Acteoside المشتق من cistanche يحسن هشاشة العظام الناجم عن الجلوكوكورتيكويد عن طريق تنشيط مسار PI3K / AKT / mTOR

خلاصة

موضوعي

تستخدم الجلوكوكورتيكويدات على نطاق واسع في الممارسة السريرية ؛ ومع ذلك ، يمكن أن تسبب آثارًا جانبية ، مثلهشاشة العظام. أكتوسيدتم استخدام (ACT) من Cistanche لمكافحة مجموعة متنوعة من الأمراض. أجريت الدراسة لتقييم فعالية ACT في المستحثة بالجلوكوكورتيكويدهشاشة العظام(GIOP) وآليتها المحتملة.

أساليب
تم حقن ديكساميثازون (Dex) في العضل للحثهشاشة العظامفي نموذج الفئران ، وتم إعطاء ACT شفويا. تم استكمال ACT في الجسم الحي في تحفيز DexالعظامMC3T 3- خلايا E1. تم إجراء RT-qPCR لتقييم مستويات مرناتكوين العظام(Runx2 ، CoL1A1) ، وارتشاف العظم (OPG و RANKL). تم تطبيق مجموعة ELISA التجارية لتقييم مستويات OC و CTX في المصل. تم إجراء لطخة غربية لتقييم مستويات البروتين في مسار إشارات PI3K / AKT / mTOR. تم إجراء فحص CCK والتدفق الخلوي -8 لتقييم صلاحية بانيات العظم وموت الخلايا المبرمج.

انقر هنا للحصول على Cistanche Acteoside لعلاج ورم العظام الذي يحفزه Dex

نتائج
خفض ACT تدهور البنية المجهرية للعظام الناجم عن Dex ، وزيادة مستويات OC في المصل ، وخفض مستويات CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and تعزيز موت الخلايا المبرمج؛ ومع ذلك ، تم تخفيف هذا التأثير بشكل كبير بواسطة ACT (P.< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

استنتاج
ACT منسيستانشقد يمارس تأثيرات واقية من العظام عن طريق تنشيط مسار إشارات PI3K / AKT / mTOR للتخفيف من هشاشة العظام التي يسببها ديكس.

الكلمات الدالة:أكتوسيد سيستانشالتي يسببها الجلوكوكورتيكويدهشاشة العظام

مقدمة
هشاشة العظام (OP) هو مرض عام في الهيكل العظمي يتميز بانخفاض كتلة العظام ، وتدمير البنية المجهرية لأنسجة العظام ، وعدم التوازن في استتباب العظام [1]. يسبب OP أكثر من 8.9 مليون كسر سنويًا وتحدث كسور هشاشة العظام كل 3 ثوانٍ تقريبًا ، وتؤدي إلى إعاقة مدى الحياة أو الوفاة [2]. تُعطى القشرانيات السكرية (GCs) بشكل شائع لعلاج الأمراض الالتهابية غير المعدية (مثل الربو ومرض التهاب الأمعاء) بالإضافة إلى أمراض المناعة الذاتية [3]. ومع ذلك ، فإن استخدام GC على المدى الطويل يهيئ لأكثر من 30 بالمائة من حالات OP وأكثر من 10 بالمائة من حالات تنخر العظم [4]. تثبط الخلايا الجذعية السرطانية بشكل مباشر تكاثر بانيات العظم وتمايزها [5] ، وتقلل من النضج والنشاط ، وتحفز موت الخلايا المبرمج لبانيات العظم ، مما يؤدي بدوره إلى الإصابة بهشاشة العظام التي يسببها الجلوكورتيكويد (GIOP) [6]. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن ضعف بانيات العظم هو السبب الرئيسي لفقدان العظام. لذلك ، يبدو أن الزيادة في عدد ووظيفة بانيات العظم هي الاستراتيجية الرئيسية لمنع OP ، وخاصة GIOP.

تم استخدام الأدوية العشبية ، وخاصة تلك التي تعتمد على المركبات الطبيعية ، منذ آلاف السنين لعلاج الأمراض المختلفة [7]. Cistanche هو عشب ثمين مسجل في الأدوية الصينية وينمو في المنطقة الجنوبية من منطقة Xinjiang Uygur ذاتية الحكم ويُعرف باسم الجينسنغ الصحراوي [8]. ثبت أن للكيستانش تأثيرات مختلفة ، مثل تقوية المناعة ، وحماية الكلى ، ومكافحة الشيخوخة ، ومضادات الأكسدة ، ومضادات الالتهاب ، وتأثيرات الحماية العصبية [9].أكتوسيد(ACT) هو غلوكوزيد فينيل إيثانول في Cistanche ، وله أنشطة بيولوجية ، مثل تثبيط موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية [1 0] ، وتخفيف تلف الكبد [11] ، ومضادات الالتهاب [12] ، ومضادات الأكسدة [13] ، والوقاية من مرض السكري [14] ، والسمنة [15] ، وكذلك تنكس الغضروف المفصلي [16]. علاوة على ذلك ، أبلغت العديد من الدراسات عن الحرائك الدوائية لـ ACT وأكدت أن التأثير العلاجي موجود حتى لو كان الاستخدام الفموي 0.12 بالمائة فقط. يعتبر ACT دواءً أوليًا مع نواتج أيضية نشطة في الجسم الحي [17].

تشانغ وآخرون. أظهر تأثير وقائي محتمل لـ ACT على فقدان العظام الناجم عن استئصال المبيض في الفئران [18]. يعدل ACT مسار إشارات IGF -1 / PI3K / mTOR لمنع فقدان العظام في الفئران المصابة بداء السكري [19]. تم الإبلاغ عن أن مسار PI3K / AKT / mTOR له أدوار تنظيمية مهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك GIOP [20]. يخفف Naringin من GIOP من خلال تنظيم مسار إشارات PI3K / AKT / mTOR [21]. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم مسار الإشارات هذا تمايز بانيات العظم [22] ، وتكوين العظام [23] ، والتئام الكسور [24]. ومع ذلك ، فإن الدور المحتمل لـ ACT على GIOP وما إذا كان يتم تنظيمه من خلال تعديل مسار إشارات PI3K / AKT / mTOR غير معروف.

هدفت الدراسة الحالية إلى فهم التأثيرات الوقائية لـ ACT في نموذج الفئران GIOP وخلايا العظم في المختبر وتوضيح الآليات الجزيئية الأساسية.

المواد والأساليب
حيوانات تجريبية
تم الحصول على أربعين {{0} أسبوعًا من ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) التي تزن 280-340 جم من مركز شنغهاي للحيوانات المختبرية (CAS ، شنغهاي ، الصين). تم تنفيذ إجراءات رعاية حيوانات التجارب وفقًا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة للمستشفى الثالث التابع لجامعة تشيتشيهار الطبية. وأجريت الدراسة بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية ARRIVE. تم إيواء الحيوانات في مراكز حيوانية خالية من مسببات الأمراض ، 24 ± 2 درجة ، 12 ساعة من دورات الضوء والظلام ، 50 ± 5 في المائة من الرطوبة ، مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.

بناء نموذج GIOP
بعد 7 أيام من التغذية التكيفية ، تم تقسيم الجرذان بشكل عشوائي إلى مجموعات تحكم ونموذج باستخدام طريقة جدول الأرقام العشوائية ، وتم حقن ديكساميثازون (Dex ، Sigma-Aldrich St. Louis ، MO ، USA) 5 مجم / كجم مرتين في الأسبوع لمدة 6 أسابيع. عضليًا للحث على OP في الفئران في المجموعة النموذجية [25]. تم حقن الفئران في المجموعة الضابطة (ن = 10) بكمية متساوية من المحلول الملحي. لم يلاحظ أي تغيرات كبيرة في وزن الجسم في الفئران في كلا المجموعتين في 6 أسابيع. بعد ذلك ، تم تقسيم الفئران في المجموعة النموذجية إلى مجموعة النموذج ، ومجموعة جرعة منخفضة من ACT (نموذج زائد ACT-L) ، ومجموعة جرعة عالية ACT (نموذج زائد ACT-H). تم الحصول على ACT (HPLC 98 بالمائة) من Baoji Herbest Bio-tech.، Ltd. (Baoji ، الصين) ، وتم معالجته بمحلول مذيب مائي. تم إعطاء جرعة مقدارها 5 0 مجم / كجم / يوم و 1 {23}} 0 مجم / كجم / يوم من مادة ACT عن طريق الفم للفئران في مجموعات الجرعات المنخفضة والعالية (8 فئران لكل مجموعة) ، على التوالي ، و استمر لمدة 8 أسابيع. من بينها ، تم حساب حجم العينة بناءً على دراسة سابقة [26]. بالنظر إلى مستوى أهمية ثنائي الجوانب يبلغ 0.05 [فاصل ثقة 95 بالمائة (= 0. 05)] ، 80 بالمائة قوة ، وحجم تأثير 0.5 ، قدر تحليل القدرة حجم العينة المطلوب المكون من 6 حيوانات لكل مجموعة بافتراض وجود مستوى التأثير ذي الصلة بهشاشة العظام بنسبة 30 في المائة. علاوة على ذلك ، مع معدل تسرب 20 في المائة ، تم اعتبار 8 حيوانات لكل مجموعة (إجمالي 32 جرذًا) مثالية.

عينات مصل الفئران
بعد 8 أسابيع ، تم تخدير الفئران بنسبة 10 بالمائة من هيدرات الكلورال (400 مجم / كجم ، داخل الصفاق ، سولاربيو ، بكين ، الصين) ، تم جمع الدم من الشريان الأورطي البطني ، وتم تخثره في درجة حرارة الغرفة ، وطرده عند 3500 دورة في الدقيقة / دقيقة لمدة 10 دقائق. تم تخزين المصل في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل حتى الاستخدام الإضافي.

تقييم كثافة المعادن في العظام
تم استخدام الكثافة المعدنية للعظام (BMD) بواسطة مقياس DAX لكثافة عظام الحيوانات الصغيرة (شركة Ranzhe Instrument Equipment Co. ، شنغهاي ، الصين). لفترة وجيزة ، تم وضع الفئران في وضع ضعيف ووضعت الأطراف الخلفية للخارج. تم مسح عظم الفخذ الأيمن للجرذان وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، وتم تسجيل قيم كثافة المعادن بالعظام [27].

تحليل شكل العظام
في نهاية التجربة ، تم قتل الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من هيدرات الكلورال الزائدة ، وتم تثبيت عظام الفخذ في 70 بالمائة من الإيثانول. بعد ذلك ، تم إجراء عمليات المسح على نظام VivaCT 40μCT كما هو موضح في الدراسة السابقة وحجم العظام / الحجم الكلي (BV / TV) ، ورقم التربيق العظمي (Tb.N) ، وسمك التربيق العظمي (Tb.Tn) ، وفصل العظم التربيقي (Tb.Sp) تم تقييمها [28]. للقتل الرحيم ، تم تخدير فئران SD بعد تحليل مورفولوجيا العظام عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 10 في المائة من هيدرات الكلورال (350 مجم / كجم).

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
تم استخدام مجموعات ELISA التجارية للكشف عن مستويات osteocalcin (OC ، E-EL-R0243c ، Elabscience) و telopeptide C-terminal (CTX ، E-EL-R1405c ، Elabscience) في مصل الفئران. باختصار ، تمت إزالة الكواشف عند درجة 18-25 للمعايرة وتحضير المحلول للغسيل والعمل القياسي. تم إعداد لوحات الإنزيم مع آبار قياسية وفارغة وعينة. تمت إضافة حوالي 100 ميكرولتر من محلول مخفف للعينة إلى الآبار ، واحتضانها لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة ، واستبدالها بجسم مضاد معالج بيوتينيل لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة. بعد الغسل ، تمت إضافة محلول عمل ربط الإنزيم واحتضانه لمدة 30 دقيقة. تمت إضافة محلول الركيزة (90 ميكرولتر) ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة مع الحماية من الضوء. عندما ظهر التدرج الأزرق في الآبار القياسية ، تمت إضافة 50 ميكرولتر من محلول الإنهاء وتم تحليل التغيير في OD450.

PCR النسخ الكمي العكسي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
تمت إضافة كاشف TRlzol LS إلى مصل الفئران وخلايا MC3T المعالجة بـ ACT 3- ، وتم استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق الحضانة عند درجة حرارة الغرفة متبوعًا بإضافة الكلوروفورم. تم تأكيد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاصية A260 / 280 في مقياس الطيف الضوئي Nanodrop ND -1000. تم استخدام مجموعة SuperScript II Reverse Transcriptase للنسخ العكسي لـ RNA إلى (كدنا). بعد ذلك ، تم تطبيق (كدنا) كقالب ، وتمت إضافة مادة أولية ، وتم خلط مجموعة المزيج الرئيسي SYBR-Green PCR واستكمالها بـ ddH2O إلى 20 ميكرولتر ، وتم إجراء تفاعل تضخيم PCR باستخدام النظم الحيوية التطبيقية AMI7500 Fast Real-time PCR نظام (ABI ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام GAPDH كمرجع داخلي للتطبيع ، وتم حساب مستويات التعبير النسبي باستخدام طريقة 2 − Ct وتم إجراؤها في ثلاث نسخ. يتم عرض التسلسل التمهيدي لعامل النسخ المرتبط بـ Runt 2 (Runx2) ، ونوع الكولاجين I 1 (CoL1A1) ، ومُنشط مستقبلات العامل النووي- B يجند (RANKL) ، osterix ، و osteoprotegerin (OPG) في الجدول 1.

تحليل لطخة غربية
تمت إضافة محلول RIPA الذي يحتوي على 1 في المائة من مثبط الأنزيم البروتيني إلى الخلايا ، وتم جمع البروتين الكلي من كل مجموعة بعد تحلل الخلايا عن طريق الاهتزاز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات. تم استخدام مجموعة اختبار BCA لتحديد تركيز البروتينات في كل مجموعة. بعد ذلك ، تم خلط عينات البروتين مع 10 في المائة من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) بكميات متساوية وغليها في حمام مائي عند 95 درجة لمدة 5 دقائق لتمسخ البروتين. تم تحضير جل عمودي SDS-polyacrylamide بنسبة 12 بالمائة ، وبعد ترسيخ الهلام ، تم أخذ عينات من 30 ميكروغرام من البروتين لفصل الفصل الكهربائي للهلام 120 مللي أمبير 90 دقيقة. تم بعد ذلك نقل البروتين إلى غشاء PVDF عند 90 فولت لمدة 120 دقيقة. بعد الختم باستخدام 5 في المائة من ألبومين مصل الأبقار ، تم قطع غشاء PVDF بناءً على الوزن الجزيئي للعلامة وشريط البروتين المستهدف واحتضانه مع الجسم المضاد الأولي المقابل طوال الليل عند 4 درجات. تم تخفيف الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد p-AKT و p-mTOR و p-PI3K إلى نسبة 1: 1000 (Proteintech ، ووهان ، الصين). تم غسل TBST لمدة 30 دقيقة واحتضانه مع الجسم المضاد الثانوي المسمى بيروكسيداز الفجل المقابل عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم تصور اللطخة باستخدام كواشف اللمعان الكيميائي المحسنة. تم قياس كثافة نطاقات البروتين باستخدام Image J. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم لحساب مستويات البروتين النسبية.

ثقافة الخلية وتجميعها
تم شراء بانيات العظم السابقة للفأر MC3T 3- E1 من مجموعات زراعة الأنسجة الصينية (CTCC ، الصين) وزُرعت في -MEM تحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين في حاضنة مرطبة عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لثقافة تمايز العظام ، تم تصنيع وسيط الحث العظمي عن طريق خلط 10 ملي مولار - - فوسفات الجلسرين و 50 مجم / مل من حمض الأسكوربيك (Sigma-Aldrich) مع -MEM وإضافته إلى خلايا MC3T {17}} E1 للحث تمايزهم. تم تغيير الوسيط بعد 3 أيام. تم استخدام الثقافات لمدة 14 يومًا من أجل بقاء الفوسفاتيز القلوي (ALP). علاوة على ذلك ، تمت معالجة الخلايا مسبقًا باستخدام مثبط PI3K LY294002 (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة ، متبوعًا بالعلاج باستخدام Dex و ACT.

فحص جدوى الخلية
تم إجراء اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) لتقييم جدوى بانيات العظم المعالجة بـ ACT. تم تلقيح خلايا MC3T 3- E1 في 96 طبقًا جيدًا عند 5 × 103 خلية / بئر. تم النظر في كمية 1 ميكرومتر من Dex بناءً على دراسات سابقة [29] واحتضانها بتركيزات متدرجة من ACT (10−8 ، 10−7 ، 10−6 ، 10−5 م). تم استبدال وسط الاستزراع في أطباق البئر 96- بعد إضافة وسيط خلط وكاشف CCK -8 بنسبة 10: 1. بعد استمرار الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة ، تم تقييم التغيير في OD450.

الكشف عن رقم موت الخلايا المبرمج
تم هضم خلايا MC3T 3- E1 التي خضعت لعلاجات مختلفة باستخدام التربسين الخالي من EDTA وتم جمعها بالطرد المركزي. بعد الغسيل باستخدام محلول ربط 1 × ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من الملحق V-FITC واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، مع استكماله بـ 5 ميكرولتر PI وتمريره عبر 200- شبكة نايلون شبكية. تم تحليل العينات باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي FACScan.

مقايسة نشاط ALP
تم تلقيح خلايا MC3T 3- E1 في 24- لوحات جيدة ، وتمت إضافة ACT و Dex بعد التجصيص. تم استبدال وسط زراعة الخلايا بوسيط تمايز عظمي للثقافة. بعد استخدام تحلل الخلايا بمحلول تحلل الخلية (P0012J ، Beyotime Biotechnology) ، تم جمع المادة الطافية بالطرد المركزي ، وتم رسم المنحنى القياسي. تم استخدام مجموعة ALP (P0132S ، Beyotime Biotechnology) لتقييم نشاط ALP وتم حساب OD450.

تحليل احصائي
بعد إجراء ثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ ، تم تحليل البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism 6. 0 وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري. تم استخدام ANOVA لمقارنة الفروق الإحصائية بين مجموعات متعددة. تم اعتبار القيمة P <0. 05 مختلفة إحصائيًا.