مستخلص من خلايا Oenothera Biennis التي تتمتع بنشاط مضاد للشيخوخة للجلد يحسن الخصائص الميكانيكية للخلايا

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:شيخوخة الجلد هي عملية معروفة جدًا تؤدي إلى تدهور تدريجي في السمات الميكانيكية للجلد بسبب انخفاض إنتاج آلية المصفوفة الخارجية الخلوية والتغيير المتزامن في عملية الانكماش. لإبطاء هذا التقدم ، من الضروري تحفيز التعبير عن العديد من البروتينات القادرة على تعزيز تكوين الألياف المرنة وإصلاح الأنسجة. هنا ، تم فحص المستخلص المائي لزراعة الخلايا Oenothera bi-Ennis من وجهة نظر كيميائية ، ثم تم اختباره في المختبر ، في الخلية ، وفي التجارب خارج الجسم الحي كمساعد في مقاومة شيخوخة الجلد وفقًا لذلك ، تم أظهر أن مستخلص Oenothera biennis كان قادرًا ، من خلال زيادة التعبير الجيني MYLK ، على تعزيز تقلص كولاجين المصفوفة ، وبلمرة الأكتين ، وإنتاج بروتينات ECM الأساسية.

الكلمات الدالة:الأيض. الشبكات الجزيئية مستخلص محبة للماء من مزارع خلايا Oenothera biennis ؛ انكماش الكولاجين المصفوفة. شيخوخة الجلد

1 المقدمة

شيخوخة الجلد هي عملية معروفة جدا تنتج عن عوامل داخلية وخارجية. أثناء الشيخوخة ، تتدهور جميع الوظائف الفسيولوجية الجلدية بلا هوادة ، وهذا التدهور التدريجي يضر الجلد [1]. في الواقع ، يسقط الجلد تدريجيًا ميزاته الميكانيكية ، ويرجع ذلك إلى انخفاض إنتاج بروتينات المصفوفة خارج الخلية وإلى التغيير المتزامن في عملية الانكماش [2]. أهم مكونات مصفوفة الأدمة الخارجية الخلوية هي البروتينات مثل الكولاجين الأول والثاني لامينين والبيريوستين والتيناسين والإيلاستين والفيبرونكتين والبروتيوغليكان ، حيث تلعب الكمية النسبية وحالة الطي دورًا رئيسيًا في التفاعل بين الخلايا و مصفوفة تضمن الملمس المناسب للأدمة [3]. على سبيل المثال ، في الفضاء خارج الخلية ، يلعب الفبرونكتين دورًا رئيسيًا في تجميع المصفوفة لأنه يشكل جسرًا بين مستقبلات سطح الخلية (على سبيل المثال ، الإنتغرينات) والكولاجين والبروتيوغليكان وجزيئات الالتصاق البؤري الأخرى. تساهم اللامينين في بنية المصفوفة خارج الخلية وتعديل الالتصاق والتمايز والهجرة واستقرار النمط الظاهري ومقاومة موت الخلايا المبرمج. الإيلاستين مهم أيضًا للالتصاق الخلوي وهجرة الخلايا ، وله القدرة على المشاركة في إشارات الخلية. تتفاعل الفبريلينات بالمثل عن كثب مع التروبولاستين والإنتغرينات ، وهي مهمة لتجميع الإيلاستين في ألياف مرنة. يرتبط Fabulous بإحكام بالأغشية السفلية والألياف المرنة ومكونات أخرى من المصفوفة خارج الخلية ، ويشارك في تكوين الألياف المرنة. Tenascins هي بروتينات سكرية متعددة الأشكال خارج الخلية (ECM) تتوسط العمليات الليفية لتمكين الإصلاح الفعال للأنسجة. يقومون بإعداد الشد المناسب للجلد ، مما يعزز الاتصالات بين مكونات المصفوفة ، والتي بدورها مسؤولة عن انضغاط الأدمة وكثافتها ومقاومتها. على أساس تنظيم الهيكل الخلوي الخاص بهم ، هناك آلية الأكتين - الميوسين ، التي تحدد التغيرات المحتملة في شكلها وهيكلها. في الواقع ، يؤدي ارتباط الأكتين والميوسين إلى تشكيل خلوي أكثر إحكاما ، مما يجعل الألياف أقرب إلى بعضها البعض ، مما يضمن نمو أنسجة صحية ومضغوطة ، ويمنع تفكك الألياف مما يؤدي إلى ظهور التجاعيد. ومع ذلك ، فإن قدرة الخلايا الليفية على الانقباض والتمدد تضيع جزئيًا على مدى سنوات لأن الخلايا المسنة لم تعد قادرة على العمل بشكل صحيح وكامل. نظرًا لقوة ميكانيكية منخفضة ، فإن الخلايا الليفية تتجه إلى شكل أكثر تقريبًا وتشوهًا من الشكل الممدود [5]. أشارت بعض الأدلة إلى أنه خلال الشيخوخة ، انخفض تخليق بروتين يسمى MYLK (Myosin Light Chain Kinase) بشكل ملحوظ. تمتلك MYLK نشاط كيناز يتم إجراؤه عن طريق الفسفرة في مجال معين من الميوسين ، يُسمى السلسلة الخفيفة التنظيمية للميوسين ، وهي قادرة على تحفيز ارتباط الأكتين وبالتالي تعزيز انقباض الخلية [6].بيوفلافونويدسعندما تم الكشف عن نشاط منخفض لهذا البروتين ، بسبب ، على سبيل المثال ، تعبير أقل للبروتين ، تم قياس الانخفاض المقابل في تقلص كولاجين المصفوفة [7] وبلمرة الأكتين [8]. لا يرتبط تجميع الهيكل الخلوي للأكتين بحركة الخلية والقدرة على الانقباض فحسب ، بل يرتبط أيضًا بإنتاج بروتين مصفوفة ECM من خلال تنشيط مستقبل TGF-II (TGFBRII) [9]. ينتمي TGFBRII إلى مركب مستقبلات سطح الخلية TGF الذي ينظم ، من خلال تنشيط عوامل نسخ Smad ، التعبير عن العديد من مكونات ترميز الجينات في ECM ، بما في ذلك الكولاجين واللامينين والفيبرونيكتين والبروتيوغليكان [10]. يؤدي تفكيك الهيكل الخلوي للأكتين إلى تنظيم مستقبلات TGF -Il. هذا التنظيم النازل ، بدوره ، يقلل من إنتاج الكولاجين وبروتينات ECM الأخرى ، مما يؤدي إلى فقدان كتلة الجلد وهشاشة الجلد.

في الواقع ، تهدف العديد من مكونات مستحضرات التجميل إلى تحفيز تخليق العديد من العوامل الرئيسية المسؤولة عن الحفاظ على الانضغاط الصحيح لمصفوفة الجلد وتقلص الجلد بشكل جيد. في هذا السيناريو ، فإن المستخلصات المشتقة من فصيلة Oenothera biennis (زهرة الربيع المسائية) ، التي تنتمي إلى عائلة Onagraceae ، تحظى باهتمام كبير نظرًا لمحتواها من المركبات النشطة بيولوجيًا مثل الأحماض الدهنية والفينولات والترايتيربين والفلافونويدات ، والتي تم استخدامها بالفعل. تم اختباره في علاج الأمراض الجلدية المختلفة [11]. تم الإبلاغ عن بعض هذه المستقلبات ، بدورها ، لتثبيط وسطاء الالتهاب مثل إنترلوكين 1 (IL -1) ، وإنترلوكين 6 (IL -6) ، والسيتوكينات ، وعامل نخر الورم (TNF-) [12 ]. علاوة على ذلك ، تحمي مقتطفات من أجزاء Oenothera biennis الهوائية خلايا HaCaT من H ، O ، تلف الحمض النووي الناتج عن موت الخلايا عن طريق منع الضرر الخلوي بسبب الإجهاد التأكسدي من خلال آلية تتضمن إزالة ROS ومسار إشارات Nrf2 / HO -1 [ 13]. علاوة على ذلك ، تم اقتراح زيت Oenothera biennis الغني بالدهون كمرطب جيد لمرضى الأكزيما بفضل قدرته على اختراق الجلد بسهولة [14]. لسوء الحظ ، قد تحتوي مستحضرات استخراج النباتات المزروعة ، المستخدمة في مستحضرات التجميل ، على بعض العيوب: أولاً ، يمكن أن تكون ملوثة بمواد سامة أو مسببة للحساسية مثل المبيدات الحشرية أو الأسمدة أو الملوثات ؛ بعد ذلك ، تخضع النباتات لضغط لا يمكن التنبؤ به وظروف موسمية أو تغيرات في توافر المغذيات ، والتي يمكن أن تحفز تخليق نواتج الأيض غير المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتوي المستخلصات على كائنات دقيقة مسببة للأمراض ، مما يقلل من جودة المنتجات النهائية. كل هذه العيوب ، بدورها ، تتقارب مع خطر وجود محتوى متغير من المستقلبات الثانوية وقابلية استنساخ منخفضة. للتغلب على نقاط الضعف هذه ، أصبح استخدام مزارع الخلايا النباتية في مستحضرات التجميل أكثر شيوعًا ويحظى بتقدير كبير ، لأنه يتغلب على العديد من العيوب المذكورة أعلاه [15].

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

في هذه الدراسة ، تم وصف مستخلص محبة للماء من مزارع خلايا Oenothera biennis (ObHEx) بشكل كامل من خلال مناهج متقدمة قائمة على قياس الطيف الكتلي ، بمساعدة المعلومات الحيوية ، واختبارها في فحوصات كيميائية حيوية وبيولوجية متعددة. يحتوي الخليط على مركبات نشطة بيولوجيًا من قشور و triterpenes بشكل أساسي ، مثل حمض الأرجونوليك وحمض آسياتيك ، والذي ارتبط سابقًا بإنتاج الكولاجين الأول في الخلايا الليفية البشرية [16 ، 17]. تم فحص المستخلص لقدرته على زيادة تعبير MYLK ، وتعزيز تقلص كولاجين المصفوفة ، وبلمرة الأكتين ، وإنتاج بروتينات ECM التي تنظمها TGF ، والتي تساعد على تقلص الأدمة ، وبالتالي إبطاء شيخوخة الجلد.

2. النتائج

2.1.التحليل النوعي والكمي للمستخلص القابل للذوبان في الماء من ثقافة خلية Oenothera Biennis

تم إجراء تحليل UPLC-MS / MS لـ ObHEx وتم استغلال بيانات قياس الطيف عالية الدقة للتوصيف الكيميائي باستخدام الشبكات الجزيئية الاجتماعية للمنتجات الطبيعية العالمية (GNPS) ، وهو نظام قياس طيفي قائم على الويب يساعد في تحديد المنتجات الطبيعية والتعليق عليها. (مصادر الطاقة النووية) [18]. ويهدف إلى أن يكون قاعدة معرفية مفتوحة الوصول للمنظمات على مستوى المجتمع ولمشاركة بيانات قياس الطيف الكتلي الخام والمعالجة أو المشروحة (MS / MS). على وجه التحديد ، تم إجراء عمليات البحث في مكتبة طيفية GNPS ووظيفة الشبكات الجزيئية القائمة على الميزات (FBMN): سمح لنا التحليل الأول بتحديد المركبات الطبيعية ، ومقارنة أطياف MS / MS الخاصة بهم مع تلك الخاصة بالمستقلبات ذات الخصائص الهيكلية ، والثاني إلى المجموعة ذات الصلة NPs داخل شبكة منذ تم عرض أنماط تجزئة MS / MS مماثلة بواسطة جزيئات متشابهة هيكليًا [19]. كما هو مبين في الشكل 1 والجدول 1 ، تم تحديد العديد من NPS بلا شك على أنها تنتمي إلى عدة فئات من المستقلبات الثانوية ، بشكل رئيسي قشور (سلفادور جانبًا و liriodendron) و triterpenes (حمض مرياتيك ، حمض أريونوليك ، حمض آسياتيك ، وهيدراجينين). تم تحديد الأنواع الكيميائية التي لم تحددها GNPS وفقًا للأدبيات.

كمثال على استخدام GNPS ، تم الإبلاغ عن الشبكة المشتقة من تحليل FBMN في الشكل 2 أ ، مما يوضح أن ObHEx يحتوي على العديد من triterpenes الأخرى غير المميزة المتعلقة بحمض المرياتيك (18 ، م / ض 503.3389 ، RT 21.89 دقيقة: تحديد حمض المرياتيك لديه تم تأكيده من خلال المقارنة مع معياره التحليلي). على سبيل المثال ، تم تحديد العديد من الأنواع غير المميزة سابقًا في m / z 701 و 665 على أنها أشكال جليكوزيلات مرتبطة بحمض المرياتيك أو أيزومراته ، على التوالي رطبة أو غير مع جزيئين من H O

علاوة على ذلك ، الأيونات المبلغ عنها في m / z 729 ، 703 ، 699687685 ، 683 مشتقة على التوالي من الارتباط بالجليكوزيل بالإضافة إلى جزيئين من H ، O من الأنواع في m / z531 ، 505 ، 501 ، 489 ، 487 ، و 485: لم يتحقق تحديدهم أحادي البؤرة ، ولكن من المفترض أن يكونوا جميعًا ترايتيربينات ، ويرتبطون بحمض المرياتيك أو متجانساته ، بسبب مسار تجزئة MSMS ، مؤخرًا ، تم عزل العديد من ترايتيربين مع m / 501 و 485 من أنواع أخرى من Oenothera ، Oenothera Maritima ، وبنيتها بها تم توضيحها على أساس البيانات الطيفية ، وبالتالي فهي مرتبطة جيدًا بنتائجنا [20].

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

قدم تحليل FBMN أيضًا معلومات عن المستقلبات عند m / z 617.3862 (أيونات MS2 عند m / z 453،145 و 119) الموجودة في الشبكات الجزيئية الموضحة في الشكل 2 ب ولم يتم الإبلاغ عنها في الأدبيات الخاصة بأنواع Oenothera. تتطابق قيمة m / z وتجزئةها مع 2- OEp-coumaroyl apostolic acid أو أيزومراته ، مما يثبت ، على الأقل ، وجود triterpene coumaroyl وأيضًا إسترات caffeoyl في المستخلص. في الواقع ، أظهر MS- أطياف الأنواع عند m / z 649 (RT 25.72 و 27.19) وجود أيونات عند m / z 179 و 161 و 135 بسبب انقسام جزء حمض الكافيين ، في حين أن أطياف MS2 للأنواع الأخرى ذكرت في الشكل 2 ب عند m / z 633 (RT 26.88 ، 27.20 ، 28.12 و 28.43) ، 649 (RT24.18 ، 24.65 ، 24.83) ، و 661 (RT 30.28) أظهرت أيونات عند م / ض 145 و 119 ، والتي كانت مميزة لشق الكومارويل.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0. 9911) ضمن النطاقات المختبرة. علاوة على ذلك ، أشار حد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOO) إلى أن الطرق المستخدمة تميزت بحساسية عالية. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من التحليل الكمي (الجدول 3) أن liriodendron و hederagenin كانا اللجنان الممثل الرئيسي و triterpene ، على التوالي.

2.3. تحليل التعبير الجيني MYLK في HDF

تم اختبار نشاط ObHEx في HDF على التعبير عن جين MYLK ، الذي يشفر الكيناز المسؤول عن سلسلة فسفرة الميوسين الخفيفة (الشكل 3 أ). أشارت النتائج إلى أن العلاج بالمستخلص بكلا التركزين زاد من التعبير الجيني MYLK بنحو 50 في المائة ، على غرار التحكم الإيجابي TGF-.

2.4 تحليل قدرة الانكماش لمصفوفة الكولاجين

لتقييم نشاط ObHEx على القدرة الانقباضية لألياف الكولاجين ، استخدمنا HDF المشتت في أقراص جل الكولاجين [21]. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، تسبب المستخلص ، عند التركيز المنخفض ، في زيادة كبيرة في تقلص قرص الكولاجين ، مما يشير إلى وجود تأثير محتمل على ثبات الكولاجين. العلاج بـ ML7 (1- (5- iodonaphthalene -1- sulfonyl) -1 H-hexahydro -1 ، 4- ديازيبين) ، أحد مثبطات MYLK ، ألغى هذه الزيادة ، مشيرًا إلى أن كلا من المستخلص و TGF- يعملان من خلال MYLK لتقلص قرص الكولاجين.

2.5 قياس مستوى بلمرة الأكتين

تم فحص قدرة ObHEx على تحفيز بلمرة الأكتين عن طريق قياس مستوى الأكتين المبلمر في الخلايا ، ومعالجته بالمستخلص والتحكم الإيجابي TGF- ، بمفرده وفي وجود ML7. كما هو مبين في الشكل 3 ج ، أسفرت المعالجة بتركيزات المستخلصات عن زيادة في كمية البوليمر أكتين بحوالي 50 بالمائة ، مقارنة بـ 33 بالمائة من TGF-.شراء cistancheمرة أخرى ، ألغى ما قبل الحضانة مع ML7com هذا التأثير تمامًا ، مما يشير إلى تورط MYLK في بلمرة خيوط الأكتين.

2.6. تحليل مسار TGF RII / SMAD في HDF

للتحقق مما إذا كانت الزيادة في بلمرة الأكتين وتقلص الكولاجين للخلايا المعالجة بـ ObHEx مرتبطة أيضًا بتنشيط مسار نقل الإشارة بوساطة TGF RII ، لاحظنا أولاً التعبير عن جين TGF RII ثم نقل HDF مع SMAD {{ 0}} مراسل لوسيفيراز بلازميد وتقييم الزيادة في نشاط لوسيفيراز استجابة لعلاج ObHEx. أشارت النتائج الواردة في الشكل 3d ، e ، إلى أن العلاج باستخدام ObHEx عند 0. أدى 002 في المائة و 0.006 في المائة إلى زيادة التعبير عن TGF RII بطريقة مشابهة لـ TGF- المستخدمة كعنصر تحكم إيجابي ، ومتوازي ، تم زيادة نشاط لوسيفيراز المرتبط بـ SMAD بنسبة 80 و 40 في المائة على التوالي. تم الحصول على انخفاض كبير في الإشارة عندما عولجت الخلايا بـ ML7 ، مما يدل أيضًا على أن هذا النشاط مرتبط بـ MYLK.

2.7. تحليل برو-كولاجين 1 ، تروبولاستين ، وبيريوستين

كنتيجة لتنشيط نقل إشارة TGF RII ، قمنا بتحليل تخليق بروتينات المصفوفة الرئيسية خارج الخلية مثل procollagen type I ، و tropoelastin ، و periostin في HDF المُعامل بـ ObHEx بنسبة 0 .002 بالمائة. كما هو مبين في الشكل 3f ، زاد ObHEx من إنتاج البروتينات المشار إليها بحوالي 98 بالمائة و 75 بالمائة و 51 بالمائة على التوالي ، على غرار التحكم الإيجابي TGF-. تم إجراء المقاييس بواسطة اختبار ELISA ، باستخدام أجسام مضادة محددة ضد الكولاجين الأول ، التروبولاستين ، والبيريوستين.

2.8 تحليل MYLK و Phospho-Myosin و Collagen I و Tropoelastin على Ex-Vivo Skin Explants

كما هو مبين في الشكل 4 أ-ج ، أنتجت ObHEx زيادة كبيرة في إنتاج MYLK والميوسين الفسفوري في إإكسبلنتس جلد الإنسان.

تم تحليل تحريض الكولاجين الأول والتروبولاستين أيضًا في إإكسبلنتس الجلد المُعالج مسبقًا باستخدام ObHEx ثم معالجته بالهيدروكورتيزون لمدة 8 أيام لمحاكاة الشيخوخة الزمنية [22]. قلل العلاج بالهيدروكورتيزون من كمية الكولاجين 1 والتروبولاستين بأكثر من 1 0 0 بالمائة ، ووجود 0.002 بالمائة ObHEx استعاد كمية التروبولاستين بنسبة 91 بالمائة تقريبًا والكولاجين بنسبة 120 بالمائة ، مقارنة بـ أسكوربات يستخدم كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 4 د-و). يشير هذا إلى تأثير محتمل مضاد للشيخوخة لـ ObHEx ، وهو فعال بشكل خاص في زيادة صلابة الجلد من خلال العمل على مكونات مصفوفة الجلد.

2.9.Atomic Force Microscopy (AFM) في الجلد إكسبلنتس

من أجل جمع المزيد من المعلومات حول الخصائص الميكانيكية الحيوية للجلد التي تم تعزيزها من خلال العلاج باستخدام ObHEx ، قمنا بتقييم المرونة ، وهي خاصية ميكانيكية جوهرية لعينات الجلد من حيث معاملات Young الخاصة بهم [23]. كما هو موضح في القسم 4 ، لحساب معامل المرونة ، في عينات الجلد المعالجة وغير المعالجة ، قمنا بجمع منحنيات القوة باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) وتناسبها مع نموذج هيرتز [24 ، 25]. كما هو مبين في الشكل 5 ، فإن معالجة عينات الجلد بالمستخلص لها قيم وحدة يونغ أقل مقارنة بالعينات غير المعالجة ، مما يشير إلى تحسن في خصائص مرونة الجلد. على وجه الخصوص ، كشفت عينات الجلد غير المعالجة عن قيمة معامل يونغ المتوسطة البالغة 0. 37 ± 0. 15 جيجا باسكال ، بينما أظهرت عينات الجلد المعالجة باستخدام ObHEx قيمة متوسطة أقل من 0. {{11 }} 7 ± 0.02 معدل تراكمي. كانت قيم معامل يونج لعينات الجلد متوافقة مع الأدبيات [26-28].

3. مناقشة

تشكل مزارع الخلايا النباتية النهج الواعد للإنتاج المستدام للمستقلبات الثانوية النباتية ذات الأهمية التجارية ، حيث توفر إمدادًا مستمرًا بالمواد عن طريق الاستزراع على نطاق واسع وتشكل نظامًا مستدامًا وصديقًا للبيئة [29 ، 30]. وجدت مقتطفات من مزارع الخلايا النباتية تطبيقات واعدة في قطاعي الرعاية الصحية ومستحضرات التجميل ، لأنها تقدم بعض المزايا ذات الصلة ؛ (1) أنها تحتوي على نواتج أيضية تم تصنيعها بيولوجيًا في ظروف مختبر النمو الخاضع للرقابة ؛ (1) مشتقة من عمليات الإنتاج الموحدة ، مما يضمن نفس الخصائص النوعية والكمية للأنواع التي تم الحصول عليها ؛ (2) المستخلصات خالية من الملوثات مثل الكائنات الحية الدقيقة ومبيدات الأعشاب ومبيدات الآفات ومبيدات الفطريات ؛ (4) مستقلة عن التقلبات الجغرافية أو البيئية ويمكن الحفاظ على الأنواع النباتية للمستقبل أجيال. في هذه المسابقة ، تم فحص مستخلص مائي لخلايا Oenothera biennis (ObHEx) كمصدر واعد للجزيئات النشطة بيولوجيًا التي تتمتع بنشاط مضاد للشيخوخة للجلد. في الواقع ، تم التحقيق في ObHEx من خلال تحليلات UPLC-MSMS عالية الدقة إلى جانب مناهج المعلوماتية الحيوية لتحقيق توصيف هيكلي واسع. تم تحقيق التوصيف المركب بشكل أساسي باستخدام GNPS لتسريع عملية تحديد الهوية ، ومقارنة أطياف MS / MS مع تلك الخاصة بالمستقلبات المميزة هيكليًا ، علاوة على ذلك ، الكشف عن أنواع جديدة غير متوقعة ، وتجميع NPs المتشابهة داخل شبكة. علاوة على ذلك ، تمت أيضًا مقارنة وقت الاستبقاء والقياسات الدقيقة للكتلة وتحليلات MS2 مع تلك الخاصة بالمعايير ، وتمت مطابقة جميع البيانات مع الأدبيات. تم تحديد قشور نشطة بيولوجيًا و triterpenes ، مثل سلفادور جانبًا ، و liriodendron ، وحمض my-anthemic ، وحمض arjunolic ، وحمض Asiatic ، و hederagenin. أظهر Liriodendron [31] وحمض المرياتيك [32] نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة ، بينما أظهر hederagenin خصائص مضادة للشيخوخة للجلد بسبب تقليل الأكسدة الخلوية وتنشيط وظيفة البروتوزوم [33]. ومع ذلك ، اعتبرت الأحماض الأرجونولية والآسيوية مسؤولة بشكل أساسي عن بعض الأنشطة المختبرة التالية ، لأنها تحفز تخليق الكولاجين الأول. في الواقع ، لقد ثبت أن ObHEx يحسن الخصائص الميكانيكية الحيوية للجلد ، والتي تعتمد في الغالب على الكمية النسبية للمكونات المختلفة لـ ECM وعلى كيفية قدرة الخلايا الليفية على التعاقد وتوفير التوتر المناسب للألياف الجلدية.سيستانشفي الواقع ، يعزز ObHEx تقلص مصفوفة الكولاجين وبلمرة الأكتين عن طريق زيادة التعبير عن جين MYLK ، مما يعزز قوة تقلص الخلايا الليفية الجلدية. ينظم تجميع الهيكل الخلوي للأكتين مستقبلات TGF من النوع الثاني ، وبما يتوافق مع تحفيز إشارات TGF- / Smad ، يزيد من مستويات بروتينات ECM التي تنظمها TGF. في الواقع ، تحفز ObHEx على إنتاج الكولاجين من النوع الأول ، والبيريوستين ، والتروبولاستين. لذلك ، فإن كل هذه الخصائص تجعله مكونًا مرشحًا واعدًا جيدًا لاستخدامه في تركيبات مستحضرات التجميل لمحاربة فقدان البشرة ومرونتها المرتبط بالعمر. تم دعم هذا الافتراض من خلال النتائج التي تم الحصول عليها في تحليل AFM ، والتي أظهرت أن معالجة شرائح الجلد باستخدام ObHEx أدت إلى تحسين الخواص الميكانيكية للجلد ، والتي تم اكتشافها على أنها انخفاض في معامل يونج ، مما يشير إلى انخفاض كبير في صلابة الجلد وصلابة.

4. المواد والطرق

4.1. زراعة الأنسجة الأنسجة وتحضير استخراج

تم توفير نباتات Oenothera biennis بواسطة GEEL Floricultura ss وكانت من أصل إيطالي (تجنب تطبيق بروتوكول ناغويا). تم الحصول على مزارع الخلايا من أوراق نباتات Oenothera biennis عن طريق تحفيز تكاثر الخلايا الإنشائية على ألواح أجار صلبة حتى الحصول على الكالو. تم نقل الخلايا إلى وسط النمو السائل (Gamborg B5 ، مع استكماله بـ 24 dichlorophenoxyacetic acid (1 mg / L) ، adenine (1 mg / L) ، kinetin (0. 01 mg / L)). ، نمت الخلايا كمزارع معلق تحت الاهتزاز المداري. بمجرد الحصول على ثقافات تبلغ حوالي 150 جم / لتر ، تم جمع الخلايا وتحللها في محلول فوسفاتي (PBS) عند درجة الحموضة 7.4 لتحضير مستخلص قابل للذوبان في الماء ، والذي تم تجفيفه بالتجميد. تم إذابة المسحوق في الماء أو وسط استنبات الخلية بتركيزات مناسبة للاختبار.

4.2 تحليل UPLC-MSMS للتوصيف الكيميائي

تم تحضير ObHEx (5 {{1 0}} مجم / مل) وتم تقديمه إلى مادة البيوتانول / الماء ذات الطور الثنائي. تم تجفيف جزء البيوتانول وتذويبه في ميثانول (1 0 مجم / مل) قبل تحليل UPLC-MS / MS. تم تنفيذه على مطياف الكتلة Q-Exactive Classic من Thermo-Scientific (Waltham ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) مزودًا بنظام Thermo Scientific TM UltiMate 3 000 UPLC. تم إجراء جميع عمليات التشغيل الكروماتوغرافي باستخدام Phenomenex Luna③C 18 100 A （150 × 2.0 مم ، وحجم الجسيمات 3 ميكرومتر） العمود عند 40 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.200 مل / دقيقة. كان حجم الحقن 5 ميكرولتر. تتكون المرحلة المتنقلة من A (ماء من ROMIL Ltd و Convent Drive و Waterbeach و Waterbeach و Cambridge ، المملكة المتحدة بنسبة 0.1 بالمائة من حمض الأسيتيك) و B (100 بالمائة أسيتونيتريل من ROMIL Ltd و Convent Drive و Waterbeach و Cambridge ، المملكة المتحدة) باستخدام شطف متدرج من 5 بالمائة ب عند 0-5 دقيقة ، 5-14 بالمائة ب عند 5-8 دقيقة ، 14-32 بالمائة ب عند 8-11 دقيقة ، 32-95 بالمائة بات {{ 26}} دقيقة ، 95-98 بالمائة بات 32-33 دقيقة ، 98 بالمائة ب عند 33-38 دقيقة ، 98-5 بالمائة بات 38-39 دقيقة ، 5 بالمائة ب عند { {34}} دقيقة تم إجراء جميع تحليلات MS و MSMS في الوضع السلبي ESI مع معدل تدفق غاز الغمد عند 30 (وحدات عشوائية) ، ومعدل تدفق الغاز الإضافي عند 5 (وحدات عشوائية) ، وجهد الرش عند 3.2 كيلو فولت ، ودرجة حرارة الشعيرات الدموية و درجة حرارة سخان الغاز المساعد عند 300 درجة. تم الحصول على البيانات باستخدام وضع MS / dd-MS2 (Top5) الكامل. إعدادات MS الكاملة كانت: دقة 70.000 ، هدف AGC 1 × 106 ، حد أقصى لتكنولوجيا المعلومات 200 مللي ثانية ، ويمكن أن تتراوح إعدادات MS2 من 100 إلى 800 m / z. dd-MS2 كانت: دقة 17.500 ، هدف AGC 2 × 105 ، كحد أقصى IT يبلغ 65 مللي ثانية ، ونافذة عزل تبلغ 1.5 م / ض و NCE من 35.

تم التحقق منها يدويًا. تمت معالجة بيانات mzXML باستخدام Mzmine 2.53 قبل وظيفة الشبكات الجزيئية القائمة على الميزات (FBMN) على GNPS. تم إجراء خطوة الكشف الشامل باستخدام كاشف الكتلة النقطية الوسطى مع الحفاظ على مستوى الضوضاء عند 5 × 1 {{1 0} 3. تم إنشاء مخطط كروماتوجرام لخط تحليل البيانات الآلي (ADAP) بالإعدادات التالية: الحد الأدنى لحجم المجموعة في عدد عمليات المسح 5 ، حد كثافة المجموعة 5 × 1 {{2 0} ³ ، الحد الأدنى لأعلى كثافة 5 × 1 0 زائد ، تفاوت m / z لـ 0. 0 1 م / ع أو 1 0 جزء في المليون. تم تحقيق deconvolution المخطط اللوني باستخدام Wavelets (ADAP) كخوارزمية ، عتبة S / N من 3 ، ارتفاع ميزة دقيقة 1 × 1 0 5 ، عتبة معامل / منطقة 5 ، نطاق مدة الذروة 0. {{ 18}}. 00 دقيقة ، ونطاق موجات RT من 0. 00-0. 05. تم إزالة النظائر اللونية باستخدام خوارزمية هامور القمم النظيرية بتفاوت m / z يبلغ 0.001 م / ض أو 5.0 جزء في المليون وتفاوت RT قدره 0.10 دقيقة. تم إجراء وظيفة FBMN باستخدام التسامح الجماعي للوالدين بمقدار 0.02 Da وتحمل أيون MS4 للجزء 0.02 Da. تم ترشيح الحواف للحصول على عتبة درجة 0.7 وحد أدنى قممتين متطابقتين. علاوة على ذلك ، تم تعيين الحد الأقصى لعدد العقد المجاورة لكل عقدة على 10.

4.4. التحليل الكمي من Lignans و Triterpenes

تم استخدام نفس شروط UPLC التي تم الإبلاغ عنها للتحليل النوعي للتحليل الكمي للقشور ، بينما تم تحسينها بالنسبة إلى triterpenes من أجل فصل زوجين من الأيزومرات ، حمض الأرجونوليك وحمض آسياتيك. تم إجراء التحليل على مطياف الكتلة Q-Exactive Classic كما هو موضح سابقًا. تم إجراء الفصل بواسطة Phenomenex Kinetex⑧EVO C 18 300 A （15 0 × 2.1 مم ، حجم الجسيم 5 ميكرومتر）. يتكون الطور المتحرك من A (5 ملي مولار من محلول أسيتات الأمونيوم المائي ، الرقم الهيدروجيني 9. 00 معدل بواسطة هيدروكسيد الأمونيوم) و B (1 0 0 بالمائة أسيتونيتريل) باستخدام شطف متدرج من 17-28 بالمائة ب عند 0-18 دقيقة ، 28-65 بالمائة ب عند 18-22 دقيقة ، 65-75 بالمائة ب عند 22-26 دقيقة ، 75-95 بالمائة عند {{17 }} ، 5 دقائق ، 95 بالمائة عند 26 ، 5-30 دقيقة ، 95-17 بالمائة في 30-30 ، دقيقة واحدة ، 17 بالمائة في 30 ، 1-42 دقيقة. كان معدل التدفق 0.450 مل / دقيقة وكان حجم الحقن 5 مايكرولتر. بالنسبة لكل من lignans و triterpenes ، تم الحصول على البيانات باستخدام وضع MS-SIM كامل و PRM. كانت إعدادات MS-SIM الكاملة: دقة 70. 000 ، هدف AGC 3 × 106 ، بحد أقصى 200 مللي ثانية ، ويمكن أن يتراوح من 200 إلى 800 م / ض للقشور ومن 400 إلى 850 م / ع لتريتربينيس. كانت إعدادات PRM: دقة 70. 000 ، هدف AGC بمقدار 2 × 10 درجة ، والحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات 100 مللي ثانية ، ونافذة العزل 1.0 م / ض ، و NCE من 35 في حالة قشور و 50 في ذلك من ترايتيربينيس.cistanche أستراليااشترينا سلفادور جانبًا (# {0} XS17293 0) من Biosynth Carbosynth (Staad ، سانت غالن ، سويسرا) ، و liriodendron (# SMB00181) ، وحمض الأرجونوليك (# SMB00119) من Sigma -Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، حمض آسيتيك (# 0027) من Extrasynthese (Genay ، ليون ، فرنسا) و hederagenin (# 89706) من PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth ، Bayern-Mittelfranken ، ألمانيا). كان حمض الميريانثيك هدية من البروفيسور ماريا فاليريا دوريا ، جامعة نابولي. تم الحصول على منحنيات المعايرة عن طريق حقن المحاليل القياسية في نطاق تركيز 0. 25-25 ميكرومتر للقشور و 0. 1-25 أوم لترايتيربين. أظهر كل من سلفادور النقي جانبًا و liriodendron قمتين LC-MSMS ، ربما بسبب التوازن الكيميائي الذي تم إنشاؤه في المحلول. تم تحديد حد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOO) للمعايير على أساس نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N).

4.5 زراعة الخلايا الجلدية والإكسبلنتس

تمت المحافظة على الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDF) في Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ؛ Sigma-Aldrich ، St. ) في 95 في المائة من الهواء ، و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، والجو الرطب عند 37 درجة. مستخلصات الجلد ، التي تم الحصول عليها من جلد متبرعات يتمتعن بصحة جيدة (تتراوح أعمارهن بين 44-47) في مركز الجراحة فيلا سينزيا (نابولي ، إيطاليا) ، تمت زراعتها في 24- لوحات منقولة في DMEM / FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية في الهواء- الظروف السائلة عند 37 درجة في الهواء المرطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. أعطى جميع المتبرعين موافقتهم الخطية المستنيرة على استخدام أنسجة الجلد ، وفقًا لإعلان هلسنكي.

4.6 اختبار السمية الخلوية

اعتمدت اختبارات السمية الخلوية على استخدام MTTcompound [{0}} (45- ثنائي ميثيل ثيازوليل) -2 ، 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم- بروميد] [34]. نمت الخلايا في 96- لوحات جيدة في وسط مزرعة DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ، مكملًا بنسبة 1 0 في المائة من مصل بقري جنيني ، لمدة 8 ساعات تقريبًا. بعد العلاج بـ ObHEx بين 0. 0 5 بالمائة و 0.0004 بالمائة (500 ميكروغرام / مل و 4 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة ، تم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني واحتضانها بـ 100 ميكرولتر / بئر من "المخزن المؤقت للتفاعل" يحتوي على 10 ملي مولار Hepes ، 1.3 ملي كلوريد الكالسيوم ، 1 ملي MgSO ، 5 ملي مولار من الجلوكوز ، و 0.5 مجم / مل من الركيزة اللونية MTT في المخزن المؤقت PBS عند pH7.4. بعد 3 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول الذوبان الذي يحتوي على 10 بالمائة من Triton-X100،0.1 N من حمض الهيدروكلوريك في الأيزوبروبانول المطلق إلى كل بئر. بعد فترة الحضانة لمدة 16 ساعة ، تم قياس التفاعل اللوني عند 595 نانومتر باستخدام قارئ لوحة Victor3 (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

4.7 تحليل التعبير الجيني MYLK و TGF6RII في HDF

لكل بئر ، 1 × 1 0 درجة من HDF تمت زراعتها في 6- ألواح بئر في DMEM بمعدل 2 بالمائة FBS ، بعد 24 ساعة تم تخفيف FBS أكثر إلى 0. 5 بالمائة ، و عولجت الخلايا بتركيزات 0. 002٪ و 0.006٪ من ObHExand TGF - 2. 5ng / mL ، متبوعة بحضانة 2h لـ MYLK و 48 لـ TGFRII. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، تم استخدام مجموعة "GenEluteM Total RNA Purification" التي اشترتها شركة Merck (دارمشتات ، ألمانيا). بعد المعالجات المشار إليها ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS ، وتجميعها في محلول تحلل ، وإخضاعها لإجراء الاستخراج كما هو مذكور. تمت معالجة العينات باستخدام DNase I (Ambion ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة لإزالة ملوث الحمض النووي الجيني. من كل عينة ، تم تحميل 2 ميكرولتر على هلام 1 في المائة agarose في وجود تغيير طبيعة صبغة التحميل لغرض تحديد كمية الحمض النووي الريبي في إشارة إلى علامة محددة لـ RNA (ThermoScientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام GeneTools (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) كبرنامج للتكميم. بعد ذلك ، تم نسخ 300 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي للإنزيم (ThermoScientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء RT-PCR شبه الكمي باستخدام معايير داخلية زوج من البادئات العالمية 18S التمهيدي / المنافس (Ambion ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم فصل منتجات PCR على هلام agarose بنسبة 1.5 بالمائة ، وتم عرضها باستخدام أداة Reliance (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تحليلها بواسطة قياس الكثافة باستخدام برنامج Genetools. كانت تسلسلات الاشعال المستخدمة للتضخيم كما يلي: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG ، MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA ، TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT ، TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8 تحليل قدرة الانكماش لمصفوفة الكولاجين

فيما يتعلق بخلايا HDF ، تم تعليق 2. 0 × 1 0 درجة في وسط نمو 5x DMEM (Gibco ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 24- لوحة بئر ، و 2 مجم / تمت إضافة محلول مل من الكولاجين من جلد البقر (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى كل بئر. تم تعديل الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 7.2. تم تحضين اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة للسماح بتصلب هلام الكولاجين. تمت إضافة DMEM مع 1 0 بالمائة من FBS و / أو ML 7 25 uM ، كمثبط بروتين MYLK ، لاحقًا. بعد 16 ساعة ، تم مسح ML7 وإضافة تركيز ObHExat بنسبة 0.002 في المائة في DMEM مع 2 في المائة من FBS. تم استخدام TGF - 2. 5 نانوغرام / مل كعنصر تحكم إيجابي. تم فصل قرص الكولاجين المتكون على الفور من البئر باستخدام ملعقة صغيرة معقمة من أجل تعزيز تقلصها. تم قياس مناطق القرص لكل علاج في الوقت 0 و 5 ساعات وتحليلها باستخدام برنامج الصور.

4.9 تحليل درجة بلمرة الأكتين

بعد ذلك ، تمت زراعة 1.5 × 1 0 درجة من خلايا HDF لكل بئر في لوحة بئر 24- وفي اليوم التالي تمت إضافة الوسط بنسبة 2 في المائة من FBS و Cytochalasin B ، وهو مثبط للأكتين البلمرة ، عند 2 ميكرومتر لمدة 3 {{1 {{2 0}}} دقيقة. بعد 30 دقيقة ، تمت إضافة ObHEx 0.002 بالمائة و 0.06 بالمائة） على الخلايا مع TGF - 2. 5 نانوغرام / مل ، يُستخدم كعنصر تحكم إيجابي ، و ML 7 25 ميكرومتر ، باعتباره السيطرة السلبية على MYLKenzyme. بعد 30 دقيقة من العلاج ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد (PFA) في فوسفات منظم لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم غسل الخلايا باستخدام PBS وتم تنفيسها بمحلول من محلول الفوسفات و Triton-X100 عند 0.2 بالمائة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا بمحلول 0.4 ميكرومتر من phalloidin مترافق مع رودامين (Santa-Cruz Biotechnology ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة ساعة واحدة في الظلام.فوائد cistancheفي الوقت 0 وبعد 18 ساعة ، تم قياس التألق عند 540/570 نانومتر باستخدام قارئ لوحة Victor3 (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). 4.10. تحليل مسار SMAD2

تم زرع خلايا HDF بكثافة 3 × 103 في 96- لوحات جيدة وبعد 16 ساعة تم نقلها باستخدام X-tremeGeneTM HP DNA transfection كاشف (Roche Diagnostics ، بازل ، سويسرا) مع ناقل مراسل Smad2 وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد 24 ساعة ، تمت معالجة الخلايا باستخدام ObHEx أو TGF - 2. 5 نانوغرام / مل ، بمفردها أو بالاشتراك مع ML 7 25 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. في نهاية فترة الحضانة ، تم غسل الخلايا باستخدام PBS وتم تحديد نشاط luciferase باستخدام نظام اختبار SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) في Multiwell Reader Plate Victor Nivo (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

4.11.Analysis of Pro-Collagen I، Tropoelastin، and Periostin Synthesis

لكل بئر ، تمت زراعة 8 × 1 0 3 HDF في 96- أطباق جيدة وتم معالجتها باستخدام 0. 0 02 بالمائة من ObHEx أو TGF 2.5 نانوغرام / مل. بعد 24 ساعة ، تمت معالجة الخلايا من أجل ELISA باستخدام الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة المضادة للبروكولاجين من النوع الأول (sc -166572 ، التكنولوجيا الحيوية سانتا كروز ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تليها الحضانة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر المسمى مع بيروكسيداز (170-6516 ، بيوراد ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم طلاء المواد الطافية للخلايا على صفيحة أخرى للكشف عن التروبولاستين والبيريوستين باستخدام الجسم المضاد للأرنب المضاد لتروبولاستين (ab21600 أو Abcam أو Cambridge أو U أو جسم مضاد للفأر المضاد للبيريوستين (sc -398631 ، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، متبوعًا بحضانة الجسم المضاد الثانوي للأرانب المسمى بالبيروكسيديز (170-6515 ، بيوراد ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية）. تم تطوير التفاعل اللوني بإضافة 100 ميكرولتر من محلول مائي من OPD (O-phenylenediamine) ، 0.35 مجم / مل في محلول سيترات 50 ملي مولار ، و 0.012٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2). بعد 30 دقيقة ، تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام القارئ المتعدد Victor Nivo (PerkinElmer، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية).

4.12. اختبارات فيفو السابقة

تم تقييم ImmunoHistoFluorescence (IHF) لـ MYLKand الميوسين الفسفوري في إإكسبلنتس الجلد لمتبرعين يبلغون من العمر {0} عامًا. تم قطع إإكسبلنتس جلد الإنسان بمكشط خزعة 8 مم وزُرعت في 24- أطباق جيدة في DMEM بنسبة 1 0 بالمائة من FBS والمضادات الحيوية. تمت معالجة اللكمات التي تم الحصول عليها بـ 0. 0 0 2 بالمائة و 0.006 بالمائة من ObHEx لمدة 24 ساعة. تم تحضينها في 15 في المائة سكروز ، ثم في 30 في المائة سكروز ، وفي النهاية تم تجميدها. بعد ذلك ، تم الحصول على 10 أقسام ميكرون باستخدام ناظم البرد CM1520 (لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا). تم ترطيب الشرائح مع التجميد لمدة 30 دقيقة في PBS ووضعها في محلول "مانع" (6 بالمائة BSA ، 5 بالمائة مصل ، 20 ملي MgCl ، 0.2 بالمائة توين) لمدة ساعة واحدة. تم تحضين عمليات التجميد باستخدام الجسم المضاد للأرنب المضاد لـ MYLK (1: 100 ، GeneTex ، Irvine ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) والأجسام المضادة الأولية المضادة للفوسفو-ميوسين (1: 100 ، LifeTechnologies ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 16 ساعة في 4 درجة. تم غسل الشرائح باستخدام PBS لمدة 30 دقيقة ثم حضنت مع الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرنب Alexa-Fluor 546 (1: 1000 ؛ A11035 ThermoFisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة ساعة واحدة. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (4 '، 6-5 ديميدينو -2- فينيليندول) 1 ميكروغرام / مل في PBS لمدة 10 دقائق. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ. بالنسبة لـ IHF من تروبولاستين وكولاجين 1 ، تم استخدام مستخلصات الجلد من متبرعات يبلغن من العمر 36- عامًا. تم الحصول على خزعات الجلد على النحو الموصوف أعلاه ومعالجتها مسبقًا بنسبة 0.002 في المائة و 0.006 في المائة من ObHEx لمدة 24 ساعة. تمت إضافة الإجهاد باستخدام الهيدروكورتيزون عند 10 ميكروغرام / مل لمدة 8 أيام في وجود ObHEx. بعد ذلك ، تم تجميد الخزعات على النحو الموصوف أعلاه وتم تحضين المقاطع بالأجسام المضادة الأولية للأرنب المضاد لتروبولاستين (1: 1000 ab21600 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ومضاد الكولاجين الأول (1: 100 C2456 Merck ، Darmstadt ، ألمانيا) من أجل 16 ساعة عند 4 درجات. تم تحليل الشرائح كما هو موضح أعلاه وتم الحصول على الصور وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ.

4.13. مجهر القوة الذرية (AFM) في الجلد إكسبلانتس

تم تقييم مرونة عينات الجلد التي لم يتم علاجها ومعالجتها باستخدام ObHEx لضمان معاملات Young الخاصة بهم من خلال طريقة في مقياس نانومتر يعتمد على مجهر القوة الذرية (AFM) ، تم تطويره ليس فقط للعينات البيولوجية ولكن أيضًا للعينات غير العضوية. تستند هذه الأساليب على افتراضات نماذج Hertz واعتبرت العينة والناتئ بمثابة نوابض في سلسلة في إعداد تجربة AFM. باختصار ، تمت معالجة الجلد الخارجي بالنبات 0. 0 تم قطع 06 بالمائة من ObHEx وعينات الجلد غير المعالجة بواسطة جهاز التبريد في شرائح بسماكة 10 ميكرون. تم تخزين العينات عند 12 درجة ، ثم غسلها ببرنامج تلفزيوني وفحصها عند درجة حرارة ثابتة ورطوبة نسبية تبلغ 22 درجة و 55 في المائة على التوالي. تم فحص كل عينة بواسطة NanoScope IIA AFM في وضع التحليل الطيفي للقوة باستخدام طرف هرمي (RESP -20) مع ثابت زنبركي يبلغ 0.9 نيوتن / م. لحساب معامل يونغ ، تم الحصول على عشرة منحنيات للقوة في عشر نقاط مختلفة من نفس العينة الفائقة. كل منحنى القوة هو منحنى انحراف (فولت) مقابل الإزاحة (نانومتر) ويمكن تحويله إلى منحنيات القوة (N) مقابل الفصل (نانومتر). في الواقع ، يشير كل منحنى القوة إلى منحنيات التحميل والتفريغ. إنها تمثل اتجاه الطرف فيما يتعلق بالعينة: عندما يكون الطرف بعيدًا عن العينة عندما يتلامس ويبدأ الطرف في الانحراف ، وعندما يتحرك بعيدًا مرة أخرى. يمكن فحص الجزء الأول فقط من هذه المنحنيات. كان كل جزء من هذه الأجزاء من المنحنيات متوافقًا مع نموذج هيرتز القياسي ، على وجه الخصوص ، معادلة هيرتز النموذجية لطرف الهرم ، لاستخراج معامل المرونة المعروف بمعامل يونج في GPa.

4.14. تحليل احصائي

كانت جميع القيم التي تم الإبلاغ عنها هي متوسط ​​ثلاث تجارب مستقلة ، تم إجراء كل منها في ثلاث نسخ. تشير العلامات النجمية إلى دلالة إحصائية محسوبة بالاتفاق مع اختبار t: * تعني قيمة أقل من أو تساوي 0. 0 5 ؛ ** قيمة p أقل من أو تساوي 0. 01 ؛ *** قيمة p أقل من أو تساوي 0.001.

تم استخراج هذه المقالة من المستقلبات 2021 ، 11 ، 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites