توزيع مميز للعامل المحرض لنقص الأكسجة -1 في الخلايا الأنبوبية الكلوية المزروعة بنقص انسياب الدم المحاكى عن طريق وضع الغطاء

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

توموكو هوندا¹| يوسوكي هيراكاوا¹ | Kiichi Mizukami²| توشيتادا يوشيهارا²| تيتسوهيرو تاناكا¹| سيجي توبيتا²| ماساومي نانجاكو

الملخص

يلعب نقص الأكسجة المزمن في النبيبات الكلوية دورًا رئيسيًا في تطور الحالة المزمنةالكلىمرض(كد). لذلك من المهم التحقيق في نقص الأكسجة الأنبوبي ونشاط العامل المحرض لنقص الأكسجة (HIF) -1 استجابة لنقص الأكسجة. يؤدي تخلخل الشعيرات الدموية حول الأنبوب إلى نقص انسياب الدم في CKD ؛ ومع ذلك ، نادرًا ما تم التحقيق في تأثير نقص انسياب الدم على HIFs. تسببنا في نقص انسياب الدم الناجم عن وضع ساترة في الإنسانالكلى-2 من الخلايا ولاحظوا تدرجًا للأكسجين تحت الغطاء. أظهرت الكيمياء المناعية لـ HIF -1 تشكيلًا على شكل كعكة دائرية على حافة منطقة إيجابية بيمونيدازول ، والتي أطلقنا عليها اسم "حلقة HIF". تم تقدير توتر الأكسجين في حلقة HIF بين حوالي 4 مم زئبق و 20 مم زئبق. لم تكن هذه النتيجة متوافقة مع نتائج الأبحاث السابقة التي أظهرت تراكم HIF -1 في نطاق نقص الأكسجين مع توتر الأكسجين المتجانس. لاحظنا أيضًا وجود تدرج الأس الهيدروجيني تحت غطاء ، بالإضافة إلى تحول في حلقة HIF بسبب التغيرات في الرقم الهيدروجيني لوسط الثقافة ، مما يشير إلى أن حلقة HIF قد تشكلت عن طريق قمع HIF -1 المرتبط إلى درجة حموضة منخفضة. أظهر هذا البحث أن تنشيط HIF -1 يحاكي الحالة الفسيولوجية في الخلايا المزروعة المصابة بنقص انسياب الدم.

الكلمات الدالةنقص تدفق الدم ، نقص الأكسجة ، العامل المحرض لنقص الأكسجة ، تدرج الأكسجين ، الرقم الهيدروجيني

سيستانش هيربايمنع أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

1|المقدمة

الاصابة المزمنةالكلىمرض(كد) يتزايد في جميع أنحاء العالم مع تقدم العمر في المجتمعات (Tonelli & Riella ، 2014). تطور مرض الكلى المزمن لا رجعة فيه بمجرد أن يصل الضرر الكلوي إلى درجة معينة وينتج عنه في النهاية مرض الكلى في نهاية المرحلة (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) ، بغض النظر عن المرض الأساسي. يشير هذا الناتج إلى وجود "مسار مشترك نهائي". وفقًا للتحليلات المرضية السابقة ، يرتبط الانخفاض في وظائف الكلى ارتباطًا وثيقًا بالضرر الأنبوبي الخلالي أكثر من الضرر الكبيبي. كانت هناك العديد من التقارير التي توضح أن التليف الكلوي يؤدي إلى نقص الأكسجة المزمن في tubulointerstitium ، ونقص الأكسجة الأنبوبي الخلالي يؤدي إلى تفاقم CKD ويؤدي إلى الداء الكلوي بمراحله الأخيرة. يشير هذا الدليل إلى أن نقص الأكسجة الأنبوبي الخلالي يلعب دورًا في المسار المشترك النهائي لمرض الكلى المزمن (Mimura & Nangaku ، 2010 ؛ Nangaku ، 2006). الالكلىشديد التأثر بنقص الأكسجة بسبب ارتفاع الطلب على الأكسجين ، ووجود تحويلة أكسجين بين الشرايين والأوردة داخل الكلى (Nangaku ، 2006 ؛ Welch et al. ، 2001 ؛ Zhang et al. ، 2014). لذلك ، نعتبر أنه من الضروري التحقيق في نقص الأكسجة والاستجابة لنقص الأكسجة في الأنابيب الكلوية البينية.

تحدث الاستجابة البيولوجية الأولية لنقص الأكسجة في الكائنات الحية عبر مسار العامل المحرض لنقص الأكسجة (Hypoxia، 2011؛ ​​Semenza & Wang، 1992؛ Zhou et al.، 2003). يتكون HIF من - و - الوحدات الفرعية. على الرغم من أن -الوحدة الفرعية نشطة بشكل أساسي ، إلا أن -الوحدة الفرعية تتدهور في وجود الأكسجين. في ظل الظروف السامة ، يتم هيدروكسيل HIF- بواسطة مجال هيدروكسيلاز البرولايل (Ph.D.) ، مما يجعله معروفًا بواسطة مثبط الورم von Hippel-Lindau (VHL). ينتج عن هذا التعرف انتشار وتدهور الهيدروكسيل HIF- في البروتيازوم. في ظل ظروف نقص الأكسجين ، يتراكم HIF- في العصارة الخلوية ، لأن HIF غير الهيدروكسيل - يفلت من التدهور. يتم نقل HIF المتراكم من العصارة الخلوية إلى النواة ، حيث يتضاءل مع HIF- ، ويعمل كعامل نسخ ، مما يعزز التعبير عن جينات المصب. من بين الأشكال الإسوية الثلاثة المحددة للوحدات الفرعية HIF - HIF -1 ، و HIF -2 ، و HIF -3 - من المعروف أن الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية تعبر عن HIF -1 (تاناكا وآخرون . ، 2016). أظهرت الدراسات السابقة تراكمًا عابرًا أو إقليميًا لـ HIF فيالكلىمع CKD (Goldfarb et al. ، 2006 ؛ Yu et al. ، 2012) ، ويتم تنشيط HIF في توتر الأكسجين المنخفض في بيئة CKD. قد يكون سبب سوء التكيف مع نقص الأكسجة في مرض الكلى المزمن هو وجود العوامل التي تثبط مسارات HIF (Asai et al. ، 2016 ؛ Tanaka et al. ، 2013 ؛ Thangarajah et al. ، 2009). تم الإبلاغ عن التأثيرات الوقائية لتنشيط HIF في العديد من النماذج الحيوانية ، بما في ذلك الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها الستربتوزوتوسين و 5/6 جرذان استئصال الكلية (Deng et al. ، 2010 ؛ Nordquist et al. ، 2015). دكتوراه. مثبطات جذبت الانتباه مؤخرًا كنهج علاجي جديد لفقر الدم الكلوي في المرضى الذين يعانون من CKD (Akizawa et al. ، 2019 ؛ Chen et al. ، 2017 ، 2019 ؛ Coyne et al. ، 2017 ؛ Miyata et al. ، 2011 ؛ Pergola et al. . ، 2016 ؛ Provenzano et al. ، 2016). ومع ذلك ، فإن تفاصيل تطور نقص الأكسجة الكلوي ، والطريقة التي يحدث بها تراكم HIF فيالكلىمع CKD ، تظل غامضة. يحدث تفاعل الهيدروكسيل المعتمد على الأكسجين لـ HIF في العصارة الخلوية ، وبالتالي من المهم قياس توتر الأكسجين داخل الخلايا وخارجها. هناك العديد من الطرق المستخدمة لقياس توتر الأكسجين ، بما في ذلك استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة أو التصوير بالرنين المغناطيسي المعتمد على مستوى الأكسجين في الدم (BOLD-MRI). استخدمنا التصوير المجهري الفسفوري (PLIM) للقياس الكمي لحالة الأكسجين داخل الخلايا (Hirakawa et al. ، 2017 ؛ Yoshihara et al. ، 2015). BTPDM1 هي صبغة فسفورية تعتمد على مركب الإيريديوم (III) BTP ، (bp) 2Ir (acc) (bp=benzoate-pyridine ، aac=acetylacetone) مع مجموعة dimethylamino كاتيونية ، وهي سلبية موزعة في الجسيمات داخل الخلايا. تم تصنيعه كمسبار فوسفوري حديث لقياس ضغط الأكسجين داخل الخلايا (Yoshihara et al. ، 2015). مكّن PLIM مع BTPDM1 من الحصول على صور عالية الدقة للضغط الجزئي للأكسجين في الخلايا الأنبوبية الكلوية على السطح الكلوي للفئران العادية ، مما يوفر بيانات تشير إلى وجود تدرج أكسجين ، حتى في الكلى الطبيعية (Hirakawa et al. ، 2018 ).

هناك تدرجات أكسجين في الأعضاء الحية ، بما في ذلكالكلى، حتى في ظل الظروف العادية (Hirakawa et al. ، 2018 ؛ Kietzmann ، 2017 ؛ Zhdanov et al. ، 2015) ، وبالتالي يمكن أيضًا توقع مثل هذه التدرجات في CKD. يحدث نقص انسياب الدم بسبب خلخلة الأوعية الدموية الدقيقة في مرض الكلى المزمن ، حيث تؤدي الإصابة الكبيبية التدريجية إلى انخفاض في تدفق الدم حول الأنبوب الشعري ، مما يؤدي إلى تفاقم التليف الخلالي. يؤدي التليف الخلالي إلى إعاقة انتشار وتزويد الخلايا الأنبوبية بالأكسجين ، ويؤدي إلى تخلخل الأوعية الدموية الدقيقة ، مما يؤدي إلى تفاقم نقص الأكسجة الأنبوبي الخلالي (Mimura & Nangaku ، 2010 ؛ Nangaku ، 2006). ومع ذلك ، تظل التأثيرات البيولوجية لنقص تدفق الدم غامضة ، لأن معظم الدراسات قد بحثت في تأثيرات نقص الأكسجة و HIF -1 على الخلايا المستنبتة في ظل ظروف التروية المتجانسة وتوتر الأكسجين (Rexius-Hall et al. ، 2017). أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا المستنبتة أحادية الطبقة المغطاة بغطاء يوفر نموذجًا جيدًا لنقص التروية الناجم عن حاجز للانتشار في وسط الثقافة. يرتبط نقص تدفق الدم النموذجي بتدرج أكسجين لأن الغطاء يمنع انتشار الأكسجين من أعلى الوسط إلى الخلايا (Pitts & Toombs، 2004؛ Takahashi & Sato، 2010؛ Yoshihara et al.، 2015). في طبقة أحادية من الخلايا المستزرعة مغطاة بغطاء ، ينخفض ​​توتر الأكسجين داخل الخلايا بمسافة من حافة الغطاء بسبب انتشار الأكسجين المحدود في الخلايا المستزرعة. نتيجة لذلك ، يتم تكوين تدرج أكسجين من الحافة إلى مركز الغطاء ، وقد ينخفض ​​توتر الأكسجين داخل الخلايا إلى نطاق نقص الأكسجين في وسط الغطاء (تاكاهاشي وساتو ، 2010 ؛ يوشيهارا وآخرون ، 2015) . في الدراسة الحالية ، ركزنا على تنشيط HIF وفحصنا ما إذا كان هناك تغيير مستقل عن الأكسجين في تعبير HIF في وجود نقص انسياب الدم مع تدرج أكسجين. نظرًا لوجود نقص انسياب الدم مع تدرج أكسجين في الأنابيب الكلوية في الجسم الحي ، فإن ملاحظة التأثيرات المستقلة عن الأكسجين على تعبير HIF- في نموذج ساترة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول عدم كفاية الآلية الكامنة لتراكم HIF- في CKD.

استخراج cistancheللكلى

2|المواد والأساليب

2.1|زراعة الخلايا

تم تحضين الخلايا المستنبتة في حاضنة مرطبة بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم إجراء حضانة نقص الأكسجين في حاضنة CO2 / غازات متعددة APM -30 D (Astec). تم إحداث Anoxia باستخدام كيس anoxia ، و AnaeroPack ، ومجموعات الزراعة اللاهوائية #A -13 (Mitsubishi Gas Chemical).

خلايا HK -2 (الإنسان العاقل ، الإنسانالكلى، ذكر ، CRL - 2190 ، ATCC ، RRID: CVCL _0302) ، سلالة خلوية نبيبية قريبة خالدة من كلى بشري بالغ ، تمت تربيتها في خليط متوسط ​​/ مغذيات من Dulbecco معدّل F {{2} } Ham (DMEM / F12) (D8062 ، Sigma Aldrich) يحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) (F7524 ، Sigma Aldrich) ، ومحلول البنسلين الستربتومايسين (15070063 ، Thermo Fisher Scientific) في طبق ثقافة 10 سم. للمرور ، تم فصل خلايا HK -2 مع التربسين (204-16935 ، Wako Pure Chemical Industries، Ltd.) وطردها عند 300 جم لمدة 5 دقائق.

هيلا خلايا سرطان عنق الرحم والجنين البشريالكلىتمت زراعة الخلايا 293 (HEK293) في DMEM باستخدام جلوكوز منخفض (1000 مجم / لتر) (D6046 ، Sigma Aldrich) يحتوي على 5 بالمائة FBS في طبق ثقافة 10 سم. تم تمرير هذه الخلايا كخلايا HK -2.

تمت المحافظة على الخلايا الظهارية للنبيبات القريبة الكلوية (RPTECs) (CC - 2553 ، Cambrex) باستخدام مجموعات RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025 ، Lonza Ltd.). بالنسبة للمرور ، تم فصل RPTECs باستخدام التربسين ، وتحييدها باستخدام محلول تحييد التربسين (CC -5002 ، Lonza Ltd.) ، وطردها عند 200 جم لمدة 5 دقائق.

2.2|إنشاء نموذج نقص انسياب الدم عن طريق وضع ساترة

تم تنظيف الأغطية المستديرة الشكل بقطر 15 مم (C015001 ، ماتسونامي) باستخدام الموجات فوق الصوتية وتخزينها في 99.5 بالمائة من الإيثانول قبل الاستخدام. تم استخدام طريقتين ، بناءً على مراقبة الخلايا خارج الغطاء.

كانت الخلايا المستنبتة أحادية الطبقة محصورة بين ساترة وقاع طبق (الشكل S1 أ ، ب) ، أو طريقة بديلة (الشكل S1c) ، كما هو موضح أدناه. تم اختيار الطريقة التقليدية أو البديلة لإنشاء نموذج ساترة للتصوير الحي ، سواء كان تصوير الأكسجين أو تصوير PH. بالنسبة للكيمياء الخلوية المناعية (ICC) ، تم اختيار الطريقة البديلة ، لأنه عند استخدام الطريقة التقليدية ، غالبًا ما يتم فصل غالبية الخلايا عن قاع الطبق أثناء إزالة ساترة لتثبيت الخلية (الشكل S2a).

2.2.1|الطريقة التقليدية

في اليوم الأول ، تم وضع الخلايا في قاع طبق زجاجي مقاس 27 مم (3910-035 ، إيواكي) عند التقاء 1 0 0 بالمائة * (حوالي 5.0 × 105 / طبق). تم تربيتها في DMEM / F12 تحتوي على 10 بالمائة من FBS بدون محلول مضاد حيوي طوال الليل. في اليوم الثاني ، تم وضع ساترة فوق الخلايا المستنبتة للفترة المشار إليها (الشكل S1b).

2.2.2|طريقة بديلة

تم زرع الخلايا على ساترة في طبق ثقافة 35 ملم عند التقاء 1 0 0 بالمائة (حوالي 5.0 × 105 / طبق) في اليوم.

1. تم تربيتها في DMEM / F12 تحتوي على 10 بالمائة من FBS بدون محلول مضاد حيوي طوال الليل. في اليوم الثاني ، تم قلب الغطاء ، لإرفاق سطح خلاياه بأسفل طبق زجاجي جديد بقطر 27 مم لفترة محددة (الشكل S1c).

أنشأنا أيضًا نموذجًا ساترة باستخدام أغطية مستديرة الشكل بقطر 10 ملم (CS01005 ، ماتسونامي) (الشكل S2b).

2.3|تصوير الأكسجين الحي باستخدام BTPDM1

تم تحضير الخلايا المزروعة في اليوم الأول ، كما هو موضح أعلاه. في اليوم الثاني ، تم شطف الخلايا مرتين بمحلول الملح المتوازن (HBSS) (H8264 ، Sigma Aldrich) واحتضانها بـ 500 نانومتر BTPDM1 ، وهي صبغة محبة للدهون قائمة على الإيريديوم تستخدم كمسبار فسفوري داخل الخلايا (Yoshihara et al. ، 2015) ، في DMEM / F12 بدون أحمر الفينول (21041-025 ، Thermo Fisher Scientific) لمدة 30 دقيقة. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS ، تم حصرها بين ساترة وقاع طبق ، كما هو موضح أعلاه. لوحظت شدة الفسفرة من BTPDM1 في الخلايا المستنبتة المغطاة بغطاء ساترة باستخدام مرشح الإثارة والانبعاثات ، وتم اكتشاف الفسفرة BTPDM1 (Hirakawa et al. ، 2015) باستخدام مجهر مضان ، BZ-X710 (شركة Keyence). تم تعديل الصور التي تم الحصول عليها من مجهر الفلورسنت المقلوب من أجل السطوع والتباين باستخدام برنامج تحليل BZ-X.

2.4|كيمياء الخلايا المناعية

تمت زراعة الخلايا الموجودة على ساترة باستخدام 200 ميكرومتر من pimonidazole HCl (HP 3-100 ، Hypoxyprobe ، Inc.) في DMEM / F12 بدون الفينول الأحمر لمدة ساعة واحدة ، وبعد ذلك تم قلب الغطاء وإرفاقه بطبق زجاجي ، مثل الموصوفة سابقا. ثم تمت زراعة الخلايا في DMEM / F12 بدون أحمر الفينول لفترة محددة. عندما لم يتم استخدام تلطيخ pimonidazole ، تم حذف المعالجة المسبقة ب pimonidazole.

بعد الانتهاء من فترة الثقافة ، تم جمع كل غطاء ، وتم تثبيت الخلايا على الفور بالميثانول / الأسيتون (1: 1) على الجليد ، حيث بقيت لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل مرتين بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) من Dulbecco (D5652 ، Sigma Aldrich) ، تم نفاذ غشاء الخلية لمدة 30 دقيقة ، واحتضانه بنسبة 5 بالمائة من ألبومين المصل البقري (BSA) (A3059 ، Sigma Aldrich) لمدة 30 دقيقة ، وبعد ذلك مع كتلة بروتين خالية من المصل (X0909 ، DAKO) لمدة 10 دقائق. كانت الخلايا ملطخة بالجسم المضاد الأول وبعد ذلك بجسم مضاد فلوريسنت ثان. ترد قائمة الأجسام المضادة الأولى في الجدول S1. تم استخدام الغلوبولين المناعي المضاد للأرانب FITC-swine (F0205 ، التخفيف 1:20 ، DAKO) كأول جسم مضاد إذا كان المضيف أرنبًا. تم استخدام الجسم المضاد الفلوريسنت Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227 ، التخفيف 1: 500 ، Thermo Fisher Scientific) كأول جسم مضاد إذا كان المضيف عبارة عن فأر ، متبوعًا بـ IgG المضاد الحيوي للفأر (H plus L) (BA {{23} } ، تخفيف 1: 1000 ، Vector Laboratories) ، باعتباره الجسم المضاد الثاني. تم إجراء تلطيخ نووي باستخدام ثنائي بنزيميد H 33342 ثلاثي هيدروكلوريد (B2261 ، سيجما ألدريتش) لكل عينة.

تمت ملاحظة إشارات الفلورسنت باستخدام مجهر فلورسنت مقلوب ، BZ-X710 (شركة Keyence) مع المرشحات التالية: Texas Red مع طول موجة إثارة (Ex) يبلغ 560/40 نانومتر ، وطول موجة انبعاث (Em) يبلغ 630/75 نانومتر ، GFP ( مثال: 470/40 نانومتر ، Em: 525/50 نانومتر) ، و DAPI (على سبيل المثال: 360/40 نانومتر ، Em: 460/50 نانومتر). تم تعديل الصور للسطوع والتباين باستخدام برنامج تحليل BZ-X.

2.5|ICC of HIF of HK -2 الخلايا المعالجة بكلوريد الكوبالت

تم تعديل الطريقة البديلة لإنتاج نموذج ساترة من خلايا HK {{0} المعالجة بكلوريد الكوبالت. تم زرع خلايا HK -2 بكثافة نصف متكدسة (2.5 × 105 / طبق) على ساترة في اليوم الأول ومعالجتها بـ 300 ميكرومتر من كلوريد الكوبالت هيكساهيدرات (C 8661 ، سيجما ألدريتش) لمدة 16 ساعة على اليوم الثاني: في اليوم الثالث ، تم قلب الغطاء لربط أسطح الخلية بأسفل طبق زجاجي جديد بقطر 27 ملم لمدة 3 ساعات ، وتم إجراء ICC لـ HIF.

2.6|النشاف الغربي

للتحقيق في تراكم HIF {0} تحت توترات أكسجين مختلفة ومستويات مختلفة من الأس الهيدروجيني ، 1. 0 × 1 0 6 HK -2 طبق استنبات 10 سم تم تحضينها إما تحت إشعاع عادي ، أو 2 في المائة من الأكسجين ، أو 1 في المائة من الأكسجين ، أو نقص الأكسجين ، لمدة 5 ساعات ، أو في DMEM / F12 عند الرقم الهيدروجيني 7.4 ، أو الرقم الهيدروجيني 6.0 ، أو الرقم الهيدروجيني 5.0 لمدة 5 ساعات.

تم تحليل هذه الخلايا في محلول RIPA يحتوي على 5 0 ملي مولار تريس عازلة (الرقم الهيدروجيني 8. 0) ، 15 0 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0. 5 وزن / حجم بالمائة من الصوديوم ديوكسي - تشولات ، 0.1 وزن / حجم في المائة SDS ، و 1.0 وزن / حجم في المائة NP40.

بالنسبة إلى النشاف الغربي ، يحتوي المخزن المؤقت لعينة SDS على {0}. 35 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 6.8) ، و 1 0 بالمائة SDS ، و 36 بالمائة من الجلسرين ، و 0.012 بالمائة من البروموفينول الأزرق ، و 0.1 مولار ديثيوثريتول تمت إضافة (DTT) إلى البروتينات. تمت إزالة البروتينات المحتوية على محلول SDS المؤقت بالغليان عند 95 درجة لمدة 5 دقائق.

تم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي على 1 0 بالمائة من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد. تم بعد ذلك نقل البروتينات إلى غشاء Amersham TM Hybond TM PVDF (10600023 ، GE Healthcare) في المخزن المؤقت للنقل (48 ملي مولار Tris-base buffer و 39 ملي جليسين و 0.04 بالمائة SDS و 20 v / v بالمائة ميثانول) باستخدام Trans-Blot® نظام النقل TurboTM (Bio-Rad). تم تحضين الأغشية في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الأولية ، والجسم المضاد لـ HIF1 (NB 100-134 ، والتخفيف 1: 500 ، و Novus Biologicals ، و RRID: AB _350071) ، والجسم المضاد للأكتين (A2066) ، تخفيف 1: 2000 ، سيجما ألدريتش ، RRID: AB _476693) ، وبعد ذلك في الجسم المضاد الثانوي ، الغلوبولين المناعي المضاد للأرنب الماعز متعدد الأضلاع / HRP (P0448 ، تخفيف 1: 10000 ، DAKO ، RRID: AB {{26) }}). تم استخدام الركيزة النشاف الغربية PierceTM ECL Plus (32132 ، ThermoFisher Scientific) للكشف. لوحظ التلألؤ الكيميائي باستخدام محلل Luminoimage ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). تم تأكيد قابلية التكاثر بإجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تم قياس شدة النطاقات باستخدام برنامج المعاهد الوطنية للصحة ImageJ (شنايدر وآخرون ، 2012).

2.7|فحص مراسل Luciferase

تم إجراء اختبار مراسل لوسيفيراز لقياس تراكم HIF1 في حضانة ثقافة نقص الأكسجة المتجانسة. لقد قمنا سابقًا ببناء جين لوسيفيراز الموسوم مدفوعًا بعنصر مستجيب لنقص الأكسجة (HRE) وطورنا ناقل مراسل Hypoxia-Responsive Reporter Vector (إنشاء التحوير الجيني). تم إنشاء هذا من نسخ ترادفية من التربية على حقوق الإنسان من جين عامل النمو البطاني الوعائي للجرذان الفرعي المستنسخ في المنطقة 5 'من وحدة نسخ am CMV-المروج-لوسيفيراز (ما قبل Luc) (Chiang et al. ، 2011 ؛ Tanaka et آل ، 2004).

تم تحضير خلايا HK {0} بتركيز 1.0 × 105 لكل بئر في 12- ألواح استنبات جيد (150628 ، Thermo Fisher Scientific). تم نقل الخلايا بشكل مشترك باستخدام 500 نانوغرام من نواقل pGL 3- الأساسية HRE-luciferase و 30 نانوغرام من متجهات التحكم pRL-SV40 Renilla luciferase (Promega) ، باستخدام 2 ميكرولتر FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311 ، Promega) لكل نحن سوف. تم استخدام خلايا HK -2 التي تم نقلها بشكل مشترك مع 500 نانوغرام ofpGL 3- نواقل luciferase الأساسية ذبابة اليراع و 30 نانوغرام من ناقلات التحكم pRL-SV40 Renilla luciferase (Promega) كعنصر تحكم سلبي.

تم تحضين الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة تحت نورموكسيا ، 2 في المائة نقص الأكسجة ، 1 في المائة نقص الأكسجة ، أو كيس نقص الأكسجين ، لمدة 5 ساعات. ثم تم حصاد الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين السلبي ، لمقايسة لوسيفيراز المزدوج. تم استخدام مقياس الإضاءة LB9507 (EG و Berthold) للقياسات. لتصحيح كفاءة تعداء العدوى ، تم تقسيم القيمة النسبية لوحدة ضوء luciferase اليراع على قيمة Renilla luciferase.

cistanche لـ ed

2.8|تحليل موت الخلايا المبرمج

تمت تغطية الخلايا المزروعة بغطاء لمدة 0 دقيقة ، و 15 دقيقة ، و 30 دقيقة ، و 1 ساعة ، و 3 ساعات ، و 6 ساعات ، و 24 ساعة ، ثم تم جمعها باستخدام التربسين. تم تحضير الخلايا المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3 في المائة (081- 04215 ، Wako Pure Chemical Industries، Ltd.) لمدة 30 دقيقة كعنصر تحكم في موت الخلايا المبرمج. تم إجراء التحليل الكمي لموت الخلايا المبرمج باستخدام Muse Annexin V و Dead Cell Kits (MCH100105 ، Millipore) في محلل الخلايا Muse ™ (Millipore) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

2.9|PCR في الوقت الحقيقي الكمي (qRT-PCR)

تم إجراء الاستخراج الكلي للحمض النووي الريبي وتوليف (كدنا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لـ RNAiso Plus (9109 ، Takara) و PrimeScript ™ RT Master Mix (RR036B ، الوقت الحقيقي المثالي) (Takara) على التوالي. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS - 201 ، Toyobo) في CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). تم تطبيع مستويات النسخ إلى مستوى تعبير -actin mRNA. تم إجراء qRT-PCR في ثلاث نسخ باستخدام بادئات خاصة بالجينات. تم تضخيم HIF -1 باستخدام البادئات الأمامية ، 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC -3 ′ والعكس ، 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC -3. تم تضخيم -actin باستخدام بادئات أمامية 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG -3 وعكس 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG -3.

2.10|تعداء مع سيرنا

للتحقيق في ضربة قاضية HIF المستحثة بـ RNAi -1 في خلايا HK -2 ، تم تحضير 5. 0 × 104 هونج كونج -2 خلايا لكل بئر في ستة أطباق. تم استخدام نوعين من RNAi - HIF -1 siRNA (siHIF -1 # 1 [HSS104774، Thermo Fisher Scientific] و siHIF -1 # 2 [HSS104775، ThermoFisher Scientific]) - مع Lipofectamine RNAiMAX كاشف تعداء (Thermo Fisher Scientific). كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام Stealth RNAi ™ siRNA Negative Control Med GC Duplex # 3 (12935-113) ؛ تم خلط 1.5 ميكرولتر من كل siRNA و 5 ميكرولتر من RNAiMAX. تم تحضين الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة عبر siRNA تحت ظروف طبيعية أو ناقصة الأكسجة (1 في المائة O2) لمدة 48 ساعة وتم استخراج الحمض النووي الريبي. تم فحص كفاءة ضربة قاضية HIF -1 باستخدام qRT-PCR.

2.11|التصوير الحي لتأثيرات تدرج الحموضة

تصورنا تدرج الأس الهيدروجيني داخل الخلايا للخلايا الحية تحت غطاء. عولجت الخلايا بمؤشر الأس الهيدروجيني pHrodo Green AM داخل الخلايا (p35373 ، ThermoFisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ، قبل تنفيذ نموذج ساترة. تم استخدام مجهر مضان مقلوب ، BZ-X710 (شركة Keyence) مع مرشح GFP لمراقبة الانتقال الزمني لتدرج كثافة التألق تحت غطاء ساترة.

2.12|التحليل الكمي لحلقة HIF

2.12.1|موقع حلقة HIF

قمنا بقياس مسافة حلقات HIF ومناطق إيجابية pimonidazole من حواف ساترة باستخدام ImageJ ، على النحو التالي. تم تحديد مناطق الدوائر الخارجية والداخلية لحلقة HIF ودائرة موجبة pimonidazole ، وتم حساب نصف قطر كل دائرة. تم طرح كل قيمة من 7.5 مم ، وهو نصف قطر غطاء 15 مم ، لحساب المسافة من حافة ساترة. تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة لـ ICC لـ HIF في كل حالة.

2.12.2|تعريف خاتم HIF

استخدمنا الصور الفلورية التي تم الحصول عليها من نموذج ساترة حضنت تحت نورموكسيا ودرجة الحموضة المحايدة. حددنا موقع حلقة HIF وخارجه وداخله على أنه 2.5-3. 0 مقياس (0. 22 - 0. 45 ملم) ، 0. 5 –1. 0 مقياس (1.12-1.35 مم) ، و 5. 0 - 5.5 مقياس (2.24-2.47 مم) من حافة ساترة ، على التوالي ، باستخدام ImageJ. قمنا بقياس خمسة مواقع لإشارات HIF -1 لكل عينة وحساب المتوسط. تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة لـ ICC of HIF.

مسحوق استخراج cistanche

2.13|قياس ضغط الأكسجين بواسطة صورة PLIM

2.13.1|انشاء خط معايرة لقياس ضغط الاكسجين

تم إجراء منحنى معايرة لخلايا HK {0}} ، بناءً على الطريقة الموضحة في تقريرنا السابق (Yoshihara et al. ، 2015). تم زرع خلايا HK -2 المحملة بـ 500 نانومتر BTPDM1 لمدة 30 دقيقة في حاضنة غازات متعددة قابلة للتغيير بتركيز الأكسجين ومجهزة بمجهر فلورسنت مقلوب تم توصيله بنظام قياس العمر. تم إنشاء خط معايرة على أساس تحليلات ستيرن-فولمر باستخدام عمر الفسفور (PL) لخلايا HK -2 تحت العديد من التوترات الأكسجين المختلفة باستخدام

المعادلة (1)

حيث τp تمثل PL في pO2 ، τ 0 تمثل PL في إزالة الأكسجين ، kq تمثل ثابت معدل التبريد ، و pO2 تمثل الضغط الجزئي للأكسجين. باستخدام خط المعايرة هذا ، يمكن حساب ضغط الأكسجين من PL.

2.13.2|صورة PLIM لنموذج ساترة

تم تحضير خلايا HK -2 المحملة بـ 500 نانومتر BTPDM1 لمدة 30 دقيقة. تم بناء وتربية نموذج ساترة في حاضنة غاز متعددة قابلة للتغيير بتركيز O2 ومجهزة بمجهر فلورسنت مقلوب ، متصل بنظام قياس العمر.

تم تسجيل صور الفحص المجهري للتصوير الفسفوري مدى الحياة (PLIM) باستخدام نطاق دقيق مضان مقلوب مزود بنظام مسح متحد البؤر (Hirakawa et al. ، 2018). تم الحصول على صور PLIM بعد 30 دقيقة من الحضانة في 21 بالمائة O2 أو 4 بالمائة O2. تم التقاط أربع صور PLIM لكل عينة ، من المناطق العلوية والسفلية واليسرى واليمنى بالقرب من حافة ساترة ، لتحديد متوسط ​​PL ، مع مراعاة التباين في PLs في ساترة.

2.13.3|تحديد حلقة HIF في صورة PLIM

كان Pimonidazole موجبًا أقل من 10 مم زئبق من ضغط الأكسجين. كان PL المكافئ لـ 10 مم زئبق من ضغط الأكسجين 4034.6 نانوثانية ، وفقًا لخط المعايرة ، لذلك يمكن تحديد الخط الخارجي لدائرة بيمونيدازول في صورة PLIM. بعد ذلك ، يمكن العثور على مواقع حلقات HIF الخارجية والداخلية في صورة PLIM باستخدام التحليل الكمي عن بعد. قمنا بقياس نطاق متوسط ​​PLs المكافئ لحلقة HIF في 21 بالمائة O2 و 4 بالمائة O2.

2.13.4|قياس ضغط الأكسجين في حلقة HIF

حسبنا نطاق ضغط الأكسجين لحلقة HIF من PLs ، باستخدام خط المعايرة. تم تحليل صور PLIM باستخدام SPCImage 5. 0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|تحليل احصائي

تم استخدام اختبار Dunnett لمقارنة المجموعات التجريبية والضابطة ، واعتبرت القيم <.05 للإشارة="" إلى="" فروق="" ذات="" دلالة="" إحصائية.="" تم="" استخدام="" اختبارات="" t="" للطلاب="" لمقارنة="" ثلاث="" مجموعات="" أو="" أكثر="" ،="" وتم="" تطبيق="" القيمة="" p="" المعدلة="" من="" bonferroni.="" تم="" إجراء="" جميع="" التحليلات="" الإحصائية="" باستخدام="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" تم="" افتراض="" أن="" القيم="" مشتقة="" من="" السكان="" الموزعين="" بشكل="" طبيعي="" ،="" ويتم="" عرضها="" على="" أنها="" متوسط="" ​​±="" الانحراف="" المعياري="">

ما هو الكفالة

3|النتائج

3.1|تشكيل التدرج الأوكسجين في نموذج نقص انسياب الدم

لقد أكدنا وجود تدرج أكسجين في نموذج نقص انسياب الدم الناجم عن وضع ساترة من خلال التقييم المباشر لتوتر الأكسجين ، باستخدام الفسفرة. يمكن أن يتنبأ قياس شدة الفسفور بالاتجاه التقريبي لضغط الأكسجين (Hirakawa et al. ، 2015 ؛ Yoshihara et al. ، 2015). لاحظنا كثافة الفسفرة لنموذج ساترة لخلايا HK -2 المعالجة بـ BTPDM1. أظهرت صور كثافة الفسفور نقصًا في الأكسجين في معظم المنطقة داخل الغطاء ، ولكن لا يوجد نقص أكسجين بالقرب من الحافة ، وهي ملاحظة تشير إلى وجود تدرج أكسجين حول حافة الغطاء في خلايا HK -2 المغطاة بقطعة ساترة (الشكل 1 أ). نظرًا لأن شدة الفسفرة تعتمد على تركيز المسبار وعلى وقت الاستدعاء ، فإن قياس عمر الفسفور (PL) مفيد للتحليل الكمي لضغط الأكسجين (Yoshihara et al. ، 2015). وبالتالي ، من أجل القياس الكمي لتوتر الأكسجين للخلايا المستنبتة حول حافة ساترة ، حصلنا على صور PLIM لخلايا HK {{8} مغطاة بغطاء ساترة لمدة 30 دقيقة (الشكل 1 ب). تمديد PL مع زيادة المسافة من حافة ساترة. أكدنا أن توتر الأكسجين ، المحسوب باستخدام خط المعايرة (الشكل S3) ، انخفض مع زيادة المسافة من حافة الغطاء ، مما يوفر دليلاً على وجود تدرج أكسجين حول حافة الغطاء (الشكل 1 ج). أشار فحص المظهر الجانبي الزمني لشدة الفسفرة إلى أن تدرج الأكسجين بدأ يتشكل بعد 10 دقائق من وضع الغطاء

(الشكل 1 د).

3.2|توزيع HIF فريد -1 في نموذج نقص انسياب الدم ، "حلقة HIF"

لقد فحصنا توزيع HIF -1 في نموذج نقص انسياب الدم مع تدرج أكسجين. أظهرت ICC لـ HIF -1 في خلايا HK -2 تحسينًا على شكل كعكة دائرية على حافة المنطقة الإيجابية للبييمونيدازول ، والتي أطلقنا عليها "حلقة HIF" (الشكل 2 أ). كانت شدة إشارة HIF -1 أعلى بشكل ملحوظ على حلقة HIF عنها في مناطقها الداخلية أو الخارجية (الشكل 2 ب). تم تأكيد هذه الظاهرة باستخدام ICC مع جسم مضاد آخر لـ HIF -1 (الشكل S4a) أو خطوط خلوية أنبوبية أخرى (الشكل S4b ، c). أجرينا أيضًا تحليل ICC لـ HIF -1 في أنواع أخرى من الخلايا المزروعة ، مثل خلايا سرطان عنق الرحم هيلا. على الرغم من صعوبة الالتصاق الضعيف لهذه الخلايا بغطاء ساترة إجراء تقييم مفصل لتوزيع HIF -1 ، فقد لاحظنا تحسينًا على شكل كعكة دائرية لـ HIF -1 في خلايا هيلا (الشكل S4d).

بدأت حلقة HIF ومنطقة pimonidazole الإيجابية في تشكيل عدة ساعات بعد وضع ساترة ، وظهرت حلقة HIF ثابتة بمقدار 3 ساعات (الشكل 2 ج). أدت ضربة قاضية HIF -1 إلى اختفاء إشارة HIF -1 ، بما في ذلك حلقة HIF (الشكل 2 د ، الشكل S4e) ، مما يشير إلى أن حلقة HIF كانت تعتمد على HIF -1.

للتحقيق في احتمال أن يكون تشكيل حلقة HIF يعتمد على الأكسجين ، قمنا بالتحقيق في توزيع HIF -1 في نموذج ساترة تحت الحضانة مع توترات أكسجين مختلفة. وضعنا طبقًا في غرف نقص الأكسجين مع توترات أكسجين مختلفة فورًا بعد عمل نموذج ساترة. أثناء حضانة نقص الأكسجين ، لاحظنا أن كلاً من حلقة HIF والمنطقة الإيجابية للبييمونيدازول يبدو أنهما يتوسعان إلى الخارج (الشكل 3 أ). قمنا بقياس مسافة كل حلقة HIF ومنطقة إيجابية بيمونيدازول من حافة ساترة تحت نورموكسيا ، و 4 بالمائة O2 ، و 1 بالمائة O2 حضانة. توسعت كل من حلقة HIF والمنطقة الإيجابية للبييمونيدازول للخارج حيث انخفض توتر الأكسجين المحيط (الشكل 3 ب). أشارت هذه النتائج إلى أن حلقة HIF كانت تعتمد على HIF -1 وتوتر الأكسجين.

من أجل تأكيد أن التراكم على شكل دونات هو ظاهرة محددة لـ HIF ، أجرينا ICC مع جينات التدبير المنزلي في نموذج ساترة. تم الحفاظ على إشارات GAPDH و actin على كامل مساحة الغطاء وكانت قابلة للمقارنة بين منطقة حلقة HIF والمناطق الأخرى (الشكل S5 أ ، ب).

3.3|قياس نطاق ضغط الأكسجين لحلقة HIF

أكدنا التحسن على شكل حلقة لتراكم HIF -1 في الخلايا المستنبتة المغطاة بغطاء ، وهي ظاهرة تعتمد على توتر الأكسجين. لتحديد نطاق توتر الأكسجين المتضمن ، قمنا بتحليل ضغط الأكسجين في حلقة HIF باستخدام تقنية عمر الفسفور. حصلنا على صور PLIM لنموذج ساترة بعد 3 0 دقيقة من الحضانة في 21 بالمائة O2 أو 4 بالمائة O2 (الشكل 4 أ). تشكلت حلقة HIF على حافة دائرة pimonidazole في المحكمة الجنائية الدولية الخاصة بـ HIF (الشكل 3 ب). حددنا الموقع في صورة PLIM الذي كان مكافئًا للمنطقة الإيجابية للبييمونيدازول في ICC لـ HIF وحددنا لاحقًا الموقع المقابل لحلقة HIF (الشكل 4 ب) ، باستخدام التحليل الكمي لبيانات المسافة من حلقة HIF و منطقة إيجابية بيمونيدازول (الشكل 3 ب). قمنا أيضًا بقياس نطاق PLs لحلقة HIF ثم استخدمنا خط المعايرة (الشكل S3) لحساب ضغط الأكسجين لحلقة HIF بنسبة 21 بالمائة O2 (4.20 [3.46-4.97] ~ 35.9 [28.5-44.9] مم زئبق) ، و 4 بالمائة O2 (2.19 [0.21-4.32] ~ 20.4 [17.1-24.1] مم زئبق) (الشكل 4 ج).

3.4|تراكم HIF -1 تحت ضغط أكسجين متجانس

في حين أن الإشارات الضعيفة لـ HIF -1 خارج حلقة HIF في نموذج ساترة يمكن أن تُعزى إلى نقص الأكسجين غير الكافي ، فإن الإشارات الموجودة داخل الحلقة ، حيث يجب تنشيط HIF -1 بقوة أكبر عن طريق توتر الأكسجين المنخفض ، يجب يتم التحكم فيها عن طريق ظاهرة مستقلة عن الأكسجين. لفحص الظواهر التي تسبب نقصًا في الحد الأقصى لتراكم HIF -1 في منطقة نقص الأكسجين التي تحدث فقط في نموذج نقص تدفق الدم ، قمنا بفحص ما إذا كانت هناك علاقة عكسية بين توتر الأكسجين وتراكم HIF -1 تحت الحضانة مع توتر الأكسجين المتجانس. أظهر تحليل اللطخة الغربية لمحللات الخلية تحت توترات أكسجين متجانسة مختلفة زيادة في تراكم HIF -1 أثناء حضانة نقص الأكسجين (الشكل 5 أ). أشار اختبار مراسل HRE-luciferase أيضًا إلى زيادة تراكم HIF -1 مع انخفاض توتر الأكسجين في ظل ظروف توتر الأكسجين المتجانس (الشكل 5 ب). أشارت هذه النتائج إلى أن تراكم HIF -1 كان معتمدًا على توتر الأكسجين ، مع ملاحظة أقصى تراكم في نطاق نقص الأكسجين. يجب أن تختلف خصائص HIF -1 بين نموذج نقص انسياب الدم ونموذج به توتر أكسجين متجانس. لقد توقعنا أن الظاهرة الفريدة لتراكم HIF -1 في نموذج نقص انسياب الدم قد يتم تحديدها بواسطة عامل آخر غير توتر الأكسجين.

3.5|كان تشكيل حلقة HIF مستقلاً عن درجة الدكتوراه

لقد فحصنا ما إذا كان تدهور HIF -1 ، وهو آلية محتملة لتشكيل حلقة HIF ، قد تم تنظيمه داخل حلقة HIF. بدت هذه الفكرة غير صالحة ، لأن الهيدروكسيل بواسطة الدكتوراه ، وهي عملية تحد من معدل تدهور HIF ، تتطلب الأكسجين كركيزة. يستخدم كلوريد الكوبالت على نطاق واسع كمثبت كيميائي HIF. أنشأنا نموذج ساترة لخلايا HK -2 المعالجة بكلوريد الكوبالت وأجرينا تحليل ICC لـ HIF. لم تزد إشارة HIF -1 داخل حلقة HIF ، والتي أصبحت غير واضحة بسبب زيادة إشارة HIF -1 خارج الحلقة (الشكل 6 ج). أنتجت خلايا ICC الخاصة بخلايا HK -2 مع ضربة قاضية لـ PHD2 ، والتي يُعتقد أنها أول هيدروكسيلاز HIF في تجارب زراعة الخلايا (Strowitzki et al. ، 2019) ، نتائج مماثلة (الشكل S6). أشارت هذه النتائج إلى أن محور PHD-VHL لتدهور HIF لم يكن مرتبطًا بتكوين حلقة HIF.

3.6|تأثير الأس الهيدروجيني على تراكم HIF -1

وصف تقرير سابق استخدام نموذج ساترة لخلايا عضلية القلب التي كان لها انخفاض في درجة الحموضة داخل ساترة (بيتس وتومبس ، 2 0 0 4). لقد بحثنا في الرقم الهيدروجيني تحت غطاء ساترة وتأثيره على تشكيل حلقة HIF. لقد عالجنا خلايا HK -2 بمؤشر الأس الهيدروجيني داخل الخلايا ، حيث تسمح شدة التألق بتقييم الرقم الهيدروجيني في الخلايا. أظهر التصوير الحي أن الرقم الهيدروجيني انخفض على معظم المنطقة الداخلية ، ولكن ليس بالقرب من حافة الغطاء ، مما يشير إلى وجود تدرج درجة الحموضة حول الحافة في نموذج ساترة (الشكل 6 أ). أظهر التحليل الكمي للعلاقة بين كثافة الإسفار والمسافة من حافة ساترة أن الأول كان مرتفعًا مع زيادة المسافة ، وهي ملاحظة دعمت وجود تدرجات الأس الهيدروجيني والأكسجين حول حافة الغطاء (الشكل 6 ب). وجد تحليل اللطخة الغربية لمحلول الخلية تحت تركيزات الأكسجين المتجانسة أن الحضانة مع درجة الحموضة 5.0 المتوسطة المكبوتة HIF -1 - تراكم تحت ظروف نقص الأكسجين (الشكل S7a-d). أكدنا أيضًا أن تراكم HIF -1 في ظل نقص الأكسجة تحت ظروف مختلفة من الأس الهيدروجيني انخفض إلى أقل من الرقم الهيدروجيني 6.0 (الشكل S8a-c).

أكد أحد التقارير على أهمية الظروف الحمضية المعتدلة ، عند درجة حموضة حوالي 6. 0. وفقًا لهذه الدراسة ، أدى إعادة الأكسجة بعد نقص الأكسجة إلى تحمض الوسائط ، مما تسبب في عزل النواة من VHL. بدوره ، تم منع تدهور HIF في الأنبوب العضلي C2C12 ، والخلايا العصبية PC12 ، و 786-0 خلايا سرطان الكلى (Mekhail et al.، 2 0 0 4). في دراستنا ، لم يكن هناك تغيير في توزيع VHL في الخلايا الأنبوبية بين المناطق التي يتراكم فيها HIF -1 وتلك التي تم قمعها ، في نموذج ساترة بقيم الأس الهيدروجيني من 5. 0 إلى 7.4 (الشكل S9a-c). تتعرض الخلايا الأنبوبية لمجموعة واسعة من ظروف الأس الهيدروجيني (Burke et al. ، 1999 ؛ Pavuluri et al. ، 2019 ؛ Raghunand et al. ، 2003) ، لذلك قمنا بالتحقيق في تباين حلقة HIF في وسائط ذات درجة حموضة مختلفة. القيم بين 5.0 و 8.5. لوحظ حلقة HIF بوضوح في وسائل الإعلام مع درجة الحموضة 8.5 و 7.4 (الشكل 6 ج). توجد حلقة HIF أيضًا عند الرقم الهيدروجيني 6.5 ولكن تم حجبها (الشكل 6 ج). تم تخفيف إشارة HIF -1 في كامل منطقة ساترة عند درجة الحموضة 5.0. (الشكل 6 ج). أجرينا مزيدًا من التحليل الكمي للعلاقة الموضعية بين حلقة HIF وحافة المنطقة الإيجابية للبييمونيدازول (الشكل 7 أ) واكتشفنا أن موضع الحلقة يختلف اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني. تميل الدائرة الداخلية إلى التوسع إلى الخارج عند درجة الحموضة 6.5 ، مقارنة مع الرقم الهيدروجيني 7.4 ، بينما تقلصت الدائرة الخارجية بشكل كبير إلى الداخل عند درجة الحموضة 8.5 ، بناءً على حافة المنطقة الإيجابية للبييمونيدازول (الشكل 7 ب ، ج). أكدنا أيضًا أن أنشطة جينات التدبير المنزلي تم الحفاظ عليها في نموذج ساترة تحت الحضانة الحمضية (الشكل S10). لذلك ، يبدو أن الأس الهيدروجيني يلعب دورًا مهمًا في الآلية الكامنة وراء تشكيل حلقة HIF.

4|نقاش

في هذه الدراسة ، حددنا توزيعًا فريدًا لـ HIF -1 في الخلايا الأنبوبية الكلوية ، باستخدام نموذج نقص انسياب الدم الناجم عن وضع ساترة. وجدنا أن تشكيل وصيانة حلقة HIF تم تنظيمهما بواسطة ضغط الأكسجين ودرجة الحموضة ، وكلاهما كان موجودًا في تدرج في حافة ساترة لنموذج ساترة. بناءً على هذه النتائج ، نقترح آلية محتملة لتشكيل حلقة HIF ، تتضمن تراكم HIF -1 مع تناقص توتر الأكسجين ، ويتم قمع التراكم بسبب انخفاض الرقم الهيدروجيني ضمن مسافة معينة من حافة الغطاء (الشكل 8) ).

يحدث نقص انسياب الدم نتيجة خلخلة الأوعية الدموية الدقيقة في مرض الكلى المزمن (Mimura & Nangaku، 2 {{2 0}} 10؛ Nangaku، 2006). في عملنا السابق ، استخدمنا في التصوير الحي لإثبات وجود تدرج أكسجين في الخلايا الأنبوبية الكلوية لكلي الفأر الطبيعي (Hirakawa et al. ، 2018). من المتوقع أيضًا أن يكون توتر الأكسجين غير متجانس في الخلايا الأنبوبية في CKD. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كان وجود نقص تدفق الدم مع تدرج أكسجين يؤثر على نظام الدفاع ضد نقص الأكسجة ، HIF. في هذه الدراسة ، درسنا توزيع HIF في خلايا الأنابيب القريبة المستزرعة تحت نموذج نقص انسياب الدم واكتشفنا أن تدرج الأكسجين في الخلايا الأنبوبية الكلوية المستزرعة قد تم تصميمه بنجاح باستخدام غطاء زجاجي دائري. أشارت الأدلة المستمدة من التجارب التي تستخدم شد الأكسجين المتجانس إلى تراكم HIF -1 ، والذي يعتمد تحليله بالهيدروكسيل وتدهوره اللاحق بشكل أساسي على الأكسجين. هذا هو مقدار HIF -1 يزداد كلما قل توتر الأكسجين. ومع ذلك ، في نموذج ساترة لدينا ، تم قمع HIF -1 في منطقة نقص الأكسجين ولديه أعلى تراكم على مسافة معينة من حافة ساترة. لم يتم عرض تراكم HIF على شكل دونات من قبل. لقد أظهرنا أنه يمكن ملاحظة حركة حلقة HIF بغض النظر عن توتر الأكسجين في الغلاف الجوي المحتضن ، لكن موقعها كان يعتمد على توتر الأكسجين. تم قياس مدى توتر الأكسجين على حلقة HIF عند حوالي 4-20 مم زئبق باستخدام PLIM مع BTPDM1. وجدت معظم الدراسات السابقة ، التي ركزت على الخلايا المستنبتة في جو به توتر أكسجين متجانس ، أن كمية بروتين HIF -1 زادت في نطاقات ناقصة التأكسج أو نقص الأكسجين (Ameri et al.، 2002؛ Carrera et al. ، 2014). وبالتالي ، في نموذجنا ، يجب أن يكون تشكيل حلقة HIF قد تأثر بعامل آخر غير توتر الأكسجين ؛ كانت مستقلة عن درجة الدكتوراه ، وهي عملية تحديد معدل تدهور HIF. كان الاختراق في توضيح آلية تكوين حلقة HIF هو اكتشافنا لدور تدرج الأس الهيدروجيني ، بالإضافة إلى تدرج الأكسجين ، في نموذج غطاء الشفة ، مما حد من تدفق الوسائط المشابهة لنقص تدفق الدم في الجسم الحي نموذج. في نموذج نقص انسياب الدم هذا ، انخفض الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا مع زيادة المسافة من حافة الغطاء المنزلق ، ولوحظ تدرج الأس الهيدروجيني حول حافة الغطاء. لقد أظهرنا أن تراكم HIF -1 قد تم كبته عند درجة حموضة منخفضة ، حوالي pH 5.0 ، مقارنةً بالحضانة عند درجة حموضة محايدة تحت توتر أكسجين متجانس. اتسعت الحافة الخارجية لحلقة HIF للخارج عند الرقم الهيدروجيني 6.5 ، وانكمشت الحافة الداخلية لحلقة HIF للداخل عند درجة الحموضة 8.5 ، بناءً على حافة المنطقة الموجبة للبيمونيدازول. تم حجب حلقة HIF في ظروف حمضية ، واختفت إشارة HIF -1 عند الرقم الهيدروجيني 5.0. وبالتالي ، أوضحنا أهمية الأس الهيدروجيني لتشكيل حلقة HIF في نموذج ساترة. لقد أوضحنا إمكانية أن تكون حلقة HIF قد تشكلت عن طريق قمع تراكم HIF -1 عن طريق انخفاض الرقم الهيدروجيني داخل الحلقة.

استخدمت العديد من الدراسات السابقة باستخدام طريقة ساترة الخلايا السرطانية. وفقًا لأحد التقارير باستخدام خط خلايا الورم الكبدي البشري Hep3B ، والذي يعبر عن الانزياح الأحمر المعتمد على الأكسجين للبروتين الفلوري الأخضر (AcGFP1) ، أظهر التصوير الحي للخلايا المغطاة بغطاء مستطيل الشكل انزياحًا أحمر مع زيادة المسافة من حافة ساترة (تاكاهاشي & ساتو ، 2 0 1 0). تحول طيف انبعاث خلايا الورم الكبدي من الطول الموجي لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) إلى اللون الأحمر مع انخفاض توتر الأكسجين. في دراسة أخرى ، تم قياس توتر الأكسجين لخلايا SCC -7 بغطاء دائري {5} مم باستخدام تقنية عمر الفسفور. كان شد الأكسجين 6.9 مم زئبق و 166 مم زئبق ، محسوبًا من PL ، والذي كان 3.89 ميكرو ثانية و 893 ميكرو ثانية ، 0-2 مم داخل ، و0-1 مم خارج حافة الغطاء ، على التوالي (Yoshihara et al. ، 2015). كما تم استخدام طريقة الأغطية مع الخلايا العضلية القلبية ، وهو نظام جذب الانتباه كنموذج واعد في ضخ الدم لنقص التروية في الجسم الحي. أظهر Kelly et al أن الخلايا العضلية المغطاة بغطاء ساترة خضعت لتغيرات مورفولوجية ملحوظة بمرور الوقت ، مصحوبة بتغييرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا وديناميكيات غشاء البلازما ، مما أدى في النهاية إلى موت الخلايا العضلية. أظهروا أيضًا أن درجة الحموضة داخل الخلايا للخلايا العضلية المغطاة بغطاء سفلي تنخفض بسرعة إلى ما يقرب من الرقم الهيدروجيني 4 في وسط ساترة (بيتس وتومبس ، 2004). يمكن لنموذج الغطاء المنزلق ، الذي يثبط انتشار الأكسجين أو التغذية إلى الخلايا المستنبتة تحت غطاء ، محاكاة نموذج في الجسم الحي للمناطق الإقفارية والطبيعية والهامشية في الوسط والخارج وحافة ساترة على التوالي. استخدمت العديد من الدراسات هذا النموذج كنموذج إقفار - ضخه للخلايا العضلية في المختبر (Chun et al. ، 2015 ؛ Pitts et al. ، 2008 ؛ Solhjoo & O'Rourke ، 2015 ؛ Wang et al. ، 2012). على حد علمنا ، فإن دراستنا هي الأولى التي تطبق طريقة ساترة على الخلايا الأنبوبية. في نظامنا ، كانت المسافة من حافة الغطاء إلى منطقة تعادل 10 ملم زئبقي من توتر الأكسجين ، حيث يجب أن يتحول بيمونيدازول موجبًا ، 1.22 ملم ، وانخفض توتر الأكسجين إلى الصفر على مسافة 2 ملم من حافة الغطاء . قد تكون هذه النتيجة متوافقة مع التقارير السابقة التي تستخدم حوالي 15 مم ساترة ، مما يدل على وجود تدرج أكسجين على الأقل في حدود 2 مم من الحافة (Akiyama et al. ، 2018 ؛ Yoshihara et al. ، 2015). قمنا بفحص معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا تحت الغطاء (الشكل S11) واكتشفنا أنه تم الحفاظ على GAPDH والأكتين حتى داخل حلقة HIF ، مما يشير إلى أن حلقة HIF لم تكن ناجمة فقط عن موت الخلايا المبرمج أو الموت داخل حلقة HIF.

قامت العديد من الدراسات بقياس توتر الأكسجين في الكلى باستخدام طرق مختلفة. كانت بعض الأمثلة على قياس شد الأكسجين في الكلى الطبيعية كما يلي: 50 مم زئبق و 30 مم زئبق في القشرة والنخاع باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة ؛ و 49 مم زئبق و 41 مم زئبق في مقاطع S1 و S2 من الخلايا الأنبوبية من القشرة باستخدام PLIM (Hirakawa et al. ، 2017 ، 2018 ؛ Zhang et al. ، 2014). سيكون توتر الأكسجين في الكلى المريضة أقل. وفقًا لتقرير سابق باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة للأكسجين ، كان لدى الفئران المصابة بداء السكري توتر أكسجين متني كلوي أقل: 36 ملم زئبقي و 11 ملم زئبقي في القشرة المخية والنخاع على التوالي (Heyman et al. ، 2013 ؛ Palm et al. ، 2003). نظرًا لأن الأقطاب الكهربائية الدقيقة للأكسجين تقيس متوسط ​​توتر الأكسجين المتني ، فمن المتوقع وجود نطاق أوسع في الكلى المريضة. انخفض توتر الأكسجين داخل الخلايا إلى صفر مم زئبقي في نموذج للكلية الدماغية التي تم تثبيت الشريان والوريد الكلوي الجانبي فيها (Hirakawa et al. ، 2015). بالنظر إلى هذه النتائج ، يبدو أن نطاق توتر الأكسجين على حلقة HIF ، حوالي 4-20 مم زئبق ، معقول في الجسم الحي.

اكتشفنا كذلك أن الرقم الهيدروجيني يؤثر على تكوين حلقة HIF وكذلك توتر الأكسجين. نظرًا لأن الخلايا الظهارية الأنبوبية في الكلى تتعرض باستمرار للسائل البولي ، يجب أن يتأثر الرقم الهيدروجيني للخلايا الأنبوبية بتلك الموجودة في البول. بالنظر إلى النطاق الواسع للأس الهيدروجيني في البول ، قررنا دراسة الخلايا المحتضنة في نطاق الأس الهيدروجيني 5. 0 - 8.5. كانت هناك دراسات حول مدى درجة الحموضة في الكلى السليمة. وجدت إحدى الدراسات أن درجة الحموضة في القشرة كانت 7.39 ± 0. {{1 0}} 8 ، وأن درجة حموضة اللب كانت 7.2 0 ± {{2 {{39} }}}. 0 9 ، كما تم قياسه باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة (Burke et al.، 1999). أظهرت دراسة أخرى ، باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الأس الهيدروجيني ، قيم pH تبلغ 7.3 ± 0 .13 و 7. 0 ± 0.29 على التوالي (Raghunand et al. ، 2003). تم الإبلاغ عن انخفاض درجة الحموضة الكلوية من 6.5 إلى 6.32 ، وإلى 5.83 في الحالات الشديدة ، في نموذج فأر مصاب بمرض الكلى المزمن مع الحماض (Pavuluri et al. ، 2019). قدمت هذه الملاحظات دليلًا على انخفاض الأس الهيدروجيني والتباين في CKD. ومع ذلك ، فإن تأثير الأس الهيدروجيني على HIF -1 الناجم عن نقص الأكسجة المزمن في مرض الكلى المزمن لم يتم فحصه جيدًا بشكل كافٍ. في هذه الدراسة ، لوحظ تحول في حلقة HIF بين الأس الهيدروجيني 6.5 و الرقم الهيدروجيني 7.4 ، وهو نطاق الأس الهيدروجيني المعقول في CKD. دعمت هذه النتيجة الفرضية القائلة بأن انخفاضًا طفيفًا في درجة الحموضة يؤثر على تراكم HIF -1 في CKD. استنادًا إلى الدليل على انخفاض الرقم الهيدروجيني إلى أقل من 6.0 في الحالات الشديدة من مرض الكلى المزمن ، فمن الضروري أيضًا تقييم الحالة الفسيولوجية لمركب HIF -1 عند درجة حموضة أقل. على الرغم من وجود تقارير تفيد بأن البيئة الحمضية ، حتى في نورموكسيا ، تعمل على استقرار HIF -1 ، فقد بحثت معظم هذه التقارير في ظروف الحموضة المعتدلة التي تزيد عن 6.0 درجة الحموضة (Filatova et al.، 2016؛ Mekhail et al.، 2004) . في هذا العمل ، أظهرنا قمعًا لتراكم HIF -1 في الخلايا الأنبوبية عند درجة الحموضة 5.0 ، والتوهين لإشارات HIF -1 في نموذج ساترة محتضن عند درجة الحموضة 5.0. لذلك ، قد يرتبط انخفاض درجة الحموضة الكلوية في CKD في الجسم الحي بعدم كفاية تنشيط HIF ، وكذلك مع السموم اليوريمية في الكلى التي تعاني من نقص الأكسجين ، مما يؤدي إلى تفاقم تطور CKD (Tanaka et al. ، 2013).

دراستنا لديها العديد من القيود. أولاً ، في منطقة نقص تدفق الدم ، يجب أن يكون وسط المزرعة ناقصًا في العناصر الغذائية ، بالإضافة إلى وجود نقص في الأكسجين وانخفاض درجة الحموضة. ومع ذلك ، من الصعب تحديد تأثيرات الأس الهيدروجيني وتوتر الأكسجين والعوامل الأخرى التي يسببها نقص تدفق الدم. في الجسم ، يحدث نقص التروية ، نقص تدفق الدم المرضي الناجم عن مزيج من الأكسجين المنخفض والعناصر الغذائية المنخفضة ، في الأعضاء والخلايا. من المهم فهم الاختلافات بين استشعار نقص الأكسجة واستشعار نقص التروية. على الرغم من صعوبة توضيح التأثير البيولوجي لكل عامل ، فإن نموذج نقص تدفق الدم لدينا مقبول من الناحية الفسيولوجية ، ويحاكي الحالة المرضية في الجسم الحي. ثانياً ، صنع نموذج ساترة يتطلب مهارة وممارسة ، لأن غالبية الخلايا أصبحت منفصلة أحيانًا أثناء إزالة ساترة ، خاصة عند استخدام الطريقة التقليدية (الشكل S2a). تعتمد هذه المشكلة على خط الخلية المستخدم. على سبيل المثال ، كان من الصعب علينا تطبيق نموذج ساترة على خلايا HEK 293 لأن التصاقها بالساترة كان ضعيفًا نسبيًا. ثالثًا ، كان من المستحسن تقليل الأضرار التي لحقت بالخلايا المستنبتة تحت غطاء. زاد عدد الخلايا التالفة مع زيادة الفترة التي تمت تغطيتها خلالها ، كما يتضح من تحليل موت الخلايا المبرمج. لقد قررنا أن 3 ساعات كانت مناسبة لتقدير حلقة HIF عندما بدت ثابتة ، وحوالي 10 بالمائة من الخلايا أصبحت موت الخلايا المبرمج (الشكل S11). كان القيد الرابع هو صعوبة ربط الخلايا المستنبتة بغطاء ساترة بطريقة موحدة في كل عينة (الشكل S2b ، c). يمكن أن يكون الاختلاف في الارتباط بين الطريقة التقليدية والطريقة البديلة لصنع نموذج غطاء الشفة قد أثر أيضًا على الدراسة. قمنا بقياس نطاق توتر الأكسجين المكافئ لحلقة HIF بواسطة تقنية عمر الفسفور ، حيث أنشأنا نموذج ساترة باستخدام طريقة تقليدية. نظرًا لأنه تم تصور حلقة HIF أثناء الكيمياء المناعية باستخدام طريقة بديلة ، فقد يكون توتر الأكسجين الحقيقي مختلفًا. قللنا هذه الأخطاء إلى الحد الأدنى باستخدام الدليل على أن البيمونيدازول كان موجبًا عند 10 مم زئبق أو أقل من توتر الأكسجين. القيد الخامس هو أن الأس الهيدروجيني داخل الخلايا ليس بالضرورة نفس الرقم الهيدروجيني لوسط المزرعة. أظهرت العديد من التقارير السابقة أن الأس الهيدروجيني داخل الخلايا يتوافق مع درجة الحموضة المتوسطة إلى حد ما في الخلايا المستزرعة (Michl et al. ، 2019) ، يمكننا فقط تقييم الاتجاه في الأس الهيدروجيني داخل الخلايا عن طريق تغيير درجة الحموضة المتوسطة. في الجسم الحي ، تكون العلاقة بين الرقم الهيدروجيني للمناطق داخل الخلايا وخارجها ، مثل البول أو سوائل الجسم ، أكثر تعقيدًا مما هي عليه في الخلايا المستنبتة. وبالتالي ، سيكون من الضروري في المستقبل إجراء المزيد من الدراسات حول الطريقة التي ينظم بها تحول الأس الهيدروجيني تراكم بروتين HIF -1 في الجسم الحي.

فائدة Cistanche: تحسين الكلىوظيفة

قيد آخر هو أن الرقم الهيدروجيني يجب أن يكون له تأثير على علامة نقص الأكسجة ، بيمونيدازول. قارنا المسافة بين حافة المنطقة الإيجابية للبيمونيدازول من مركز ساترة تحت ظروف مختلفة من الأس الهيدروجيني في نموذج ساترة لدينا. كانت حافة المنطقة الإيجابية للبييمونيدازول قابلة للمقارنة بين الأس الهيدروجيني 6.5 و 7.4 و 8.5 (الشكل S12 أ ، ب). أظهرت دراسة سابقة أيضًا الحفاظ على ارتباط pimonidazole عند قيم pH مختلفة (Kleiter et al.، 2 0 06). بناءً على هذا الدليل ، خلصنا إلى أن بيمونيدازول هو علامة نقص الأكسجة المناسبة لتجاربنا على ساترة. القيد النهائي هو أنه بالنظر إلى نطاق توتر الأكسجين بين حوالي 4 مم زئبق و 20 مم زئبق (0.52 في المائة O2 إلى 2.6 في المائة O2) من حلقة HIF ، Pt (II) - و Pd (II) -porphyrins ، والتي تستخدم على نطاق واسع كمواد بيولوجية تتمتع مجسات الأكسجين بمزايا لقياس تركيزات الأكسجين المنخفضة جدًا نظرًا لعمر الفسفرة الأطول بشكل ملحوظ مقارنةً بتلك التي تستخدم مجمعات Ir (III) (Yoshihara et al. ، 2017). ومع ذلك ، بشكل عام ، فإن القياس الكمي للأكسجين المستند إلى الفسفرة ، المحسوب باستخدام معادلة ستيرن-فولمر ، له أداء أفضل في نطاقات O2 المنخفضة (Papkovsky & Zhdanov ، 2016). أظهرت العديد من الدراسات السابقة القياس المعقد القائم على Ir (III) لتوترات الأكسجين منخفضة تصل إلى حوالي 10 ملم زئبقي (Akiyama et al. ، 2018 ؛ Yoshihara et al. ، 2015). لذلك ، نعتقد أن نطاق توتر الأكسجين في حلقة HIF يجب أن يكون نتيجة دقيقة.

5|الاستنتاجات

باختصار ، وجدنا أن فهم دور كل من الأكسجين ودرجة الحموضة ضروري لفهم الحالة الفسيولوجية لـ HIF -1 في مرض الكلى المزمن ، ويمكن اكتسابه من خلال فحص الخلايا الأنبوبية التي تعاني من نقص انسياب الدم. كان نموذج ساترة ، مع حدوده لتدفق الوسائط ، نموذجًا جيدًا لنقص انسياب الدم في الجسم الحي ، وخاصة في الأنابيب في CKD ، نظرًا لأن خلخلة الشعيرات الدموية حول الأنبوب هو السمة المميزة الرئيسية لـ CKD (Mimura & Nangaku ، 2010 ؛ Nangaku ، 2006). يمكن أن يحاكي نموذج نقص التروية هذا أيضًا تدرجات الأكسجين ودرجة الحموضة في الجسم الحي ، مثل الأورام والآفات الدماغية. يوفر النموذج نهجًا واعدًا لتوضيح هذه الآليات البيولوجية.

تضارب المصالح

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان.

مساهمات المؤلفين

ساهم جميع المؤلفين في تشكيل المفهوم العام. أجرى TH التجارب الشاملة. قامت TH و YH بتحليل النتائج وتكوين الأرقام. كتب TH المخطوطة الأصلية. أجرى KM و TY و ST التجربة باستخدام تقنية عمر الفسفور وحرر الجزء من المخطوطة. قام كل من YH و TT و MN بتحرير المخطوطة بأكملها. قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها.

المرجعي

Akiyama، H.، Takahashi، I.، Shimoda، Y.، Mukai، R.، Yoshihara، T.، & Tobita، S. (2018). الأشعة تحت الحمراء (3) تصوير الأكسجين المعقد للخلايا الحية وقاع العين بكاميرا ICCD مسورة. العلوم الضوئية والبيولوجية الضوئية ، 17 (6) ، 846-853.

Akizawa، T.، Nangaku، M.، Yamaguchi، T.، Arai، M.، Koretomo، R.، Maeda، K.، Miyazawa، Y.، & Hirakata، H. (2019). Enarodustat ، علاج التحويل والصيانة لفقر الدم في مرضى غسيل الكلى: تجربة عشوائية من المرحلة 2 ب مضبوطة بالغفل تليها تجربة طويلة الأجل. نفرون ، 143 (2) ، 77-85.

العامري ، ك. ، بورك ، ب. ، لويس ، م ، وهاريس ، آل (2002). تنظيم عنصر VL30 الجرذ في خلايا سرطان الثدي البشرية في نقص الأكسجة ونقص الأكسجين: دور HIF -1. المجلة البريطانية للسرطان ، 87 (10) ، 1173-1181.

Asai، H.، Hirata، J.، Hirano، A.، Hirai، K.، Seki، S.، & Watanabe- Akanuma، M. (2016). تنشيط مستقبلات أريل الهيدروكربونات يتوسط قمع تعبير الإريثروبويتين المعتمد على عامل نقص الأكسجة بواسطة كبريتات الإندوكسيل. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. فسيولوجيا الخلية ، 310 (2) ، C142-C150.

Burke ، TJ ، Malhotra ، D. ، & Shapiro ، JI (1999). العوامل التي تحافظ على تدرج الأس الهيدروجيني داخل الكلى: دور بنية الأوعية الدموية. منظمة الكلى الدولية ، 56 (5) ، 1826-1837.

Carrera، S.، Senra، J.، Acosta، ​​MI، Althubiti، M.، Hammond، EM، de Verdier، PJ، & Macip، S. (2014). دور عامل نسخ ألفا HIF -1 في زيادة انقسام الخلايا عند توترات الأكسجين الفسيولوجية. بلوس واحد، 9 (5) ، e97938.

Chen، N.، Hao، C.، Peng، X.، Lin، H.، Yin، A.، Hao، L.، Tao، Y.، Liang، X.، Liu، Z.، Xing، C.، Chen، J.، Luo، L.، Zuo، L.، Liao، Y.، Liu، BC، Leong، R.، Wang، C.، Liu، C.، Neff، T.،… Yu، KHP (2019 ).

Roxadustat لفقر الدم لدى مرضى الكلى الذين لا يخضعون لغسيل الكلى. مجلة نيو إنجلاند الطبية ، 381 (11) ، 1001-1010.

Chen، N.، Qian، J.، Chen، J.، Yu، X.، Mei، C.، Hao، C.، Jiang، G.، Lin، H.، Zhang، X.، Zuo، L.، He، Q.، Fu، P.، Li، X.، Ni، D.، Hemmerich، S.، Liu، C.، Szczech، L.، Besarab، A.، Neff، TB،… Valone، F.

هـ (2017). دراسات المرحلة الثانية لمثبط البروليل هيدروكسيلاز الفموي المُحفّز لنقص الأكسجين FG -4592 لعلاج فقر الدم في الصين. أمراض الكلى ، غسيل الكلى ، زرع الأعضاء ، 32 (8) ، 1373-1386.

شيانغ ، سي كي ، تاناكا ، ت. ، إناجي ، ر. ، فوجيتا ، ت. ، ونانجاكو ، إم. (2011). كبريتات الإندوكسيل ، ممثل سموم اليوريمي ، يقمع إنتاج إرثروبويتين بطريقة تعتمد على HIF. الفحوصات المخبرية ، 91 (11) ، 1564-1571.

Chun، WJ، Nah، DY، Bae، JH، Chung، JW، Lee، H.، & Moon، IS (2015). يحمي محلول الجلوكوز والأنسولين والبوتاسيوم الخلايا العضلية البطينية للفئران حديثي الولادة في نموذج نقص التروية / إعادة التروية في المختبر. مجلة التداول الكورية ، 45 (3) ، 234-241.

Coyne، DW، Goldsmith، D.، & Macdougall، IC (2017). خيارات جديدة لفقر الدم الناتج عن أمراض الكلى المزمنة. ملحق الكلى الدولي ، 7 (3) ، 157-163. قبلة 2017.09.002

دينغ ، أ ، أرندت ، ماساتشوستس ، ساتريانو ، جيه ، سينغ ، بي ، ريج ، تي ، طومسون ، إس. وآخرون (2010). الحماية الكلوية في أمراض الكلى المزمنة: تنشيط العامل المحرض بنقص الأكسجة مقابل حصار الأنجيوتنسين 2. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. فسيولوجيا الكلى ، 299 (6) ، F1365-F1373.

Filatova، A.، Seidel، S.، Bogurcu، N.، Graf، S.، Garvalov، BK، & Acker، T. (2016). يعمل الحماض من خلال HSP90 بطريقة مستقلة لدرجة الدكتوراه / VHL لتعزيز وظيفة HIF والحفاظ على الخلايا الجذعية في الورم الدبقي. أبحاث السرطان، 76 (19) ، 5845-5856. يمكنه -15-2630

Goldfarb، M.، Rosenberger، C.، Abassi، Z.، Shina، A.، Zilbersat، F.، Eckardt، KU، Rosen، S.، & Heyman، SN (2006). الفشل الكلوي الحاد المزمن في الفئران: التعويض الوظيفي وتحمل نقص الأكسجة. المجلة الأمريكية لأمراض الكلى ، 26 (1) ، 22 - 33.

Heyman، SN، Rosenberger، C.، Rosen، S.، & Khamaisi، M. (2013). لماذا يعتبر داء السكري عامل خطر للإصابة باعتلال الكلية الناجم عن التباين؟ BioMed Research International، 2013، 123589.

Hirakawa، Y.، Mizukami، K.، Yoshihara، T.، Takahashi، I.، Khulan، P.، Honda، T.، Mimura، I.، Tanaka، T.، Tobita، S.، & Nangaku، M. (2018). التصوير داخل الحجاج الفسفوري مدى الحياة للقشرة الكلوية يقيس بدقة نقص الأكسجة الكلوي. Kidney International، 93 (6) ، 1483-1489.

Hirakawa، Y.، Tanaka، T.، & Nangaku، M. (2017). نقص الأكسجة الكلوي في كد. الفيزيولوجيا المرضية وطرق الكشف. الحدود في علم وظائف الأعضاء ، 8 ، 99.