اختبار حيوي لمراقبة تأثير علاج دم الحبل السري على مقاومة الشيخوخة

جهة الاتصال: jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1 *، Ala Jo1،2 *، Jae Hyun Park1، Chul-Woo Lim1، Yuri Choi1، Juhyun Oh2، Ji-Min Park1، TaeHo Kong1، Ralph Weissleder2،3، Hakho Lee2، Jisook Moon1

1. قسم التكنولوجيا الحيوية ، كلية علوم الحياة ، جامعة CHA ، Gyeonggi-do 13488 ، جمهورية كوريا

2. مركز بيولوجيا الأنظمة ، مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس 02114 ، الولايات المتحدة الأمريكية

3. قسم بيولوجيا الأنظمة ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس 02115 ، الولايات المتحدة الأمريكية * ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي.

المؤلف المراسل: Hakho Lee ، دكتوراه. مركز بيولوجيا الأنظمة ، مستشفى ماساتشوستس العام ، 185 شارع كامبريدج ، CPZN 5206 ، بوسطن ، ماساتشوستس 02114 ، الولايات المتحدة الأمريكية. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu جيسوك مون ، دكتوراه. قسم التكنولوجيا الحيوية ، كلية علوم الحياة ، جامعة CHA ، Pangyo-ro 335 ، Bundang-gu ، Seongnam-si ، Gyeonggi-do 13488 ، جمهورية كوريا. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. هذه مقالة وصول مفتوح موزعة بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). راجع http://ivyspring.com/terms للحصول على الشروط والأحكام الكاملة.

تم الاستلام: 2018.10.04 ؛ مقبولة: 2018. 11. 18 ؛ تاريخ النشر: 2019.01.01

Cistanche له تأثير مضاد للشيخوخة

الملخص

خلفية: أظهرت معالجة الحيوانات المسنة بالبلازما في مرحلة نمو مبكرة (على سبيل المثال ، بلازما الحبل السري) إمكانية رائعة لإبطاء تدهور الوظائف العصبية والمعرفية المرتبط بالعمر. ومع ذلك ، فإن ترجمة هذه النتائج إلى حقائق إكلينيكية تتطلب طرقًا فعالة لتقييم فعالية العلاج ؛ يجب أن تكون الطرق المثالية طفيفة التوغل ، وقابلة للمقايسات التسلسلية ، وفعالة من حيث التكلفة ، وكمية.

طُرق: قمنا بتطوير نهج جهاز استشعار حيوي جديد للرصدمكافحة الشيخوخةعلاج نفسي. قمنا بتطوير مكونين رئيسيين من أجهزة الاستشعار: 1) تم تحديد المستقلب الذي ينتقل عن طريق الدم كعلامة بديلة للشيخوخة ؛ 2) تم تطوير نظام فحص مدمج وفعال من حيث التكلفة للتطبيقات في الموقع. عالجنا الفئران المسنة إما ببلازما الحبل السري البشري أو بمحلول ملحي. كشف التنميط المستقلب غير المتحيز على بلازما الفأر عن حمض الأراكيدونيك (AA) كمؤشر قوي مرتبط بـمكافحة الشيخوخةتأثير. قمنا بعد ذلك بتطبيق مستشعر مغناطيسي كهروكيميائي تنافسي (cMES) محسّن لاكتشاف AA مباشرة من البلازما. يمكن للمنصة المطورة اكتشاف AA مباشرة من أحجام صغيرة من البلازما (0. 5 ميكرولتر) في غضون 1.5 ساعة.

النتائج: أكدت فحوصات cMES وجود علاقة قوية بين مستويات AA وتأثير مكافحة الشيخوخة: بينما تتناقص مستويات AA مع تقدم العمر ، تزداد في الفئران المسنة المعالجة بالبلازما والتي أظهرت أيضًا تحسنًا في التعلم وأداء الذاكرة.

الاستنتاجات: ستعمل منصة cMES على تمكين كل من قبل السريرية والسريريةمكافحة الشيخوخةالبحث عن طريق تمكين مراقبة المعالجة الطولية طفيفة التوغل ؛ هذه القدرات سوف تسريع تطويرمكافحة الشيخوخةالعلاجات وتحسين نوعية الحياة الفردية.

الكلمات الرئيسية: مكافحة الشيخوخة ، حمض الأراكيدونيك ، تحديد ملامح المستقلب ، مستشعر مغناطيسي كهروكيميائي ، مستشعر حيوي

مقدمة

يتم التعرف على الشيخوخة بشكل متزايد كعامل خطر سريري للضمور المعرفي (مثل التنكس العصبي والخرف) والأمراض المزمنة الأخرى (مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والتنكس العضلي) [1]. مع زيادة عمر الإنسان وتزايد عدد المسنين ، تُبذل جهود كبيرة لتوضيح آليات الشيخوخة [1-3] وإيجاد استراتيجيات علاجية لإبطاء أو حتى عكس عمليات الشيخوخة [4]. في الواقع ، تم الإبلاغ عن نتائج واعدة من الدراسات على الحيوانات ؛ استعادت الفئران البالغة التي تلقت نقل بلازما من فئران صغيرة الوظيفة الإدراكية ، واللدونة المشبكية ، والنشاط العصبي [5]. التطور السريع فيمكافحة الشيخوخةالعلاجات وترجمتها إلى تجارب بشرية متوقعة [6]. ومع ذلك ، فإن المقاييس الحالية لرصد تأثيرات العلاج لها إجراءات عملية محدودة ، حيث يصعب غالبًا تطبيق الأساليب مع البشر (على سبيل المثال ، تصوير الدماغ الغازي ، ومراقبة السلوك الخاضع للرقابة) والشخصية (على سبيل المثال ، الاستبيانات حول تجارب المريض). أحد المتطلبات الرئيسية في التقدممكافحة الشيخوخةوبالتالي تكمن العلاجات في تطوير فحوصات كمية قليلة التوغل لمراقبة العلاج.

لقد اعتقدنا أن المستقلبات ستكون مصدرًا قويًا لـمكافحة الشيخوخةالمؤشرات الحيوية. المستقلبات هي نمط ظاهري أساسي في الكائن الحي ويتم دراستها كمؤشرات بيولوجية تشخيصية لأمراض أخرى [7]. على وجه الخصوص ، ترتبط الشيخوخة عادةً بالتغيرات الأيضية أو الخلل الوظيفي ، مما يؤثر على الملامح العامة للمستقلبات في الكائنات الحية. على هذا النحو ، فمن المتصور أن تتبع تكوين و / أو مستويات الأيضات من شأنه أن يبلغ فعاليةمكافحة الشيخوخةعلاج او معاملة. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون فحوصات المستقلب ، لا سيما في شكل اختبارات الدم ، كمية وذات حد أدنى من التدخل الجراحي ؛ هذه المزايا من شأنها أن تسهل التعرف على أنظمة العلاج المختلفة أو مجموعات المرضى ، ورصد ديناميكيات (مكافحة) الشيخوخة من خلال أخذ العينات التسلسلي.

نحن هنا نصف استراتيجية جهاز استشعار حيوي جديدة للرصدمكافحة الشيخوخةعلاج او معاملة. تم تطوير عنصرين رئيسيين: 1) تم تحديد المستقلب الذي ينتقل عن طريق الدم كعلامة بديلة للشيخوخة. و 2) تم تطوير نظام فحص سريع وفعال من حيث التكلفة للتطبيقات في البيئات السريرية الروتينية. على وجه التحديد ، عالجنا مجموعة من الفئران المسنة (حوالي عامين) بالبلازما المأخوذة من دم الحبل السري البشري. كشفت تحليلات الأيض الشاملة على دم الفأر أن حمض الأراكيدونيك (AA) ، الذي انخفض مستواه بشكل كبير مع تقدم العمر ، زاد بشكل عكسي في المجموعة المعالجة. أدت هذه الملاحظة إلى ابتكار مستشعر مغناطيسي كهروكيميائي للأهداف الجزيئية الصغيرة: قمنا بتحسين تفاعل كهروكيميائي تنافسي حيث تم التقاط AA على خرز مغناطيسي وتركيزه للحصول على حساسية أعلى. يمكن للمنصة المطورة اكتشاف AA مباشرة من أحجام صغيرة من البلازما (0. 5 ميكرولتر) في غضون 1.5 ساعة. باستخدام هذه المنصة ، يمكننا أيضًا إنشاء علاقة إيجابية بين مستويات الدم AA والأداء الأفضل للحيوانات في المهمة الحركية.

نتائج

يُظهر علاج الفئران البالغة ببلازما دم الحبل السري الشكل 1 أ مخطط التجربة الشامل.

كعامل ، استخدمنا البلازما المشتقة من عينات دم الحبل السري البشري. أظهرت الدراسات السابقة أن الفئران المسنة التي حُقنت ببلازما الفئران الصغيرة استعادت وظيفة الذاكرة المكانية ، وأن الإعطاء الجهازي لبلازما دم الحبل السري البشري حسَّن الإدراك المعتمد على الحصين لدى الفئران المسنة [5 ، 8]. يقلل حقن البلازما ، الخالي من المكونات الخلوية ، من خطر الرفض المناعي الناتج عن عدم تطابق الأنواع. تم اختيار الفئران المسنة (عمر البدء ، 18 شهرًا) بشكل عشوائي وتم تلقيها إما بالبلازما (مجموعة معالجة) أو محلول ملحي (مجموعة صورية) عن طريق حقن عبث الذيل (130 ميكرولتر ؛ انظر الشكل S1 للحصول على التفاصيل). كعنصر إيجابي ، تم استخدام الفئران الصغيرة (3 أشهر). لم يتم تجميع البلازما المشتقة من دم الحبل السري وتم حقن كل فأر بشكل متكرر بالبلازما من نفس المتبرع (الشكل S1). بعد علاج لمدة 4- أسبوع ، خضعت الفئران لاختبار سلوك (مثل rotarod) ، وسحب الدم للتحليل.

الشكل 1. التصميم التجريبي. تم إعطاء بلازما دم الحبل السري البشري للمجموعات الصغيرة (3- شهر) وكبار السن (20- و 23- شهر) والمجموعات القديمة المعالجة بالبلازما (20- و 23- شهر). خضعت المجموعات الثلاث 2- لاختبارات روتارود التجريبية لقياس التنسيق الحركي والتعلم. تم إجراء التنميط غير المستهدف للمستقلبات على الدم من المجموعات الثلاث ، والأكثرمكافحة الشيخوخةتم تحديد المسار ذي الصلة من خلال نهج المعلومات الحيوية. تم تطوير جهاز الاستشعار الحيوي لاكتشاف أهم مستقلب في المسار.

الشكل 2. تحديد المؤشرات الحيوية المستقلب المرتبطة بمعالجة بلازما دم الحبل السري البشري. (أ) الملف الشخصي العالمي لاضطراب المستقلب. تتوافق الصفوف مع الميزات (مجموعة فريدة من قيمة m / z ووقت الاحتفاظ) من LC / MS والأعمدة إلى العينات. يتم تجميع الصفوف بشكل هرمي. (ب) نقاط مؤامرة من PCA لتقليل الأبعاد. تم رسم العينات مقابل المكون الرئيسي (PC) 1 و 2. القيم الموجودة بين أقواس أساطير المحور هي نسب التباين التي تم شرحها بواسطة تلك المكونات. يفسر PC1 على الأرجح التأثيرات المضادة للشيخوخة ، بالنظر إلى أن المجموعة المعالجة بالبلازما كانت أقرب بكثير إلى المجموعة الشابة منها إلى المجموعة الصورية. (ج) تحليل مسار التخصيب. تم تحديد المستقلبات من خلال مطابقة قيم m / z المقاسة بمعلومات الكتلة الجزيئية. تمثل كل دائرة مسارًا محددًا تم العثور عليه. بالنسبة لمسار معين ، يتوافق موقع x أو حجم الدائرة مع المركزية النسبية (مقياس لتأثير المسار) للأيضات ، والموقع y أو اللون (قيم p منخفضة للأحمر وأعلى للأزرق) إلى حد أي المستقلبات يتم تمثيلها بشكل مفرط. المسارات المهيمنة لها قيم x و y أعلى. وفقًا لذلك ، تم تحديد استقلاب حمض الأراكيدونيك (AA) باعتباره المسار الأكثر احتمالية لشرحآثار مكافحة الشيخوخةمن بلازما دم الحبل السري.

تحاليل التمثيل الغذائي على عينات دم الفأر

أجرينا أولاً تنميط مستقلب غير متحيز لجزيء صغير في بلازما الفأر. تم إخضاع عينات الدم من جميع مجموعات الفئران الثلاثة لتحليلات كروماتوجرافيا السائل وقياس الطيف الكتلي (LC / MS). قمنا بمعالجة بيانات m / z بواسطة MAIT (مجموعة أدوات التعريف التلقائي للمستقلب) وحددنا ميزات ذات دلالة إحصائية عبر ANOVA (8572 توليفة فريدة من m / z ووقت الاحتفاظ) (الشكل 2 أ). كشف تحليل المجموعات الهرمية (HCA) للمستقلبات عن نمطين رئيسيين: 1) كانت ملامح المستقلب مختلفة بشكل مميز بين الفئران المسنة (غير المعالجة) والفئران الصغيرة. و 2) كان ملف تعريف الفئران المسنة المعالجة بالبلازما أقرب إلى الفئران الصغيرة.

كشف تحليل المكون الرئيسي (PCA) عن الهياكل المتأصلة لبيانات الأيض (الشكل 2 ب). تم تفسير حوالي 50 بالمائة من إجمالي الاختلافات بواسطة المكونين الأول (PC1) والمكونات الرئيسية الثانية (PC2). استقرت الأتراب الثلاثة (أي مجموعات الشباب والمعالجة بالبلازما والشورية) في مواقع منفصلة ، مما يشير إلى أنه تم تحديد السمات ذات الصلة بيولوجيًا لفئات المجموعات المتمايزة. ومن المثير للاهتمام أن المجموعة المسنة المعالجة بالبلازما ابتعدت عن الزائفة تجاه المجموعة الشابة. لتقدير فصل المجموعة ، قمنا بحساب المجموعات الهرمية على المكونين الرئيسيين. في مخطط dendrogram ، تم تجميع المجموعات الشابة والمعالجة بالبلازما عند مستوى تباين أقل (أو مستوى تشابه أعلى ، 1120.9) من المجموعة غير المعالجة (3162.5) (الشكل S2). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام الميزات المحددة (المتغيرات أو الصفوف في الشكل 2 أ) لاستنتاج المرقم الحيوي المستقلب ذي الصلة بالشيخوخة ومكافحة الشيخوخة. قمنا بتعليق الميزات مع المستقلبات المعروفة باستخدام قاعدة بيانات في المجال العام [9].

قمنا كذلك بتقييم الوظائف والترابط بين المستقلبات المحددة ، وتطبيق KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينوم) [10] رسم الخرائط. بالنسبة لمسار معين ، قمنا بقياس 1) التمثيل الزائد لمستقلب مرشح و 2) أهميته (أي ، مركزية بينية) [11] كعقدة وسيطة رئيسية بين أزواج من المستقلبات الأخرى (انظر الطرق للحصول على التفاصيل). وجدنا أن استقلاب حمض الأراكيدونيك (AA) كان المسار الأكثر تمثيلاً (أعلى قيمة y في الشكل 2 ج) ، وتميل المستقلبات في هذا المسار إلى تحديد موقع مسارات الاتصال (قيم x أعلى في الشكل 2 ج) و تحكم في تدفق المعلومات. من بين العديد من المستقلبات في استقلاب AA ، اخترنا AA نفسه كمؤشر حيوي. كمدخل بداية في المسار ، يمكن أن يكون AA وحده ممثلًا لنواتج مضطربة أخرى.

جهاز استشعار مغناطيسي كهروكيميائي تنافسي (cMES) للكشف عن AA في البلازما

شرعنا بعد ذلك في تطوير نظام فحص سريع في الموقع لاكتشاف AA. اخترنا استخدام تكنولوجيا الاستشعار المغناطيسية الكهروكيميائية [12-17]. فهو يجمع بين تخصيب الهدف والكشف في منصة واحدة: تُستخدم الخرزات المغناطيسية (MBs) لالتقاط الأهداف الجزيئية وتسميتها ، ويتم اكتشاف الأهداف المرتبطة بالخرز من خلال الاستشعار الكهروكيميائي. هذا النهج له العديد من المزايا العملية: 1) يمكن استخدام العينات الأصلية (البلازما أو الدم) مباشرة دون الحاجة إلى تنقية العينة ؛ ii) يحقق الفحص حساسية عالية للكشف من خلال الإثراء المغناطيسي وتضخيم الإشارة الأنزيمية ؛ iii) استنادًا إلى مخطط الكشف الكهربائي ، يمكن تصغير المستشعرات بسهولة كجهاز محمول (الشكل 3 أ).

ومع ذلك ، فإن الكشف عن AA من خلال الاستشعار المغنطيسي الكهروكيميائي يمثل تحديًا تقنيًا ؛ نظرًا لأن AA عبارة عن جزيء صغير (~ 304.5 Da) ، كان من الصعب تطبيق المقايسات المناعية باستخدام زوج من الأجسام المضادة AA. لذلك اكتشفنا تنسيق اختبار تنافسي (cMES ؛ مستشعر مغناطيسي كهروكيميائي تنافسي) يتطلب فقط جسمًا مضادًا AA واحدًا (الشكل 3 ب). لالتقاط الهدف ، قمنا بتغليف MBs بأجسام مضادة AA (MBAb). قمنا أيضًا بإعداد عامل منافس (AA-HRP) من خلال اقتران AA مع إنزيم مؤكسد (بيروكسيداز الفجل ، HRP). على وجه التحديد ، استخدمنا نموذج hapten ؛ AA مترافق على ألبومين المصل البقري (BSA) ، ومزيد من HRP المترافق إلى الناقل BSA (الشكل S3). لفحص cMES ، تم خلط عينات الدم مع MBAb و AA-HRP. كانت كمية AA-HRP كافية لإشباع مواقع ربط AA في MBAb (الطرق). قد يؤدي هذا إلى تحميل تفاضلي في HRP على MBs ، اعتمادًا على كميات AA الداخلية في العينات. أدت إضافة وسيط إلكترون كروموجينيك بالتتابع (3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine، TMB) إلى توليد تيار كهربائي تمت قراءته بواسطة قطب كهربائي مستوٍ. تم تحسين وقت رد الفعل لالتقاط AA وحضانة TMB لتعظيم مستوى الإشارة (الشكل S4).

الشكل 3. جهاز استشعار مغناطيسي كهروكيميائي تنافسي (cMES) لمقايسة AA. (أ) الجهاز التخطيطي. جهاز cMES له بصمة صغيرة ويوفر

العمليات في الموقع. (ب) ابتكرنا مقايسة كهروكيميائية تنافسية للكشف عن AA. تم تصريف الخرزات المغناطيسية (MBAb) مع الأجسام المضادة ضد AA.

احتوت عينات التحكم على AA-HRP فقط وتم خلطها مع حبيبات مغناطيسية. تم خلط عينات الاختبار مع خرز مغناطيسي و AA-HRP. (ج) التيارات الكهربائية

يقاس بواسطة قارئ cMES المحمول. في مقايسة cMES ، يتناقص المقدار الحالي مع زيادة تركيز AA [AA]. الإشارة من جهاز التحكم

عين العينة خط الأساس لـ [AA]=0 نانوغرام / مل. تم استخدام الفرق الحالي (I) بين مجموعة التحكم وعينات البلازما المستهدفة كمقياس تحليلي. (د)

تم زيادة الكميات المعروفة من AA في مصل الدم وتم قياسها بواسطة cMES. كان حد الكشف ~ 126 نانوغرام / مل. تمت مقارنة (E) cMES و ELISA

فهرس أبجدي. أظهرت النتائج من كلا الطريقتين اتفاقًا جيدًا (R 2=0. 959). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ​​± SEM من قياسات ثلاثية.

الشكل 4. قياسات AA في عينات البلازما. (أ) تحليل الدورة الزمنية لمستوى الماوس AA بعد حقن البلازما. حقننا 13 {{1 0} ميكرولتر من البلازما (تركيز AA=7. 2 ميكروغرام / مل) في الفئران (ن=6) وجمعنا دم الفئران بعد 3 و 7 و 14 أيام. ثم تم رصد مستويات AA من دم الفئران. زادت مستويات AA بشكل ملحوظ في اليوم الثالث وعادت إلى المستوى الطبيعي بعد 7 أيام. * ف <0. 0="" 5="" ؛="" **="" p=""><0. 0="" 1="" ؛="" ***="" p=""><0. 0="" 0="" 1.="" (ب)="" تم="" فحص="" عينات="" بلازما="" الفأر.="" في="" المجموعة="" الضابطة="" (ن="5)" ،="" كان="" لدى="" الفئران="" الصغيرة="" (بعمر="" 5="" و="" 8="" أشهر)="" مستويات="" aa="" أعلى="" من="" الفئران="" القديمة="" المعالجة="" بطريقة="" الشام="" (الأعمار="" ،="" 20="" و="" 23="" شهرًا="" ؛="" ن="8)." بالنسبة="" للمجموعة="" المعالجة="" بالبلازما="" (ن="5)" ،="" لوحظت="" زيادة="" مطردة="" في="" aa.="" *="" ف=""><0.05 ؛="" **="" ف=""><0.01 ؛="" ***="" ف=""><0.001. (ج)="" تم="" تحليل="" عينات="" البلازما="" من="" نفس="" المجموعات="" كما="" في="" (ب)="" بواسطة="" مطياف="" الكتلة.="" أظهرت="" مستويات="" aa="" اتجاهًا="" مشابهًا="" كما="" تم="" قياسه="" بواسطة="" cmes.="" *="" ف=""><0.05 ؛="" **="" ف=""><0.01 ؛="" ***="" ف=""><0.001. يتم="" عرض="" البيانات="" على="" أنها="" تعني="" ±="">

نتيجة للمقايسة التنافسية ، انخفض حجم التيار الكهربائي مع ارتفاع تركيزات البلازما AA ([AA]). لذلك قمنا بإعداد عينة تحكم من خلال احتضان MBAb باستخدام AA-HRP فقط. تم استخدام عينة التحكم لتعيين خط الأساس العلوي (على سبيل المثال ، [AA]=0 نانوغرام / مل) لحساب فروق الإشارة ؛ تم قياس التيارات الكهربائية من عينة التحكم وعينة البلازما ، وصافي الفرق|I |=| Icontrol - إبلازما|تم الحصول عليها (الشكل 3 ج). مثل

وتعوض القياسات التفاضلية أيضًا عن إشارة الخلفية المشتركة.

كشفت تجربة المعايرة (الشكل ثلاثي الأبعاد) باستخدام عينات مسننة بكميات متفاوتة من AA أن حد الكشف (LOD) يصل إلى 125.9 نانوغرام / مل. كان LOD للمقايسة حوالي 300- ضعفًا أقل من تركيز AA النموذجي البالغ (38 ميكروغرام / مل) في بلازما الفئران الصغيرة (5 أشهر ، ن=2). بناءً على هذه النتائج ، قمنا بتخفيف عينات البلازما الأولية (100- أضعاف) عن طريق إضافة محلول عازلة (انظر الطرق). كانت الإشارة من الارتباط غير المحدد قريبة من مستوى الخلفية الجوهرية (~ 43 nA) ، ومن المحتمل أن تستفيد من عامل التخفيف المرتفع. أكدنا أيضًا أن نتائج الفحص مطابقة مع نتائج ELISA التقليدية (R 2=0. 961 ، الشكل 3 هـ). ومع ذلك ، كان اختبار cMES أسرع (ساعة واحدة) من ELISA (4 ساعات) ، ويرجع ذلك في الغالب إلى حركية الربط السريع ؛ في cMES ، تلتقط MBs AA في حجم العينة بالكامل (3- الانتشار البعدي) ، بينما يعتمد الالتقاط AA على 1- الانتشار البعدي في ELISA القائم على اللوحة.

مراقبة AA في الفئران المعالجة بالبلازما

طبقنا cMES لتحليل مستويات AA في الفئران بعد معالجة بلازما واحدة. نظرًا لوجود AA بشكل طبيعي في دم الحبل السري البشري ، فإن حقن البلازما سيزيد بشكل إضافي من مستويات AA في الفئران. كان متوسط ​​تركيز AA من ستة بلازما مختلفة من دم الحبل السري البشري 7.2 ± 0 .5 ميكروغرام / مل (يعني ± SEM). لقد حقننا 13 0 ميكرولتر من بلازما دم الحبل السري البشري للفئران (ن=6) وراقبنا مستويات AA (الشكل 4 أ). أدى حقن البلازما على الفور إلى زيادة مستويات AA في الدم (اليوم 3 ؛ P <0.01 ،="" مقارنة="" بجميع="" النقاط="" الزمنية="" الأخرى)="" ،="" لكن="" التأثير="" كان="" مؤقتًا="" ؛="" عادت="" مستويات="" aa="" إلى="" وضعها="" الطبيعي="" بعد="" 7="" أيام="" من="" العلاج="" (ص="0." 34="" ،="" مقارنة="" بالنقطة="" الزمنية="" قبل="" حقن="">

نراقب بعد ذلك مستويات AA في البلازما بعد جدول العلاج الكامل (الشكل S1). تم استخدام ثلاث مجموعات مختلفة من الفئران: مجموعة معالجة بالبلازما (n=8) ومجموعات عمرية زائفة (n=8) (20-23 شهرًا) ومجموعة ضابطة صغيرة (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

علاج البلازما يؤدي إلى تحسين الإدراك والسلوك في الفئران المسنة

قمنا كذلك بتقييم الأنماط الظاهرية السلوكية لأتراب الحيوانات ، ولا سيما تقييم وظائف التعلم الحركي والذاكرة. أجرينا {0} اختبارات تجريبية للروتارود في 1 و 4 أشهر بعد العلاج بالبلازما أو الصور الزائفة (الشكل 5 أ) ؛ تم استخدام الكمون (وقت التشغيل) للماوس قبل السقوط على قضيب دوار لتقييم الأداء الحركي للحيوان. في شهر واحد بعد العلاج (20- شهرًا) ، كان وقت استجابة كل من الصور الوهمية والمجموعات المعالجة بالبلازما أقل بكثير (p <0.0001) من="" وقت="" استجابة="" الصغار="" (5-="" شهرًا="" )="" المجموعة="" (الشكل="" 5="" ب).="" ومع="" ذلك="" ،="" أظهرت="" المجموعة="" المعالجة="" بالبلازما="" تحسنًا="" تدريجيًا="" في="" التعلم="" الحركي="" والذاكرة="" ،="" في="" حين="" انخفض="" أعضاء="" هيئة="" التدريس="" نفسها="" في="" المجموعة="" الصورية.="" التغييرات="" في="" مستويات="" aa="" سببت="" تغييرات="" سلوكية="" ،="" والتي="" يمكن="" أن="" تكون="" بمثابة="" مؤشر="" مبكر="">مكافحة الشيخوخةتأثير العلاج (الشكل 5 ج).

أظهرت تحليلات أنسجة المخ (الأشكال 5 د ، 5 هـ) أن الفئران المسنة (المجموعة الشام) لديها مساحة أصغر من الخلايا الإيجابية لـ DCX في المنطقة تحت البطينية مقارنة بالفئران الصغيرة. بالمقابل ، زادت مساحة الخلايا الموجبة لـ DCX في الحيوان المعالج بالبلازما وظلت دون تغيير (ص=0. 04) مما يشير إلى أن حقن بلازما دم الحبل السري تحفز تكوين الخلايا العصبية للدماغ القديم. تشير النتائج إلى الفائدة المحتملة من العلاج بالبلازما في تكوين الخلايا العصبية المستمرة مما أدى إلى تحسين الوظيفة الحركية في المجموعة المعالجة.

مناقشة

يؤدي التقدم في علاجات التجديد بالتزامن إلى زيادة الحاجة إلى مقياس موضوعي وكمي لقراءة فعالية العلاج. لذلك صممنا دراستنا لتحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية التي يمكن أن تشرح بشكل أفضل السمات المظهرية للشيخوخة ومكافحة الشيخوخةعلاج او معاملة. أدت تجاربنا على الحيوانات إلى الملاحظات التالية: 1) تختلف الملامح الأيضية لمجموعات الفئران الصغيرة والكبيرة بشكل واضح ؛ و 2) يؤدي حقن بلازما الحبل البشري في الفئران المسنة إلى تغيير أنماط الأيض الخاصة بها بشكل أقرب إلى أنماط الأيض الخاصة بالفئران الصغيرة. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا حمض الأراكيدونيك (AA) باعتباره المرقم الحيوي البديل الأكثر فاعلية لـمكافحة الشيخوخةعلاج او معاملة؛ كان التمثيل الغذائي AA غير منظم إلى حد كبير في كل من الفئران الصغيرة والمعالجة بالبلازما ، ووجد أنه يلعب أدوارًا رئيسية في التفاعل مع مسارات التمثيل الغذائي الأخرى مثل استقلاب حمض اللينوليك [10 ، 18].

قمنا بتطوير نظام استشعار سريع ومحمول (cMES) لتسهيل اكتشاف AA في البحث الروتيني والإعدادات السريرية. لقد قمنا على وجه التحديد بدمج مخطط الفحص التنافسي مع الإثراء المناعي المغناطيسي في محاولة لاكتشاف الأهداف الجزيئية الصغيرة (أي المستقلبات) مباشرة من عينات البلازما. يجلب هذا المزيج المزايا التالية. (ط) يستفيد الاختبار من حركيات الربط السريع ، حيث تلتقط الحبيبات المغناطيسية AA في حجم العينة بالكامل (3- انتشار الأبعاد). (2) يتم تبسيط عمليات الفحص (على سبيل المثال ، خطوات الغسيل) باستخدام مغناطيس خارجي يستخدم لجمع الخرزة. (3) من خلال التركيز المغناطيسي للخرز المرتبط بـ AA بالقرب من قطب الكشف ، يمكن تحسين الإشارة التحليلية الإجمالية (~ 72 بالمائة) [12]. في الواقع ، أظهرنا أن اختبار cMES يستخدم<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

الشكل 5. المقايسات السلوكية والجزيئية. (أ) 2- أجريت اختبارات Rotarod التجريبية في 1 و 4 أشهر بعد حقن البلازما. (ب) المجموعة المعالجة بالبلازما

أظهر تحسنًا تدريجيًا في التنسيق الحركي ؛ كان الأداء قريبًا من أداء المجموعة الشابة في النهاية (التجربة الثانية في 3 أشهر). انخفض وقت تشغيل المجموعة الصورية مع تقدم العمر. * ف <0. 0="" 5="" ؛="" **="" ف=""><0. 0="" 1.="" (ج)="" بالنسبة="" للمجموعة="" المعالجة="" بالبلازما="" ،="" كانت="" الزيادة="" في="" مستويات="" aa="" سبقت="" تحسن="" الوظيفة="" الحركية.="" *="" ف=""><0. 05="" ؛="" **="" ف=""><0.01 ؛="" ***="" ف=""><0.001. (د)="" كانت="" خلايا="" الدماغ="" في="" المنطقة="" تحت="" البطينية="" مناعية="" من="" أجل="" علامة="" تكوين="" الخلايا="" العصبية="" ،="" دبل="" كورتين="">

شريط المقياس هو 5 0 ميكرومتر. لاحظ أن المجموعة الصورية كانت تحتوي على مساحة أصغر بكثير من الخلايا الإيجابية لـ DCX في منطقة البطين الفرعي مقارنة بالفئران الصغيرة ، بينما زادت المنطقة في الحيوان المعالج بالبلازما وظلت دون تغيير. (هـ) تم قياس مساحة الخلايا الإيجابية لـ DCX في الصورة (D). * ف <0. 05="" ؛="" ***="" ف=""><>

لقد ثبت أن AA يعزز نمو العضلات وتطور الدماغ [19 ، 20]. سلطت تقارير أخرى الضوء أيضًا على الفوائد المحتملة لـ AA فيمكافحة الشيخوخة[21 ، 22]. تتماشى الدراسة الحالية مع هذه النتائج ، لكن نطاقها اقتصر على إنشاء علاقة ارتباطية بين مستويات AA ومكافحة الشيخوخةالأنماط الظاهرية. ومع ذلك ، أشارت مراقبة AA التسلسلية إلى أن الزيادات في AA في الفئران المعالجة بالبلازما كانت على الأرجح من مصادر داخلية ، وليس من البلازما المنقولة. علاوة على ذلك ، مستداممكافحة الشيخوخةلوحظت التأثيرات في الفئران المتلقية حتى بعد 4 أشهر من نهاية العلاج بالبلازما. تحسين وظائف التعلم الحركي والذاكرة ؛ وزاد عدد الخلايا العصبية في الدماغ. تشير هذه الملاحظات بقوة إلى تغييرات فسيولوجية في الفئران المعالجة بالبلازما. الآلية الدقيقة لم يتم توضيحها بعد.

يجب معالجة العديد من القيود الأخرى لهذه الدراسة في البحث المستقبلي. أولاً ، يحتاج اختبار cMES إلى الصقل للحصول على دقة أعلى. على وجه الخصوص ، مع عدم وجود عينات سلبية حقيقية (أي عينات دم بدون أي AA داخلي) ، كان من الصعب حساب الإشارات من الارتباط غير المحدد. من المحتمل أن يكون تأثير مصفوفات الدم ضئيلًا حيث قمنا بتخفيف العينات 100- أضعاف. ومع ذلك ، يجب التحقق من صحة مثل هذا الافتراض باستخدام عينات بلازما محذوفة من AA والتي يمكن تحضيرها من نموذج فأر يعاني من نقص AA [23] أو من خلال الاستنفاد المناعي لـ AA. ثانيًا ، ركزنا على اكتشاف مستقلب واحد في استقلاب AA من أجل البساطة ، ولكن هذا النهج قد يتجاهل السياق البيولوجي مثل التفاعلات بين المستقلبات في مسار معين. سيؤدي تضمين لوحة من المستقلبات إلى التقاط الاضطرابات الأيضية بشكل أفضل وكذلك زيادة دقة التشخيص. يمكن تحجيم cMES بسهولة لاكتشاف الواسمات المتنوعة أثناء استهلاك كميات عينة صغيرة. ثالثًا ، سيكون إقحام النتائج الحالية للبشر أمرًا صعبًا. على الرغم من أن الفئران والبشر يتشاركون في مسارات أيضية متشابهة ، فإن معدل الأيض لدى الفئران 7- أعلى من معدل الأيض عند البشر [24]. التجارب البشرية ضرورية لتحديد جرعات البلازما المثلى للتسريب ولإعداد خطوط الأساس للواصمات الحيوية ؛ من خلال الدراسات التي أجريت على الحيوانات ، فإننا نخطط لمثل هذه الدراسات البشرية. هذه الجهود سوف تسرع من تطويرمكافحة الشيخوخةالعلاجات وتحسين نوعية الحياة الفردية وكذلك تقليل الأعباء المجتمعية.

طُرق

تصميم تجريبي

تم فصل البلازما من دم الحبل السري البشري الذي تم جمعه عند الولادة. تم إعطاء بلازما دم الحبل السري عن طريق التسريب الوريدي لفئران كبيرة (18- شهر) والتحكم الصوري (18- شهر) وفئران صغيرة (3- شهرًا كانت إيجابية control) بمحلول ملحي. في 1 و 4 أشهر بعد الزرع ، تم إجراء 2- اختبارات روتارود التجريبية لتقييم التنسيق الحركي والذاكرة طويلة المدى (الشكل S1). تم إجراء التنميط المستقلب غير المستهدف على الدم من المجموعات الثلاث ، وحدد التحليل المعلوماتي الحيويمكافحة الشيخوخةالمسار المناسب (استقلاب حمض الأراكيدونيك). تم تطوير جهاز الاستشعار الحيوي للكشف عن حمض الأراكيدونيك في الدم بسهولة وكفاءة.

تحضير عينة دم الحبل السري

تم جمع دم الحبل السري البشري بموجب مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى CHA العام (سيول ، كوريا ، رقم IRB CHAMC -2015- 08-130-009). تم التبرع بدم الحبل السري البشري من 4 متبرعين وعولج باستخدام السترات والفوسفات وسكر العنب بمضاد تخثر الأدينين (CPDA -1). تم عزل بلازما دم الحبل السري البشري بالطرد المركزي عند 2 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. تم تخزين عينات البلازما المعزولة عند درجة -80 واستخدمت مع دورة واحدة للتجميد والذوبان في درجة حرارة الغرفة.

التجارب على الحيوانات

تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة CHA (IACUC). استخدمنا 18- أنثى من الفئران C57BL / 6 عمرها شهر لتقييم الاضطرابات الأيضية والأنماط الظاهرية السلوكية التي ترتبط بالشيخوخة ومكافحة الشيخوخة. كانت عناصر التحكم الإيجابية هي 3- أنثى بعمر شهر C57BL / 6 فأرة. تم تربية جميع الفئران في درجة حرارة الغرفة في دورة قياسية مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة. بالنسبة للفئران البالغة ، تم حقن بلازما دم الحبل السري أو محلول ملحي (130 ميكرولتر) عن طريق الوريد 12 مرة لمدة 4 أسابيع. لم يتم تجميع بلازما دم الحبل السري البشري المعزولة ، وتلقى حيوان معين بلازما دم الحبل السري من نفس المتبرع. تم وصف عدد الحيوانات المستخدمة في كل تجربة في أقسام الطريقة المقابلة. تم جمع البلازما عن طريق الطرد المركزي (3 ، 000 جم ، 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة).

الحصول على المستقلبات وتحليل البيانات

لتحديد سمات المستقلبات المنقولة بالدم ، تم جمع الدم من الفئران عن طريق ثقب في القلب في النقاط الزمنية المحددة: المجموعة الشابة (3- الشهر ، n=10) ، المجموعة الصورية ({{ 4}} شهر ، ن=10 ؛ 23- شهر ، ن=12) ، المجموعة المعالجة بالبلازما (20- شهر ، ن {{13 }} ؛ 23- شهر ، ن=5). تم تحليل عينات الدم باستخدام نظام الكروماتوجرافيا السائلة - مقياس الطيف الكتلي (LC-MS) (Agilent). قمنا بتحويل ملفات LC / MS إلى تنسيق mzXML قياسي (ProteoWizard) [25] ثم قمنا بمعالجتها باستخدام MAIT (مجموعة أدوات تعريف المستقلب الأوتوماتيكي) [26] لاكتشاف الميزات والتحليل الإحصائي وتحديد المستقلب. تم تحديد السمات ذات الدلالة الإحصائية (أي المستقلبات المؤينة و / أو المجزأة) من خلال تحليل التباين (ANOVA). تمت مطابقة هذه الميزات مع جميع المستقلبات المفترضة الممكنة في قاعدة بيانات الأيض [9] بناءً على نسبة الكتلة / الشحن للأيون الطيفي الكتلي (تحمل m / z لـ 0. 0 05). وصفنا تعديلات المستقلب العالمية من خلال تحليل المجموعات الهرمية والهياكل المتأصلة لبيانات الأيض عبر تحليل المكون الرئيسي (PCA). تم تضمين اثنين أو ثلاثة مكررات تقنية (ضمان أن الاختلاف التقني أصغر بكثير من التباين البيولوجي) لكل ماوس في التعلم غير الخاضع للإشراف مثل PCA والتكتل الهرمي. تم إجراء التجميع الهرمي للمكونات الرئيسية (HCPC) بواسطة FactoMineR ، حزمة R [27]. لتحليل وظيفي ، تم تحديد المسارات الأيضية الأكثر احتمالية للاضطراب بسبب الشيخوخة وعلاج البلازما من خلال تحليل مسار KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. تم استخدام التوزيع الهندسي المفرط لقياس التمثيل الزائد للمستقلبات المتطابقة في مسارات KEGG محددة.

تحضير الخرز المناعي

تم تعليق الخرزات المغناطيسية (5 مجم) المطلية بمجموعات الإيبوكسي (Dynabeads M -270 Epoxy ، Invitrogen) في 1 0 0 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 مولار. تمت إضافة مائة ميكروغرام من الأجسام المضادة ضد حمض الأراكيدونيك (Biomatik) وخلطها جيدًا. تمت إضافة مائة ميكرولتر من محلول كبريتات أمونيوم 3 مولار ، وتم تحضين الخليط عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ثم تم تحضينه مرة أخرى عند 4 درجات طوال الليل مع دوران إمالة بطيء. تم إجراء تفاعل الاقتران عند درجة الحموضة=7 .4. تحث هذه العمليات على تكوين رابطة تساهمية بين مجموعات الإيبوكسي (حبة) والأمين (الجسم المضاد) ، والتي أكدناها سابقًا من خلال تعريض اقترانات حبة الجسم المضاد لتحديات الأس الهيدروجيني [29]. في المتوسط ​​، تم تجميد 2.4 × 104 من الأجسام المضادة لكل حبة. تم فصل الخرزات المغناطيسية المقترنة بالأجسام المضادة بمغناطيس دائم ، وغسلها مرتين بمحلول PBS ، وأعيد تعليقها في 200 ميكرولتر من PBS مع 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم. تم تخزين الخرز في 4 درجات حتى شهر واحد.

اقتران HRP لحمض الأراكيدونيك

ثم تم اقتران HRP إلى BSA عبر كيمياء الاختزال. على وجه التحديد ، تم إذابة 1 0 0 ميكروغرام من AA المترافق مع BSA (RPU51089 ، Biomatik) في 0.5 مل من محلول كربونات-بيوكربونات 0.2 مولار (درجة الحموضة 9.4) ، يضاف إلى ملليغرام واحد من رابط EZ المجفف بالتجميد بالإضافة إلى البيروكسيداز المنشط (Thermo Scientific) ، والمحتضنة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من سيانوبوروهيدريد الصوديوم (Thermo Scientific) وتم تحضين الخليط لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من محلول التبريد (Thermo Scientific) ، متبوعًا بحضانة لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. أكد التحليل الكهربائي للهلام وتحليل شريط البروتين اقتران HPR بـ BSA-AA (الشكل S3a). تم جمع AA المترافق مع HRP وتركيزه باستخدام مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra 100K (Millipore). تم غسل البيروكسيديز المتبقي و BSA-AA باستخدام برنامج تلفزيوني لأربع مرات.

الكشف الكهروكيميائي عن AA في عينات البلازما

للكشف الكهروكيميائي عن AA ، تم جمع الدم من الشباب (n {0}}) ، والشام (n=8) ، والمجموعات المعالجة بالبلازما (n=5 لمدة شهر واحد و=5 لمدة 3 أشهر). تم تخفيف عينات بلازما الفأر (0. 5 ميكرولتر) في 50 ميكرولتر من 1 في المائة من مساحة سطح الجسم في PBS (× 100- تخفيف أضعاف) وخلطها بمحلول حبة مغناطيسي مناعي (50 ميكرولتر) ومحلول AA مترافق مع HRP (50 ميكرولتر). كانت كمية AA-HRP كبيرة بما يكفي لتشبع مواقع الربط في خرز مغناطيسي. استخدمنا حوالي 8.4 × 107 خرزة لكل اختبار ، مما أتاح مواقع ربط 2.0 × 1012 AA. كانت كمية AA-HRP ~ 1.7 × 1013 ؛ كانت النسبة بين AA-HRP ومواقع الربط ~ 8: 1. تم تحضين الخليط عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع دوران إمالة بطيء. تم تحضير حبة التحكم بخلط 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم في PBS (50 ميكرولتر) مع محلول حبة مغناطيسي مناعي (50 ميكرولتر) ومحلول AA مترافق مع HRP (50 ميكرولتر). تم فصل جميع الخرزات المتفاعلة بمغناطيس دائم وغسلها مرتين باستخدام 80 ميكرولتر من PBS (1 بالمائة من مساحة سطح الجسم). أخيرًا ، تم تعليق الخرزات في 7 ميكرولتر من PBS. تم تحميل محلول الخرزة المحضر و 20 ميكرولتر من محلول TMB (Biomatik) فوق القطب. بعد 6 دقائق ، بدأ القياس الزمني. استخدمنا مستشعرًا كهروكيميائيًا مصغرًا (نظام نموذج أولي طورته شركة AcurreHealth Inc.). تم حساب متوسط ​​المستويات الحالية في النطاق 40-45. استخدمنا عامل التحويل (× 100) للإبلاغ عن تركيزات AA الأصلية المقدرة في البلازما.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم إجراء تجارب ELISA باستخدام مجموعة ELISA لحمض الأراكيدونيك (AA) (Biomatik) وفقًا لإرشادات التصنيع. تمت إضافة AA المخفف تسلسليًا في كل بئر ، وحضنت باستخدام AA مترافق مع HRP عند 37 درجة لمدة 40 دقيقة. بعد الغسيل باستخدام محلول الغسيل لمدة أربع مرات ، تمت إضافة محلول TMB واحتضانه لمدة 20 دقيقة. تم إيقاف تطوير اللون عن طريق إضافة محلول التوقف. تمت قراءة الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Tecan).

اختبار روتارود

قمنا بتعديل اختبار Rotarod لـ Kong et al. [30] لتقييم التنسيق الحركي. بدأ الروتارود بقضيب قطره 3- سم عند 4 دورة في الدقيقة ويتسارع بمقدار 4 دورة في الدقيقة كل 30 ثانية لمدة 5 دقائق. تم وضع الفئران على العصا ، وتم قياس الوقت الذي يستغرقه سقوط الفئران عن القضيب. تم إعطاء كل فأر 3 تجارب في اليوم ، وتم حساب أوقات الجري لكل يوم على أنها متوسط ​​أوقات التدريب. تم إجراء أول اختبار روتارود في شهر {7}} بعد العلاج بالبلازما: المجموعة الشابة (ن=29) ​​، المجموعة الصورية (ن=17) ، المجموعة المعالجة بالبلازما (ن {{ 11}}). بدأت جلسة إعادة التدريب في غضون 4- شهرًا بعد العلاج بالبلازما. لتجنب الإفراط في التدريب ، تم إجراء إعادة التدريب لمدة يومين. الإجراء الآخر هو نفس الجلسة الأولى.

تصوير أنسجة المخ

في شهر واحد (ن=4) و 4 أشهر (ن=3) بعد حقن بلازما دم الحبل السري البشري أو حقن محلول ملحي ، تم التخلص من الحيوانات بطريقة القتل الرحيم ثم ترويها بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد (PFA) و PBS من خلال البطين الايسر. تم استخدام الشباب (ن=5) والمجموعات الصورية (ن=4) كعناصر تحكم. كانت أدمغتهم

المستخرجة والمحمية بالتبريد. تم تقسيم كل دماغ على خلية تجميد بسمك 30 ميكرومتر. إلى

إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، تم حظر الارتباط غير النوعي باستخدام مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5 بالمائة في 0. 3 بالمائة Triton X -100 لمدة 40 دقيقة. تم تطبيق الجسم المضاد الأولي ضد Doublecortin (DCX ؛ 1: 400 ، Cell Signaling ، # 4604S) طوال الليل عند 4 درجات ، ثم تم استخدام PBS للغسيل [31]. تم استخدام الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 488 (1: 2000 ، Invitrogen ، # A11008) للكشف عن DCX. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مضان (Nikon Eclipse 80i) وتم تحليلها باستخدام Image J [32].

تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام وظائف R الأساسية و lme4 ، حزمة R لأي من الدوال الخطية

نماذج التأثيرات المختلطة أو النموذج الخطي المعمم

(GLM) متبوعًا باختبار LSD اللاحق [33]. يتم تقديم البيانات على أنها الوسيلة ± الخطأ المعياري وقيمة ap لـ <0. تم="" ​​اعتبار="" 05="">

المواد التكميلية

ارقام تكميلية.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

شكر وتقدير

نشكر شركة AccureHealth لتوفير المستشعر الكهروكيميائي المصغر. تم دعم هذه الدراسة جزئيًا من خلال منحة معهد ترويج تكنولوجيا المعلومات والاتصالات (IITP) بتمويل من حكومة كوريا (MSIT) (2017M3A9B4025699).

تضارب المصالح

أعلن المؤلفون أنه لا توجد مصلحة متنافسة.