Acteoside في النباتات الطبيعية الصينية لتحسين مرض الكلى -- الجزء الأول
Mar 03, 2022
جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com
منتج طبيعي من مادة الأكتيوسايد يخفف من إصابة الكلى في الفئران المصابة بداء السكري / ديسيبل وخلايا HK {0} من خلال تنظيم مسار إشارات NADPH / oxidase-TGF- / Smad
تشينوين وانغ|شينجين داي وآخرون
تم تصميم هذه الدراسة للتحقيق في الآثار الوقائية وآلياتأكتيوسيدعلى DKD في ذكور فئران ديسيبل / ديسيبل وخلايا HK -2 المُحدثة بالجلوكوز. تم تقسيم فئران السكري ديسيبل / ديسيبل بشكل عشوائي إلى المجموعة النموذجية ومجموعة الميتفورمين ومجموعة إيربيسارتان وأكتيوسيدمجموعة. لاحظنا المنتج الطبيعي لـأكتيوسيدتظهر تأثيرا كبيرا فيحماية الكلىمن خلال تحليل المؤشرات البيوكيميائية والمستقلبات الذاتية ، الملاحظات النسيجية المرضية ، والنشاف الغربي. تم استخدام خلايا HK -2 المعرضة لارتفاع نسبة الجلوكوز في التجارب المعملية. تم فحص الآليات الجزيئية بواسطة RT-PCR واللطخة الغربية.أكتوسيديمنع خلايا HK -2 التي يسببها ارتفاع الجلوكوز وفئران السكري ديسيبل / ديسيبل عن طريق تثبيط مسار إشارات NADPH / oxidase-TGF- / Smad.أكتوسيدينظم المسار الأيضي المضطرب لعملية التمثيل الغذائي للدهون ، وأيض الجليوكسيلات والديكاربوكسيلات ، وأيض حمض الأراكيدونيك. اكتشفنا المنتج الطبيعي لـأكتيوسيديعرض تأثيرًا كبيرًا علىحماية الكلى.مهدت هذه الدراسة الطريق لمزيد من استكشاف الإمراض والتشخيص المبكر وتطوير عامل علاجي جديد لـ DKD.
الكلمات الدالة أكتيوسيد، مريض بالسكرمرض كلوي، التنميط الأيضي ، مسار إشارات NADPH / أوكسيديز- TGF- / Smad ، ROS
الجزء الأول
1|المقدمة
أكتوسيدهو مكون تمثيلي لجليكوسيدات الفينيثانويد ، الموزعة على نطاق واسع في 79 جنسًا من النباتات ، مثل Rehmannia glutinosa ،Cistanche Deserticolaوالنباتات الطبية الأخرى.أكتوسيديتميز بحمض الكافيين وهيدروكسي إيروسول المرتبطين بجزء جلوكوز من خلال روابط الإستر والجليكوسيد ، على التوالي ، مع وحدة رامنوز مرتبطة بجزيء الجلوكوز (Zhao et al. ، 2015). يقال أنأكتيوسيديمتلك أنشطة دوائية على نطاق واسع ، مثلالكلىالحماية (Gan et al. ، 2018) ، مضادات الأكسدة (He et al. ، 2011) ، الحماية العصبية (Li ، Zhou ، Xu ، Song ، & Lu ، 2018) ، حماية الكبد (Lee et al. ، 2004) ، مضاد للسرطان (Ohno ، Inoue، Ogihara، & Saracoglu، 2002) وهكذا. ومع ذلك ، فإن الآثار الوقائيةأكتيوسيدفي السكريإصابة كلويةغير واضح.
يعد مرض السكري أحد أسرع حالات الطوارئ الصحية العالمية نموًا في القرن الحادي والعشرين. في عام 2019 ، تشير التقديرات إلى أن 463 مليون شخص يعانون من مرض السكري ومن المتوقع أن يصل هذا العدد إلى 578 مليون بحلول عام 2030 ، و 700 مليون بحلول عام 2045.مرض كلوي(DKD) والمرحلة النهائيةامراض الكلى(الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) يستمر في الارتفاع (هو ، 2011). DKD هي واحدة من أكثر مضاعفات الأوعية الدموية الدقيقة المزمنة لمرضى السكري التي يخشى حدوثها والسبب الرئيسي لمرض الداء الكلوي بمراحله الأخيرة. معدل الوفيات لجميع الأسباب لدى الأفراد المصابين بمرض DKD أعلى بحوالي 30 مرة من معدل الوفيات لدى مرضى السكري غير المصابين باعتلال الكلية. تشير الدراسات الحديثة إلى ذلككلويالانتقال الظهاري الأنبوبي اللحمية المتوسطة (EMT) وتراكم المصفوفة خارج الهيولى (ECM) فيكلوييلعب الخلالي العوامل الرئيسية في التسبب في DKD (He et al. ، 2015 ؛ Yao et al. ، 2014). أفادت الدراسات المتزايدة أن تطوركلويتم التوسط في التليف في اعتلال الكلية السكري من خلال العديد من مسارات الإشارات. تم إثبات TGF- كعامل ممرض رئيسي في معظم أنواع CKD المرتبطة بالتليف ، بما في ذلك DKD (Lv & Zhang ، 2019). مركب الإشارات غير المتجانسة ، الناتج عن ارتباط TGF - 1 بمستقبلات من النوع الثاني وبدوره مستقبل من النوع الأول ، يحول الإشارات من خلال Smads المنظم بالمستقبلات (Smad2 / 3) والشريك المشترك Smad (Smad4) ، مما يؤدي إلى تنظيم نسخ الجينات المستهدفة (سييرا وآخرون ، 2015). يمكن أن يؤدي تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية إلى ضغوط تأكسدية في الخلية ، مما يؤدي إلى تلف المكونات الخلوية بما في ذلك البروتين والحمض النووي. في النهاية ، يؤدي الإجهاد التأكسديكلويتليف وتراجع فيوظيفة الكلى. يتم قبول أوكسيدات NADPH (NOX) كمصادر رئيسية لتوليد ROS في اعتلال الكلية السكري والمزمنمرض كلوي. من المحتمل أيضًا أن يسهم التنظيم الأعلى والتنشيط المفرط لأكاسيد النيتروجين في الإجهاد التأكسدي في المراحل الفيزيولوجية المرضية. ارتفاعكلوييؤدي مستوى ROS من خلال تنشيط NOX بوساطة ارتفاع السكر في الدم إلى الإجهاد التأكسدي ، مما يؤدي إلى تلفأنسجة الكلى، تسبب DKD (Lee، An، Kim، & Bae، 2020).
الأيض هي تقنية جديدة ومهمة لتحليل نوعي وكمي لجميع المستقلبات الجزيئية الصغيرة في الخلايا الحية والأنسجة وسوائل الجسم. كنظام جديد لتحديد التغيرات الأيضية الشاملة للكائنات الحية ، تقدم الأيض رؤى جديدة لدراسة مرض السكري ومضاعفات مرض السكري (Lu، Xie، Jia، & Jia، 2013).
كان الغرض من هذه الدراسة هو معرفة التأثير الوقائي للمنتج الطبيعيأكتيوسيدعلى DKD لذكور الفئران المصابة بمرض السكري ديسيبل / ديسيبل وخلايا HK -2 المستحثة عن طريق ارتفاع نسبة الجلوكوز في المختبر وآلياته. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم اعتماد الفئران ديسيبل / ديسيبل لتقييمكلويالآثار الوقائيةأكتيوسيد، وتم تحليل تنظيم المستقلبات المختلفة في مصل الدم لإلقاء الضوء على آلياتأكتيوسيد. علاوة على ذلك ، فإن نموذج HK -2 الناجم عن ارتفاع الجلوكوز في المختبر يقيِّم فعاليةأكتيوسيدعلى الفئران ديسيبل / ديسيبل عن طريق تحديد مستويات التعبير عن مسار الإشارة NADPH / أوكسيديز- TGF- / Smad.
2|المواد والأساليب
2.1|الكيماويات والأدوات
تم شراء أسيتونتريل UPLC من شركة Merck (دارمشتات ، ألمانيا) ؛ تم شراء حمض الفورميك من Sigma-Aldrich (Sigma ، St. Louis ، Missouri).أكتوسيد(نقاء أكبر من أو يساوي 98 في المائة) تم شراؤه من المعاهد الوطنية لمراقبة الأغذية والأدوية (بكين ، الصين). هيكلأكتيوسيدهو مبين في الشكل 1 أ. مجموعة كاشف نيتروجين اليوريا (BUN) في المصل ، مجموعة كاشف الأسبارتات أمينوترانسفيراز (GOT) ، مجموعة كاشف ألانين أمينوترانسفيراز (GPT) ، مجموعة كاشف الكوليسترول الكلي (TCHO) ، مجموعة كاشف الدهون الثلاثية (TG) ، مجموعة كاشف الكرياتينين في المصل ، الألبومين المجهري البولي تم شراء مجموعة الكاشف (mALB) ومجموعة كاشف الأنسولين (INS) من معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (نانجينغ ، الصين). تم شراء أقراص Metformin hydrochloride من Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd ؛ تم شراء Irbesartan من Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co.، Ltd. تم شراء DMEM و F12 من GIBCO ، أمريكا ؛ تم شراء أول جسم مضاد لـ NOX1 (رقم الكتالوج: ab121009) و NOX2 (رقم الكتالوج: ab129068) و NOX4 (رقم الكتالوج: ab154244) و Smad7 (رقم الكتالوج: ab216428) من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة). -SMA (رقم الكتالوج: 19245) ، E-cadherin (رقم الفهرس: 3195) ، NF-κB p65 (رقم الكتالوج: 8242) ، TGF - 1 (رقم الكتالوج: 3711) ، Smad2 (رقم الكتالوج: 5339) ، Smad3 (رقم الكتالوج: 9523) ، Smad4 (رقم الكتالوج: 46535) ، و PSmad2 / 3 (رقم الكتالوج: 8828) تم شراء أول جسم مضاد من CST. كانت جميع المواد الكيميائية والكواشف الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة من الدرجة التحليلية ومصنوعة في الصين.
نظام Waters Acquity ™ Ultra Performance LC (مياه) مزود بمقياس طيف Quattro Micro MS وجهاز Waters Xevo TM G2 QTof MS (تقنيات Waters MS ، مانشستر ، نيو هامبشاير). تمت تنقية المياه منزوعة الأيونات على نظام Milli-Q (ميليبور ، بيدفورد ، ماساتشوستس). تم اعتماد محطة عمل Mass Lynx v4.1 لتحليل البيانات ، وتم استخدام جهاز طرد مركزي فائق السرعة عند درجة حرارة منخفضة (Thermo Scientific ، المملكة المتحدة) ومجهر DMI3000M (Leica ، ألمانيا).
2.2|ظروف التجارب الحيوانية
تمت مراجعة جميع الإجراءات والبروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية بجامعة نانجينغ للطب الصيني (نانجينغ ، الصين). كانت البروتوكولات الموصوفة في الدراسة الحالية في اتفاق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. تم شراء الفئران من مركز أبحاث النماذج الحيوانية بجامعة نانجينغ (رقم الشهادة Su 2015–0001). تم إجراء جميع التجارب على 8- فئران ذكور ديسيبل / ديسيبل عمرها أسبوع وفئران من النوع البري ديسيبل / م متطابقة مع العمر مع وزن أولي للجسم يبلغ 30 40 جم. نموذج الفأر السكري ديسيبل / ديسيبل هو نموذج حيواني معترف به دوليًا لمرض السكري. أظهرت الدراسات أن آلية DKD في الفئران ديسيبل / ديسيبل مماثلة لتلك التي لدى البشر. تم إيواء الحيوانات في أقفاص ذات رطوبة ثابتة (حوالي 60 بالمائة ± 2 بالمائة) ودرجة حرارة (حوالي 23 ± 2 درجة) ودورة فاتحة / مظلمة لمدة 12 ساعة. كانت الحيوانات تمر بفترة تكيف مدتها 3 أسابيع ، سُمح خلالها لها بالوصول غير المحدود إلى طعام الطعام ومياه الصنبور. بعد فترة التأقلم ، تم تقسيم الفئران ديسيبل / ديسيبل بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات كل منها ستة مجموعات: مجموعة نموذجية (محلول ملحي عادي ، M) ، مجموعة الميتفورمين (250 مجم كجم)-1 d-1، EJSG) ، مجموعة إيربيسارتان (50 مجم كجم-1 d-1، EBST) ،أكتيوسيدالمجموعة (70 مجم كجم-1 d-1، MRHTG) ، مرة في اليوم (Gao ، Peng ، Huo ، Liu ، & Yan ، 2015). علاوة على ذلك ، في هذه الدراسة ، تم اختيار الميتفورمين والإربيسارتان كأدوية تحكم إيجابية. تم الإبلاغ عن أن الإربيسارتان يمكن أن يخفض ضغط الدم والدهون في الدم ودهون الكلى.ليس له أي تأثير على جلوكوز الدم ودهون الكبد. يمكن أن يحسن الوظيفة والتغيير المرضيالكلىعدد الفئران ديسيبل / ديسيبل. التأثير الوقائي للميتفورمين علىالكلىينعكس في الحد من بروتينية في الفئران المصابة بداء السكري ومرضى السكري من النوع 2. تم استقراء الجرعة الحيوانية من الميتفورمين والإربيسارتان من الجرعة اليومية للإنسان ، باستخدام طريقة تطبيع مساحة سطح الجسم. بعد ذلك ، تم إعطاء الفئران الدواء المقابل مرة واحدة يوميًا عن طريق غسل المعدة لمدة 6 أسابيع ، وتم استخدام db / الفئران كمجموعة تحكم ، والتي تم إعطاؤها نفس حجم المحلول الملحي في نفس الوقت.
2.3|جمع العينات
خلال الفترة التجريبية ، تم تسجيل أوزان الجسم ومستويات الجلوكوز في الدم (FBG) أسبوعيًا ، وتم قياس مستويات FBG بواسطة نظام مراقبة الجلوكوز في الدم One Touch Ultra II (Life Scan ، Milpitas ، كاليفورنيا) عن طريق الوريد الذيل كل يوم اثنين (الساعة 8 صباحًا) ). بعد 6 أسابيع من الإعطاء ، صُممت الفئران في أقفاص استقلابية مع حرية الوصول إلى الماء لجمع 24 ساعة من البول. تم طرد جميع عينات البول على الفور عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق بعد التجميع ، وتم فصل المواد الطافية وتخزينها عند درجة -80 حتى التحليل. في نهاية الدراسة ، تم التضحية بالفئران تحت التخدير بنسبة 10٪ كلورال هيدرات (3 ملجم / كجم) ، وتم جمع الدم لتركيز البارامترات البيوكيميائية ودراسة الأيض. بعد ذلك ، تم طرد عينات الدم عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وفصل عينات الدم وتخزينها عند درجة -80 حتى التحليل. تمت إزالة الكلية اليمنى بقطعة واحدة ثابتة مع 10٪ فورمالين مخزون محايد للفحص النسيجي. الكلويتم عزل القشرة عن القطعة الأخرى وتجميدها في نيتروجين سائل من أجل النشاف الغربي.
القسطرة لعلاج الفشل الكلوي
2.4|زراعة الخلايا وعلاجها
تم الحصول على خط RTEC البشري HK {0} من شركة Nanjing Keygen Biotechnology Development Co.، Ltd. الوسيط الكامل كان منخفض الجلوكوز DMEM مع 1 0 بالمائة من FBS و 1 بالمائة من محلول البنسلين الستربتومايسين. تمت زراعة خلايا HK -2 في 37 درجة و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ورطوبة مشبعة. تمت زراعة الخلايا الفرعية عند التقاء 80 في المائة ، والتي تمت إزالتها من الحاضنة ، وتم التخلص من الوسط الأصلي في الطبق. تم شطف الخلايا باستخدام 0.5 مل من محلول ملحي فوسفاتي (PBS) وهضمها بالمعالجة بـ 0.5 مل من التربسين لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة. تم إنهاء الهضم باستخدام وسيط DMEM سعة 2 مل ، وتم بعد ذلك الطرد المركزي لمعلق الخلية عند 450 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم التخلص من المادة الطافية وتم إعادة تعليق الخلايا في وسيط DMEM المقابل 2 مل للحصول على تعليق أحادي الخلية. تم زرع الخلايا في أطباق / أطباق ميكروية مختلفة بكثافات مختلفة للتجارب اللاحقة ، كما هو موضح أدناه. تم طلاء خلايا HK -2 على أطباق وأطباق الآبار 96- ، وتم معالجتها مسبقًا باستخدام DMEM منخفض الجلوكوز (5 مليمول / لتر) ، وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون2لمدة 6 ساعات ، ثم تمت مزامنتها. تم تقسيم المجموعات التجريبية على النحو التالي: المجموعة الضابطة (C) ، دون عامل التدخل. المجموعة النموذجية (M) ، حيث تمت زراعة الخلايا في محلول DMEM عالي الجلوكوز (30 مليمول / لتر) ؛ مجموعة التحكم في الضغط الأسموزي (DMEM plus 24.5 mmol / L mannitol ، GLC) ؛ مجموعة irbesartan (25 مليمول / لتر) وأكتيوسيد(MRHTG) في خمس جرعات (5 ، 10 ، 25 ، 50 ، و 100 ميكرولتر / لتر) ، على التوالي.
2.5|مورفولوجيا الخلية
تم غسل خلايا HK -2 مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ومشاهدتها تحت مجهر مقلوب (OLYMPUS IX51). لوحظ شكل الخلايا تحت 100 تكبير.
2.6|قياسات المؤشرات البيوكيميائية
الفعالية العلاجية لـأكتيوسيدعلى الفئران ديسيبل / ديسيبل تم تقييم مستويات mALB في البول و FBG و INS و T-CHO و TG و Scr و GOT و GPT و BUN في المصل ، والتي تم اكتشافها متبوعة بالوصف المقدم من الشركة المصنعة للمجموعة.
2.7|التحليل المرضي
جزء منكلويتم إجراء القشرة من أجل تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوزين (HE) وتلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) من أجل مراقبة التغيرات المرضية فينسيج كلوي، درجات تضخم الأنسجة التليفية ، هياكل الكبيبات والأنابيب من خلال مجهر إلكتروني (400). عند التقاط صورة ، حاول أن تملأ مجال الرؤية بالكاملأنسجة الكلىللتأكد من أن ضوء الخلفية لكل صورة هو نفسه. تم استخدام برنامج Image-Pro Plus 6. 0 لتحديد نفس اللون الأحمر الأرجواني كمعيار موحد للحكم على إيجابية جميع الصور. تم الحصول على الكثافة البصرية المتراكمة (IOD) للتعبير الإيجابي للغشاء القاعدي ومساحة البكسل للضفيرة الوعائية الكبيبية (AREA) من خلال تحليل كل صورة ، وتم حساب متوسط الكثافة البصرية (IOD / AREA).
2.8|النشاف الغربي
أنسجة الكلىوتم استخلاص الخلايا باستخدام محلول تحلل ؛ تم طرد المحللين. بعد التحلل الحراري الكامل ، تم جمع أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 12000 دورة في الدقيقة ، وتم جمع المادة الطافية والمواد الطافية. تم استخدام مجموعة تركيز بروتين حمض Bicinchoninic (BCA) لتحديد تركيز البروتين. بعد القياس الكمي ، تم حل البروتين بنسبة 10 بالمائة SDS-PAGE ، ونقله إلى أغشية PVDF ، ثم حظر في 5 بالمائة من مساحة سطح الجسم في TBST ، واحتضانه بالأجسام المضادة الأولية متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة. تم اكتشاف تفاعل الجسم المضاد بعد ذلك بواسطة ECL وقياسه كميًا باستخدام برنامج ImageJ.أنسجة الكلىتم تحليل العينات بواسطة النشاف الغربي للكشف عن مستويات التعبير عن -SMA ، TGF - 1 (1: 1300) ، Smad2 (1: 3000) ، Smad3 (1: 1000) ، P-Smad2 / 3 (1: 500 ) ، Smad4 (1: 1000) ، و Smad7 (1: 1000) بروتين.
2.9|تحليل ELISA
إفراز بروتين الجذب الكيميائي وحيد الخلية -1 (MCP -1) ، إنترلوكين -1 (IL -1) ، عامل نخر الورم- (TNF-) ، وإنترلوكين -6 (IL -6) في المادة الطافية لكل خلية بواسطة مجموعة ELISA.
2.10|الوقت الحقيقي PCR
علاوة على ذلك ، تم تحضير هذه الخلايا لـ PCR في الوقت الفعلي لفحص مستويات التعبير عن NOX1 و NOX2 و NOX4 و -SMA و E-cadherin و NF-κB p65 و TGF - 1 و Smad2 و Smad3 و Smad4 و Smad7 مرنا. تم جمع الخلايا في كل مجموعة (حوالي 1 107 خلية). تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وفقًا لطريقة Trizol ذات الخطوة الواحدة ، وتم تحديد نقاوتها وتركيزها. مع GAPDH كمرجع داخلي ، كان التسلسل التمهيدي كما يلي. TGF - 1 ، أساس الحواس: 5- ACACATCAGCTCCGAGAA -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- GAGGTATC GCCAGGAATTGT -3 ؛ E-cadherin ، المعنى التمهيدي: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC -3 ، التمهيدي المضاد: 5- GGTGAATTCGGGCTTGTTGT -3 ؛ NF-κB p65 ، أساس الحواس: 5- CTTCCTGCCCTACAGAGGTC -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC -3 ؛ NOX1 ، المعنى التمهيدي: 5- CCTAGAAGGGCTCCAAACCA {{33} } ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- GGAAGGCATCCACAAACAGG -3 ؛ NOX2 ، المعنى التمهيدي: 5- ACCCTTCGCATCCATTCTCA -3 ، التمهيدي المضاد للحساسية: 5- TCTGCAAACCACTCAAAGGC -3 ؛ NOX4 ، المعنى التمهيدي: 5- CAAGCAGGAGAACCAGGAGA -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- AGTTGAGGGCATTCACCAGA -3 ؛ Smad2 ، المعنى التمهيدي: 5- TGAGCACGTGAGGTGAGATT -3 ، التمهيدي المضاد: 5- CTCCATCACAGTGCACCAAG -3 ؛ Smad3 ، المعنى التمهيدي: 5- CAGCCGGTTTGGATTACAGG -3 ، التمهيدي المضاد: 5- GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT -3 ؛ Smad4 ، المعنى التمهيدي: 5- CACTGCCAACTTTCCCAACA -3 ، التمهيدي المضاد للحساسية: 5- ATCCATTCTGCTGCTGTCCT -3؛ Smad7 ، المعنى التمهيدي: 5- AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- GCGGACTTGATGAAGATGGG -3 ؛ -SMA ، المعنى التمهيدي: 5- GGTGCTGTCTCTCTATGCCT -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- CAGATCCAGACGCATGATGG -3 ؛ GAPDH ، المعنى التمهيدي: 5- TGGTATCGTGGAAGGACTCA -3 ، التمهيدي المضاد للمعنى: 5- CCAGTAGGGCAGGGATGAT -3.
2.11|تحليل احصائي
تتوافق البيانات والتحليل الإحصائي مع التوصيات الخاصة بالتصميم التجريبي والتحليل في علم الأدوية. كانت جميع التجارب عشوائية ومعمية. يتم التعبير عن النتائج على أنها M ± SD / SEM للعدد المشار إليه (ن) للتجارب المستقلة. يتم تقديم البيانات في الدراسة الحالية على أنها M ± SD / SEM من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تم تحليل أهمية الاختلافات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey (أكثر من مجموعتين) أو اختبار t للطالب (مجموعتان). يتم إجراء الاختبارات اللاحقة فقط عندما يصل F إلى p <. 0="" 5="" ،="" ولم="" يكن="" هناك="" تباين="" كبير="" في="" عدم="" التجانس.="" كانت="" جميع="" الاختبارات="" ثنائية="" الجانب="" ،="" واعتبرت="" p=""><.05 ذات="" دلالة="" إحصائية.="" تم="" إجراء="" التحليل="" الإحصائي="" باستخدام="" برنامج="" graphpad="" prism="">
Cistanche acteoside لتحسين الكلى
2.12|شروط UPLC-QTOF / MS وتحليل البيانات
تم إذابة جميع عينات المصل في درجة حرارة الغرفة قبل التحضير. تمت إضافة 3 0 0 ul acetonitrile إلى 100 ul من عينات المصل إلى البروتين المترسب ، وخلطها بقوة لمدة 60 ثانية. تم طرد جميع العينات عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. أخيرًا ، تم حقن المادة الطافية في تحليل UPLC-QTOF / MS. تم إجراء فصل المستقلب باستخدام نظام Waters Acquity ™ Ultra Performance LC (Waters) المجهز بنظام Waters Xevo ™ G2 Q / TOF-MS (تقنيات Waters MS). تم حقن قسامة من 2 مايكرولتر من محلول العينة على Acquity UPLC BEH C18 (100 مم 2.1 مم ، 1.7 ميكرومتر ، شركة ووترز كوربوريشن ، ميلفورد ، كونيتيكت) عند 35 درجة وكان معدل التدفق 0.4 مل / دقيقة. تتكون المرحلة المتنقلة المثلى من الماء (أ) (يحتوي على 0.1 في المائة من حمض الفورميك) والأسيتونتريل (ب). كانت شروط شطف UPLC المُحسَّنة لتحليل المصل 0 3 دقيقة ، 95 بالمائة 55 بالمائة أ ؛ 4 13 دقيقة ، 55 بالمائة 5 بالمائة أ ؛ 13 14 دقيقة ، 5 بالمائة أ. تم الحفاظ على جهاز أخذ العينات عند 4 درجات.
تم إجراء قياس الطيف الكتلي باستخدام Xevo ™ G2 QTof (Waters MS Technologies) ، ورباعي القطب ، ومقياس كتلة متعامد لوقت الرحلة. تم استخدام Leucine-enkephalin ككتلة قفل لتوليد [M plus H]زائدأيون (m / z 556.2771) و [MH]-أيون (m / z 554.2615) في الوضعين الموجب والسالب ، على التوالي. كان تركيز leucine-enkephalin 2 0 0 بيكوغرام / مل وكان معدل تدفق التسريب 100 ميكرولتر / دقيقة لضمان الدقة أثناء تحليل MS عبر مضخة حقنة. تم جمع البيانات في وضع النقطه الوسطى من 100 إلى 1 ، 000 م / ع. لكل من وضعي الرش الكهربائي الموجب والسالب ، تم ضبط جهد الشعيرات الدموية والمخروط عند 3.0 كيلو فولت و 30 فولت على التوالي. تم ضبط غاز الإذابة على 600 لتر / ساعة عند درجة حرارة 350 درجة ، وتم ضبط غاز المخروط على 50 لتر / ساعة وضبط درجة حرارة المصدر على 120 درجة. تم ضبط معدل الحصول على البيانات على 30 مللي ثانية ، مع تأخير 0.02 ثانية بين الفراغات.
بالإضافة إلى ذلك ، تم اختيار 10 عينات مصل عشوائيًا من كل مجموعة وخلطها معًا كعينة مراقبة الجودة (QC) ، على التوالي. تم استخدام عينة QC لتحسين حالة UPLCQTOF / MS ، حيث احتوت على معظم المعلومات من العينة بأكملها. تم حقن عينات مراقبة الجودة ست مرات في بداية التشغيل من أجل تكييف أو موازنة النظام ثم كل 10 عينات لمزيد من مراقبة استقرار التحليل. كل يوم ، بعد معايرة الجهاز ، تم تحليل عينة مراقبة الجودة أولاً لاختبار ثبات الجهاز من أجل ضمان الأداء المتسق للنظام.
تم التحكم في جميع عمليات الحصول على البيانات وتحليلها بواسطة برنامج Waters MassLynx v4.1. تم تحليل مصفوفة البيانات متعددة المتغيرات بواسطة برنامج EZinfo 2. 0 (Waters Corp.). تتضمن المعلمات الرئيسية نطاق وقت الاستبقاء 0 14 دقيقة ؛ نسبة الكتلة م / ع 100 1 ، 000 ، نطاق تحمل الكتلة 0. {{1 0} 1 دا ، حد ذروة الشدة 50 ، نافذة الجودة 0.05 دا ، الاحتفاظ نوافذ زمنية 0.20 دقيقة ، واكتشاف تلقائي لارتفاع الذروة بنسبة 5 بالمائة والضوضاء. تم تطبيع شدة كل أيون فيما يتعلق بإجمالي عدد الأيونات لإنشاء مصفوفة بيانات تتكون من وقت الاستبقاء وقيمة m / z ومنطقة الذروة الطبيعية.
تم تقديم مصفوفات البيانات الناتجة إلى برنامج EZinfo 2. 0 لتحليل المكون الرئيسي ، والتحليل الجزئي للمربعات الصغرى المميزة (PLS-DA) ، والإسقاط المتعامد لتحليل الهياكل الكامنة (OPLS-DA). من OPLS-DA ، يمكن تحديد المستقلبات المختلفة على أنها مسؤولة عن الفصل بين مجموعة التحكم ومجموعة النموذج ، وبالتالي تم اعتبارها علامات محتملة. تم استخراج العلامات المحتملة ذات الأهمية من S-plots التي تم إنشاؤها بعد التحليل باستخدام OPLS-DA ، وتعرضت المتغيرات التي كان لها مساهمات كبيرة في التمييز بين المجموعات لمزيد من تحديد الصيغة الجزيئية.
الأهمية المتغيرة (VIP) في قيمة الإسقاط هي مجموع مربعات مرجحة لأوزان PLS ، واعتبرت المتغيرات مع VIP> 1 مؤثرة في فصل العينات في مخططات النقاط الناتجة عن تحليل OPLS-DA. في جميع التجارب ، تم تعيين مستوى الثقة بنسبة 95٪ لتحديد أهمية الاختلاف (p <. 0="" 5).="" تم="" اختيار="" هذه="" المتغيرات="" في="" النهاية="" كمؤشرات="" حيوية="" محتملة.="" تم="" وصف="" مخططات="" نقاط="" pls-da="" بواسطة="" معلمة="" التحقق="" المتبادل="" r2y="" و="" q2="" ،="" والتي="" تمثل="" التباين="" الإجمالي="" الموضح="" لمصفوفة="" x="" وإمكانية="" التنبؤ="" بالنموذج="" ،="" على="" التوالي.="" يتم="" الحصول="" على="" نماذج="" ممتازة="" عندما="" تكون="" القيم="" التراكمية="" لـ="" r2y="" و="" q2="" أعلى="" من="" 0.8.="" تم="" حساب="" المسافات="" النسبية="" بين="" مجموعات="" الإدارة="" ومجموعة="" التحكم="" من="" مخطط="" نقاط="" pls-da="" بمتوسط="" القيمة="" (المحور="" السيني="" والمحور="" الصادي)="" لجميع="" عينات="" مجموعة="" التحكم="" كنقطة="">
تم تحديد المستقلبات المحتملة المختارة وفقًا لتحديد دقيقة m / z ، ووقت الاستبقاء ، وجزء MS / MS النموذجي ونمط المؤشرات الحيوية المحتملة أعلاه ، والتي تم الحصول عليها في أوضاع الأيونات الإيجابية والسلبية. تم إجراء بناء المسار الأيضي باستخدام Metabo Analyst ، وهي أداة قائمة على الويب لتصور الأيض (https: // www. metaboanalyst.ca/) استنادًا إلى مصادر قاعدة البيانات بما في ذلك KEGG (HTTP: // www.genome .jp / kegg /) وقواعد بيانات HMDB (http: //www.hmdb. ca /) للبحث. كان لوقت الاستبقاء وشظية MS / MS النموذجية ونمطها فائدة كبيرة لتضييق نطاق الجزيئات الممكنة.
يمكن أن يحسن Acteoside في Cistanche وظائف الكلى
3|النتائج
انقر هنا للحصول على معلومات حول الجزء الثاني (نتائج) من هذه المقالة.
مقتبس من: "منتج طبيعي لـ"أكتيوسيدتحسينإصابة في الكلىفي فئران السكري ديسيبل / ديسيبل وخلايا HK -2 من خلال تنظيم مسار إشارات NADPH / oxidase-TGF- / Smad '----- بواسطة Qinwen Wang|شينجين داي وآخرون
---- أبحاث العلاج بالنباتات. 2021 ؛ 35: 5227-5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002 / ptr.7196