 2 يتظاهر بانحدار معرفي في مرحلة الطفولة. J تشايلد نيورول 2008 ؛ 23: 999-1001.

12 ميتشل إن ، لاتوش جي إيه ، نيلسون ب ، فيغيروا كي بي ، ووكر آر إتش ، سوبرينج إيه كيه. بداية الطفولة ترنح النخاع الشوكي 3: خلل توتر اللسان كمظهر مبكر. الهزة الأخرى Hyperkinetic Mov 2019 ؛ نشرت على الإنترنت في 13 سبتمبر.

13 بيرد TD. نوع الحثل العضلي 1. In: Adam MP، Ardinger HH، Pagon RA، et al، eds. المراجعات الجينية. سياتل ، واشنطن: جامعة واشنطن ، 2019.

14 Aydin G و Dekomien G و Hoffman S و Gerding WM و Epplen JT و Arning L. تكرر التوسعات SCA8 و SCA10 و SCA12 و SCA36 و FXTAS و C9orf72 في مرضى SCA سلبيًا لأنواع SCA الفرعية الأكثر شيوعًا. BMC Neurol 2018 ؛ 18: 3.

15 Turro E و Astle WJ و Megy K et al. تسلسل الجينوم الكامل للمرضى الذين يعانون من أمراض نادرة في نظام صحي وطني. طبيعة 2020 ؛ 583: 96-102.

16 اشلي إي. نحو الطب الدقيق. نات ريف جينيت 2016 ؛ 17: 507-22.

17 Liu HY و Zhou L و Zheng MY وآخرون. المنفعة التشخيصية والسريرية لتسلسل الجينوم الكامل في مجموعة من العائلات الصينية غير المشخصة المصابة بأمراض نادرة. ممثل Sci 2019 ؛ 9: 19365.

18 موسوي إن ، شليزر-بوركو إس ، يانيكي آر ، جيمريك م. تحديد ملامح المشهد الجينومي الواسع للتوسعات المتكررة الترادفية. الأحماض النووية Res 2019 ؛ 47: e90.

19 Tankard RM ، Bennett MF ، Degorski P ، Delatycki MB ، Lockhart PJ ، Bahlo M. الكشف عن توسعات التكرارات الترادفية في مجموعات متسلسلة مع بيانات تسلسل قراءة قصيرة. آم J Hum Genet 2018 ؛ 103: 858-73.

20 Rafehi ​​H، Szmulewicz DJ، Bennett MF، et al. التحديد القائم على المعلوماتية الحيوية للتكرارات الموسعة: التوسع الخماسي غير المرجعي في RFC1 يسبب CANVAS. آم J Hum Genet 2019 ؛ 105: 151-65.

21 Gross AM ، Ajay SS ، Rajan V ، et al. متغيرات رقم النسخ في تسلسل الجينوم السريري: النشر والتفسير للأمراض النادرة وغير المشخصة. جينيت ميد 2019 ؛ 21: 1121 - 30.

22 Trost B ، Engchuan W ، Nguyen CM ، et al. الكشف على نطاق الجينوم عن تكرار الحمض النووي الترادفي الذي يتم توسيعه في التوحد. طبيعة 2020 ؛ 5 86: 80–86.

23 روبنسون بي إن ، كوهلر إس ، باور إس ، سيلو دي ، هورن دي ، موندلوس إس. آم J Hum Genet 2008 ؛ 83: 610-15.

24 علم الجينوم إنجلترا. حالات الأمراض النادرة نماذج البيانات السريرية. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/؟wpdmdl=5500 (تم الوصول إليه في 4 أغسطس 2021).

25 Dolzhenko E و van Vugt JJFA و Shaw RJ et al. الكشف عن التوسعات المتكررة الطويلة من بيانات تسلسل الجينوم الكامل الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. جينوم ريس 2017 ؛ 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E ، Deshpande V ، Schlesinger F ، وآخرون. ExpansionHunter: أداة قائمة على الرسم البياني المتسلسل لتحليل التباين في مناطق التكرار الترادفي القصيرة. المعلوماتية الحيوية 2019 ؛ 35: 4754-56.

27 روي إس ، كولدرين سي ، كارونامورثي أ وآخرون. المعايير والمبادئ التوجيهية للتحقق من تسلسل الجيل التالي من خطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية: توصية مشتركة من جمعية علم الأمراض الجزيئية وكلية علماء الأمراض الأمريكية. J مول تشخيص 2018 ؛ 20: 4-27.

28 روبنسون جيه تي ، ثورفالدسدوتير إتش ، وينكلر دبليو ، وآخرون. عارض الجينوم التكاملي. Nat Biotechnol 2011 ؛ 29: 24-26.

29 Schneider SA ، van de Warrenburg BPC ، Hughes TD ، et al. التجانس المظهري للعرض الشبيه بمرض هنتنغتون في عائلة SCA17. علم الأعصاب 2006 ؛ 67: 1701–03.

30 Schneider SA ، مرض Bird T. موف ديسورد كلين براكت 2016 ؛ 3: 342–54.

31 باهلو إم ، بينيت إم إف ، ديجورسكي بي ، تانكارد آر إم ، ديلاتيكي إم بي ، لوكهارت بيجاي. التطورات الحديثة في اكتشاف التوسعات المتكررة مع تسلسل الجيل التالي قصير القراءة. F1000Res 2018 ؛ 7: 736.

32 Cortese A و Simone R و Sullivan R et al. يعد توسع Biallelic لتكرار intronic في RFC1 سببًا شائعًا للرنح المتأخر. نات جينيت 2019 ؛ 51: 649-58.

33 Ishiura H ، Doi K ، Mitsui J ، et al. تتكرر توسعات TTTCA و TTTTA في الصرع الرمعي العضلي الحميد لدى البالغين. نات جينيت 2018 ؛ 50: 581-90.

34 Ishiura H و Shibata S و Yoshimura J وآخرون. التوسعات المتكررة CGG غير المشفرة في مرض التضمين النوى العصبي ، واعتلال عضلي بلعومي ، ومرض متداخل. نات جينيت 2019 ؛ 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H، Szmulewicz DJ، Pope K et al. التشخيص السريع للرنح النخاعي المخيخي 36 في عائلة مكونة من ثلاثة أجيال باستخدام بيانات تسلسل الجينوم الكامل قصيرة القراءة. موف ديسورد 2020 ؛ 35: 1675–179.

36 Mantere T، Kersten S، Hoischen A. تسلسل القراءة الطويلة الناشئة في علم الوراثة الطبية. الجبهة جينيت 2019 ؛ 10:42.

37 Ellerby LM. تكرار اضطرابات التوسع: الآليات والمداواة. العلاج العصبي 2019 ؛ 16: 924–27.

38 نظام الصحة الوطني. دليل الاختبارات الجينومية الوطنية: معايير الاختبار للأمراض النادرة والموروثة. أكتوبر 2021.