تحفز حويصلات الغشاء الخارجي البكتيري تحولًا نسخيًا في الأرابيدوبسيس نحو تنشيط الجهاز المناعي مما يؤدي إلى قمع نمو العوامل المسببة للأمراض في بلانتا

خلاصة

تشكل البكتيريا سالبة الجرام فقاعات كروية على محيط الخلية، والتي تنفصل لاحقًا عن جدار الخلية البكتيرية لتشكل حويصلات خارج الخلية. لقد ثبت أن هذه الهياكل النانوية، والمعروفة باسم حويصلات الغشاء الخارجي (OMVs)، تعزز العدوى والمرض ويمكن أن تحفز مخرجات مناعية نموذجية في كل من الثدييات والنباتات المضيفة. لفهم أفضل لنباتات التغيير النسخي الواسعة التي تخضع لها بعد التعرض لـ OMVs، قمنا بمعالجة شتلات Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) مع OMVs المنقى من البكتيريا المسببة للأمراض النباتية سالبة الجرام Xanthomonas Campestris pv. Campestris وأجرى تحليل RNA-seq على OMV والنباتات المعالجة الصورية في 2 و6 و24 ساعة بعد التحدي. حدث التحول النسخي الأكثر وضوحًا في أول نقطتين زمنيتين تم اختبارهما، كما يتضح من عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا ومتوسط ​​تغير الطية. تحفز OMVs تحولًا نسخيًا كبيرًا نحو تنشيط الجهاز المناعي، مما يؤدي إلى تنظيم العديد من المسارات المرتبطة بالمناعة بما في ذلك مجموعة متنوعة من المستقبلات المناعية. كشفت مقارنة استجابة نبات الأرابيدوبسيس مع OMVs والمستحثات النقية، أن OMVs تحفز مجموعة مماثلة من الجينات والمسارات كمستحثات فردية، ومع ذلك، تم اكتشاف المسارات التي تم تنشيطها بواسطة OMVs وليس بواسطة مستحثات أخرى. أدت المعالجة المسبقة لنباتات الأرابيدوبسيس باستخدام OMVs وإصابتها بعد ذلك بمسببات الأمراض البكتيرية إلى انخفاض كبير في نمو العوامل المسببة للأمراض. لم تؤثر الطفرات في مستقبل عامل استطالة النبات (EFR)، أو مستقبل فلاجيلين (FLS2)، أو المستقبل المشارك للكيناز (BAK1) غير الحساس للبرازينوستيرويد 1، بشكل كبير على تأثير التحضير المناعي لـ OMVs. تظهر هذه النتائج مجتمعة أن OMVs يؤدي إلى تحول نسخي واسع النطاق في الأرابيدوبسيس، مما يؤدي إلى تنظيم مسارات مناعية متعددة، وأن هذا التغيير النسخي قد يسهل مقاومة العدوى البكتيرية.

الكلمات الدالة

الأرابيدوبسيس ثاليانا، العدوى البكتيرية، الحويصلات خارج الخلية، OMVs، حويصلات الغشاء الخارجي، مناعة النبات، RNA-seq، Xanthomonas Campestris pv. com.campestris

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

1 المقدمة

تواجه النباتات باستمرار الميكروبات الضارة التي تزدهر في أنسجتها وتعيق النمو الطبيعي. تعتمد الاستجابة الدفاعية الفعالة إلى حد كبير على الكشف السريع والدقيق وتحديد هوية الميكروب الغازي. ولهذا الغرض، تستخدم النباتات أنظمة مراقبة واسعة النطاق لرصد غزو مسببات الأمراض (Cook et al., 2015). من المتوقع أن الخط الأول من نظام مراقبة النبات، أو الواجهة الخلوية الأولى حيث تتفاعل النباتات والميكروبات، هو الفضاء بين الخلايا، أوبلاست. هناك، يتم التعرف على الميكروبات الغازية عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط المكشوفة خارج الخلية (PRRs) المرتبطة بالأغشية (Boutrot & Zipfel، 2017؛ Couto & Zipfel، 2016). تتعرف سجلات PRR على المحددات الميكروبية الموجودة على نطاق واسع والمحفوظة بين العديد من الميكروبات والمعروفة باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات أو مسببات الأمراض (MAMPs) (Ranf et al.، 2016). نظرًا لأن الميكروبات تخضع للطفرات بمعدل سريع، يتم تكييف المستقبلات المناعية التطورية المفيدة لاكتشاف المناطق المحفوظة للغاية من المكونات الميكروبية المهمة التي لا يمكن التخلص منها أو تحورها بسهولة بسبب تكلفة اللياقة البدنية الخطيرة. على سبيل المثال، يعد السوط البكتيري عنصرًا حاسمًا في فسيولوجيا العديد من الميكروبات بما في ذلك مسببات الأمراض، وهو حاليًا أحد أفضل MAMPs التي تمت دراستها (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). يؤدي إدراك فلاجيلين، أو الحاتمة الاصطناعية flg22 (المكونة من 22 حمضًا أمينيًا محفوظًا بدرجة عالية في الطرف N من كتلة بناء السوط، فلاجيلين)، بواسطة مستقبلات مناعة النبات المشابهة فلاجيلين الاستشعار 2 (FLS2)، إلى تغيير نسخي كبير ، تليها استجابة مناعية فعالة توقف العدوى (Chinchilla et al.، 2007؛ Gómez-Gómez & Boller، 2000). ترتبط العديد من MAMPs المعروفة بالجدار الخلوي للميكروب. على سبيل المثال، الكيتين الفطري (Fesel & Zuccaro، 2016)، الببتيدوغليكان البكتيري (PG) (Erbs et al.، 2008؛ Gust et al.، 2007)، السكريات الدهنية الدهنية البكتيرية (LPS) (Dow et al.، 2000؛ Silipo et al. .، 2005)، فلاجيلين (Boutrot & Zipfel، 2017؛ فيليكس وآخرون، 1999)، وأكثر من ذلك. ومع ذلك، ليس من الواضح تمامًا كيف تتفاعل هذه المكونات المرتبطة بجدار الخلية مع مستقبلاتها المناعية المشابهة في النبات. سواء حدث ذلك بسبب موت الخلايا و/أو تدهور جدار الخلية، أو عن طريق الإطلاق النشط لمكونات مثل السوط، فهو موضوع يحتاج إلى مزيد من البحث (Bahar, 2020).

أحد الأمثلة على الإطلاق النشط لشظايا جدار الخلية بواسطة البكتيريا سالبة الجرام هو انفصال الحويصلات خارج الخلية (EVs) التي تنفجر وتنفصل من الغشاء الخارجي إلى البيئة المحيطة (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). يُطلق على هذه EVs البكتيرية عادةً اسم حويصلات الغشاء الخارجي (OMVs) ، وسنلتزم من الآن فصاعدًا بهذه التسمية (Schwechheimer & Kuehn، 2015). تحدث عملية إطلاق OMV بشكل مستمر وفي ظل ظروف بيئية مختلفة، بما في ذلك أثناء استعمار المضيف (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). بالإضافة إلى جزيئات الغشاء الخارجي المتكاملة مثل بروتينات الغشاء الخارجي (OM) وLPS والدهون، تقوم OMVs بتغليف السوائل المحيطة بالبلازمية، والتي تتكون من مجموعة متنوعة من الجزيئات مثل البروتينات والإنزيمات المحللة لجدار الخلية والسكريات والأحماض النووية (Kuehn & كيستي، 2005). نظرًا لأنه يتم إطلاق OMVs أثناء استعمار المضيف، وبما أن حمولتها تتكون من MAMPs، فمن المغري التكهن بأنها تعمل كحاملات للمثيرات المناعية التي توصل الجزيئات المثيرة على مقربة من مستقبلاتها المناعية المشابهة (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). في الواقع، ثبت أن OMVs تحفز كلاً من الجهاز المناعي للثدييات والنباتات عند تقديمها لمضيفيها (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). بينما في خلايا الثدييات، تعمل كل من LPS ومكونات البروتين في OMVs كمحفزات مناعية (Ellis et al., 2010)، في النباتات، ليس من الواضح بعد أي جزيئات OMV هي المثيرات المناعية الرئيسية.

بالإضافة إلى تعديل الاستجابة المناعية للمضيف، تبين أيضًا أن OMVs تحمل عوامل الفوعة وتشارك في العديد من العمليات. وهذا يشمل التواصل بين الخلايا (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019) وتوصيل السموم إلى الخلايا المستهدفة (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996) وتكوين الأغشية الحيوية (التعليم). & Beveridge، 2006)، إخماد المركبات المضادة للميكروبات (Manning & Kuehn، 2011)، والاستجابة للإجهاد (MacDonald & Kuehn، 2013)، ونقل الجينات الأفقي (Fulsundar et al.، 2014؛ Velimirov & Ranftler، 2018) والفوعة (Ellis & كوهن، 2010؛ كونسمان وآخرون، 2015). في حين أن معظم هذه الأمثلة تأتي من دراسات مسببات الأمراض البكتيرية في الثدييات، فإن الدراسات الحديثة التي أجريت على البكتيريا المسببة للأمراض النباتية تدعم أيضًا أن OMVs تعزز الفوعة البكتيرية واستعمار النبات. إيونيسكو وآخرون. (Ionescu et al., 2014) أظهر أن إنتاج OMV بواسطة العامل الممرض للنبات Xylella fastidiosa أثناء استعمار أوعية الخشب يمنع الارتباط البكتيري بالعناصر الموصلة للماء في النبات (نسيج الخشب)، مما يؤدي إلى إمالة التوازن بين الأشكال اللاطئة والمتحركة للنبات. الممرض نحو الشكل المتحرك. ويعتقد أن هذا الشكل يعزز تشتت الخلايا في نسيج الخشب، مما يؤدي إلى انخفاض أسرع في النبات (Ionescu et al., 2014). أظهرت دراستان أخريان أن عوامل الفوعة مثل الليباز / الإستراز والزيلاناز المفرز من النوع الثاني، والمؤثرات المفرزة من النوع الثالث، يتم إفرازها بالتعاون مع OMVs (Chowdhury & Jagannadham، 2013؛ Sidhu et al.، 2008؛ Solé et al. ، 2015) مما يشير إلى أن OMV قد يكون له دور مهم في الفوعة البكتيرية. إن التعقيد الجزيئي لـ OMVs، إلى جانب وظائفها المزدوجة وربما المتعارضة في المضيف (تحفيز المناعة وتعزيز الفوعة)، يدفعنا إلى دراسة الاستجابة النسخية الأوسع لنباتات Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) لتحدي OMV واختبار ما إذا كان هذا التغيير النسخي من شأنه أن يحفز المقاومة أو القابلية للعدوى البكتيرية اللاحقة.

2. المواد والأساليب

2.1 المواد النباتية وظروف النمو

تم استخدام خط Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) من النوع البري Col -0 بالإضافة إلى الخطوط المتحولة التالية: bak- (Schlesinger et al.، 2011) and Falls Ever (Nekrasov et al.، 2009) في هذه الدراسة. تم تعقيم بذور نبات الأرابيدوبسيس وزُرعت على ألواح أجار Murashige وSkoog (MS) كما هو موصوف (Bahar et al., 2016). تم حفظ الأطباق في الظلام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام ثم نقلها إلى 22 درجة مئوية للإنبات لمدة 5-8 أيام. تم نقل الشتلات النابتة ذات الحجم المماثل إلى 24-ألواح بئر (شتلتين لكل بئر) تحتوي على 1 مل من وسط MS مع 1% (وزن:حجم) من السكروز (Duchefa Biochemie) ونمت لمدة 8-10 أيام أخرى في نفس الشروط قبل الطعن مع Elicitor كما هو موضح أدناه. بالنسبة لفحوصات التحضير، تم إنبات بذور نبات الأرابيدوبسيس من النوع البري Col -0 والخطوط المتحولة (التي تسقط دائمًا وتعود) كما هو موصوف أعلاه ثم يتم زرعها في أوعية مقاس 7 × 7 × 6 سم (1 شتلة / وعاء) تحتوي على مزيج التربة الخضراء رقم 7611 (إفيناري، أشدود، إسرائيل) ونمت في فترة ضوئية مدتها 9.5 ساعة عند درجة حرارة 22-24 درجة مئوية. كانت النباتات

2.2 تنقية حويصلات الغشاء البكتيري الخارجي

مخزونات الجلسرين من Xanthomonas Campestris الكهروضوئية. تم رسم خطوط Campestris (Xcc) 33913 على أطباق Nutrient Agar (Difco، NA، Becton، Dickinson، and Company) ونمت لمدة 2-5 أيام عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. تم جمع المستعمرات الفردية واستخدامها لتطعيم 3- مليلتر YEB (مرق مستخلص الخميرة) يحتوي على 1 0 ميكروغرام / مل هيدرات سيفالكسين (Cp، Sigma-Aldrich). تمت زراعة البادئات طوال الليل عند درجة حرارة 28◦ مئوية مع رج 185-200 دورة في الدقيقة، ثم تم استخدامها لتطعيم 500 مل من وسط PSB (مرق الببتون السكروز) بالمضادات الحيوية (كما هو موضح أعلاه) في قوارير 2- لتر بنسبة ∼ 1:1000 (v:v). نمت الثقافات كما هو موضح أعلاه إلى OD600 من 0.6-0.8 ثم تم نسج الخلايا البكتيرية وتم استخراج OMVs من الطاف كما هو موصوف (Mordukhovich & Bahar، 2017). تم بعد ذلك إخضاع مستحضر OMV الخام إلى الطرد المركزي المتدرج Optiprep للحصول على OMVs المنقى، كما هو موصوف (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). تمت تنقية كل دفعة OMV من 1.5- لتر من الثقافة البكتيرية وتم إعادة تعليقها أخيرًا في 1 مل من PBS (الرقم الهيدروجيني 7.3). تم استخدام OMVs المنقى على الفور أو تخزينها عند درجة حرارة 4◦ مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام قبل الاستخدام. تم قياس توزيع حجم OMVs باستخدام جهاز تشتت الضوء الديناميكي (Zetasizer Nano ZS، Malvern Panalytical، Worcestershire، UK) وكان متوسط ​​قطره 121.7 ± 55.43 نانومتر (SD). تم قياس تركيز الجسيمات بالمثل ويتم توفيره في كل وصف للتجربة أدناه.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

2.3 تحدي شتلات نبات الأرابيدوبسيس مع OMVs

لفحص الاستجابة النسخية لنبات الأرابيدوبسيس لتحدي OMV، تم استخدام شتلات Col-0 المزروعة في 24-ألواح جيدة كما هو موضح أعلاه. في اليوم السابق لتحدي OMV، تم سحب وسط MS من اللوحات واستبداله بـ 250 ميكرولتر من dH2O المعقم، وتركت الأطباق على المقعد طوال الليل. في صباح اليوم التالي، تمت إضافة 20 ميكرولتر من OMVs المنقى (30 ميكروغرام لكل مل يقابل 1.44 × 10 جزيئات لكل بئر)، أو dH2O معقم كصورة وهمية، إلى كل بئر. تم جمع الشتلات بعد 2 و 6 و 24 ساعة من التحدي، وتم تجفيفها على الورق، وتم تجميدها باستخدام النيتروجين السائل في 2- مل من أنابيب إيبندورف ذات القفل الآمن (هامبورغ، ألمانيا). في كل نقطة زمنية، تم جمع أربعة آبار معالجة بـ OMV وأربعة آبار معالجة وهمية، مما يمثل أربع مكررات بيولوجية لكل علاج في كل نقطة زمنية.

2.4 تنقية الحمض النووي الريبي

تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من شتلات الأرابيدوبسيس باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تمت تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل أكبر باستخدام مجموعة Turbo DNA الخالية (Ambion، Thermo Fisher Scientific)، ومجموعة تنظيف وتركيز الحمض النووي الريبي (Norgen Biotek) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إخضاع عينات الحمض النووي الريبي المنقى لتحليلات التركيز والجودة باستخدام جهاز TapeStation 2200 (Agilent Technologies)، وشريط شاشة RNA، وشاشة RNA

2.5 بناء مكتبة RNA وتسلسلها

لكل علاج ونقطة زمنية، تم اختيار عينتين تظهران أعلى درجة نقاء للتحليل. تم إعداد مكتبات TruSeq mRNA (Illumina) مع التقاط PolyA من عينات الحمض النووي الريبي (RNA) المختارة في معهد كراون لعلم الجينوم في معهد وايزمان للعلوم (رحوفوت، إسرائيل). تم وضع علامة على كل عينة، وتم إعداد مجموعة من العينات. تم بعد ذلك تحميل هذا المجمع داخل مسارين NGS، وتشغيله في آلة تسلسل Illumina HiSeq، في وضع تشغيل عالي الإخراج، قراءة واحدة (SR) 60 (الإصدار 4).

2.6 يقرأ التسلسل المعالجة الأولية

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 الأنطولوجيا الجينية ووصف الجينات 

تم استرجاع الجينات الجينية (GO) باستخدام التعليقات التوضيحية الخاصة بـ TAIR's GO (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). تم الحصول على أوصاف الجينات، وفقًا لنماذج الجينات، باستخدام بحث الوصف الجيني الخاص بـ TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). تم حساب تخصيب GO باستخدام أداة الويب AgriGO (//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) باستخدام موضع الجينوم Arabidopsis (TAIR10) كمرجع

2.8 التحقق الكمي من PCR وRNA-seq

للتحقق من صحة بيانات RNA-seq، تم استخدام عينات الحمض النووي الريبي (RNA) من الشتلات التي تتحدى OMV لتخليق [كدنا]، تليها PCR الكمي (qPCR) باستخدام الاشعال الخاص بالجينات (ملحق الجدول S4)، كما هو موضح (Bahar et al. ، 2016). بشكل عام، تم اختبار 17 DEGs من مجموعة بيانات RNA-seq، باستخدام أربع مكررات بيولوجية من RNA لـ OMV- أو شتلات معالجة وهمية. تمت مقارنة التعبير النسبي للجينات التي تم اختبارها مع تعبير اليوبيكويتين، باستخدام جهاز PCR سريع في الوقت الحقيقي 7500 (النظم البيولوجية التطبيقية)، كما هو موضح (Bahar et al.، 2016).

2.9 مقارنة استجابة الأرابيدوبسيس النصية لـ MAMPs وOMVs 

تمت مقارنة مجموعة البيانات التي يسببها OMV مع النسخ المتاحة من الأرابيدوبسيس التي تم تحديها مع flg22، (Denoux et al.، 2008) elf26 (Zipfel et al.، 2006)، PGN (Willmann et al.، 2011)، OG (Davidsson et al. ، 2017) وLPS (ليفاجا وآخرون، 2008). لمقارنة البيانات، تم إجراء إثراء مصطلحات GO وتم تصور GOs المستحثة بواسطة مخططات Venn كما هو موضح أعلاه.

2.10 تجارب تحضير الأرابيدوبسيس

لاختبار التأثير الأولي لـ Xcc OMVs على نبات الأرابيدوبسيس المصاب ببكتيريا Pseudomonas syringae pv. الطماطم DC3000 (Pst)، اتبعنا الإجراء الموضح بواسطة Zipfel et al. (2004). باختصار، تم اختراق أوراق نباتات الأرابيدوبسيس التي يبلغ عمرها من 6 إلى 8 أسابيع، والمزروعة كما هو موصوف أعلاه، باستخدام 50-100 ميكروليتر من Xcc OMVs المنقى (30 ميكروغرام/مل، أي ما يعادل 3.6-7.2 × 109 جزيئات لكل ورقة)، 1 ميكرومتر flg22، أو الماء باستخدام حقنة أقل إبرة. لكل معاملة، تم استخدام 5 أوراق / نبات وثلاث مكررات نباتية. تم تحضير لقاح Pst عن طريق زراعة البكتيريا على ألواح King's B المتوسطة (20 جم/لتر ببتون، 1.5 جم/لتر MgSO4 x7H2O، 10 مل/لتر جلسرين، و15 جم/لتر أجار) عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. ومن ثم إعادة تعليق المستعمرات بالماء وضبط تركيز اللقاح إلى 105 CFU/ml. تم تسلل لقاح Pst إلى الأوراق المعدة لمدة 24 ساعة بعد التحضير، باستخدام حقنة بدون إبرة (تم اختراق حوالي 100 ميكروليتر في كل ورقة). تم تحديد النمو البكتيري عند 0 (ساعة واحدة بعد التلقيح) ويومين بعد التلقيح (dpi) عن طريق جمع ووزن الأوراق الملقحة، ونقعها في 1 مل من 10 ملي مولار MgCl وطلاء التخفيفات التسلسلية 10- أضعاف على نبات King's لوحات أجار ب. تم تحديد عدد CFU على كل لوحة بعد يومين وحسابه لكل ورقة جرام.

الشكل 1: استجابة الأرابيدوبسيس النصية لـ OMVs في 2 و 6 و 24 بعد التحدي. تحليل المكون الرئيسي (A) ومصفوفة ارتباط العينة (B) للاستجابة النصية لشتلات الأرابيدوبسيس لـ OMV، أو وهمية، في 2 و 6 و 24 ساعة بعد التحدي

2.11 فحوصات النمو البكتيري في المختبر 

لتقييم تأثير Xcc OMVs المنقى على نمو Pst في المختبر، تمت زراعة Pststarters في وسط King's B السائل لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية ثم تم استخدامها لتلقيح ثلاث مزارع مختلفة تحتوي على 12 مل من وسط King's B لكل منها، في {{3 }}مل أنابيب فالكون بنسبة 1:100. تم تعديل المزارع البكتيرية باستخدام 30 ميكروغرام/مل من OMVs (1:50 أو 1:100، أي ما يعادل 1.44 × 109 أو 7.2 × 108 جسيمات لكل مل، على التوالي)، أو PBS كعنصر تحكم، وحضنت لمدة 20 ساعة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية. تم قياس نمو البكتيريا باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Amersham Biosciences) بكثافة بصرية (OD) تبلغ 600 نانومتر على مدار 22 ساعة.

3 نتائج

3.1 يكشف تحليل RNA-seq عن مجموعة كبيرة من جينات الأرابيدوبسيس التي يتم التعبير عنها تفاضليًا استجابةً لتحدي OMV

لدراسة التغير النسخي في الأرابيدوبسيس بعد تحدي OMV، تعاملنا مع شتلات الأرابيدوبسيس باستخدام OMVs المنقى من مسببات الأمراض البكتيرية Xanthomonas Campestris pv. Campestris 33913 (Xcc) وجمع الحمض النووي الريبي (RNA) للنبات في 2 و 6 و 24 ساعة بعد التحدي (HPC). تم بعد ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) من عينات OMV والمعالجة الصورية وتحليلها كما هو موضح في المواد والأساليب. يظهر الارتباط الرئيسي (الشكل 1A) وتحليلات مصفوفة ارتباط العينة (الشكل 1B) أن التكرارات البيولوجية في كل مجموعة علاجية تكون قريبة من بعضها البعض، وهو مؤشر على تشابه الاستجابة النسخية الشاملة بين التكرارات البيولوجية. عالج OMV العينات في مجموعة 2 و 6 HPC معًا، مما يشير إلى أن علاج OMV كان له تأثير أكبر على الاستجابة النسخية من وقت أخذ العينات (الشكل 1B). من ناحية أخرى، تم تجميع العينات المعالجة بـ OMV مع المعالجة الوهمية لكل منها عند 24 حصانًا، مما يشير إلى أن التغيير النسخي الناجم عن OMVs في هذه المرحلة الزمنية قد انخفض وكان مشابهًا لتلك الخاصة بالنباتات المعالجة الصورية.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

في كل نقطة زمنية تم اختبارها، تمت مقارنة الشتلات المعالجة بـ OMV مع الشتلات المعالجة الصورية وتم استخراج الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs). في جميع النقاط الزمنية مجتمعة، تم العثور على إجمالي 984 و175 جينًا بشكل كبير (سجل تغيير الطية > 1 أو ← 1، قيمة p وFDR < 0.05) منظمة لأعلى أو لأسفل، على التوالي، استجابة لتحدي OMV (الشكل 2A؛ الملحق الجدول S1). تراوح سجل التعبير الجيني (LogFC) من حد أقصى قدره 9.08 (AT1G26410، 6 hpc)، وهو ما يتوافق مع أكثر من 500- تغيير أضعاف، إلى -5.73 (AT3G17520، 24 hpc). تم العثور على أكبر عدد من DEGs عند 2 و6 hpc، حيث تم تحديد إجمالي 647 و876 DEGs، على التوالي، (مجمعة للتنظيم لأعلى ولأسفل). عند 24 HPC، تم العثور على 121 درجة مئوية. تمت مشاركة أكثر من 50% من الجينات التي تم تنظيمها في 2 و 6 ساعات بعد تحدي OMV فيما بينها (الشكل 2B). لدراسة تغير التعبير الجيني الزمني، استخرجنا جميع DEGs المنتظمة التي تم العثور عليها في جميع النقاط الزمنية (37 جينًا) وقارنا تغيرها مع مرور الوقت (الشكل 2C). كان تعبير التغيير الطي لهذه الجينات مختلفًا بشكل كبير بين النقاط الزمنية المختلفة (ANOVA أحادي الاتجاه؛ F2، 108=8.1633، p=0.0005). أشارت المقارنة اللاحقة باستخدام اختبار Tukey Kramer HSD إلى أن LogFC عند كل من 2 (M=3.45، SD=1.72) و6 hpc (M=3.87، SD=1.98) كان أعلى بكثير من 24 hpc (M=2.32، SD=1.31) (ص=0.0145 وp=0 .0005، على التوالي) (الشكل 2D). في حين أن متوسط ​​تعبير LogFC عند 6 hpc كان أعلى منه عند 2 hpc، فإنه لم يكن مختلفًا إحصائيًا (p=0.5413). ومن ثم، عند النظر في عدد DEGs والجين العام LogFC في النقاط الزمنية الثلاث التي تم اختبارها، يمكننا أن نستنتج أن التغيير النسخي الأكثر أهمية حدث في 2 و 6 ساعات بعد تحدي OMV. لفحص صحة نتائج RNA-seq، تم تحديد التعبير عن 17 جينًا منظمًا باستخدام PCR الكمي (qPCR) مع بادئات محددة. عرض أربعة عشر من الجينات التي تم اختبارها نفس النمط كما في تحليل RNA-seq وتم تنظيمهم بشكل ملحوظ مقارنةً بالنماذج الوهمية. كان لثلاثة من الجينات التي تم اختبارها تعبير نسبي أعلى ولكنها لم تكن مختلفة بشكل كبير عن الجينات الوهمية بهذه الطريقة (ملحق الشكل S1).

الشكل 2: أرابيدوبسيس الجينات المعبر عنها تفاضليًا استجابةً لتحدي OMV. (أ) إجمالي عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) (أعلى أو أسفل التنظيم، LogFC > 1 أو ← 1، القيمة p وFDR < 0.05) عند 2، 6، و 24 ساعة بعد التحدي. (ب) التداخل بين DEGs في نقاط زمنية مختلفة (يسار، منظم لأعلى، يمين، خاضع للتنظيم). (ج) تم رسم الجينات المُنظَّمة الموجودة في جميع النقاط الثلاث على رسم بياني للتعبير LogFC، يُظهر التعبير الجيني مع مرور الوقت. (د) متوسط ​​LogFC لجميع DEGs في نقاط زمنية مختلفة. تشير الحروف المختلفة إلى اختلاف إحصائي عند p <0.05 بواسطة اختبار Tukey-Kramer HSD

3.2 يستجيب الأرابيدوبسيس لـ OMVs مع تحول نسبي نحو تنشيط الجهاز المناعي

لتحديد مسارات الأرابيدوبسيس التي تأثرت بشكل كبير بتحدي OMV، استخدمنا أداة الويب AgriGO (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). لقد حددنا 333 و 55 بشكل ملحوظ (FDR <0.05) مصطلحات علم الجينات (GO) لأعلى ولأسفل، على التوالي، في جميع النقاط الزمنية مجتمعة استجابة لتحدي OMV. ما يقرب من 25٪ من المنظمات الحكومية التي تم تنظيمها كانت مرتبطة باستجابة النبات للتحفيز (الشكل 3A). ضمن فئة "الاستجابة للتحفيز"، ارتبطت مصطلحات GO الأكثر شيوعًا بالاستجابة للضغط والتحفيز الحيوي والمواد الكيميائية والتحفيز الداخلي (الشكل 3 ب؛ الجدول الملحق S2). حددت أداة AgriGO أيضًا 103 وظائف جزيئية منظمة بشكل كبير بما في ذلك "نشاط النقل"، ونشاط الكيناز، و"نشاط عامل النسخ"، و"ربط الأيونات والأيونات المعدنية"، و"ربط الكربوهيدرات"، و"ربط البروتين"، و"النشاط التحفيزي". و "ربط نيوكليوتيدات الأدينيل" و"نشاط مستقبلات الغشاء" والمزيد من وظائف الربط (ملحق الجدول S2). كان الموقع الخلوي للمصطلحات المهمة في أجزاء مختلفة من الخلية بما في ذلك النواة، والفجوة، ونظام الغشاء الداخلي، ولكنه كان مرتبطًا بشكل ملحوظ بمحيط الخلية وشمل "غشاء البلازما"، و"المنطقة خارج الخلية"، و"جدار الخلية" و"الجدار الخلوي". أنطولوجيات "apoplast" (ملحق الجدول S2). من ناحية أخرى، تضمنت المنظمات الحكومية الخاضعة للتنظيم بشكل كبير مصطلحات "عملية تقويضي واستقلابي للسموم"، و"الاستجابة للحرمان من الماء والماء"، و"نقل الدهون وتوطينها"، وغيرها (ملحق الجدول S2). لم يتم إثراء GOs المرتبطة بالاستجابة للتحفيز الحيوي في الجينات الخاضعة للتنظيم. تضمنت الوظائف الجزيئية الخاضعة للتنظيم بشكل كبير العديد من مصطلحات الأكسدة والاختزال مثل "نشاط الأكسدة والاختزال" و"ربط الهيم" و"ربط أيون الحديد" و"ربط الدهون" و"ربط الأكسجين" والمزيد من الوظائف المرتبطة بالأكسجين (ملحق الجدول S2). . كانت الشروط الخاضعة للتنظيم موجودة أيضًا في المنطقة خارج الخلية. لتحديد مصطلحات GO التي تنتمي إليها DEGs ذات التعبير الأعلى، قمنا بتصفية قائمة DEGs الأصلية عن طريق تحديد الجينات التي تحتوي على LogFC أعلى من 4، أو أصغر من -4 (المقابلة لفرق 16- أضعاف) . لقد حددنا 117 جينًا استوفت هذه المعايير، منها 115 جينًا تم تنظيمها بشكل أعلى و2 تم تنظيمها بشكل سفلي في جميع النقاط الزمنية مجتمعة. نظرًا للعدد الصغير من الجينات الخاضعة للتنظيم مع LogFC أقل من -4، لم يتم تحديد GOs المكبوتة بشكل كبير. من ناحية أخرى، تم تحديد 72 منظمة حكومية منظمة بشكل كبير، والتي ترتبط أهمها بـ "الاستجابة للمحفزات الحيوية الخارجية"، و"الاستجابة للكائنات الحية الأخرى"، و"الاستجابة الخلوية لمستويات الأكسجين"، و"الاستجابة الدفاعية". و "الاستجابة للإجهاد" والمزيد من المنظمات الحكومية ذات الصلة بالمناعة (الشكل 3C).

الشكل 3: مصطلحات علم الجينات الأرابيدوبسيس (GO) المخصبة استجابةً لتحدي Xcc OMV. تمثيل المخطط الدائري لتوزيع الفئة في العملية البيولوجية المنظمة (A) والاستجابة لمصطلحات GO للتحفيز (B). (ج) قائمة جينات الأرابيدوبسيس مع LogFC أكبر من 4 استجابة لتحدي OMV. تمت تصفية الجينات من مجموعة البيانات الكاملة لـ DEGs واستخدامها لتحديد مصطلحات GO المخصبة باستخدام أداة الويب AgriGo. قطع روزفلت < 0.05

3.2 أدى تحدي OMV إلى زيادة تنظيم المستقبلات المناعية

يتم التوسط إلى حد كبير في استشعار MAMP واستجابة النبات لـ MAMPs من خلال PRRs المرتبطة بالغشاء والتي تتوسط في إدراك مسببات الأمراض والتخفيف الفعال للعدوى. يتم تصنيف PRRs عادةً في مجموعتين من كينازات المستقبلات (RKs) والبروتينات الشبيهة بالمستقبلات (RLPs) (Boutrot & Zipfel، 2017). لتحديد PRRs التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي استجابةً لـ OMVs ، قمنا بمقارنة مجموعة DEG الخاصة بنا مع قوائم Arabidopsis RKs المحددة مسبقًا (Kemmerling et al.، 2011؛ ​​Mott et al.، 2016) و RLPs (Wang et al.، 2008). لقد حددنا في مجموعة البيانات الخاصة بنا 33 و10 RKs وRLPs منظمة، على التوالي، في جميع النقاط الزمنية مجتمعة (الجدول 1). لم يتم العثور على RKs أو RLPs في قائمتنا المكونة من 175 جينًا خاضعًا للتنظيم. كيميرلينج وآخرون. (2011) حدد قائمة تضم 49 RKs، والتي تم تحفيز تعبيرها بشكل كبير بواسطة MAMPs مثل flg22 وNLP (النخر والببتيد المحفز للإيثيلين 1- مثل البروتين)، أو علاج مسببات الأمراض. لقد قارنا هذه القائمة مع RLKs التي تم تنظيمها من تجربتنا ووجدنا أن 45٪ من RKs التي حددها Kemmerling et al. (2011) تم تحفيزها أيضًا استجابةً لـ OMVs. ومن بين تلك الجديرة بالملاحظة FRK1، وSOBIR1، وSERK4، وRLK/IKU2، وPSKR1، وHAESA، وEFR، وBIR، وIOS1 (الجدول 1). من بين مجموعة RK، كان لدى FRK1 أعلى تعبير عند كل من 2 و6 حصان مع LogFC يبلغ 7.11 و5.2 على التوالي، في حين كان متوسط ​​LogFC لجميع RKs 2.11 و2.13 عند 2 و6 حصان على التوالي. في حين أن RKs و RLPs المرتبطة بالغشاء تتوسط في الغالب في الاستشعار خارج الخلية للميكروبات الغازية، فإن مستقبلات التكرار (LRR) الغنية بالليوسين (LRR) في موقع ربط النوكليوتيدات، هي مستقبلات مناعية داخل الخلايا. لقد وجدنا 7 جينات مختلفة من NLR تم تنظيمها استجابةً لتحدي OMV عند 2 و6 hpc، ولم يتم العثور على أي منها عند 24 hpc (تم استخراج قائمة NLR من TAIR، 102 جينًا) (الجدول 1).

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

3.3 تحفز OMVs التعبير عن عوامل النسخ WRKY المتعددة

تم العثور على عوامل النسخ WRKY (TFs) تلعب أدوارًا في الاستجابات المناعية للنبات، وتشارك في كل من المناعة المحفزة بـ MAMP (MTI) واستجابات المناعة المحفزة بالمستجيب (ETI) (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010). ). أدى تحدي OMV إلى تنظيم 20 WRKY TFs مختلفة (قائمة مستخرجة من TAIR، 70 جينًا) فقط عند 2 و6 HPC (الجدول 1). كانت WRKY TFs غائبة عن مجموعة الجينات الخاضعة للتنظيم. عائلة أخرى من TFs المتأثرة بتحدي OMV هي البروتينات التي تحتوي على مجال MYB (Tsuda & Somssich، 2015)، والمعروفة بمشاركتها في عمليات متعددة بما في ذلك الضغوط الحيوية وغير الحيوية (Ambawat et al.، 2013). بشكل عام، تم التعبير بشكل مختلف عن 9 MYB TFs (قائمة مستخرجة من TAIR، 211 جينًا) استجابةً لتحدي OMV، و5 خاضعة للتنظيم و4 خاضعة للتنظيم (الجدول 1). يتم سرد فئات إضافية من TFs المعبر عنها تفاضليًا والتي تم اكتشافها في الجدول 1.

3.4 مقارنة استجابة الأرابيدوبسيس النصية لـ OMV مع الاستجابة لـ MAMPs المنقى

للتعرف على الاختلافات في استجابة الأرابيدوبسيس للمستنشق المنقى مقابل البنية الخام والمعقدة جزيئيًا - OMVs، قمنا بمقارنة بيانات RNA-seq الخاصة بنا مع البيانات النصية الحالية لاستجابة الأرابيدوبسيس لـ MAMPs المعروفة بما في ذلك flg22، (Denoux et al.، 2008) elf26 (Zipfel et al.، 2006)، PGN (Willmann et al.، 2011)، OGs (Davidsson et al.، 2017) و LPS (Livaja et al.، 2008). تم استخراج GOs المخصب من مجموعات البيانات المذكورة أعلاه كما هو موضح أعلاه (ملحق الجدول S3) ومقارنتها مع GOs المخصب بعد تحدي OMV. بشكل عام، كانت مصطلحات Arabidopsis GO المستحثة بواسطة OMVs مماثلة لتلك المستحثة بواسطة MAMPs المفردة والبروتينية وغير البروتينية، حيث شاركت 56 و51 و47٪ من GOs المستحثة بـ OMV مع GOs المستحثة بواسطة flg22 وelf26 وPGN، على التوالي. من ناحية أخرى، شوهد تداخل أقل في GOs المستحثة مع LPS وOGs، حيث شاركا 24 و 33٪، على التوالي، مع GOs الناجم عن OMV (الشكل 4A). والجدير بالذكر أن الجين 1 (PR1) المرتبط بالتسبب في المرض (At2g14610)، وهو السمة المميزة للاستجابات المناعية الناجمة عن LPS (Silipo et al.، 2005، 2008)، كان غائبًا عن قائمة الجينات المستحثة بـ OMV في جميع النقاط الزمنية التي تم اختبارها. تم العثور على واحد وأربعين GOs مستحثة بواسطة OMV وليس بواسطة أي من MAMPs الأخرى التي تم اختبارها هنا (الشكل 4B). تضمنت هذه القائمة GOs المتعلقة بـ "موت الخلايا المبرمج"، و"الاستجابة للدواء"، و"نقل الأدوية و"نقل الأدوية المتعددة"، و"نشاط الليباز" (ملحق الجدول S3، يُشار إليه بالعلامات النجمية والخط الغامق).

3.5 OMVs تحفز مقاومة الأرابيدوبسيس للعدوى البكتيرية

هنا وسابقًا (Bahar et al., 2016)، قدمنا ​​أدلة تثبت أن الجهاز المناعي لنبات الأرابيدوبسيس ينجم عن تحدي OMV. لفحص ما إذا كان هذا الحث المناعي بوساطة OMV يُترجم إلى استجابة مناعية فعالة، استخدمنا اختبار نمو البكتيريا النباتية (Zipfel et al.، 2004) حيث تتم معالجة نباتات الأرابيدوبسيس باستخدام OMVs متبوعة بالتلقيح البكتيري. انخفاض ملحوظ بأكثر من 10- أضعاف في Pseudomonas syringae pv. وقد لوحظت أوراق الطماطم DC3000 (Pst) CFU/g في كل من النباتات المعالجة مسبقًا OMV- وflg22- مقارنةً بالمعالجة المسبقة الوهمية، بعد يومين من التلقيح (الشكل 5A). لم يتأثر نمو Pst في المختبر سلبًا بإضافة OMVs إلى الوسط، مما يشير إلى أن انخفاض نمو Pst في النبات يرتبط بالتأثير الأولي لـ OMV، وليس تأثيرًا مباشرًا لـ OMVs على البكتيريا (ملحق. الشكل S2). لاختبار ما إذا كانت المقاومة الناجمة عن OMV لـ Pst تتوسط بواسطة FLS2 أو EFR أو BAK1، كررنا هذه التجربة مع Col-0، bak-mutant، ويقع الخط المتحول المزدوج efr. مع كلا الخطين المتحولين، أدت المعالجة المسبقة لـ OMV إلى انخفاض كبير في أوراق Pst CFU/g مقارنة بالنباتات المعالجة الصورية (الشكل 5B-C). كما هو متوقع، كانت خطوط fls efr وbak-mutant المعالجة بـ flg22 تحتوي على عيارات Pst مماثلة للنباتات غير المعالجة حيث من المعروف أنها لا تستجيب لـ flg22. لمقارنة الانخفاض النسبي في عيار العامل الممرض في Col-0 مقابل الخطوط المتحولة للمستقبلات المناعية التي تقع دائمًا وتخبز في النباتات المجهزة، قمنا بحساب الفرق في عيار Pst في النباتات المعالجة بالـ OMV والنباتات الصورية في ثلاث تجارب مستقلة (ملحق الشكل S3). كان متوسط ​​التخفيض في عيار Pst في النباتات الخلفية المعالجة بـ OMV أصغر من ذلك الذي لوحظ في نباتات Col-0 (0.89 مقابل 1.14 Log CFU/gr لتخفيض أوراق الخبز والكول -0، على التوالي، واحد- طريقة ANOVA، F2، 4=4.3781، ص=0.0523). لم نشهد انخفاضًا مشابهًا مع خط متحولة fls efr (1.26 مقابل 1.32 تخفيض سجل CFU لـ fls efr وCol-0، على التوالي، ANOVA أحادي الاتجاه: F1,4=0.0352, p=0.5698) (الشكل 5D-E).

الجدول 1 RKs / RLPs الناجم عن OMV وعوامل النسخ المرتبطة بالمناعة في شتلات الأرابيدوبسيس

الجدول 1 (تابع)

الجدول 1 (تابع)

4. مناقشة

حويصلات الغشاء البكتيري الخارجي (OMVs) عبارة عن هياكل نانوية معقدة تنشأ من الغشاء الخارجي البكتيري وتتكون من مئات البروتينات ومكونات جدار الخلية الأخرى. لقد سبق أن تبين أن نباتات الأرابيدوبسيس تستجيب لتحدي OMV من خلال تنشيط الاستجابات المناعية النموذجية مثل انفجار ROS والتعبير الجيني للعلامة المناعية والقلوية المتوسطة (Bahar et al.، 2016). في هذه الدراسة، قمنا بفحص الاستجابة النسخية الأوسع لنبات الأرابيدوبسيس تجاه OMVs البكتيرية وتأثيرها على العدوى اللاحقة. الاستنتاج الشامل من تحليلات بيانات RNA-seq التي تم إجراؤها في هذه الدراسة هو أن الجهاز المناعي الأرابيدوبسيس مُجهز بعد التعرض لـ Xanthomonas Campestris pv.campestris (Xcc) OMVs. ويدعم هذا الاستنتاج تحليلات متميزة ومتكاملة. أولاً، يُظهر إثراء الجينات (GO) في النباتات المعرضة لـ Xcc OMVs بوضوح أن الأرابيدوبسيس ينظر إلى OMVs على أنها ضغوطات. ارتبط الموقع الخلوي لاستجابة النبات في المقام الأول بمحيط الخلية مما يشير إلى الإدراك الخلوي الخارجي للمادة الصعبة، OMVs. وهذا يوفر المزيد من الدعم لفكرة أن OMVs ومكوناتها يتم استشعارها بواسطة مستقبلات خارج الخلية، على غرار العديد من MAMPs المعروفة. ثانيًا، لاحظنا أن مجموعة كبيرة من RKs وRLPs يتم تنظيمها استجابةً لتحدي OMV. من المعروف أن العديد من هذه المستقبلات تتوسط في إدراك مسببات الأمراض أو ثبت سابقًا أنها مرتبطة بالاستجابة المناعية للنبات. كان FLG 22- كيناز 1 الشبيه بالمستقبل (FRK1) هو المستقبل الأكثر تحفيزًا. هذا أمر مثير للاهتمام لأننا لم نتمكن من اكتشاف فلاجيلين في تحليل البروتينات Xcc OMV (البيانات غير معروضة). ومن المعروف أن FRK1 يتم تحفيزه أيضًا بواسطة محفزات مناعية أخرى، ولكن من المثير للاهتمام سبب كون تعبيره أعلى بكثير من بقية RKs التي يتم تنظيمها هنا. من ناحية أخرى، تم تنظيم تعبير مستقبل عامل الاستطالة (EFR) بشكل كبير فقط عند النقطة الزمنية ساعتين، وكان لديه LogFC قدره 1.12، على الرغم من وجود EF-Tu في Xcc OMVs (Bahar et al., 2016). ). لقد وجدنا أيضًا عددًا قليلاً من جينات NLR التي تم تنظيمها استجابةً لتحدي OMV، نصفها مشروح كبروتينات مقاومة للأمراض، ومع ذلك لم يتم وصف وظيفتها في مناعة النبات. على الرغم من أننا لا نفترض أن NLRs متورطة بشكل مباشر في إدراك OMV، إلا أنه يمكن تحفيزها في اتجاه مجرى النهر لاستشعار RK/RLPs لجزيئات OMV كما لوحظ أيضًا استجابةً لـ MAMPs المنقى مثل flg22 وelf18 وLPS (Denoux et al., 2008). ؛ ليفاجا وآخرون، 2008؛ زيبفيل وآخرون، 2006). ثالثًا، تم تنظيم العديد من عوامل النسخ المرتبطة بالمناعة، مثل WRKY وMYB وغيرها، بشكل كبير بواسطة OMVs (Bjornson et al., 2021). في دراستنا، حدث التغيير النسخي الرئيسي استجابةً لـ OMV في أول نقطتين زمنيتين (2 و6 حصان). وقد تم توضيح ذلك من خلال عدد أكبر بكثير من الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) وتسجيل طيات سجل أعلى بكثير (LogFC) عند 2 و6 حصان. ومع ذلك، من إجمالي 121 درجة حرارة تم العثور عليها عند 24 حصانًا، لم يتم العثور على نصفها تقريبًا (52) عند 2 أو 6 حصان. يشير هذا إلى أن نصف DEGs عند 24 حصانًا هي جينات متأخرة التنظيم، والتي تم تنظيم تعبيرها لأعلى أو لأسفل بعد 6 حصان. في الواقع، تم تحديد جينات الأرابيدوبسيس ذات ديناميكيات التعبير المختلفة بعد تحديات المستحث (Bjornson et al.، 2021).

الشكل 4: مقارنة مصطلحات علم الجينات المخصب (GO) استجابةً لـ OMV وMAMPs المنقى. تم استخدام مجموعات بيانات تعبير Arabidopsis استجابة لتحدي MAMP (elf26، وflg22، وOGs، وPGN، وLPS؛ راجع قسم المواد والطرق للحصول على مراجع) لاستخراج GOs المخصب باستخدام أداة الويب AgriGo. تمت مقارنة مجموعات GO المخصبة لكل MAMP مع قائمة GO المخصبة استجابةً لـ OMVs باستخدام Venny (A، وSupp. Table S3). تظهر مصطلحات GO المخصبة فقط في مجموعات بيانات OMV في (B) مرتبة حسب قيمة FDR الخاصة بها.

في دراستنا، حدث التغيير النسخي الرئيسي استجابةً لـ OMV في أول نقطتين زمنيتين (2 و6 حصان). وقد تم توضيح ذلك من خلال عدد أكبر بكثير من الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) وتغيير أضعاف سجل أعلى بكثير (LogFC) عند 2 و6 حصان. ومع ذلك، من إجمالي 121 درجة حرارة تم العثور عليها عند 24 حصانًا، لم يتم العثور على نصفها تقريبًا (52) عند 2 أو 6 حصان. يشير هذا إلى أن نصف DEGs عند 24 حصانًا هي جينات متأخرة التنظيم، والتي تم تنظيم تعبيرها لأعلى أو لأسفل بعد 6 حصان. في الواقع، تم تحديد جينات الأرابيدوبسيس ذات ديناميكيات التعبير المختلفة بعد تحديات الاستنباط مسبقًا (Bjornson et al.، 2021). إن نمط التعبير الجيني السريع والعابر في الغالب الذي رأيناه هنا يتوافق مع الدراسات الأخرى التي اختبرت الاستجابة الزمنية لنبات الأرابيدوبسيس تجاه MAMPs. على سبيل المثال، دينوكس وآخرون. (2008) وبيورنسون وآخرون. (2021) أظهر أن التغيير النسخي في الأرابيدوبسيس استجابة لمختلف MAMPs يحدث في غضون دقائق إلى ساعات، وفي معظم الحالات، تعود DEGs إلى المستويات الأساسية ∼ خلال 24 ساعة بعد تحدي النبات. على عكس التفاعلات بين النبات والعامل الممرض، حيث يكون التفاعل ديناميكيًا ومستمرًا عند تحديه بعينة غير حية، مثل MAMP المنقى أو مع OMVs - يمكن توقع أن استجابة النبات، على الأقل على المستوى النسخي، ستكون عابرة ولن تستمر على مدى أيام. كشفت الأبحاث المكثفة في العقود الثلاثة الماضية عن مستقبلات مناعية نباتية متعددة مسؤولة عن التعرف على الميكروبات. العديد من هذه المستقبلات لديها القدرة على اكتشاف السمات الميكروبية الفردية ويتم دراستها بالتفصيل لفهم إدراك مسببات الأمراض، وإشارات الجهاز المناعي، واستجابة النباتات النموذجية والمحاصيل بشكل أفضل. ومع ذلك، تتعرض النباتات في الوقت نفسه لميزات ميكروبية متعددة من مصادر مختلفة، مما يزيد من تعقيد الإدراك والاستجابة المناعية. كنا مهتمين بدراسة الاختلافات في الاستجابة النسخية لنبات الأرابيدوبسيس تجاه MAMPs المنقى المفرد مقابل OMVs، والتي تمثل بنية ميكروبية أكثر طبيعية وتعقيدًا ولكن درجة من التعقيد تمت إزالتها من الميكروب نفسه. تحمل OMVs عوامل الفوعة والإنزيمات التحللية والسموم والجزيئات الحيوية الأخرى التي يمكن أن يكون لها دور وظيفي في نمو البكتيريا في النبات، وبالتالي كان من المثير للاهتمام اختبار ما إذا كان تحدي OMV يحفز GOs فريدة من نوعها لا يتم إحداثها بواسطة MAMPs الاصطناعية.

الشكل 5: المعالجة المسبقة لأوراق نبات الأرابيدوبسيس باستخدام OMVs تؤدي إلى مقاومة العدوى البكتيرية اللاحقة. تمت معالجة نباتات Col-0 (A) باستخدام OMVs أو الماء (وهمي) أو flg22 كعناصر تحكم، وبعد 24 ساعة تم تلقيحها بتعليق 105 CFU/ml من Pst DC3000 باستخدام تسلل حقنة بدون إبرة . تم تحديد عيار خلية Pst DC3000 في الأوراق الملقحة بعد 48 ساعة من التلقيح بواسطة ألواح التخفيف التسلسلية. تم اختبار نباتات Arabidopsis Col-0 وfls efr (B) أو bak (C) في تجربة مماثلة كما هو موضح في (A). تمت مقارنة متوسط ​​تخفيض Log Pst DC3000 CFU/gr بعد المعالجة المسبقة لـ OMV (مقارنة بالنباتات غير المعالجة) في Col-0 والسقوط efr (D)، وCol-0 والعودة (E). يمثل كل شريط متوسط ​​​​تخفيض Log Pst DC3000 CFU / gr من ثلاث تجارب مستقلة (يتم عرض بيانات التجارب المستقلة في الملحق. الشكل S3). لم تكن الاختلافات ذات دلالة إحصائية (تتم الإشارة إلى قيم t-test. p للطالب ثنائي الذيل أعلى أشرطة الرسم البياني). أجريت التجارب A وB وC ثلاث مرات على الأقل بنتائج مماثلة (3 نباتات/مكررات لكل علاج في كل تجربة). تشير العلامات النجمية (**) إلى وجود فرق كبير مقارنة مع الصور الوهمية (اختبار Dunnet p <0.001)

بالنسبة لمقارناتنا النصية، قمنا بتجميع البيانات من الدراسات ذات الظروف التجريبية المماثلة، أي في النباتات وفي نقاط زمنية مماثلة. شوهد تداخل كبير في تخصيب GO في استجابة الأرابيدوبسيس لـ OMV وflg22 وelf26 وPGN. هذا ليس غير متوقع لأنه من المعروف أن العديد من مسارات الدفاع التي يتم تنشيطها عند استشعار مسببات الأمراض متشابهة، بغض النظر عن المستحث المحدد أو مصدره (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). ومع ذلك، فقد وجد أن بعض المنظمات الحكومية الفريدة يتم تنظيمها بواسطة OMVs وليس بواسطة MAMPs الأخرى التي قمنا بمسحها. من بين هذه العناصر GOs المرتبطة بتدهور جدار الخلية مثل "نشاط الليباز" و"نشاط الهيدرولاز الذي يعمل على روابط الجليكوزيل"، مما قد يشير إلى أن نظام الدفاع النباتي يستهدف تدهور OMV. ومن المثير للاهتمام أنه تم أيضًا العثور على ثلاث منظمات حكومية مرتبطة بنقل المخدرات يتم تنظيمها بشكل فريد من خلال تحدي OMV. قد يشير هذا إلى أن النباتات تواجه مركبات سامة يتم توصيلها إلى خلاياها، ربما عن طريق التوصيل بوساطة OMV. على عكس استجابة الأرابيدوبسيس للببتيدات المحفزة للمناعة وPGN، لاحظنا تداخلًا قليلًا نسبيًا بين استجابة الأرابيدوبسيس لـ OMVs OGs وLPS. يعد هذا التداخل الصغير، خاصة مع LPS، مفاجئًا إلى حد ما، مع الأخذ في الاعتبار أنه في خلايا الثدييات، يتم الاعتراف بـ LPS جيدًا كمساهمين أقوياء في الاستجابة المناعية للمضيف الناجم عن OMVs (Ellis et al.، 2010). علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أننا لم نتمكن من العثور على تنظيم السمة المناعية المميزة لـ LPS PR1 (Silipo et al. ، 2005) ، يمكن أن تشير إلى أن LPS ليس منشطًا رئيسيًا للتفاعل المناعي للنبات مع OMVs البكتيرية. ومع ذلك، لا يزال يتعين فحص هذا الأمر بشكل أكثر شمولاً. تبين أن OMVs تساهم في الاستعمار البكتيري لكل من مضيفي الثدييات والنباتات وفي بعض الحالات إلى الفوعة البكتيرية. من ناحية أخرى، تعمل OMVs على تنشيط الجهاز المناعي للمضيف، وبالتالي تعمل كسيف ذو حدين، حيث تعزز بقاء البكتيريا وضراوتها من ناحية، وتغذي نظام مراقبة المضيف وتنشط مناعة المضيف من ناحية أخرى (McMillan & Kuehn, 2021). ). أظهرت فحوصاتنا الأولية أن تحدي OMV أدى إلى تثبيط كبير لبكتيريا Pseudomonas syringae pv. نمو الطماطم DC3000 (Pst) في النبات، على غرار التأثير الأولي الذي شوهد مع MAMPs الاصطناعية (Jung et al.، 2009). ومن ثم، في هذه الحالة، فإن الإدارة المسبقة لـ OMVs على الأنسجة الملقحة لم تعزز الاستعمار البكتيري بل جهزت النباتات للحث على استجابة مناعية فعالة تمنع نمو مسببات الأمراض. تتماشى هذه النتيجة مع بياناتنا النصية ومع دراستنا السابقة، مما يدعم فكرة أن OMVs تحفز استجابة مناعية قوية وفعالة في الأرابيدوبسيس. أظهرت دراستان حديثتان أيضًا أن معالجة نبات الأرابيدوبسيس باستخدام OMVs من أحد أنواع الزائفة المسببة للأمراض أو المتعايشة، أدت إلى قمع عدوى Pst اللاحقة (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). تشير هذه النتائج بشكل تراكمي إلى أنه في ظل الظروف التي تم اختبارها، فإن تسلل OMV لا يسهل الإصابة بالعوامل الممرضة. في دراسة سابقة، أظهرنا أن طفرات مستقبلات المناعة المتعددة تحافظ على استجابة WT لـ Xcc OMVs. تضمنت هذه المسوخات PRRs المعروفة، والتي تتعرف إما على البروتينات (FLS2، EFR، RLPReMAX) أو MAMPs غير البروتينية (LYM1 / LYM3) (Bahar et al.، 2016). ومن المثير للاهتمام أن جاندا وآخرون. (2021) أفاد أنه عندما تم تحدي الخط المتحور لمستقبل FLS2 من الأرابيدوبسيس (الأنفلونزا) باستخدام OMVs من Pst، لم يتغير تعبير FRK1 وكان مشابهًا للنباتات المعالجة وهمية، مما يشير إلى أن FLS2 يتوسط الاستجابة لـ Pst OMVs. من الممكن أن يكون فلاجيلين أكثر وفرة في مستحضرات Pst OMV مما هو عليه في Xcc 33913 OMVs، وبالتالي فإن إزالة مستقبل فلاجيلين كان له تأثير أكثر وضوحًا على استجابة النبات لـ Pst مقارنةً بـ Xcc OMVs.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

لقد ثبت أن فحوصات المناعة النباتية المختلفة قد تسفر عن نتائج مختلفة، مما يؤدي إلى استنتاجات متعارضة. على سبيل المثال، لقد أظهرنا أنه في اختبار انفجار ROS على قرص الأوراق، كانت استجابة الأرابيدوبسيس لـ OMVs تعتمد على مستقبل EFR، ومع ذلك، في اختبار التعبير الجيني للعلامة المناعية مع شتلات الأرابيدوبسيس، كان الخط المتحول دائمًا مستجيبًا لـ OMVs مثل وزن. ماكميلان وآخرون. (2021) أظهر أن العلاجات الفيزيائية المختلفة المطبقة على OMVs ألغت بعض الأنشطة مثل تثبيط نمو البادرات. ومع ذلك، فإنه لم يغير النواتج المناعية الأخرى مثل تحضير النبات. ومن ثم، من المهم الجمع بين مجموعة متنوعة من الاختبارات لاختبار النواتج المناعية المختلفة للحصول على رؤية واسعة قدر الإمكان للاستجابة المناعية للنبات لمستدعي معين. لمزيد من دراسة تورط بعض من PRRs والمستقبلات المشتركة المعروفة، قمنا باختبار السقوط على الإطلاق والخطوط المتحولة bak باستخدام اختبار تحضير النبات. تظهر نتائجنا أن شلالات خط الأرابيدوبسيس المزدوج المتحولة تم تحضيرها بالمثل بواسطة Xcc OMV كما كانت الحال مع مصانع WT، مما يدعم فكرة أن MAMPs بخلاف فلاجيلين و EF-Tu موجودة أيضًا في Xcc 33913 OMVs. استنادًا إلى فحوصات التعبير الجيني للعلامة المناعية، اقترحنا سابقًا أن المستقبل المشترك BAK1 متورط في إدراك و/أو استجابة OMV (Bahar et al.، 2016). في هذه الدراسة، قمنا بإعادة النظر في هذا الاقتراح باستخدام اختبار فتيلة. هنا، تم تحضير خط طفرة الخبز بواسطة المعالجة المسبقة OMV، ولكن بدرجة أقل قليلاً من نباتات WT Col-0. في حين أن هذا الهامش لم يكن ذا دلالة إحصائية، إلا أنه كان أكبر من ذلك الذي شوهد مع الخط المزدوج المتحول على الإطلاق. تتماشى هذه النتيجة أيضًا مع دراسة حديثة أظهرت أن خط bak المتحول كان يستجيب لـ OMV مثل نباتات WT في تجارب التحضير المناعي (Tran et al.، 2021). بشكل عام، قد يشير هذا إلى أنه في حين أن BAK1 متورط في إدراك OMV، فإن الإدراك المناعي ومسارات الإشارة الأخرى يتم تحضيرها بواسطة OMV، مما يؤدي إلى استجابة مناعية فعالة وقمع نمو مسببات الأمراض. إن مشاركة المستقبلات المشتركة BAK1 و SOBIR1 في الاستجابة لـ OMVs (Bahar et al.، 2016) دفعنا إلى افتراض أن المستقبلات المناعية المتعددة، ومن المحتمل أن تكون PRRs، متورطة في إدراك OMV. ومع ذلك، أشارت دراسة حديثة إلى أن التنشيط المناعي للنبات بواسطة OMVs قد يكون مستقلاً عن MAMP وينتج عن التغيرات الفيزيائية والكيميائية في غشاء البلازما النباتية الناجم عن تكامل OMV (Tran et al.، 2021). هذه فرضية مثيرة للاهتمام ولا يزال يتعين معالجتها بشكل أكبر. ومن المثير للاهتمام أن ماكميلان وآخرون. (2021) أفاد أن OMVs المعالجة بالبروتيناز K احتفظت بقدرتها على التحضير المناعي، مما يشير إلى أن هذا النشاط قد يكون مستقلاً عن الشحنة البروتينية OMV. في حين أن هذه النتيجة قد تدعم فرضية التنشيط المناعي المستقلة لـ MAMP الخاصة بـ Tran et al. (2021) ، قد تقوم MAMPs الأخرى غير البروتينية الموجودة في OMVs مثل LPS و PGN بتنشيط MTI (Bahar et al.، 2016؛ McMillan et al.، 2021). بالإضافة إلى ذلك، احتفظت OMVs المعالجة بالبروتيناز K بقدرتها على تحفيز تثبيط نمو البادرات، مما يشير إلى أن تثبيط النمو يعتمد على الشحنة البروتينية لـ OMVs (McMillan et al.، 2021). بشكل عام، تؤكد هذه النتائج أيضًا على مدى تعقيد استجابة النبات لـ OMVs وأهمية استخدام مجموعة متنوعة من النواتج لاختبار مشاركة مستنبِع معين في مسارات محددة.

خلال عام 2021، أفادت أربع دراسات مستقلة، بما في ذلك هذه الدراسة (التي من المحتمل أن تتم في وقت واحد)، أن OMVs البكتيرية تعدل الجهاز المناعي للنبات وتحفز استجابة فعالة ضد عدوى مسببات الأمراض (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; تران وآخرون، 2021). تضع هذه النتائج المثيرة OMVs كلاعب جديد ومهم في التفاعلات بين الميكروبات النباتية، حيث لا يزال هناك الكثير مما يمكن تعلمه. في هذه الدراسة، نقدم رؤية أوسع للاستجابة النسخية لـ Arabidopsis إلى Xcc OMV. ستكون هناك حاجة إلى مناهج بحثية تكميلية لزيادة فهم المكونات والآليات المشاركة في إدراك النبات لـ OMVs.

مراجع

أمباوات، إس، شارما، بي، ياداف، إن آر، وياداف، آر سي (2013). جينات عامل النسخ MYB كمنظمين لاستجابات النبات: نظرة عامة. علم وظائف الأعضاء والبيولوجيا الجزيئية للنباتات، 307-321.

بهار، ع. (2020). الحويصلات الغشائية من البكتيريا المسببة للأمراض النباتية وأدوارها أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية. في: M. Kaparakis-Liaskos، & TA Kufer eds. الحويصلات الغشائية البكتيرية – التولد الحيوي والوظائف والتطبيقات. سبرينغر الدولية للنشر، سويسرا، 119-129.

Bahar، O.، Mordukhovich، G.، Luu، DD، Schwessinger، B.، Daudi، A.، Jehle، AK، Felix، G.، & Ronald، PC (2016). تحفز حويصلات الغشاء الخارجي البكتيري الاستجابات المناعية للنبات. التفاعلات الجزيئية بين النبات والميكروبات، 374-384.

بيركنبيل، آر بي، كراشر، بي، روس، أ، كرامر، ك، فينكيمير، آي، وسومسيتش، آي إي (2018). مبادئ وخصائص الشبكة التنظيمية Arabidopsis WRKY خلال المناعة المبكرة التي تسببها MAMP. مجلة النبات، 487-502.

بيورنسون، إم، بيمبريكار، بي، نورنبيرجر، تي، وزيبفيل، سي. (2021). المشهد النسخي لنمط أرابيدوبسيس ثاليانا الذي يثير المناعة. نباتات الطبيعة، 579-586.

بولجر، إيه إم، لوهس، إم، وأوساديل، بي. (2014). Trimmomatic: أداة تشذيب مرنة لبيانات تسلسل Illumina. المعلوماتية الحيوية، 2114-2120.

بوتروت، ف.، وزيبفيل، سي. (2017). وظيفة واكتشاف واستغلال مستقبلات التعرف على أنماط النبات لمقاومة الأمراض واسعة النطاق. المراجعة السنوية لعلم أمراض النبات، 257-286.

شينشيلا، D.، زيبفيل، C.، روباتزيك، S.، كيمرلينج، B.، نورنبيرجر، T.، جونز، JDG، فيليكس، G.، وبولر، T. (2007). يبدأ المركب الناجم عن فلاجيلين للمستقبلات FLS2 و BAK1 في الدفاع عن النبات. الطبيعة، 497-500.

تشودري، سي.، وجاغانادهام، إم. ضد (2013). يتم إطلاق عوامل الفوعة بالاشتراك مع حويصلات الغشاء الخارجي لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم T1 أثناء النمو الطبيعي. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics,(1)، 231-239.

كوك، DE، Mesarich، CH، & Thomma، BPHJ (2015). فهم مناعة النبات كنظام مراقبة للكشف عن الغزو. المراجعة السنوية لعلم أمراض النبات، 541-563.

كوتو، د.، وزيبفيل، سي. (2016). تنظيم إشارات مستقبلات التعرف على الأنماط في النباتات. مراجعات الطبيعة علم المناعة، (9)، 537-552.

ديفيدسون، بي، بروبيرج، إم، كاريولا، تي، سيباري، إن، بيرهونين، إم، وبالفا، إي تي (2017). oligogalacturonides القصيرة تحفز التعبير الجيني المرتبط بمقاومة العوامل الممرضة في Arabidopsis thaliana. بي إم سي بيولوجيا النبات، 1-17.

ديثيراجيا، بي إل، وكوكسون، بريتيش تيليكوم (2012). إطلاق الحويصلة الغشائية في البكتيريا وحقيقيات النوى والعتيقة: جانب محفوظ ولكنه لا يحظى بالتقدير من الحياة الميكروبية. العدوى والمناعة، 1948-1957.

Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM, & Dewdney, J. (2008). تفعيل مسارات الاستجابة الدفاعية بواسطة محفزات OGs و Flg22 في شتلات الأرابيدوبسيس. النبات الجزيئي، 423-445.

داو، إم، نيومان، إم إيه، وفون روبيناك، إي. (2000). تحريض وتعديل استجابات الدفاع النباتي بواسطة عديدات السكاريد الدهنية البكتيرية. المراجعات السنوية لعلم أمراض النبات، 241-261.

دو، Z.، تشو، X.، لينغ، Y.، تشانغ، Z.، وسو، Z. (2010). agriGO: مجموعة أدوات تحليل GO للمجتمع الزراعي. أبحاث الأحماض النووية، W64 – W70.

إليس، تينيسي، وكوهين، إم جي (2010). الفوعة والأدوار المناعية لحويصلات الغشاء الخارجي البكتيري. مراجعات علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية، 81-94.

إليس، تينيسي، ليمان، سا، وكوهين، إم جي (2010). تثير حويصلات الغشاء الخارجي المنتجة طبيعيًا من Pseudomonas aeruginosa استجابة مناعية فطرية قوية من خلال الاستشعار المشترك لكل من مكونات عديد السكاريد الدهني والبروتين. العدوى والمناعة، 3822-3831.

Erbs، G.، Silipo، A.، Aslam، S.، de Castro، C.، Liparoti، V.، Flagiello، A.، Pucci، P.، Lanzetta، R.، Parrilli، M.، Molinaro، A. ، نيومان، M.-A.، وكوبر، آر إم (2008). الببتيدوغليكان والمروببتيدات من مسببات الأمراض Agrobacterium و Xanthomonas تثير المناعة الفطرية للنبات: الهيكل والنشاط. الكيمياء والبيولوجيا، 438-448.

فيليكس، جي.، دوران، جي دي، فولكو، إس.، وبولر، تي. (1999). تتمتع النباتات بنظام إدراك حساس للمجال الأكثر حفظًا من السوط البكتيري. مجلة النبات، 265-276.

فيسيل، بي إتش، وزوكارو، أ. (2016). -جلوكان: مكون حاسم لجدار الخلية الفطرية وMAMP بعيد المنال في النباتات. علم الوراثة الفطرية والبيولوجيا، 53-60

فولسوندار، إس، هارمز، كيه، فلاتن، جي إي، جونسن، بي جيه، تشوباد، بي إيه، ونيلسن، كيه إم (2014). إمكانات نقل الجينات لحويصلات الغشاء الخارجي لـ Acinetobacter baylyi وتأثيرات الإجهاد على الحويصلة. علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي، 3469-3483.

غوميز-غوميز، ل.، وبولر، ت. (2000). FLS2: كيناز يشبه مستقبلات LRR يشارك في إدراك فلاجيلين البكتيريا في الأرابيدوبسيس. الخلية الجزيئية، 1003-1011.

غوست، AA، بيسواس، آر، لينز، إتش دي، راوهوت، تي، رانف، إس، كيمرلينغ، بي، غوتز، إف، جلاويشنيغ، إي، لي، جيه، فيليكس، جي، ونورنبيرجر ، ت. (2007). تشكل الببتيدوغليكان المشتقة من البكتيريا أنماطًا جزيئية مرتبطة بالعوامل الممرضة تؤدي إلى مناعة فطرية في الأرابيدوبسيس. مجلة الكيمياء البيولوجية، 32338 – 32348.

Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM, & Lindow, SE (2014). تعمل حويصلات الغشاء الخارجي لـ Xylella fastidiosa على تعديل استعمار النبات عن طريق منع الارتباط بالأسطح. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، E3910 – E3918.

Janda، M.، Ludwig، C.، Rybak، K.، Meng، C.، Stigliano، E.، Botzenhardt، L.، Szulc، B.، Sklenar، J.، Menke، FLH، Malone، JG، Brachmann، أ.، كلينجل، أ.، وروباتزيك، إس. (2021). تشير التحليلات الفيزيائية الحيوية والبروتينية إلى وظائف حويصلات Pseudomonas syringae pv الطماطم DC3000 خارج الخلية في النمو البكتيري أثناء إصابة النبات. BioRxiv، 2021.02.08.430144.