الببتيد المشتق من النيترين-1-يعزز الحماية ضد موت الخلايا العصبية ويخفف من النزف داخل المخ في الفئران - الجزء 2

علاوة على ذلك، وجدنا أن الببتيد E1 قام على وجه التحديد بتنشيط مسارات إشارات FAK وSFK. لذلك، قد يكون للببتيد E1 تأثيرات محددة للغاية ويكون فعالًا في عملية التعافي بعد ICH.

هناك علاقة بين الخصوصية العالية والذاكرة. تشير الخصوصية العالية إلى النشاط الأقوى في مناطق معينة من الدماغ عندما يقوم الأشخاص بمهمة ما. تشير الذاكرة إلى قدرة الأشخاص على التعلم وتذكر المعلومات. عندما نتعلم كيفية استخدام خصوصية عالية لأداء مهمة ما، ستزداد ذاكرتنا أيضًا.

تظهر الأبحاث أنه عندما تكون لدينا مهارات وخبرة متخصصة في مهمة ما، فإن الدماغ سيقوم تدريجياً ببناء دوائر عصبية متخصصة وأنماط ذاكرة. سيكون لهذه الدوائر والأنماط تأثير محدد على الاستجابة للمهمة، وبالتالي تحسين كفاءة المهمة. وفي الوقت نفسه، عند أداء مهام مماثلة في المستقبل، سيتم أيضًا تنشيط هذه الدوائر والأنماط لمساعدتنا على تذكر المهمة وتنفيذها بشكل أفضل.

تشمل المهام ذات الخصوصية العالية الموسيقى واللغة والرياضة وما إلى ذلك، وتعلم هذه المهارات يمكن أن يعزز ذاكرتنا. على سبيل المثال، عندما يتدرب عازف البيانو على العزف، سيتعلم الدماغ المهارات المحددة للبيانو ويستمر في تقوية هذه الدوائر أثناء عملية التدريب. سيؤدي إنشاء هذه الدوائر وتعزيزها أيضًا إلى تحسين فهم عازف البيانو وذاكرته للموسيقى.

ولذلك، هناك علاقة إيجابية بين الخصوصية العالية والذاكرة. إن تعلم مهارات وتجارب محددة لا يؤدي فقط إلى تحسين كفاءة التنفيذ لدينا، بل أيضًا إلى تقوية ذاكرتنا، مما يساعدنا على تعلم وتذكر المعلومات المختلفة بشكل أفضل. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة، ويمكن لسيستانش أن يحسن الذاكرة بشكل كبير لأنه يحتوي على تأثيرات مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ومضادة للشيخوخة، والتي يمكن أن تساعد في تقليل الأكسدة والتفاعلات الالتهابية في الدماغ، وبالتالي حماية صحة الدماغ. الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Cistanche أيضًا تعزيز نمو وإصلاح الخلايا العصبية، وبالتالي تعزيز اتصال الشبكات العصبية ووظيفتها. يمكن أن تساعد هذه التأثيرات في تحسين الذاكرة والقدرة على التعلم وسرعة التفكير، ويمكن أن تمنع أيضًا حدوث الخلل المعرفي والأمراض التنكسية العصبية.

انقر فوق معرفة المكملات الغذائية لتعزيز الذاكرة

على عكس الببتيد E1، يمكن للببتيد E2 تنشيط إشارات ERK، مما يعزز موت الخلايا العصبية. قد يحدث هذا بسبب Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G motifin E2 والذي يمكنه تنشيط مسار إشارات ERK [28].

يشير هذا إلى أن الببتيدات المشتقة من Netrin-1- مختلفة تؤدي وظائف مختلفة. والمستقبلات الرئيسية لـ Netrin-1 هي DCC وأعضاء عائلة UNC5 [50]. لا يزال دور DCC وUNC5H2 في التراث الثقافي غير المادي مثيرًا للجدل [51،52].

يعد تسلسل Netrin-1 الذي حددناه أمرًا بالغ الأهمية لتفاعل Netrin-1 مع DCC [19]. تشير هذه النتائج إلى أن DCC قد تشارك في الاسترداد الوظيفي الناجم عن Netrin-1- بعد ICH.

هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاستقصاء الآليات الأساسية لهذه العمليات ومسارات الإشارات ذات الصلة. في التجارب المستقبلية، سنقوم بتقييم الخصائص البيولوجية للببتيد E1 لاستكشاف سميته ونصف عمره للتطبيق السريري.

4. المواد والأساليب

4.1. الحيوانات

كان المختبر معملًا محددًا خاليًا من مسببات الأمراض (SPF). تم إيواء جميع الفئران تحت دورة 12- ساعة من الضوء والظلام مع إضاءة الأضواء من الساعة 6 صباحًا حتى 6 مساءً وتزويدها بإمكانية الوصول إلى الطعام حسب الرغبة. تم إنشاء الفئران DCC +/− كما هو موضح سابقًا [53].

تم استخدام الفئران Embryosof DCC +/− للثقافة العصبية القشرية. تم إجراء التنميط الجيني عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) كما هو موضح سابقًا [53]. تم شراء الفئران C57BL / 6J من شركة Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (بكين، الصين).

4.2. يبني

تم إنشاء بنيات التعبير التي ترميز DCC البشري (HGNC: 2701)، وNetrin البشري -1 (HGNC: 8029)، وUNC5A البشري (HGNC: 12567) في مختبرنا [14،32،45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His تم إنشاؤه باستخدام مجموعة Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter، C5891، USA). تم رؤية تسلسل [كدنا] لـ hNetrin -1 (∆407–443) في الجدول التكميلي S2.

تم إنشاء تسلسلات cDNA المقابلة لمجال FN5 الخاص بـ DCC والأحماض الأمينية 407-443 من Netrin -1 عن طريق الارتباط في ناقل pGEX -5 x -1 لإنتاج بروتينات دمج GST.

4.3. مجموعة Netrin-1 متوسطة مشروطة

تم جمع الوسيط المشروط netrin-1- والتحقق من صحته كما هو موضح في تقريرنا السابق [13،14]. باختصار، تم التعبير عن Netrin البشري -1 الذي يحمل علامة Myc-His في خلايا HEK293T.

بعد 24 ساعة، تم غسل الخلايا 3 مرات باستخدام Opti-MEM (Invitrogen، 31985070، Carlsbad، CA، USA) ثم حضنت لمدة ثلاثة أيام في Opti-MEM الخالي من المصل.

تم إثراء الوسائط عن طريق الترشيح بالطرد المركزي (Millipore، UFC903096، Billerica، MA، USA) وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. تم تحصين Netrin المخصب -1 بمضادات له وتم قياسه كمياً بالمقارنة مع BSA كعنصر تحكم في التحميل.

تم بعد ذلك تقييم تأثير Netrin {{0}} عن طريق فسفرة FAK. عادةً، يؤدي 0.1 مجم/مل من Netrin-1 إلى إحداث فسفرة FAK بشكل فعال، وقد تم استخدام هذا التركيز في دراساتنا. كانت مدة تحفيز Netrin-1 20 دقيقة في جميع التجارب ما لم تتم الإشارة إلى خلاف ذلك.

4.4. تحليل لطخة غربية

تم إجراء النشاف الغربي كما هو موضح سابقًا [54]. تم تحليل العينات في المخزن المؤقت للتحلل (1% Nonidet P-40، 0.5% ديوكسيكولات الصوديوم، {{5}).1% SDS، 1 ملم EDTA، 1 ملم EGTA، 150 ملم كلوريد الصوديوم، 10% جلسرين، 1% تريتون X-100، 100 ملي مولار NaF، 1 ملم فانادات، ومثبطات الأنزيم البروتيني) لخلايا الليز وأنسجة المخ الطازجة.

كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي: mouse anti-DCC (1:500، #554223، BD، San Jose، CA، USA)، mouse anti-His(1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Beijing, China )، مضاد للفطريات myc (1:1000، 22E8، Sungene Biotech، تيانجين، الصين)، مضاد للنيترين للفئران -1 (1:1000، ALX804838، Enzo Life Sciences، Farmingdale، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية )، الماوس anti-flag (1:1000، F3165، Sigma Aldrich، St Louis، MO، USA)،rabbit anti-phospho-FAK(pTyr 861) (1:1000، F9176، Sigma Aldrich، St Louis، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)، مضاد الأرانب FAK (1:200، sc-557، سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، مضاد الأرانب الفوسفوSRC (Tyr418)(1:1000، Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) ، عائلة أرنب مضادة لـ SRC (1: 1000، # 2123، CST، Danvers، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)، الماوس المضاد لـ GAPDH (1: 5000، TransGene Biotech، بكين، الصين)، الماوس المضاد لبيتا أكتين (1: 3000، A5441، سيجما ألدريش، سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)، أرنب مضاد للفوسفو-ERK (Thr202 / Tyr204) (1:1000، #9101، CST، Danvers، MA، USA)، Rabbitanti-ERK (1:1000، # 4695، CST، Danvers، MA، USA)، تم شراء الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP ضد الماوس أو الماعز أو الأرانب من Jackson ImmunoResearch (West Grove، PA، USA).

4.5. ربط سطح الخلية

تم نقل خلايا HEK293 المطلية على الأغطية باستخدام بلازميدات Flag-DCC باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم كما هو موضح سابقًا [55]. ما يقرب من 4 0 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تم تحضين الخلايا بـ 1 0 0 ميكروغرام / مل myc-Netrin -1 أو myc-Netrin -1 (∆407–443) لمدة 30 دقيقة قبل أن يتم غسلها لمدة 5 دقائق باستخدام HBHA (20 مم HEPES، ودرجة الحموضة 7.0، و0.5 ملغ/مل LBSA في HBSS)، وتشطف بـ 1 × PBS، ويتم تثبيتها بالتتابع باستخدام بارافورمالدهيد 4% في PBS لمدة 10 دقائق. كانت الأجسام المضادة الأولية التي تم استخدامها هي الأجسام المضادة للأرنب anti-myc (1:200، Abcam،ab9106، Cambridge، MA، USA) والأجسام المضادة للفئران المضادة للعلم (1:100، Sigma Aldrich، F3165).

كانت الأجسام المضادة الثانوية التي تم استخدامها هي الأجسام المضادة Alexa Fluor 488-المترافقة مع الحمير والأرنب (1:1000؛ Invitrogen، A21206) والأجسام المضادة Alexa Fluor 546-الماعز المترافقة المضادة للفأر (1:1000؛ Invitrogen، A10036) . كانت النوى ملطخة بـ 40،6- ديامينو -2- فينيليندول (DAPI) (ثيرمو فيشر، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 880.

4.6. ضريبة السلع والخدمات المنسدلة

تمت تنقية بروتين الاندماج GST-DCC باستخدام حبات الجلوتاثيون-SepharoseTM 4B (GE Healthcare، Little Chalfont، Buckinghamshire، UK) بواسطة بروتوكول الشركة المصنعة.

تم تحضين ما يقرب من 500 ميكروغرام من المحللة الخلوية من خلايا HEK293T المنقولة بالبلازميدات المشار إليها مع 2-5 ميكروغرام من بروتين الاندماج GST-DCC-FN5 في المخزن المؤقت RIPA عند 4 درجات مئوية خلال الليل. تم استخدام حبات Glutathi-one-SepharoseTM 4B لالتقاط بروتين الاندماج GST-DCC-FN5 والبروتينات المتفاعلة معه. تم إطلاق البروتينات المرتبطة في المخزن المؤقت لتحميل البروتين عن طريق تمسخ الحرارة.

4.7. ثقافة الخلايا العصبية القشرية الأولية

تمت زراعة الخلايا العصبية القشرية الأولية كما هو موضح سابقًا [56]. باختصار، تمت إزالة الأجنة (E17) من الفئران الحوامل المخدرة. تم فصل القشرة الدماغية وتقطيعها إلى قطع صغيرة.

بعد الحضانة في {{0}}.125% التربسين بلس مع 0.05% DNase في HBSS عند 37 ◦ مئوية لمدة 20 دقيقة، تمت سحق الخلايا باستخدام ماصات باستور زجاجية مصقولة بالنار وتم ترشيحها باستخدام مرشح 40 ميكرون.

تم تعليق الخلايا المنفصلة في DMEM مع 10٪ FBS ومطلية على أطباق مغلفة ببولي-D-ليسين أو ساترة زجاجية عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد 4 ساعات، تم استبدال الوسيط بوسيط عصبي مكمل بـ B27 وGlutaMAX.

4.8. NLT ثقافة الخلية وبروتوكولات العلاج

تم الحفاظ على الخلايا العصبية التي تعبر عن GnRH للماوس (NLT) بواسطة مختبرنا. نمت خلايا NLT في DMEM (سيجما ألدريش، سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) تحتوي على 10٪ FBS (BiologicalIndustries، Kibbutz Beit Haemek، Israel) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (Thermo FisherScientific، Waltham، MA، USA) عند 37 درجة مئوية تحت جو رطب يتكون من 95% هواء و5% ثاني أكسيد الكربون.

لتحديد السمية العصبية للهيمين، تمت إضافة تركيزات مختلفة (0 و10 و30 و60 و90 و120 ميكرومتر) من الهيمين (Sigma-Aldrich) إلى خلايا NLT وتم علاجها لمدة 6 ساعات. من هذه التركيزات، تم اختيار 60 ميكرومتر (LD50) واستخدامها في التجارب اللاحقة.

تم علاج المجموعات الضابطة بالمركبة (DMSO) فقط. تم إجراء بقاء الخلية و Live/Deadstaining لمدة 6 ساعات بعد العلاج. تم استخدام ثلاثة آبار لكل مجموعة. وتكررت التجارب 3 مرات على الأقل.

4.9. في النموذج المختبري لموت الخلايا الناجم عن الهيمين

تم إحداث موت الخلايا في الخلايا العصبية القشرية الأولية وخلايا NLT عن طريق العلاج بـ50 ميكرومتر و60 ميكرومتر من الهيمين، على التوالي، كما هو موضح سابقًا [57،58]. تم إذابة Hemin في 0.1 M NaOH لتوليد محلول المخزون. بالنسبة لدراسات الحماية العصبية، تمت معالجة الخلايا باستخدام الهيمين 6 ساعات في وجود عوامل معينة أو سيلينيت الصوديوم المذاب في الماء المقطر المضاعف.

4.10. فحص CCK -8

تم قياس صلاحية الخلية بواسطة اختبار CCK -8 (CK04، Dojindo، Kumamoto، Japan) كما هو موضح سابقًا [59]. باختصار، تم زرع الخلايا العصبية في أطباق بئر 96- بكثافة 6000 خلية/بئر في وسط استزراع 100 ميكرولتر وتم تغذيتها في الحاضنة طوال الليل.

تم علاج الخلايا باستخدام Hemin لمدة 6 ساعات. تم غسل الخلايا العصبية في كاشف PBS (37 درجة مئوية) وكاشف CCK -8 (10 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر) في كل بئر.

بعد ذلك، قمنا بحضانة الصفائح لمدة ساعتين في جو يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون، وتم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الصغيرة. تم تمثيل بقاء الخلية كنسبة مئوية من التحكم (الخلايا غير المعالجة).

4.11. تلطيخ حي/ميت

تم التحقق من قدرة اختبار CCK-8 على قياس الصلاحية عن طريق التلوين باستخدام calceinAM/PI في PBS (Live/Dead Assay، KeyGEN BioTECH، Nanjing، China) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

يتكون محلول التلوين من كاشف 2 ميكرومتر كالسين AM وكاشف PI 8 ميكرومتر مختلط في برنامج تلفزيوني. تم تحضين العينات لمدة 30 دقيقة وتم تصويرها باستخدام عدسة موضوعية 20x لمجهر مضان (Olympus FSX100، طوكيو، اليابان). تم استخدام ما لا يقل عن 3 ثقافات الخلايا المستقلة للنموذج المختبري لموت الخلايا الناجم عن الهيمين.

4.12. تخليق الببتيد وإدارته

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2)، Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)، Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2)، Tat (NH{{11}) }YGRKKRRQRRR-CONH2)،TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)، FITC المسمى TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2)، FITC المسمى Pep EGF3 (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2)، العلم المسمى Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2)، العلم المسمى Pep E1 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GG GGS-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2) والعلم المسمى تم شراء Pep E2 (NH 2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) الببتيدات بنقاء 99٪ من قبل شركة Shanghai GL Biochem (شنغهاي، الصين) وشركة Wuhan Bioyeargene Biosciences (ووهان، الصين).

For more information:1950477648nn@gmail.com