دراسة مقارنة لخصائص وآلية مكافحة الشيخوخة: ريسفيراترول وتقييد السعرات الحرارية Ⅱ

تأثير ريسفيراترول و CR على تعبيرات الرنا المرسال لـ SIRT1 و p53 و Foxo3a في أنسجة الجرذان المسنة

ظروف الإجهاد التأكسديغالبًا ما تحفز تعبير SIRT1 ونشاطه. يعدل SIRT1 وظائف عوامل البقاء الرئيسية بما في ذلك p53 و Foxo3a [9]. لتحديد تأثير ريسفيراترول و CR على مستويات الرنا المرسال لكل من SIRT1 و p53 و Foxo3a في فئران الشيخوخة التي يسببها D-Gal ، تم إجراء فحوصات RT-PCR الكمية. مقارنة بمجموعة التحكم السلبية المقابلة ، انخفضت مستويات تعبير SIRT1 و Foxo3a mRNA بشكل كبير ، ولكن مستوى p53 زاد بشكل ملحوظ في مجموعة D-Gal (P <0. 0 1 ؛ الشكل 9 أ و 9 ب). علاوة على ذلك ، تسبب العلاج المتزامن ريسفيراترول أو CR مع D-gal في الفئران في زيادة مستويات تعبيرات SIRT1 و Foxo3a mRNA ولكن خفض مستويات p53 مقارنة بمجموعة التحكم في النموذج (P <0. 05). ومع ذلك ، بالمقارنة مع علاج CR ، زاد مستوى تعبير SIRT1 mRNA بشكل ملحوظ في كبد جرعة عالية من مجموعة ريسفيراترول بالإضافة إلى مجموعة D-gal ، وانخفض مستوى تعبير p53 mRNA بشكل كبير في الكبد والأدمغة بجرعة عالية من ريسفيراترول بالإضافة إلى D- مجموعة غال (P <0.05).

انقر هنا للحصول على مكملات مكافحة الشيخوخة من سيستانش

تأثير ريسفيراترول و CR على تعبيرات البروتين الرئيسي المرتبط بـ SIRT 1- في أنسجة المخ لدى الجرذان المسنة

FOXO3a و p53 ، اللذان ينظمهما SIRT1 ، هما جزيئات المصب لـ SIRT1. في الوقت نفسه ، يتم تنظيم نشاط SIRT1 من خلال جزيئاته الأولية ، على سبيل المثال ، DBC1 (المعروف أيضًا باسم KIAA1967) و AROS (المعروف أيضًا باسم RPS19BP1) وكابت الورم HuR (المعروف أيضًا باسم ELAVL1) [9 ، 1 0] . لتحديد تأثير ريسفيراترول و CR على مستويات البروتين لكل من p53 و FOXO3a و HuR و AROS و DBC1 في الجرذان التي يسببها D-Gal ، تم إجراء فحوصات اللطخة الغربية. مقارنة بمجموعة التحكم السلبية المقابلة ، انخفضت مستويات تعبيرات البروتين FOXO3a و AROS و HuR بشكل ملحوظ ، لكن مستويات p53 و DBC1 زادت بشكل ملحوظ في مجموعة D-gal (P <0. 0 1 ؛ الشكل 1 0). علاوة على ذلك ، تسبب العلاج المتزامن ريسفيراترول أو CR مع D-gal في الفئران في زيادة تعبيرات البروتين لـ FOXO3a و AROS و HuR ولكنه انخفض مستويات p53 و DBC1 مقارنة بمجموعة التحكم في النموذج (P <0.05). ومع ذلك ، بالمقارنة مع علاج CR ، زاد مستوى التعبير عن بروتين HuR بشكل كبير ولكن مستوى DBC1 انخفض بشكل ملحوظ في أدمغة جرعة عالية من مجموعة ريسفيراترول بالإضافة إلى D-gal (P <0.05). لم تكن هناك فروق بين مجموعة ريسفيراترول بالإضافة إلى D-gal ومجموعة CR plus D-gal في مستويات التعبير البروتيني p53 و FOXO3a و AROS (P> 0.05).

تعبيرات FOXO3a و p53 في أنسجة المخ والكبد

تم تحديد حالة التعبير عن FOXO3a و p53 في أنسجة المخ والكبد عن طريق الكيمياء المناعية. أظهر التحليل الكيميائي الهيستوكيميائي المناعي لـ FOXO3a و p53 أن تعبير FOXO3a في أنسجة المخ والكبد قد انخفض بشكل ملحوظ ، وأن تعبير p53 زاد بشكل ملحوظ في مجموعة D-Gal ، مقارنة بمجموعة التحكم السلبية (P <0. {{13} } 5 ، الشكل 11). علاوة على ذلك ، تسبب العلاج المتزامن ريسفيراترول أو CR مع D-gal في الفئران في زيادة تعبير FOXO3a ولكنه قلل من تعبير p53 مقارنة بمجموعة التحكم في النموذج (P <0. 05). ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق بين مجموعة ريسفيراترول بالإضافة إلى D-gal ومجموعة CR plus D-gal في تعبيرات p53 و FOXO3a (P> 0.05).

مناقشة

تم تطوير العملية الكيميائية الأساسية الكامنة وراء الشيخوخة لأول مرة بواسطةنظرية الجذور الحرة للشيخوخة[11] والاكسدةيُعتقد أنه عامل أساسي في عملية الشيخوخة الطبيعية.البادئ الجذور الحرة AAPHاعتاد علىتحريض الاكسدةوإنشاء نموذج مؤكسدالشيخوخة الخلوية الناجمة عن الإجهادفي خلايا IMR -90 البشرية [12 ، 13]. مزايا هذه الطريقة هي أن AAPH يتحلل حرارياً إلىتوليد الجذوردون التحولات الحيوية أو الإنزيمات ، ومعدلجيل راديكالييمكن التحكم فيها بسهولة عن طريق ضبط تركيز البادئ [12]. تم العثور على AAPH لتمنع انتشار الإنسانIMR - 90 في تركيز وبطريقة تعتمد على الوقت. أظهرت النتائج أن الحضانة لمدة يومين مع AAPH (1 مم) أدت إلى زيادة معنوية في النسبة المئوية للنسبة الإيجابية لـ SA -Gal ، وتعداد الخلايا المبرمجة ، وتقليل تعبير mRNA لـ SIRT1 ، وتسبب في تضخم ومسطحة مورفولوجيا. هذه تشير إلى أن الإجهاد التأكسدي نتج عن AAPH أدى إلى شيخوخة خلايا IMR -90. بناءً على نموذج الشيخوخة الخلوية هذا ، فإن علاج 10 ميكرومتر ريسفيراترول أكثر كفاءة في تثبيط الشيخوخة والاستماتة الناجم عن AAPH من علاج CR.

نموذج D-gal الحيواني هو نموذج حيواني معترف به دوليًا وقد تم استخدامه على نطاق واسع في مجالالأدوية المضادة للشيخوخة. D-gal هو عنصر غذائي فسيولوجي يتم استقلابه عادة بواسطة D-galactokinase و galactose -1- الفوسفات في الحيوانات. ومع ذلك ، فإن الإفراط في إمداد D-gal ، والذي لا يتم استقلابه بواسطة الإنزيمات المذكورة أعلاه ولكنه يتراكم في الخلايا ، يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي وتلف الخلايا [14]. وبالتالي ، فإن تناول D-gal على المدى الطويل يؤدي إلى تغييرات تشبه الشيخوخة الطبيعية في الحيوانات ، مثل تقصير العمر ، والخلل الإدراكي ، والتنكس العصبي ، والإجهاد التأكسدي ، وانخفاض الاستجابات المناعية ، وتشكيل المنتج النهائي للجليكيشن (AGE) المتقدم [15]. أشارت الدراسة الحالية إلى التأسيس الناجح لنموذج الشيخوخة المحاكي ، والذي يتضح من التعلم الرائع وضعف الذاكرة ، وإنتاج MDA ، وتراكم الدهون ، وانخفاض T-AOC و SOD ، والتنظيم السفلي لنشاط التيلوميراز في الدماغ. وفي الوقت نفسه ، تحمي علاجات ريسفيراترول أو CR الفئران التي يسببها D-gal من الإجهاد التأكسدي عن طريق زيادة نشاط إنزيمات مضادات الأكسدة ، وخفض مستويات منتجات بيروكسيد الدهون ، والحفاظ على توازن أنظمة الأكسدة ومضادات الأكسدة. في اختبارات النشاط السلوكي والتيلوميراز ، يمكن أن يعكس علاج ريسفيراترول أو CR ضعف الإدراك الناجم عن D-gal ونشاط التيلوميراز. علاوة على ذلك ، أظهرت الفئران النموذجية الشيخوخة التي عولجت بجرعات عالية من الريسفيراترول تأثيرًا معنويًا أكبر نسبيًا على السلوك من تلك التي عولجت بـ CR.

الشكل 11: التحليل الكيميائي المناعي لتعبيرات p53 (A ، B) و FOXO3a (C ، D) في أنسجة الكبد (A ، C) والدماغ (B ، D) للفئران المسنة. كان التكبير 20 ×. NG ، مجموعة التحكم السلبية ؛ MG ، نموذج مجموعة التحكم ؛ RESL ، جرعة منخفضة من مجموعة ريسفيراترول ؛ RESH ، جرعة عالية من مجموعة ريسفيراترول ؛ CR ، مجموعة تقييد السعرات الحرارية

وقد أظهرت الدراسات أن CR ، وهو انخفاض بنسبة 10-40 في المائة في تناول نظام غذائي مغذي ، يمكن أن يحدثيؤخر الشيخوخة ويزيد من العمر الافتراضي، وبالتالي تم تطبيق مستوى شائع الاستخدام من CR (انخفاض بنسبة 40 في المائة في تناول الطعام) في جرذان مجموعة CR في هذه الدراسة. ومع ذلك ، كشفت بعض التحقيقات أنه لا يوجد تأثير مفيد لـ CR على طول العمر في الرئيسيات المسنة بشكل طبيعي [16]. وبالمثل ، على الرغم من أن العلاج بالريسفيراترول ثبت أنه يسبب تأثيرات تشبه CRاستقلاب الطاقةوالمظهر الأيضي في البشر البدينين [17] ، لم يحسن وظيفة التمثيل الغذائي لدى النساء غير البدينات اللائي لديهن تحمل طبيعي للجلوكوز [18]. سبب الاختلافات بين هذه الدراسات غير واضح ، ولكن قد يكون السبب هو أن CR و resveratrol يعملان على استعادة التوازن في الأفراد المعرضين للخطر الأيضي ، وأقل من ذلك في الأفراد الأصحاء ، وهو احتمال يتوافق مع الوظائف المعروفة لـ SIRT1 في الدراسات على الحيوانات [19]. لذلك ، تم تطبيق نماذج الجرذان المتقادمة التي يسببها D-gal لمقارنة أنشطة مكافحة الشيخوخة من ريسفيراترول أو CR ، بدلاً من نموذج الفئران الطبيعي العمر.

اكتسب SIRT1 ، وهو (NAD plus) ، ديستيلاز معتمد على (NAD plus) ، الكثير من الاهتمام بسبب أدواره المتعددة في إطالة العمر ، ومقاومة الإجهاد وتقليل موت الخلايا المبرمج [20 ، 21]. تشير الدراسات المتراكمة بقوة إلى أن SIRT1 كان هدفًا رئيسيًا لريسفيراترول وسي آر [22]. هناك عدد كبير من جزيئات المصب من SIRT1 ، بما في ذلك p53 و Foxo1 و Foxo3 و Foxo4 و E2F1 ، والتي تنظمها SIRT1. في نفس الوقت ، يتم تنظيم نشاط SIRT1 بواسطة جزيئاته الأولية ، على سبيل المثال ، p53 و HIC1 و E2F1 و DBC1 و HuR و AROS. ينشط سحب المغذيات الحاد برنامج النسخ في محفز SIRT1 الذي يتم توجيهه بواسطة عوامل النسخ Foxo3a و p53. نظرًا لأن p53 يقمع التعبير الجيني لـ SIRT1 ، فإن إزالته بواسطة Foxo3a ينشط نسخ SIRT1 [23]. تم وصف DBC1 و AROS مؤخرًا كمنظمين سلبيين وإيجابيين مباشرين لنشاط SIRT1 ، على التوالي ، يُظهر HuR تأثير تقليل مستويات التعبير عن SIRT1 في الخلايا المسنة المسنّة [9 ، 10].

سجل تجارييؤخر الشيخوخة ويطيل متوسط ​​العمر والحد الأقصىفي مجموعة متنوعة من الأنواع ، بما في ذلك الجرذان والفئران والأسماك والذباب والديدان والخميرة. ومع ذلك ، فإن مثل هذه البرامج الغذائية الصارمة في الأشخاص الذين يعيشون بحرية قد أثارت قضايا أخلاقية ومنهجية [24]. في الوقت الحالي ، قد يكون زيادة الفترة الصحية أكثر أهمية من مجرد إطالة العمر الافتراضي. تشير التحقيقات الحديثة إلى أن الريسفيراترول هو أحد أكثر المحرضات فعالية على نشاط SIR2 بين جميع البوليفينول النباتي [25] ، ويؤثر على طول العمر من خلال آليات مماثلة كما هو موضح في تقييد السعرات الحرارية. أظهرت هذه النتائج أن CR و resveratrol لهما أنشطة مماثلة لاستعادة مستويات تعبير SIRT1 mRNA ، وزيادة تعبيرات البروتين لـ FOXO3a و AROS و HuR وخفض مستويات p53 و DBC1. وفي الوقت نفسه ، تشير خطوط متعددة من الأدلة القاطعة إلى الآثار المفيدة للريسفيراترول على الجهاز العصبي والكبد والقلب والأوعية الدموية.

المواد والأساليب

ثقافة الخلية والتوتر والعلاجات

تم الحصول على سلالة الأرومة الليفية ثنائية الصبغة البشرية IMR -90 من ATCC. نمت الخلايا في الوسط الأساسي الأدنى (MEM) (Gibco ، المملكة المتحدة) مكملًا بنسبة 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) (Gibco) عند 37 درجة في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد أن تم الوصول إلى التقاء ، تم زرع الخلايا في 6- لوحات مزرعة جيدة. بعد يوم واحد ، عولجت الخلايا لمدة 48 ساعة باستخدام 1 ملي مولار 2،2′-أزوبيس (2- ميددينوبروبان) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH) (سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية) مخفف في MEM بالإضافة إلى 10 بالمائة FBS. حضانة 48 ساعة مع بادئ الجذور الحرة AAPH يؤسس نموذجًا للشيخوخة الخلوية المؤكسدة التي يسببها الإجهاد [12 ، 13]. تم تحضين خلايا الضوابط في وسط مستنبت وحده. بعد معالجة AAPH ، تم غسل IMR -90 بمحلول ملحي عازل الفوسفات البارد (PBS) درجة الحموضة 7.4 وحضنت بوسط استزراع جديد أو وسط استزراع يحتوي على ريسفيراترول (مجموعة ريسفيراترول) أو MEM مع 3 بالمائة FBS (مجموعة CR) 48 ساعة إضافية قبل الحصاد.

SA- نشاط تلطيخ الطحالب

تم فحص ظهور المؤشرات الحيوية للشيخوخة (انخفاض القدرة التكاثرية وزيادة في SA- تلطيخ الطلع) [26] من اليوم التالي للعلاج. ثم تم تلوين الخلايا باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة SA -gal Staining Kit (CST ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد التلوين ، تم فحص ما لا يقل عن 300 خلية في عدة مجالات وتم عد الخلايا الموجبة SA. تكررت هذه التجارب ثلاث مرات ، وعرضت النتائج على أنها القيم المتوسطة مع الانحرافات المعيارية (SD). لتجنب تلطيخ غير محدد ربما بسبب التقاء الخلايا ، تم إجراء تلطيخ كيميائي نسجي SA -gal مع خلايا subconfluent.

مسح تحليل المجهر الإلكتروني

نمت الخلايا على أغطية في 6- لوحات زراعة البئر كما هو موضح أعلاه. بعد معالجة ريسفيراترول و CR ، تمت إزالة الأغطية من الألواح ، ثم تم تثبيت الخلايا في 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد المخزن بالفوسفات وثبت بعد ذلك في 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم المخزن. تم غمر العينات الثابتة في كحول تي بوتيل بعد الجفاف من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول. تم تجفيف العينات بالتجميد من كحول T-butyl ، ثم تم تغليفها بالذهب بالتبخير باستخدام طلاء ناعم آلي (JFC -1600 ، JEOC ، اليابان) ، وتم فحصها باستخدام مجهر إلكتروني مسح (JEOL ، JSM {{11} } LV ، اليابان).

تحليل أبوبوتيك

بعد حضانة ريسفيراترول أو CR ، تم حصاد جميع الخلايا باستخدام التربسين وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، متبوعًا بتعليقها في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الملحق الخامس. ثم تم تلطيخ الخلايا باتباع تعليمات الشركة الصانعة لمجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج لخلايا Annexin V-FITC (BestBio ، الصين). تم استخدام مقياس التدفق الخلوي FACSCalibur (Becton-Dickinson ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) لاكتشاف التألق ، وتم حساب النسبة المئوية للخلايا المبرمج بواسطة نظام البرنامج الداخلي لـ FACSCalibur. تم تحليل ما يقرب من 104 خلية لكل مسار.

إجراءات الحيوان

تم الحصول على ذكور فئران ويستار البيضاء ، التي تزن حوالي 200 ± 10 جم ، من مركز الحيوانات التجريبية بكلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا (SCXK {2}}). تم تأقلم الحيوانات لمدة أسبوعين قبل الجرعات في مركز الحيوانات التجريبية التابع لجامعة هوبى للطب الصيني ، وخلال هذه الفترة كان لديهم حرية الوصول إلى الطعام والماء. بعد التأقلم ، تم اختيار 50 جرذًا وقسمت إلى خمس مجموعات كل منها عشرة. تم الحفاظ على الحيوانات وفقًا للإرشادات والبروتوكولات الوطنية المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية المؤسسية للحيوان (IAEC).

تلقت جرذان المجموعة الأولى (المجموعة الضابطة السلبية) السيارة وحدها (1 مل / كجم من وزن الجسم 0. 9٪ من المحلول الملحي) لمدة 6 أسابيع. المجموعة الثانية (مجموعة التحكم النموذجية) تلقت D-gal (200 مجم / كجم من وزن الجسم ، Sigma Chemical ، St. Louis ، MO) لمدة 6 أسابيع. المجموعة الثالثة (جرعة منخفضة من مجموعة ريسفيراترول) تلقت فئران جالون وريسفيراترول (50 مجم / كجم من وزن الجسم) مذاب في 5 بالمائة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 6 أسابيع. المجموعة الرابعة (جرعة عالية من مجموعة ريسفيراترول) تلقت D-gal و resveratrol (100 مجم / كجم من وزن الجسم). تلقت جرذان المجموعة الخامسة (مجموعة CR) D-gal و CR (تغذت على نظام غذائي يحتوي على سعرات حرارية أقل بنسبة 40 في المائة من الجرذان التي تتغذى بالشهرة الإعلانية [27]) لمدة 6 أسابيع. تم إعطاء D-gal داخل الصفاق ، في حين تم إعطاء ريسفيراترول شفويا طوال مدة التجربة. تم التضحية بالجرذان في اليوم الأخير من العلاج ، ثم تم جمع الدم والأمصال والأعضاء على الفور للمقايسة الحيوية أو تخزينها في درجة حرارة -80 درجة لاستخدامها لاحقًا.

الاختبارات السلوكية

تم تصميم اختبار متاهة موريس المائية لتقييم قدرة الفئران على التعلم المكاني والذاكرة بعد 6 أسابيع بعد الإصابة [28]. يتكون اختبار Morris Water Maze من 4- يوم من التعلم والتدريب على الذاكرة وتجربة مسبار في اليوم الخامس. تم تدريب الحيوانات في بركة دائرية (قطرها 155 سم) مع إشارات بصرية. تم غمر منصة هروب (قطرها 9. 0 سم) بمقدار 1. 0 سم تحت سطح مياه البركة ، والتي تم الحفاظ عليها عند 25 ± 2 درجة. ظل موقع المنصة في وسط الربع الشمالي الغربي طوال فترة التدريب التي تبلغ 4- يومًا. في كل يوم ، تم تدريب الفئران على كتلة صباحية واحدة وكتلة بعد الظهر. سبح الجرذ بحرية حتى وجد المنصة في غضون 120 ثانية. إذا فشلت ، تم وضعها على المنصة لمدة 10 ثوانٍ. تم تسجيل زمن الهروب (العثور على منصة الهروب المغمورة) وسرعة السباحة. تم إجراء تجربة المسبار عن طريق إزالة المنصة والسماح لكل فأر بالسباحة بحرية لمدة 120 ثانية داخل المسبح. تم تسجيل عدد معابر المنصة في الربع المدرب (حيث تمت إزالة المنصة) باستخدام نظام فيديو محوسب. لم يتم إجراء نسخة المنصة المرئية من المتاهة المائية بعد ملاحظة اختلاف كبير في سرعة السباحة بين الفئران التي عولجت بـ D-gal والمركبة.

الكشف عن المؤشرات البيولوجية المرتبطة بالإجهاد التأكسدي

تم تحديد مستويات MDA و SOD و T-AOC في الدم والأنسجة ضوئيًا وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعات الفحص الأنزيمية المتاحة تجاريًا (معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering ، مدينة Nanjing ، جمهورية الصين الشعبية). تم إجراء جميع التجارب الموصوفة في هذا القسم في ثلاث نسخ للحصول على الوسائل و SD.

تم تحديد مستوى Lipofuscin بواسطة طريقة Sohal [29]. باختصار ، قمنا بوزن 2 0 0 ملغ من القشرة الدماغية ، وأضفنا 2 مل من خلاصة الكلوروفورم-ميثانول (2: 1) ، وتم تجانسها وتصفيتها ، ثم غسلنا البقايا بالمستخلص ، ودمجنا الترشيح ، وأضفنا المستخلص إلى 5 مل وقياس شدة التألق على مطياف مضان. كان الطول الموجي للانبعاث 435 نانومتر وكان الطول الموجي للإثارة 365 نانومتر. تم توحيد مقياس الطيف الضوئي لإعطاء انحراف قدره 50 عند الأطوال الموجية أعلاه بمحلول 1 ميكروغرام / مل من ثنائي كبريتات الكينين في 0.1 مولار H2 SO4. تم التعبير عن النتائج كوحدات فلورية نسبية / مل كلوروفورم / جم من وزن الأنسجة الرطبة.

الكشف عن نشاط TE

لاستخراج التيلوميراز ، تم غسل ما يقرب من 3 0 ملغ من الأنسجة مرتين في برنامج تلفزيوني بارد مثلج ، وأخيراً تم تجانسه في حوالي 150 مل من برنامج تلفزيوني. تم قياس نشاط TE باستخدام مجموعات TE ELISA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co.، Ltd. ، Nanjing ، الصين). كانت حدود حساسية المقايسات 0.8 وحدة دولية / لتر لـ TE.

تحليل RT-PCR

تم تحليل مستويات تعبير mRNA لـ SIRT1 و Foxo3 و p53 في أنسجة الكبد والدماغ باستخدام تحليل RT PCR. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام Trizol ، وتم تقييم كميتها ونقاوتها بواسطة مقياس ضوئي فائق الدقة (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) بناءً على قياس الامتصاصية عند 260 و 280 نانومتر. بعد القياس الكمي ، تم تصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة FastQuant RT (Tiangen Biotech ، بكين ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس مستويات تعبير SIRT1 و Foxo3 و p53 mRNA بواسطة RT-PCR باستخدام TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech ، بكين ، الصين) باستخدام بادئات محددة (الجدول 2). تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام نظام LightCycler 480 درجة PCR (روش ، بازل ، سويسرا) باستخدام 20 ميكرولتر كحجم إجمالي لكل تفاعل. بدأ تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لمدة 15 دقيقة من تمسخ الطبيعة عند 95 درجة ، ثم تبعه 40 دورة من 95 درجة لمدة 10 ثوانٍ ، و 59-63 درجة (درجة حرارة التلدين) لمدة 20 ثانية و 72 درجة لمدة 30 ثانية ، وحضانة نهائية عند 72 درجة لمدة 5 دقائق. تم تطبيع رقم عتبة الدورة التي تم الحصول عليها لكل جين (قيمة Ct) في أضعاف التغييرات النسبية وفقًا لمعادلة 2- طريقة ∆∆CT [30].

الجدول 2: قائمة التمهيدي

تحليل لطخة غربية

تم تحليل مستويات التعبير البروتيني لـ p53 و FOXO3a و HuR و RPS19BP1 و DBC1 في أنسجة المخ باستخدام تحليل النشاف الغربي. تم استخراج البروتين الكلي لأنسجة المخ باستخدام RIPA Lysis Buffer (Beyotime ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA (بيوتايم ، الصين). تم فصل 5 ملغ من البروتينات باستخدام 12 بالمائة من المواد الهلامية SDS-polyacrylamide ونقلها إلى غشاء PVDF (0. 45 ميكرومتر ، ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حجب البقع بحليب خالٍ من الدسم بنسبة 5 في المائة في TBS ، ثم حضنت طوال الليل عند 4 درجات مع التخفيف المناسب للأجسام المضادة الأولية: anti-p53 (SC - 6243 ، Santa Cruz Biotechnology) ، anti-FOXO3a (# 12829 ، خلية تقنية التشوير) ، anti-HuR (# 12582 ، Cell Signaling Technology) ، anti-AROS (Ab201091 ، abcam) ، anti-DBC1 (# 5857 ، Cell Signaling Technology) ، مضاد - - للعمل (AC004 ، ABclonal Technology) . بعد غسل الأغشية لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة ، تم تحضين الأغشية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بتخفيف 1: 2000-1: 5000 (AC004 أو AS003 ، ABclonal Technology). تم غسل الأغشية 3 مرات ثم تصورها باستخدام الركيزة النشاف الغربية Pierce ECL (Thermo Scientific). - تم استخدام الفعل كرقابة داخلية.

الكيمياء المناعية

تم إصلاح عينات الأنسجة في الفورمالين المحايد بنسبة 10 في المائة في غضون ساعة واحدة بعد الإزالة الجراحية والبارافين المضمنة باستخدام الإجراءات القياسية. ثم تم تقطيع العينات الثابتة المضمنة بالبارافين إلى أقسام بسماكة 5- ميكرومتر ، والتي تم إزالة الكافيين منها في زيلين ، وترطيبها في الإيثانول ، ومعالجتها بالميكروويف لاسترجاع المستضد. تم تحضين الجسم المضاد الأولي المخفف بشكل مناسب ، مضاد p53 (SC -6243 ، سانتا كروز Biotechnology) ومضاد FOXO3a (# 12829 ، تقنية تشوير الخلية) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة. تم شطف الشرائح بعد ذلك في برنامج تلفزيوني وتم تحضينها لاحقًا باستخدام الجسم المضاد الثانوي ضد الجسم المضاد للأرانب وتصور HRP (التركيز 1: 300 ، # 074-1506 ، KPL). ثم تم غسل الشرائح وتم تطوير المقاطع في محلول الركيزة الإنزيمية ديامينوبنزيدين (DAB ، Sigma). تم التقاط صور المقاطع الملطخة المناعية بواسطة مجهر أوليمبوس الرقمي (IX -73 P1F ، أوليمبوس ، اليابان).

تحليل احصائي

تم التعبير عن النتائج كوسائل ± SD لثلاث تجارب مستقلة على الأقل وتم تحليلها باستخدام برنامج SPSS 18. 0. تم تحليل الفروق الجماعية في زمن انتقال الهروب وسرعة السباحة في مهمة تدريب متاهة موريس المائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع القياسات المتكررة ، والعوامل هي العلاج ويوم التدريب. تم تحليل البيانات الأخرى باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق. تعتبر قيمة P أقل من 0. 05 تعتبر مهمة.

الاستنتاجات

أظهر ريسفيراترول وسي آر أنشطة مماثلة لمكافحة الشيخوخة في كل من المختبر وفي الجسم الحي ، ويتضح ذلك من خلال قدرتها على تثبيط الشيخوخة وموت الخلايا المبرمج الناجم عن AAPH ، واستعادة الضعف الإدراكي المرتبط بالعمر الناجم عن إعطاء D-gal. تضمنت آلياتها المضادة للشيخوخة تنظيم نشاط TE ، وتقليل الضرر التأكسدي ، وتنظيم مسار SIRT1. بشكل عام ، أظهر 10 ميكرومتر من ريسفيراترول في المختبر والجرعة العالية من ريسفيراترول في الجسم الحي أنشطة أقوى نسبيًا لمكافحة الشيخوخة وتحفيز مستويات SIRT1. أشارت هذه النتائج إلى إمكانات ريسفيراترول كمحاكي CR.

الاختصارات

AAPH، 2،2′-azobis (2- ميددينوبروبان) ثنائي هيدروكلوريد ؛ AMPK ، كيناز البروتين المنشط أحادي الفوسفات ، ANOVA ، تحليل التباين ؛ AROS ، منظم نشط لـ SIRT1 ؛ CR ، تقييد السعرات الحرارية ؛ DBC1 ، تم حذفه في سرطان الثدي 1 ؛ D- غال ، د- الجالاكتوز. FBS ، مصل بقري جنيني ؛ Foxo3a ، صندوق مفترق 3a ؛ HuR ، هو مستضد R ؛ MEM ، الوسيط الأساسي الأدنى ؛ برنامج تلفزيوني ، محلول ملحي الفوسفات ؛ PGC -1 ، منشط G coactivator المنشط بالبيروكسيسوم -1 ؛ RES ، ريسفيراترول. SA- جالكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ؛ SD ، الانحرافات المعيارية ؛ SIRT1 ، إسكات منظم المعلومات ؛ TE ، تيلوميراز.

الكاتب الاشتراكات

مفهوم وتصميم البحث: جانج تشن ؛ الحصول على البيانات وتحليلها وتفسيرها: جوان لي ، شيا تشون تشانغ ، يي مي ليو ؛ الحصول على التمويل والمراجعة النقدية للمخطوطة الخاصة بالمحتوى الفكري: Gang Chen، Ke-Li Chen؛ كتابة المخطوطة: خوان لي. لقد قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على نشر هذه المخطوطة. شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة الصين للعلوم ما بعد الدكتوراه (2016M601237) ، مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية (81373704 ، 30873292).

تضارب المصالح

لا تضارب المصالح من جميع المؤلفين المشاركين.

مراجع

1. Ramis MR ، Esteban S ، Miralles A ، Tan DX ، Reiter RJ. تقييد الكالسيوم ، ريسفيراترول والميلاتونين: دور SIRT1 وآثاره على الشيخوخة والأمراض ذات الصلة. التنمية الميكانيكية للشيخوخة. 2015 ؛ 146 - 148: 28 - 41.

2. كولمان آر جيه ، بيسلي TM ، كيمنتس جي دبليو ، جونسون إس سي ، وايندروش آر ، أندرسون آر إم. يقلل تقييد السعرات الحرارية من الوفيات المرتبطة بالعمر وجميع الأسباب في قرود الريسوس. نات كومون. 2014 ؛ 5:3557.

3. Sohal RS ، Weindruch R. الإجهاد التأكسدي ، تقييد السعرات الحرارية ، والشيخوخة. علوم. 1996 ؛ 273: 59-63.

4. Testa G ، Biasi F ، Poli G ، Chiarpotto E. تقييد السعرات الحرارية ومحاكاة تقييد النظام الغذائي: استراتيجية لتحسين الشيخوخة الصحية وطول العمر. ديس فارم بالعملة. 2014 ؛ 20: 2950 - 77.

5. لين إم إيه ، روث جي إس ، إنجرام دي كيه. مقلدات تقييد السعرات الحرارية: نهج جديد لعلم الشيخوخة البيولوجي. طرق Mol Biol. 2007 ؛ 371: 143-9.

6. Baur JA و Pearson KJ و Price NL و Jamieson HA و Lerin C و Kalra A و Prabhu VV و Allard JS و Lopez-Lluch G و Lewis K و Pistell PJ و Poosala S و Becker KG وآخرون. يحسن ريسفيراترول صحة الفئران وبقائها على قيد الحياة عند اتباع نظام غذائي عالي السعرات الحرارية. طبيعة. 2006 ؛ 444: 337–42.

7. Lagouge M، Argmann C، Gerhart-Hines Z، Meziane H، Lerin C، Daussin F، Messadeq N، Milne J، Lambert P، Elliott P، Geny B، Laakso M، Puigserver P، et al. يحسن ريسفيراترول وظيفة الميتوكوندريا ويحمي من أمراض التمثيل الغذائي عن طريق تنشيط SIRT1 و PGC -1 alpha. خلية. 2006 ؛ 127: 1109 - 22.

8. Howitz KT، Bitterman KJ، Cohen HY، Lamming DW، Lavu S، Wood JG، Zipkin RE، Chung P، Kisielewski A، Zhang LL، Scherer B، Sinclair DA. تعمل المنشطات الجزيئية الصغيرة من السرتوينات على إطالة عمر الخميرة. طبيعة. 2003 ؛ 425: 191-6.

9. Kwon HS، Ott M. صعود وهبوط SIRT1. اتجاهات علوم الكيمياء الحيوية. 2008 ؛ 33: 517-25.

10. بروكس سي إل ، جو دبليو كيف يؤثر SIRT1 على التمثيل الغذائي والشيخوخة والسرطان؟ نات ريف السرطان. 2009 ؛ 9: 123-8.

11. هارمان D. نظرية الجذور الحرة للشيخوخة. مؤتة إعادة. 1992 ؛ 275: 257 - 66.

12. Mayo JC، Tan DX، Sainz RM، Lopez-Burillo S، Reiter RJ. الضرر التأكسدي للكاتلاز الناجم عن جذور البيروكسيل: حماية وظيفية بواسطة الميلاتونين ومضادات الأكسدة الأخرى. الدقة الراديكالية الحرة. 2003 ؛ 37: 543-53.

13. Hubackova S و Krejcikova K و Bartek J و Hodny Z. IL 1- وإشارات TGF -Nox4 والإجهاد التأكسدي والاستجابة لتلف الحمض النووي هي سمات مشتركة لشيخوخة Bystander Bystander التكراري والناجم عن الأورام والمستحثة بالأدوية ". الشيخوخة (ألباني نيويورك). 2012 ؛ 4: 932–51. https: // doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X و Zuo P و Zhang Q و Li X و Hu Y و Long J و Packer L و Liu J. يؤدي التعرض الجهازي المزمن D-galactose إلى فقدان الذاكرة والتنكس العصبي والتلف التأكسدي في الفئران: التأثيرات الوقائية لـ R {{ 2}} حمض ليبويك. الدقة J Neurosci. 2006 ؛ 84: 647–54.

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950