جهة الاتصال: jerry.he@wecistanche.com

لين باي|غوي ينغ شي|يا جون يانغ|وي تشن|ليان ‐ فنغ تشانغ|تشوان تشين

Cistanche له تأثير مضاد للشيخوخة

الملخص

خلفية: الانخفاض المرتبط بالوقت في القدرة على التجدد وتوازن الأعضاء هو سمة رئيسية من سماتشيخوخة. تم استخدام Rehmannia glutinosa و Astragalus Membranaceus كأدوية عشبية صينية تقليدية لتعزيز المناعة وإطالة العمر. ومع ذلك ، فإن الآلية التي يؤدي بها هذا الدواء العشبي إلى إبطاء الشيخوخة غير معروفة. في هذه الدراسة ، بحثنا في آلية عمل الأعشابتأثير مضاد للشيخوخة.

الطريقة: تم تغذية الفئران بأغذية مكملة بـ R. glutinosa أو A. Membranaceus لمدة 10 أشهر. تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي. تم تقييم الأنماط الظاهرية باستخدام نظام درجات الدرجات وتحليل البقاء على قيد الحياة. تم تحديد النسب المئوية للأنماط الظاهرية للشيخوخة للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) عن طريق تحليل فرز الخلايا المنشطة الفلورية. تم تحليل وظيفة وآلية HSCs عن طريق المقايسة المستنسخة وتفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي.

النتائج:تأثير مضاد للشيخوخةمن R. glutinosa يرجع إلى الوظيفة المحسنة لـ HSCs. أظهرت الفئران التي تتغذى على R. glutinosa خصائص تباطؤشيخوخةالعملية ، بما في ذلك انخفاض الشيخوخة وزيادة معدل البقاء على قيد الحياة. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي عددًا أقل من خلايا Lin-Sca1 plus c-kit- (LSK) ، و HSCs طويلة المدى (LT‐ HSCs) و HSCs قصيرة المدى (ST‐ HSCs) في مجموعة R. glutinosa. في المختبر ، أظهرت الاختبارات المستنسخة زيادة قدرة التجديد الذاتي لـ LT‐ HSCs من مجموعة R. glutinosa بالإضافة إلى الحفاظ على هدوء LSK من خلال التعبير p18 المنظم. أظهرت مجموعة R. glutinosa أيضًا انخفاضًا في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلي ونسبة الخلايا ‐gal plus من خلال تقليل تنظيم البروتين المرتبط بالشيخوخة الخلوية p53 و p16.

الخلاصة: Rehmannia glutinosa تمارسمكافحة الشيخوخةالآثار من خلال الحفاظ على الهدوء وتقليل شيخوخة الخلايا الجذعية السرطانية.

الكلمات الرئيسية: مكافحة الشيخوخة ، الخلايا الجذعية المكونة للدم ، الهدوء ، Rehmannia glutinosa

1|المقدمة

يتم تعريف الشيخوخة على أنها التدهور الوظيفي المعتمد على الوقت والذي يؤثر على معظم الكائنات الحية .1 يتم الحفاظ على طول عمر الكائنات الحية بشكل أساسي بواسطة الخلايا الجذعية. 2 الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة لديها القدرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى مجموعة متنوعة من الخلايا المستجيبة. 3 ومع ذلك ، أثناء عملية الشيخوخة ، فإن هذه القدرة على التجديد الذاتي تنخفض ، مما يؤدي في النهاية إلى تراكم الأنسجة التالفة غير المعالجة في الكائنات الحية المسنة. قد تؤدي المقصورة إلى الموت أو الأمراض المرتبطة بالعمر .2 علاوة على ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أن تجديد الخلايا الجذعية قد يعكس النمط الظاهري للشيخوخة .5،6 في نظام المكونة للدم ، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي المسؤولة عن إنتاج خلايا الدم في الفئران المسنة ، يُظهر نظام المكونة للدم ضعف الخلايا اللمفاوية T‐ و B and ويزداد عدد الخلايا النخاعية. أظهرت HSCs المسنين نشاطًا منخفضًا للتجديد الذاتي وانخفاض القدرة على تكوين الدم. والجدير بالذكر أن التغييرات المرتبطة بالعمر في حجرة HSC تتجلى في المضيف المسن مثل فقر الدم ، وزيادة الميل للأورام التكاثرية النقوية ، وانخفاض وظيفة المناعة وزيادة الإصابة بالسرطان. 7-9 ومع ذلك ، فإن آلية شيخوخة HSC و آثار الأدوية العشبية على شيخوخة HSC غير معروفة

لقد اهتم الناس بتأخير عملية الشيخوخة والبقاء شابة من العصور القديمة ومكافحة الشيخوخةهو التركيز الحالي للبحث. لقد حظي الطب الصيني التقليدي باهتمام متزايد لعلاج مختلف الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. من المعروف أن العديد من الأعشاب المستخدمة في الطب الصيني التقليدي لها تأثيرات إيجابية ضد الشيخوخة من خلال آليات مختلفة. تم استخدام Rehmannia glutinosa و Astragalus Membranaceus على نطاق واسع بهذه الطريقة لآلاف السنين.

يستخدم Rehmannia glutinosa لعلاج اضطرابات السكري المختلفة ، وتعزيز التمثيل الغذائي للعظام في هشاشة العظام ، وتثبيط التهاب الكبد والتليف. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه العشبة لها تأثيرات أخرى بما في ذلكمكافحة التعب، الخصائص المضادة للاكتئاب والحماية العصبية. في السنوات القليلة الماضية ، ركزت الدراسات الدوائية على R. glutinosa ومكوناته النشطة بشكل أساسي على تأثيره الواسع على الدم والغدد الصماء والقلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي. 11-14 وهكذا ، تبين أن R. glutinosa يمتلك مناعة قوية تعزيز النشاط ، الذي وفر الأساس النظري لمزيد من الدراسات.

يمتلك أستراغالوس غشاء خصائص منشط ، وقائي للكبد ، ومدر للبول وطارد للبلغم 15 وقد ثبت أنه يُظهر مناعة ، 16مضاد التهاب،ومضادات الأكسدةإن توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تأثيرات الأدوية الصينية التقليدية في الممارسة السريرية هو خطوة أساسية نحو تطبيقها في جميع أنحاء العالم ، وهذا الموضوع حاليًا موضوع اهتمام بحثي مكثف.

وهكذا ، في هذه الدراسة ، قمنا بإطعام الفئران على حمية غذائية مكملة بـ R. glutinosa و A. Membranaceus لمدة 10 أشهر لاستكشاف الآلية الكامنة وراء قدرة R.

2|المواد والأساليب

2.1|تجميع الحيوانات وعلاجها

تم الحفاظ على إناث الفئران C57BL / 6J في بيئة خالية من مسببات الأمراض وتم إطعامها بنظام غذائي قياسي. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجان رعاية الحيوان والاستخدام التابعة لمعهد علوم الحيوان في كلية الطب في اتحاد بكين. تم تقسيم الفئران (بعمر 10 أشهر) بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات (ن=20 / مجموعة). تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي (Beijing HFK Biosicence ، بكين ، الصين). تم تكميل وجبات المجموعتين الأخريين بجرعة 200 مجم / يوم لمدة 10 أشهر. تم اختيار هذه الجرعة باستخدام طريقة تطبيع مساحة سطح الجسم لتأكيد جرعات الدواء من الدراسات البشرية إلى دراسات الفئران. تم تحديد وزن الجسم كل شهرين وتم تسجيل البقاء على قيد الحياة يوميًا.

2.2|تقييم درجة الشيخوخة

تم اعتماد نظام درجات لتقييم درجة الشيخوخة وفقًا للمعايير التي حددها Takeda وآخرون. تم اختيار كل فئة مدرجة في البروتوكول من العلامات السريرية المرتبطة بعملية الشيخوخة. تم تسجيل كل فأر في عمر 18 شهرًا وتم جمع النتيجة في كل فئة لتحديد درجة التقدير الإجمالية.

2.3|التدفق الخلوي

تم حصاد الخلايا من الغدة الصعترية والطحال والدم المحيطي (PB) ونخاع العظام (BM). تم استئصال الطحال والغدة الصعترية على الفور ، وغسلها بمحلول ملحي ووزنها. تم تجانس الطحال والغدة الصعترية بلطف في الخالط الزجاجي وتم تعليق الخلايا في محلول ملحي معقم من الفوسفات (PBS). تم تطبيق الخلايا من PB على تحلل خلايا الدم الحمراء (BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عزل الخلايا من BM عن طريق غسل كل من عظم الساق وعظام الفخذ باستخدام PBS معقم. تم عزل جميع الخلايا عن طريق الترشيح عبر شبكة نايلون معقمة وملطخة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مع الأجسام المضادة المترافقة التالية: phycoerythrin (PE) - مضاد مترافق ‐ CD3 (G4.18) ، allophycocyanin (APC) مضاد مترافق - CD4 (OX35) و PE Cy7 المضاد المترافق ‐ CD8a (OX8). بالنسبة لخلايا BM ، كانت علامات النسب ملطخة باستخدام البيوتين ‐ المقترن المضاد للماوس CD4 (RM4‐5) ، CD5 (53‐7.3) CD8a (53‐6.7) ، CD11b (M1 / 70) ، B220 (RA3‐6B2) ، تم الحصول أيضًا على TER119 (TER‐ 119) و Gr1 (RB6‐8C5) ، متبوعًا بالتلطيخ باستخدام الجسم المضاد APC ‐ eFluor 780- ستربتافيدين المترافق من eBioscience (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام الأجسام المضادة اللاحقة لتلطيخ السطح: الغلوبولين المناعي APC (Ig) M (II / 41) ، فلوريسئين أيزوثيوسيانات (FITC) IgD (11 - 26) ، PE Cy7 Sca‐ 1 (D7) ، PE Flt3 ( A2F10) و FITC B220 (RA3‐6B2) و FITC CD34 (RAM34) و PerCP ‐ Cy5.5 CD127 (A7R34) و PE CD16 / CD32 (93) و PerCP ‐ Cy5.5 CD3e (145‐2C11). تم الحصول على جميع الأجسام المضادة من eBiosciences (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على البيانات عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية

Aria II (Becton Dickinson ، Franklin Lakes ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo (Three Star ، Ashland ، OR ، USA).

2.4|تحليل دورة الخلية

لتحليل دورة الخلية ، تم تلوين خلايا BM الكلية للعلامات السطحية للخلايا الجذعية (Lin – Sca‐ 1 plus c‐ KitHigh؛ LSTKs) ، ثم تم تثبيتها ومنفصلة (00 - 5123‐43 ؛ بيكتون ديكنسون ) قبل تلطيخها باستخدام FITC Ki‐

67 جسمًا مضادًا و 7 أمينوأكتينوميسين D (7 ‐ AAD). تم إجراء الحصول على البيانات على FACS Aria II (Becton Dickinson). تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo.

2.5|شيخوخة ‐ المرتبطة بتلطيخ ‐gal

تم أيضًا تقييم نشاط Senescence ‐ المرتبط (SA) - gal عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام C12FDG كما هو موصوف من قبل الشركة المصنعة (مجسات جزيئية ، يوجين ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم تلوين الخلايا الجذعية أولاً لعلامات سطح الخلية ثم تم تحضينها بـ 100 نانومول لتر 1 بافيلوميسين A1 لمدة ساعة عند 37 درجة للحث على قلونة الليزوزومات. بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تحضين الخلايا بـ 2 مليمول لتر C12FDG لمدة 12 ساعة عند 37 درجة ثم تحليلها باستخدام FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|تحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)

تم تحضين الخلايا باستخدام ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسين (DCFH‐ DA ؛ بيوتايم ، شنغهاي ، الصين) عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة. ينتشر DCFH‐ DA بشكل سلبي في الخلايا ، حيث يتم نزع الأسيتيل بواسطة إسترات لتكوين ثنائي كلورو فلورسين غير الفلوري 2 ′ ، 7 ‐ ثنائي كلورو فلورسين (DCFH). يرتبط مقدار التألق المنبعث بكمية ROS في الخلية. تم الحصول على البيانات على FACS Aria I (Becton Dick- inson) وتحليلها باستخدام برنامج FlowJo.

2.7|تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تضخيم الجينات ذات الأهمية من الحمض النووي الريبي الكلي المعالج بـ DNase I باستخدام M‐ MLV Reverse Transcriptase (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية)

والبادئات poly ‐ dT. كانت البادئات المستخدمة في PCR كما يلي: p21 (5′ TCCAGACATTCAGAGCCACA ‐ 3 ′ و 5′ ‐ CGAAGAGACAACGG- CACACT ‐ 3 ، Tm=60 درجة ، 30 دورة) ، p53 (5′ ‐ CATGAACCGCCGACC- TATC‐ 3 ′ و 5′ ‐ TCCCGGAACATCTCGAGGC ‐ 3 ، Tm=62 درجة ، 35 دورة) ، p16 (5′ ‐ CGAACTCTTTCGGTCGTACCC ‐ 3 ′ و 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC ‐ 3 درجة ، Tm {21} دورات) ، p57 (5 AGGAGCAGGACGAGAATCAA ‐ 3 و 5 TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT ‐ 3 ′ ، Tm=61 درجة ، 30 دورة) ، p19 (5′ ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3 GTCC و 3GTCG ′ ، Tm=61 درجة ، 35 دورة) ، p18 (5′ ‐ GGGACCTAGAGCAACTTACT ‐ 3 ′ و 5′ ‐ TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA ‐ 3 ′ ، Tm=61 درجة ، 30 دورة) ، جليسيرالديهيد 3 فوسفات ديهيدروجينيز (5′ ‐ GAGCGACCCCACTAACAT ‐ 3 و 5′ ‐ TTCACACCCATCACAAACAT ‐ 3 ′ ، Tm=60 درجة ، 25 دورة). في الوقت الحقيقي (RT) - تم تنفيذ PCR باستخدام SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo ، كيوتو ، اليابان) على نظام الكشف ABI StepOne ™ (Applied Biosystems ، Foster City ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.8|فحوصات كلونوجينيك

طويل المدى (LT) - تم فرز HSCs عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) ثم تم تربيتها في ألواح خلايا 96 ‐ بئر باستخدام وسط قاعدة methylcel- lulose (HSC007 ؛ R&D Systems ، Minneapolis ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكية) . تم تحضير عشرة آبار مكررة لكل عينة. استخدمنا 96 ‐ لوحة زراعة خلية بئر ، ثلاث خلايا لكل بئر. بعد أسبوعين من الطلاء ، تم حساب عدد وأحجام المستعمرات تحت نطاق دقيق.

2.9|تحليل احصائي

تم تحليل البيانات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام برنامج Microsoft Excel (Microsoft ، Redmond ، WA ، الولايات المتحدة الأمريكية) و GraphPad Prism (برنامج GraphPad ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± SD. تم اعتبار P <0. 05="" للدلالة="" على="" دلالة="">

3|النتائج

3.1|R. glutinosa و A. Membranaceus لهما تأثيرات مضادة للشيخوخة

لتأكيدآثار مكافحة الشيخوخةمن R. glutinosa و A. mem- branaceus ، قمنا بدراسة آثار الإعطاء كمكمل غذائي (200 مجم / يوم). بعد ذلك ، سجلنا وزن الجسم ودرجة الشيخوخة ومعدل بقاء الفئران. كان وزن الجسم من الفئران التي تتغذى على R. glutinosa أو A. غشاء طبيعي مقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة الضابطة ، على الرغم من وجود انخفاض في وزن الجسم لمجموعة R. glutinosa ومجموعة A. الغشاء في 20 شهرا (الشكل 1A). أظهر تحليل درجة الشيخوخة زيادة مطردة وغير قابلة للانعكاس في درجات التصنيف مع تقدم العمر في مجموعة R. glutinosa و A. المجموعة (الشكل 1 ب). ترجع درجة التصنيف المرتفعة إلى البداية المبكرة لفقدان السلبية والتفاعلية ، وفقدان لمعان الجلد وزيادة الخشونة ، وتساقط الشعر ، والآفات حول العين ، وزيادة الإصابة بالتهاب اللوردي في العمود الفقري وزيادة ملحوظة في شدتها .18 الفئران في A أظهرت مجموعة الفئران الغشائية صفات النمط الظاهري للشيخوخة أكثر وضوحًا ، بما في ذلك فقدان لمعان الجلد وتساقط الشعر. أظهرت منحنيات البقاء أن عمر الفئران في مجموعتي R. glutinosa و A. وأكدت هذه البياناتآثار مكافحة الشيخوخةفي كل من R. glutinosa و A. Membranaceus ، على الرغم من أن R. glutinosa وجد أنه أكثر كفاءة في إبطاء عملية الشيخوخة.

الشكل 1 كان لدى Rehmannia glutinosa و Astragalus Membranaceusآثار مكافحة الشيخوخة. تم تغذية الفئران بنظام غذائي مكمل بـ R. glutinosa المطحون أو A. تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي. أ ، التغيرات في وزن جسم الفئران تقاس كل شهرين. ب ، التغييرات في درجات شيخوخة الفئران مع تقدم العمر. ج ، منحنيات البقاء على قيد الحياة. تمثل البيانات المتوسط ​​± SD ؛ n=20 الفئران / المجموعة. تمثل البيانات المتوسط ​​± SD ؛ n=5 الفئران / المجموعة. * P <0.05 ،="" ***="" p=""><>

3.2|يقلل R. glutinosa من عدد الخلايا الجذعية المكونة للدم

يُعتقد أن استنفاد الخلايا الجذعية هو نتيجة تكاملية لأنواع متعددة من التلف المرتبط بالشيخوخة وأحد الأسباب الرئيسية لشيخوخة الأنسجة والكائن الحي. تشير الدراسات الحديثة إلى أن تجديد الخلايا الجذعية قد يعكس النمط الظاهري للشيخوخة على مستوى الكائن الحي. افترض أنآثار مكافحة الشيخوخةمن R. glutinosa عن طريق تعزيز وظيفة الخلايا الجذعية. لذلك ، أجرينا تحليل التدفق الخلوي لعدد الخلايا الجذعية / السلف المعزولة عن الفئران (التي تبلغ من العمر 20 شهرًا) التي تم تغذيتها بنظام غذائي مكمل بـ R. glutinosa أو A. . تم تخفيض النسبة المئوية من LSKs في مجموعات R. glutinosa و A. الغشاء (الشكل 2B). تم تقليل عدد LT‐ والمدى القصير (ST) - HSCs بمقدار ضعفين تقريبًا في مجموعة R. glutinosa مقارنة بالرقم في المجموعة الضابطة (الشكل 2C‐ D). تم الكشف عن أعداد أكبر من السلالات اللمفاوية الشائعة (CLPs) في مجموعة R. glutinosa مقارنة مع العدد في المجموعة الضابطة (الشكل 2I). لم تكن هناك فروق في أعداد السلالات متعددة القدرات (MPPs) ، أسلاف النخاع الشائع (CMPs) ، أسلاف الخلايا المحببة - العاثية الكبيرة (GMPs) وسلائف خلايا النواء - الكريات الحمر (MEPs) في مجموعة R. مجموعة التحكم. لم يكن هناك فرق كبير في أعداد LT‐ و ST‐ HSCs في مجموعة A. Membranaceus مقارنة بالأرقام في المجموعة الضابطة (الشكل 2C‐ D). علاوة على ذلك ، لم يكن هناك اختلاف في عدد خلايا MPP و CMP و MEP و CLP مقارنة بالأرقام الموجودة في مجموعة التحكم (الشكل 2E و 2F و 2 H و 2I) ؛ ومع ذلك ، انخفض عدد GMPs في مجموعة A. Membranaceus. وهكذا ، فإن الفئران التي تغذت على وجبات مكملة بـ R. glutinosa أظهرت عددًا منخفضًا من الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية.

3.3|عزز R. glutinosa الوظيفة وحافظ على هدوء الخلايا الجذعية السرطانية

لتقييم وظيفة HSCs ، تم فحص إمكانات استنساخ LT‐ HSCs في المختبر. قمنا بفرز خلايا LT‐ HSCs في وسط قاعدة ميثيل السليلوز باستخدام FACS وحساب عدد وحجم المستعمرات بعد 14 يومًا. مقارنة بعدد وحجم المستعمرات التي تنتجها خلايا من الفئران في المجموعة الضابطة ، أظهرت الخلايا المأخوذة من الفئران في مجموعة R. glutinosa زيادة في عدد المستعمرات ، خاصة بالنسبة للحجم الصغير (P=0. 0241 ) واستنساخ كبير الحجم (P=0. 0418) ، بينما لم يكن هناك اختلاف في العدد من الفئران في مجموعة A. الغشاء (الشكل 3). اقترحت زيادة حجم المستعمرة وعددها في مجموعة R. glutinosa أن هذه العشبة تعزز إمكانات التجديد الذاتي لـ LT‐ HSCs.

تظل معظم الخلايا الجذعية السرطانية في الفئران البالغة هادئة ؛ 19 لذلك ، فإن الحفاظ على الهدوء الخلوي هو آلية أساسية للتجديد الذاتي للخلايا الجذعية. 2 0 ، 21 تشير الانخفاضات الملحوظة في HSCs إلى تناقص تكاثر الخلايا في R. glutinosa و مجموعات الغشاء. لذلك ، قمنا بفحص حالة دورة الخلية لـ HSCs من خلال تحليل علامة الخلية التكاثرية Ki ‐ 67 جنبًا إلى جنب مع تحديد محتوى الحمض النووي 7 ‐ AAD في مجتمع LSK. لاحظنا زيادة عدد خلايا LSK في المرحلة G0 في مجموعات R. glutinosa و A. الغشاء مقارنة مع تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 4 أ). أشارت هذه النتائج إلى أن R. gluti- nosa و A. غشاء حافظ على هدوء HSCs.

كشف تحليل PCR في الوقت الفعلي لمنظمات دورة الخلية في خلايا LSK أن p18 و p19 و p57 لعبوا أدوارًا مهمة في الحفاظ على هدوء HSC. 22-24 لم تكن هناك تغييرات واضحة لوحظت في p57 و p19 (الشكل 4C‐ D) ، و p18 في مجموعة R. glutinosa مقارنة مع المجموعة الضابطة ، وتم تنظيمها بشكل طفيف في مجموعة A. الغشاء (الشكل 4 ب).

الشكل 2 أثرت Rehmannia glutinosa و Astragalus Membranaceus على عدد الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم. الفئران (العمر

2 0 شهرًا) تم إطعامهم وجبات مكملة بـ R. glutinosa أو A. Membranaceus (2 0 0 مجم / يوم) لمدة 10 أشهر (عدد=5 / مجموعة) ؛ تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي. تم تلطيخ خلايا نخاع العظم المعزولة حديثًا بالأجسام المضادة المحددة وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. أ ، لمحات تلطيخ تمثيلية للخلايا الجذعية المكونة للدم BM وخلايا السلف. B ، النسبة المئوية لخلايا Lin – Sca1 زائد c kit- (LSKs) في خلايا BM. C‐ I ، أرقام خلايا (C) طويلة المدى (LT ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1 plus ، c‐ Kit ، CD34 plus - ، Flt3–) ؛ D ، قصير المدى (ST ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1 plus ، c‐ Kit ، CD34 plus plus ، Flt3–) ؛ E ، السلف متعدد القدرات (MPP ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1 plus ، c‐ Kit plus ، Flt3 plus) ؛ F ، السلف النخاعي الشائع (CMP ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1– ، c‐ Kit- ، CD34 plus ، CD16 / CD32–) ؛ G ، الخلايا المحببة ، سلف البلاعم (GMP ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1– ، c‐ Kit– ، CD34 plus ، CD16 / CD32 plus) ؛ H ، خلايا النواء ، سلف الكريات الحمر (MEP ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1– ، c‐ Kit- ، CD34– ، CD16 / CD32–) ؛ وأنا ، السلف اللمفاوي الشائع (CLP ؛ Lin– ​​، Sca‐ 1low ، c‐ Kitlow ، CD127 plus). تمثل البيانات المتوسط ​​± SD ؛ عدد=5 الفئران / المجموعة. * ف <0.05 ،="" **="" ف=""><>

3.4|R. glutinosa تأخير شيخوخة HSCs

يمكن للمكملات الغذائية طويلة الأمد مع R. glutinosa إطالة عمر الفئران. يزداد شيخوخة الخلايا مع تقدم العمر. لذلك ، قمنا بالتحقيق في شيخوخة HSC في الفئران المسنة عن طريق تحليل التدفق الخلوي لـ HSCs المصبوغ بـ SA‐gal باستخدام طبقة فرعية فلورية (C12FDG). R. glutinosa ، مشيرا إلى أن R. glutinosa يؤخر شيخوخة الخلية LSK (الشكل 5A).

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورًا رئيسيًا في شيخوخة HSC ، وكثيراً ما يرتبط فقدان هدوء HSC بزيادة ROS الخلوية. وأظهر تحليل ROS داخل الخلايا في LSKs أن المستويات انخفضت في مجموعة R. المجموعة (الشكل 5 ب). أشارت هذه البيانات إلى أن R. glutinosa قد يحافظ على هدوء HSC ويعزز وظيفة HSC عن طريق خفض مستويات ROS.

ثم درسنا التعبير عن العديد من الجينات المشاركة في الشيخوخة الخلوية عن طريق تحليل RT‐ PCR لخلايا LSK. مقارنة

الشكل 3 تعزيز وظيفة الخلايا الجذعية المكونة للدم عن طريق مكملات Rehmannia glutinosa الغذائية. القدرة الاستنساخية في المختبر للخلايا النجمية الكبدية طويلة المدى المأخوذة من الفئران (ن=3)

مع المجموعة الضابطة ، تم تقليل التعبير عن البروتينات المرتبطة بالشيخوخة الخلوية p53 و p16 في مجموعة R. glutinosa (الشكل 5D‐ E). لكن التعبير عن p53 و p16 لم يتم تنظيمه بشكل كبير بين مجموعة A. غشاء ومجموعة التحكم (الشكل 5 D‐ E). مجتمعة ، تظهر هذه البيانات أن العديد من الجينات المرتبطة بدورة الخلية الرئيسية والشيخوخة الخلوية تنظم وظيفة HSCs في الفئران التي تتغذى على وجبات مكملة بـ R. glutinosa.

3.5|عزز R. glutinosa مناعة الخلايا B

الخلايا الليمفاوية B و T كلاهما مهمان للاستجابات المناعية. تلعب الخلايا الليمفاوية التائية دورًا مهمًا في المناعة الخلوية وتنظيمها ، بينما تشارك الخلايا الليمفاوية B بشكل أساسي في المناعة الخلطية. انتشار الخلايا الليمفاوية هو المؤشر الفوري الذي يعكس المناعة العضوية. لدراسة الدور في التحسين المناعي ، تم فحص تأثير R. glutinosa و A. Membranaceus على تكاثر الخلايا الليمفاوية.

عرضت الفئران في مجموعة R. glutinosa انخفاض أعداد الخلايا الجذعية السرطانية وزيادة أعداد CLPs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أعدادًا متزايدة من الخلايا البائية الناضجة (B220 زائد) في PB و BM وطحال الفئران في مجموعة R. glutinosa مقارنة بالأعداد المكتشفة في المجموعة الضابطة (الشكل 6 أ) ؛ ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في عدد الخلايا التائية (CD4 plus و CD8 plus) ، وحيدات وخلايا محببة (CD11b plus) بين المجموعتين (الشكل 6B‐ D). وبالتالي ، تشير هذه النتائج إلى أن R. glutinosa الغذائي يعزز مناعة الخلايا البائية.

الشكل 4 حافظت المكملات الغذائية من ريهمانيا جلوتينوزا وأستراغالوس غشاء على سكون الخلايا الجذعية المكونة للدم. أ ، النسبة المئوية للخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. تحليل التدفق الخلوي لـ 7 aminoactinomycin D (7 ‐ AAD) وتلطيخ Ki ‐ 67 لخلايا Lin – Sca1 plus c kit (LSKs). B ، تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي للتعبير الجيني لخلية LSK المصنفة ؛ تم استخدام GAPDH للتطبيع. تمثل البيانات متوسط ​​± SD لثلاث تجارب. * P <0. 0="" 5="" ،="" **="" p=""><0. 01="" ،="" ***="" p=""><>

الشكل 5 أدت مكملات Rehmannia glutinosa الغذائية إلى تقليل شيخوخة الخلايا النجمية الكبدية (HSC). تم إطعام الفئران (التي يبلغ عمرها شهرين 0 شهرًا) على وجبات غذائية مكملة بـ Rehmannia glutinosa أو Astragalus Membranaceus (2 0 0 مجم / يوم) لمدة شهر 0 (ن {{4) }}/مجموعة)؛ تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي. A ، تحليل التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية SA‐ gal Lin – Sca1 plus c kit– (LSK) باستخدام ركيزة ‐galactosidase الفلورية (C12FDG). ب ، النسبة المئوية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الخلايا الإيجابية في LSKs. تحليل التدفق الخلوي لـ LSKs الإيجابية لـ ROS. تمثل البيانات متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). * P <0. 05="" ،="" ***="" p=""><0.001. c="" ،="" نمط="" التعبير="" عن="" الجينات="" المرتبطة="" بالشيخوخة="" الخلوية="" في="" lsks="" ؛="" تم="" استخدام="" gapdh="" للتطبيع.="" تمثل="" البيانات="" متوسط="" ​​±="" sd="" لثلاث="" تجارب.="" *="" ف=""><0.05 ،="" **="" ف=""><0.01 ،="" ***="" ف=""><>

4|نقاش

في هذه الدراسة ، بحثنا في آليةآثار مكافحة الشيخوخةمن R. glutinosa أو A. Membranaceus عن طريق استكمال غذاء الفئران بالأعشاب بجرعة 200 مجم / يوم لمدة 10 أشهر. وجد أن R. glutinosa يظهر تأثيرات مضادة للشيخوخة ، بما في ذلك انخفاض الشيخوخة وزيادة بقاء HSCs وكذلك

تعزيز مناعة الخلايا البائية. من حيث آليةآثار مكافحة الشيخوخة، وجدنا أن R. glutinosa قلل من عدد HSCs ، بينما زادت قدرة التكاثر. علاوة على ذلك ، حافظ R. glutinosa على هدوء HSC وخفض عدد الخلايا الإيجابية لـ SA‐gal ومستويات ROS من خلال تنظيم p18 و p53 و p16. مجتمعة ، أكدت نتائجنا أن ملفآثار مكافحة الشيخوخةمن R. glutinosa في الفئران يتم علاجها عن طريق الحفاظ على الهدوء وتعزيز وظيفة HSCs.

يمكن استخدام Rehmannia glutinosa ، الذي يُستخدم كدواء عشبي صيني تقليدي لآلاف السنين ، لعلاج نقص السكر في الدم في اضطرابات السكري المختلفة .27،28 كما تم الإبلاغ عن أن مستخلص R. يمنع R. glutinosa الاستجابات الالتهابية والمتلازمات ، 30،31 ويحمي من تلف الخلايا عن طريق تنظيف الجذور الحرة.آثار مكافحة الشيخوخةوعزز مناعة الخلايا B عن طريق زيادة القدرة التكاثرية لـ LT‐ HSCs وخفض أعداد الخلايا الإيجابية SA‐gal ومستويات ROS.

تم العثور على درجة الضرر التأكسدي تزداد مع تقدم العمر في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة. الإجهاد التأكسدي هو محدد حاسم لتجديد HSC الذاتي. يرتبط فقدان هدوء LT‐ HSC بشكل متكرر بزيادة ROS الخلوية ، والتي ترتبط سلبًا بالتجديد الذاتي لـ HSCs. أظهر Catalpol تثبيط الإجهاد التأكسدي وتلف الحمض النووي وتقصير التيلومير من خلال مسار PGC‐ 1 / TERT في دراسة سابقة .33 في دراستنا ، انخفض مستوى ROS في خلايا LSK من مجموعة R. glutinosa مقارنة مع مجموعة التحكم. وهكذا يطيل R. glutinosa بقاء الفئران عن طريق تثبيط الإجهاد التأكسدي في HSCs.

الشكل 6 تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية للخلايا المناعية الناضجة في الدم المحيطي (PB) ونخاع العظام (BM) والطحال والغدة الصعترية. تم تغذية الفئران (التي يبلغ عمرها 2 0 شهرًا) على أنظمة غذائية مكملة بـ Rehmannia glutinosa أو Astragalus Membranaceus (200 مجم / يوم) لمدة 10 أشهر (عدد=5 / مجموعة) ؛ تم تغذية المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي. A ، تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية للخلايا B (B220 plus) في PB و BM والطحال. B ، تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية للخلايا الوحيدة والخلايا المحببة (CD11b plus) في PB و BM. C و D ، تحليل التدفق الخلوي للنسبة المئوية لخلايا CD4 plus و CD8 plus في PB والطحال والغدة الصعترية. تمثل البيانات متوسط ​​± SD. * ف <>

يستخدم Astragalus Membranaceus أيضًا في الطب الصيني التقليدي لتعزيز المناعة وتقليل نسبة السكر في الدم وتعزيز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية ، ولديه أيضًامضادات الأكسدةومكافحة الشيخوخةالخصائص. في هذه الدراسة ، وجدنا أن المكملات الغذائية مع A. memranaceus لمدة 10 أشهر لم يكن لها آثار واضحة مقارنة بتلك التي لوحظت في الفئران الضابطة ، بينما انخفض وزن الفئران عند 20 شهرًا. لذلك ، قد يكون A. غشاء غير مناسب لعلاج LT لتغذية الفئران.

في الختام ، تظهر نتائجنا أن R. glutinosa يمكن أن يطيل عمر الفئران عن طريق الحفاظ على الهدوء وتعزيز وظيفة HSCs. علاوة على ذلك ، يمكن أن يقلل R. glutinosa من المستويات بين الخلايا لـ ROS وعدد الخلايا الإيجابية SA ‐gal ويعزز مناعة الخلايا B.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة جزئيًا من قبل مؤسسة العلوم الوطنية للصين (31672374) وصندوق CAMS للابتكار في العلوم الطبية (CIFMS) (2016-12 مليونًا و 1-012) وصندوق الشباب PUMC (2017310018).

تضارب المصالح

لا أحد.

الكاتب الاشتراكات

جميع المؤلفين المدرجين يستوفون متطلبات التأليف. قام كل من CQ و LFZ بتصميم وتصميم التجارب. أجرى LB التجارب وكتب اختبار المخطوطة الرئيسي. قام GYS بإجراء وتحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية. صممت YJY التجربة حول الطب الصيني التقليدي. تمكن مرحاض الفئران. قرأت جميع المؤلفين ووافق على المخطوطة.