الببتيد المشتق من النترين-1-يعزز الحماية ضد موت الخلايا العصبية ويخفف من النزف داخل المخ في الفئران - الجزء 3

تم إعطاء مجموعات علاجية من المياه المالحة أو TAT أو TE1 (المذابة في المياه المالحة) للفئران بعد ساعتين من ICH وكل يوم لمدة 5 أيام عن طريق الحقن داخل الصفاق بحجم إجمالي قدره 0.1 مل لكل حيوان. أعطيت الببتيدات بطريقة عمياء بجرعات 12 ملغم / كغم.

المياه المالحة الفسيولوجية هي عازلة فسيولوجية شائعة الاستخدام، وتستخدم على نطاق واسع في التجارب الطبية والبيولوجية. لكن هل تعلم؟ يمكن للمحلول الملحي الفسيولوجي أيضًا تحسين ذاكرتنا!

بادئ ذي بدء، تلعب المياه المالحة الفسيولوجية دورًا مهمًا في الوظيفة الطبيعية للخلايا. يمكنه الحفاظ على الضغط الاسموزي الطبيعي للخلايا والحفاظ على الشكل الطبيعي للخلايا ووظيفتها. في الدماغ، يحتاج عدد كبير من الخلايا العصبية إلى محلول ملحي فسيولوجي كمادة أساسية، ويمكن لمكملات المحلول الملحي الفسيولوجي أن تعزز التشغيل الطبيعي لخلايا الدماغ، وتوفر ما يكفي من الأكسجين والمواد المغذية للدماغ، وتجعل الدماغ أكثر صحة.

ثانيًا، يمكن للمحلول الملحي الفسيولوجي أن يعزز نقل الإشارات بين الخلايا العصبية في الدماغ ويعزز قدرة الدماغ على التعلم. أظهرت الدراسات أنه في عملية تعلم المهام، يمكن أن يؤدي حقن المحلول الملحي الفسيولوجي إلى تحسين تأثير التعلم للمتعلمين بشكل كبير، وتحسين الحالة العاطفية للمتعلمين، وتقليل القلق والتوتر في التعلم. وفي الوقت نفسه، يمكن للمحلول الملحي الفسيولوجي أيضًا زيادة عدد الخلايا العصبية وتعقيد الخلايا العصبية في الحصين، مما يساعد على تكوين الذاكرة والحفاظ عليها.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمحلول الملحي الفسيولوجي تحسين البيئة الأيضية للدماغ وتقليل التأثيرات الضارة المختلفة على الدماغ، مثل الضرر والآفات ونقص التروية ونقص الأكسجة. هذه هي العوامل التي يمكن أن تؤذي الدماغ، ويمكن لحقن المحلول الملحي الفسيولوجي أن يعزز قدرة الدماغ على التكيف ويقلل من تلفه، وبالتالي تحسين ذاكرة الدماغ وقدرته على التفكير.

بشكل عام، تعتبر المياه المالحة مادة مثالية لتحسين الذاكرة. يمكن أن يكون له تأثيرات إيجابية متعددة على الدماغ، بما في ذلك زيادة عدد وتعقيد الخلايا العصبية، وتعزيز البيئة الأيضية، وتعزيز نقل الإشارات بين الخلايا العصبية. لذلك، عندما نحتاج إلى تحسين ذاكرتنا، قد نفكر أيضًا في حقن محلول ملحي لتوفير حماية ودعم أفضل لعقلنا. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا، ويمكن لـ Cistanche تحسين ذاكرتنا بشكل كبير لأنه يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو، وهي مهمة جدًا للذاكرة والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Cistanche أيضًا تحسين تدفق الدم وتعزيز توصيل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على التغذية والطاقة الكافية، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.

انقر فوق معرفة طرق تحسين ذاكرتك

4.13. نموذج الفأر الناجم عن الكولاجيناز من ICH

يستخدم حقن الكولاجيناز بشكل شائع للحث على ICH [60]. تم تخدير ذكور الفئران C57BL/6 (من عمر 8 إلى 12 أسبوعًا) باستخدام الأيزوفلورين (2 إلى 5%) ووضعها على إطار التجسيمي.

أثناء الإجراء، تم الحفاظ على درجة حرارة الجسم لكل حيوان عند 37 درجة مئوية باستخدام بطانية حرارية. باستخدام أداة التجسيمي (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd.، Shenzhen، الصين) وحقنة (Hamilton Company، Reno، NV، USA)، 0.3 μLof كولاجيناز ({{3}).{{12 }} تم غرس 45 IU؛ Sigma-Aldrich، St Louis، MO، USA) في المخطط الأيمن (AP: +0.2 مم؛ ML: −2.3 مم؛ DV: −3.5 مم) بمعدل تدفق قدره 0.1 ميليلتر/دقيقة.

تم حقن إجمالي 0.3 ميكرولتر من المياه المالحة في الحيوانات الخاضعة للمراقبة. تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت ظروف معقمة. في هذه الدراسة، تم استخدام أكثر من 66 فأرًا ذكرًا، وتم تقسيم الحيوانات بشكل عشوائي إلى مجموعات قبل كل تجربة [57].

4.14. التحليل السلوكي

تم الكشف عن التحليل السلوكي العصبي للفئران بعد تكوين ورم دموي في المخ عن طريق اختبار إزالة الشريط اللاصق [61] واختبار الأسطوانة [60]. تم إجراء اختبار إزالة الشريط اللاصق عن طريق وضع الشريط اللاصق على منطقة الغراس لكل مقدمة (يمين ويسار) من الفئران.

تم وضع كل فأر في قفص جديد.

تم تسجيل الوقت منذ تطبيق الشريط حتى إزالته الماوس بنجاح لكل مخلب. تم السماح بحد أقصى 300 ثانية لكل مخلب. بين التجارب، تم إيواء الحيوانات في أقفاصها المنزلية في منشأة خالية من مسببات الأمراض.

تم إجراء اختبار الأسطوانة عن طريق وضع الماوس في أسطوانة زجاجية أكريليك شفافة (القطر: 8 سم؛ الارتفاع: 25 سم) أمام مرآتين وكاميرا لمدة 5 دقائق. تم وضع الكاميرا في المنتصف أمام المرآتين والأسطوانة للحصول على فيديو مثالي.

لتقييم استخدام الطرف الأمامي المستقل، (1) تم تقييم قدرة الفئران على ملامسة جدار الأسطوانة بطرف أمامي واحد أثناء التربية الكاملة و(2) قدرة الفئران على الهبوط بطرف أمامي واحد فقط على الأرض بعد التربية الكاملة. تم حساب ما لا يقل عن 20 نقطة اتصال لكل طرف أمامي باستخدام الحركة البطيئة.

لتحليل خط الأساس قبل الجراحة، تم إجراء الاختبار مرتين لكل فأر مع استراحة لمدة ساعة واحدة بين التجارب. يتم التعبير عن Forelimbuse كنسبة استخدام الطرف الأمامي المستقل من الجانب الأيمن إلى الجانب الأيسر.

4.15. تحليل حجم الورم الدموي

لتحديد ما إذا كانت العلاجات خفضت حجم الورم الدموي، تم التضحية بالفئران بعد 5 أيام من ICH؛ تمت إزالة العقول وتجميدها في أكتوبر. تم تقطيع المقاطع الإكليلية بسمك 30 ميكرون ووضعها مباشرة على شرائح زجاجية. لقياس حجم الورم الدموي، تم رقمنة الأقسام على مستويات إكليلية موحدة.

قام مستخدم أعمى بقياس الملامح والورم الدموي في نصفي الكرة الأيسر والأيمن في كل قسم. وتم قياس وحساب حجم الورم الدموي والتورم باستخدام ImageJ (NIH).

تعرض ما لا يقل عن 5 أدمغة لكل مجموعة لقياسات ورم دموي، وتم قياس حجم الورم الدموي في جميع أنحاء الدماغ.

4.16. تلطيخ فلورو اليشم C

تم تقييم التنكس العصبي في الفئران بعد ICH الناجم عن الكولاجيناز من خلال تلطيخها باستخدام مجموعة تلطيخ Fluoro-jade C الجاهزة للتخفيف (TR-100-FJT، Biosensis، Thebarton، Australia) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة [62].

باختصار، تمت التضحية بفئران التحكم وفئران ICH (± ip الببتيد) بعد 5 أيام من النمذجة، وتمت معالجة العقول وفقًا للبروتوكول المستخدم في تجربة الكيمياء المناعية.

تم غمر المقاطع الدماغية العائمة في محلول هيدروكسيد الصوديوم 1٪ لمدة 5 دقائق، ثم شطفها لمدة دقيقتين في 70٪ إيثانول، ثم شطفها لمدة دقيقتين في الماء المقطر. بعد ذلك، تم غمر المقاطع العائمة في محلول برمنجنات البوتاسيوم 0.06% (KMnO4 في الماء المقطر) لمدة 10 دقائق.

تم غسل المقاطع باستخدام ddH2O قبل غمرها في 0.0001% محلول تلطيخ Fluoro-jade (Fluoro-jade C في الماء المقطر) لمدة 20 دقيقة مع رج لطيف في الظلام.

تم غسل المقاطع باستخدام ddH2O، وتثبيتها على شرائح مغلفة، وتجفيفها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل في الظلام. تم فحص تلطيخ Fluoro-Jade C داخل المنطقة المحيطة بالدم باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 880. تم إجراء القياس الكمي لـ Fluoro-jade Cstaining باستخدام برنامج ImageJ.

4.17. التألق المناعي للأنسجة

تم إجراء تلوين الأنسجة المناعي باستخدام سلسلة من المقاطع ذات سمك 30- ميكرومتر. تم تحضين الأقسام باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس antiNeuN (1:500، Millipore، MAB377، Billerica، MA، USA) أو الأجسام المضادة لـ GFAP (1:200، SigmaAldrich، G3893، St Louis، MO، USA) عند 4 ◦ درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد الغسيل باستخدام PBS، تم بعد ذلك تحضين المقاطع باستخدام الجسم المضاد للفأر Alexa Fluor 488- المترافق مع الحمير (1:1000؛ Invitrogen، A21202، Carlsbad، CA، USA).

4.18. فحص تونيل

تم استخدام اختبار وضع العلامات النهائية للنيك (TUNEL) بوساطة ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز ديوكسيوريدين (dUTP) لتحديد الخلايا المبرمج مع تجزئة الحمض النووي النووي في المنطقة المحيطة بالدم في الدماغ.

تم إجراء التلوين باستخدام مجموعة مقايسة موت الخلايا المبرمج التجارية ذات الخطوة الواحدة TUNEL (Beyotime، C1090، Nanjing، China) وتم تنفيذها وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد التألق المناعي للأنسجة، تم إجراء تفاعل TUNELreaction.

تم تحضين أقسام الدماغ بخليط تفاعل TUNEL (ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية)، ثم تم غسل المقاطع باستخدام PBS وصبغها بـ DAPI. تم فحص التوطين المشترك لتلوين NeuN-TUNEL باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 880.

تم قياس كمية الخلايا العصبية الإيجابية TUNEL (NeuN الإيجابية) في المنطقة المحيطة بالدم داخل الجسم المخطط باستخدام برنامج ImageJ على ثلاث صور مختلفة لكل ماوس تم التقاطها تحت هدف 20X. كان التوطين المشترك لتلوين GFAP-TUNEL مشابهًا لتلوين NeuN-TUNEL.

4.19. في الجسم الحي فحص نفاذية حاجز الدم في الدماغ

في الجسم الحي، تم إجراء فحوصات نفاذية حاجز الدم في الدماغ كما هو موضح سابقًا [63-65]. باختصار ، تم حقن فئران التحكم وفئران ICH (± ip الببتيد) داخل الصفاق باستخدام 4 كيلو دالتون ديكستران المسمى FITC (100 ميكرولتر من مخزون 2 مم في PBS، Sigma Aldrich، 46944-100 MG-F، St Louis، MO، USA) بعد النمذجة لمدة 5 أيام، يليها التخدير لمدة 5 دقائق.

بعد فترة دوران مدتها 10 دقائق للتتبع، تم إعداد الحيوانات لنضح عبر القلب، وتم جمع ~ 300 ميكرولتر من الدم من تجويف الصدر مباشرة بعد البزل الأذيني، تليها التروية لمدة 3 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. تم جمع نصف الدماغ (خالي من الفصوص الشمية والمخيخ والدماغ الخلفي) وكلية واحدة وتجميد النيتروجين السائل على الفور وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

لقياس التألق، كانت العينات مذابة بالثلج، ووزنها، ومتجانسة في برنامج تلفزيوني (400 ميكرولتر لنصف المخ و600 ميكرولتر للكلى)، متبوعة بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 4 ◦C و15، 000 × جم.

تم تحميل المواد الطافية (100 ميكرولتر)، وكذلك كميات متساوية من المصل (1/5 التخفيف في برنامج تلفزيوني)، في لوحة سوداء جيدة 96-، وتم قياس التألق عند الإثارة المقابلة (490 نانومتر) / الانبعاث (520 نانومتر ) في قارئ لوحة (Tecan، Männedorf، سويسرا). تم استخدام الحيوانات الشامية (بدون حقن التتبع) لطرح قيم التألق الذاتي. تم حساب مؤشر النفاذية (مل / جم) كنسبة من وزن الأنسجة RFUs / g إلى مصل RFUs / mL في الدم.

4.20. تلطيخ الليكتين الفلورسنت

لتصور الأوعية الدقيقة في الدماغ، استخدمنا Lycopersicon esculentum lectin المترافق مع الفلورسين (1:200، Vector Laboratories، FL-1171، Burlingame، CA، USA) لغمر المقاطع العائمة لمدة ساعة واحدة.

تم تصوير المقاطع باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 880 تحت هدف 20 ×، وتمت معالجة الصور بإعداد غاما 1.3. تم التقاط ثلاث صور من 3 مناطق محددة مسبقًا في المنطقة المحيطة بالدم في الدماغ الإكليلي للحيوان. تم قياس نقاط فرع السفينة في كل دماغ من قبل محقق أعمى. تم تعريف نقطة الفرع على أنها وعاء واحد يحمل علامة الفلورسين ويفصل بشكل ملحوظ إلى مسارين متميزين ومنفصلين للسفينة [66].

4.21. التحليل الإحصائي

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية بشكل أعمى وتم تنفيذها 3 مرات بشكل مستقل كما هو موضح سابقًا [67]. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة One-way ANOVA وTwo-way ANOVA واختبار Student'st، حسب الاقتضاء، باستخدام GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc.، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). ) وإصدار برنامج SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

يمكن العثور على المعلمات الإحصائية في وسائل إيضاح الشكل ذات الصلة. تم تحديد الأهمية الإحصائية عند *p < {{0}}.05; ** ع < 0.01; *** ف < 0.001؛ **** ع <0.0001.]

5. الاستنتاجات

يعد مجال EGF3 الخاص بـ Netrin -1 أمرًا بالغ الأهمية لتفاعل Netrin -1 مع DCC ويمكنه تنشيط مسارات الإشارات المختلفة. يتفاعل الببتيد المقطوع E1 من Netrin -1 (البقايا 407-422) مع DCC لحماية الخلايا العصبية من السمية الناجمة عن الهيمين.

يؤدي تطبيق الببتيد E1 إلى تحسين التعافي الوظيفي في نموذج تجريبي للتراث الثقافي غير المادي. علاوة على ذلك، يمكن للببتيد E1 حماية الخلايا العصبية من الضمور وموت الخلايا المبرمج بعد ICH.

مساهمات المؤلف: Conceptualization, LL, Z.-XH وX.-JZ; المنهجية، LL، K.-JL andJ.-BC؛ التحقق من صحة H.-LY وX.-XH؛ التحقيق، X.-JZ؛ تنظيم البيانات، JY؛ الموارد LL andZ.-XH؛ كتابة LL، Z.-XH وX.-JZ؛ الإشراف، Z.-XH، X.-JZ؛ الحصول على التمويل، Z.-XHand X.-JZ لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل: تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671065 و32071018)، خطة تطوير العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيلين (202520YY01017404).

بيان مجلس المراجعة المؤسسية: تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لجامعة شمال شرق عادي (NENU/IACUC، AP2016200299). كانت المعايير الوطنية لجمهورية الصين الشعبية (GB/T 35892–2018)، المبادئ التوجيهية لحيوانات المختبر للمراجعة الأخلاقية لرفاهية الحيوان، بمثابة التوجيه الخاص برعاية الحيوان وبروتوكولاتنا.

بيان الموافقة المستنيرة: لا ينطبق.

شكر وتقدير: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671065 و32071018)، وخطة تطوير العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيلين (202520YY01017404).

تضارب المصالح: المؤلفون يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة؛ في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة، أو في قرار نشر النتائج.

مراجع

1. كيرشنر، الإدارة الطبية للنزف داخل المخ: العودة إلى الأساسيات. كثافة العمليات. جيه كلين. تدرب. 2008، 62، 521-522.[CrossRef] [مجلات]

2. أندرسون، CS؛ هيلي، إي. هوانغ، Y.؛ وانغ، J.؛ ستاف، سي؛ ديلكورت، C.؛ ليندلي، ر. روبنسون، T.؛ لافادوس، ب. نيل، ب. وآخرون. انخفاض سريع في ضغط الدم لدى المرضى الذين يعانون من نزيف حاد داخل المخ. ن. إنجل. جيه ميد. 2013، 368، 2355-2365. [CrossRef] [مجلات]

3. قريشي، منظمة العفو الدولية؛ مندلو، م. هانلي، DF نزيف داخل المخ. لانسيت (لندن. الإنجليزية) 2009، 373، 1632-1644. [المرجع المتقاطع]

4. احتفظ بالترددات اللاسلكية؛ هوا، Y.؛ Xi، G. نزيف داخل المخ: آليات الإصابة والأهداف العلاجية. لانسيت نيورول. 2012، 11،720-731. [المرجع المتقاطع]

5. شراج، م.؛ كيرشنر، هـ. إدارة النزف داخل المخ: ندوة مركزة من JACC. ج. صباحا. كول. كارديول. 2020، 75، 1819-1831.[CrossRef] [مجلات]

6. كانداسامي، ر.؛ إدريس، ز.؛ عبد الله، جراحة النزف داخل المخ. في جراحة الأوعية الدموية العصبية، الأساليب الجراحية لأمراض الأوعية الدموية العصبية؛ يوليو، J.، Wahjoepramono، EJ، Eds.؛ سبرينغر: سنغافورة، 2019؛ ص 201-210.7. بروتون،

7. بروتون، ر. ريوتنس، العاصمة؛ سوبي، CG آليات موت الخلايا المبرمج بعد نقص تروية الدماغ. السكتة الدماغية 2009، 40، e331 – e339. [CrossRef] [مجلات]

8. كريستيانسن، م.؛ جرافيرسين، JH؛ جاكوبسن، C .؛ سون، O.؛ هوفمان، هـ. القانون، كورونا؛ Moestrup، SK تحديد مستقبلات زبال الهيموجلوبين. طبيعة 2001، 409، 198-201. [المرجع المتقاطع]

9. مادانجارلي، ن.؛ بونساك، ف؛ داساري، ر. سوكوماري-راميش، إس. النزف داخل المخ: مكونات الدم والسمية العصبية. علوم الدماغ. 2019، 9، 316. [المرجع المتقاطع]

10. دينر، MS؛ كينيدي، TE؛ فاضلي، أ.؛ سيرافيني، T .؛ تيسييه لافين، م.؛ يتوسط Sretavan وDW Netrin-1 وDCC توجيه المحور العصبي محليًا في القرص البصري: يؤدي فقدان الوظيفة إلى نقص تنسج العصب البصري. الخلايا العصبية 1997، 19، 575-589. [المرجع المتقاطع]

11. كينيدي، TE؛ سيرافيني، T .؛ دي لا توري، JR؛ Tessier-Lavigne، M. Netrins هي عوامل كيميائية منتشرة للمحاور العصبية الصوارية في الحبل الشوكي الجنيني. خلية 1994، 78، 425-435. [المرجع المتقاطع]

12. فلوريس، سي. دور النترين -1 في تنظيم ووظيفة نظام الدوبامين mesocorticolimbic. J. الطب النفسي العصبي. Jpn.2011، 36، 296-310. [المرجع المتقاطع]

For more information:1950477648nn@gmail.com