توصيف البروانثوسيانيدين الطبيعي والقلوي المؤكسد في المستخلصات النباتية بواسطة UHPLC-MS / MS عالي الدقة

لمزيد من المعلومات. اتصلtina.xiang@wecistanche.com

الملخص: في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل تركيبة proanthocyanidin (PA) لـ 55 مستخلصًا نباتيًا قبل القلوية وبعدها.أكسدةعن طريق UHPLC-MS / MS فائقة الدقة. لقد وصفنا هياكل PA الطبيعية بالتفصيل ودرسنا التغييرات المعقدة في هياكل PA المعدلة والأنماط والنماذج النموذجية للتفاعلات داخل فئات PA المختلفة بسبب الأكسدة. كانت المناطق المحمية الطبيعية عبارة عن أجهزة كمبيوتر شخصية من النوع A و B ، وأجهزة PD ، ومخاليط PC / PD. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا المناطق المحمية المرنة. كانت أجهزة الكمبيوتر من النوع B في المستخلصات النباتية المختلفة مستقرة إلى حد ما ولم تظهر أي تعديل أو تعديل طفيف بسببأكسدة قلوية. بالنسبة لبعض العينات ، اكتشفنا التفاعلات الجزيئية لأجهزة الكمبيوتر التي تنتج روابط إيثر من النوع A. كانت أجهزة الكمبيوتر من النوع A أيضًا مستقرة إلى حد ما مع عدم وجود تعديل أو تعديل طفيف ، ولكن في بعض النباتات ، تكون تكوين إيثر إضافيالروابطتم التحقق. كانت المناطق المحمية المحتوية على وحدات PD أكثر تفاعلًا. بعد الأكسدة القلوية ، لم يعد يتم اكتشاف هذه المناطق المحمية أو منتجات الأكسدة الخاصة بها بواسطة MS على الرغم من وجود نوع مختلف و / أو حدبة PA المتأخرة لا تزال تكتشف بواسطة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. كانت المناطق المحمية بالغالويل مستقرة نوعًا ما تحت الأكسدة القلوية إذا كانت قائمة على الكمبيوتر ، لكننا اكتشفنا التحويل داخل الجزيء من النوع B إلى النوع A. كانت PDs التي تحتوي على Galloylated أكثر تفاعلًا وتفاعلت بشكل مشابه مع PDs غير الملولبة.

الكلمات الدالة: قياس الطيف الكتلي عالي الدقة ؛ أكسدة المدار العفص. UHPLC-DAD-MS / MS

انقر هنا لمعرفة المزيد من المنتجات

1 المقدمة

بروانثوسيانيدينس(المناطق المحمية ، التانينات المتزامنة) عبارة عن أوليغومرات وبوليمرات تتكون من وحدات أحادية {{0} فلافان أولية (الشكل 1). يُستمد تنوع هياكل PA بشكل أساسي من أنماط الهيدروكسيل ، والترتيب التسلسلي لوحدات flavan -3- ol ، ودرجة البلمرة (DP) ، بالإضافة إلى الاختلافات في الكيمياء الفراغية عند C2 و C3 والتباين في الموقع والكيمياء الفراغية بينالفلافانويدالسندات [1]. أكثر المناطق المحمية شيوعًا هي بروسيانيدين (أجهزة الكمبيوتر) التي تتكون من وحدات كاتشين (epi) و prodelphinidins (PDs) التي تتكون من وحدات (epi) gallocatechin (الشكل 1). تحتوي هياكل PA المعروضة في الشكل على روابط C4 → C8. ومع ذلك ، يمكن أيضًا ربط المناطق المحمية بواسطة روابط C4 → C6 ، ولا يمكننا فصل هذين الرابطين عن بعضهما البعض عن طريق قياس الطيف الكتلي.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>متعددة 100- كيلو طن سنويًا) ، وهي أكثر جاذبية كيميائيًا واقتصاديًا باعتبارها بوليمر حيوي [2-5]. في الوقت الحالي ، لا يتم استخدام سوى عدد قليل من الموارد ، مثل لحاء أو غابات الأبقار ، والميموزا ، والكيبراشو ، والبلوط ، والكستناء ، والمانغروف ، والسماق ، والميروبالان ، والتارا ، لإنتاجها وبشكل أساسي لمتطلبات دباغة الجلود والنبيذ والمعادن التعويم ، وصناعات التنقيب عن النفط ، لتحضير المواد اللاصقة ، بالإضافة إلى تغذية الحيوانات [4،6،7]. ومع ذلك ، يمكن حتى للنفايات أو المنتجات الثانوية الناتجة عن مناولة ومعالجة الفواكه والخضروات وموارد الغابات من التطبيقات الصناعية المذكورة أعلاه أن تكون مصدرًا محتملاً للمناطق المحمية الطبيعية [8-11]. يمكن أيضًا تعديل المناطق المحمية من أجل تعزيز قابليتها للاستخدام والنشاط الحيوي [12 ، 13].

يمكن تعديل الخصائص الكيميائية للمناطق المحمية من خلال تفاعلات الاشتقاق [12]. تتضمن هذه التفاعلات ، على سبيل المثال ، أسيل O عن طريق تفاعل مع كلوريد حامض أو أنهيدريد أو ألكلة مع هاليدات ألكيل. يعدل الاشتقاق الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمناطق المحمية لتطبيقاتها التجارية وتقنيات التنقية. ومع ذلك ، لفهم التفاعلات الفعلية التي تحدث حقًا ، يجب تنظيم العديد من المعلمات ، مثل الكواشف والمذيبات المستخدمة ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة ووقت التفاعل [12]. تتمثل إحدى الطرق البسيطة والسريعة لتحسين قابلية استخدام المناطق المحمية النباتية في أكسدة هذه المناطق المحمية لإنشاء مناطق محمية جديدة بهياكل جزيئية متغيرة. على الرغم من أن ظروف تفاعل الأكسدة معروفة جيدًا وقد تم اقتراح آليات تفاعل مختلفة ، فإن التغييرات الهيكلية المقابلة معروفة بشكل أساسي للمناطق المحمية الصغيرة الفردية [14-18]. على سبيل المثال ، تمت مناقشة تفاعلات الأكسدة وإعادة الترتيب لمختلف المونوميرات والفلافان -3- بأناقة منذ 30 عامًا ، مما يدل على أن كيمياء هذه المناطق المحمية عند الأس الهيدروجيني القلوي ينظمها تكوين A و / أو ميثيدات كينون الحلقة B كمواد وسيطة شديدة التفاعل تسبب تفاعلات إعادة الترتيب والتحويل التأكسدي من النوع B إلى المناطق المحمية من النوع A [15]. بدلاً من ذلك ، لا يُعرف سلوك مخاليط PA في المستخلصات النباتية ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الصعوبات في تحليل المناطق المحمية الأولية المختلفة هيكليًا ، والتي يتم تحديها بشكل أكبر بعد الأكسدة. في دراستنا السابقة ، اختبرنا ما إذا كان يمكن تعديل أنواع مختلفة من المناطق المحمية الطبيعية كيميائيًا لإنتاج أنواع جديدة من المناطق المحمية ودرسنا تأثيرات الأكسدة القلوية غير المحددة التي تحاكي عملية الاستخراج القلوية المستخدمة غالبًا لنفايات اللحاء [19-23] على 102 مستخلصات نباتية تحتوي على PA [13]. أشارت النتائج إلى تفاعلات مختلفة لأجهزة الكمبيوتر الشخصية وأجهزة PD. اقترحت النتيجة أنه يمكن تعديل المناطق المحمية للنبات عند درجة حموضة عالية ، كما أن وجود مجموعات PD عزز بشكل كبير احتمال تفاعلات التعديل. تم التوصل إلى أن طريق التفاعل الرئيسي هو داخل الجزيء ، ولكن بالنسبة للمناطق المحمية الغنية بالـ PD والمفروقة ، تمت الإشارة إلى التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات [13]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسات أخرى أن أكسدة المناطق المحمية تشمل تفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات [14 ، 15 ، 24 ، 25].

يعد التوصيف والفهم التفصيلي للمناطق المحمية الطبيعية والمؤكسدة أمرًا صعبًا ، ولكن التطورات الحديثة في أجهزة قياس الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل فائقة الأداء (UHPLC-MS / MS) مع أجهزة تحليل الكتلة عالية الدقة قد مكنت من توصيف العديد من المناطق المحمية النباتية المختلفة [18 ، 26-28]. كانت أجهزة تحليل الكتلة الشائعة لتوصيف المناطق المحمية هي أوربيتراب [27،28] ورباعية الأضلاع

وقت الرحلة (OTOF) [29،30] نظرًا لخصائصها عالية الدقة ، والتي تسمح بتحديد الكتل الدقيقة والصيغ الجزيئية المقابلة للمناطق المحمية المدروسة في المستخلصات النباتية. عادةً ما تحتوي المناطق المحمية الموجودة في الطبيعة على خليط من بنى بوليمرية وقليلة مختلفة ، والتي تنتج أيونات مشحونة مضاعفة في التأين بالرش الكهربائي ، مما يؤدي إلى توسيع نطاق الكتلة المستخدم [30-32]. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي المناطق المحمية على أنماط تجزئة مميزة معروفة جيدًا ، والتي يمكن استخدامها لتحديدها: وتشمل هذه الانقسام كينون ميثيد (QM) ، والانشطار الحلقي غير المتجانسة (HRF) ، وتفتت رجعي ديلز-ألدر (RDA) [27 ، 31-33]. عادةً ما توجد أنماط التجزئة نفسها لكل من المناطق المحمية من النوع A والنوع B ، وتختلف قيم m / z التي لوحظت في المناطق المحمية من النوع A مع ارتباط إيثر واحد بمقدار 2 Da عن المناطق المحمية من النوع B المقابلة [26 ، {{ 19}}].

في هذه الدراسة ، استخدمنا UHPLC جنبًا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي الترادفي فائق الدقة من أجل (أ) دراسة هياكل PA الطبيعية في 55 عينة نباتية غنية بـ PA بالتفصيل ، (ب) لمعرفة التغييرات المعقدة في هياكل PA المعدلة بعد الأكسدة الهوائية في الظروف القلوية و (ج) للتعرف على الأنماط والنماذج النموذجية للتفاعلات داخل فئات PA المختلفة بسبب الأكسدة.

2. النتائج والمناقشة

اخترنا 55 عينة نباتية غنية بـ PA تحتوي على مخاليط مثيرة للاهتمام ولكنها معقدة من المناطق المحمية الطبيعية بناءً على دراستنا السابقة [13]. تم أكسدة هذه العينات النباتية بالمثل بواسطة الأكسدة الهوائية تحت ظروف قلوية كما في [13] وبعد الأكسدة ، كانت المناطق المحمية أكثر تعقيدًا. تمت دراسة هذه المناطق المحمية الطبيعية والمعدلة هنا بواسطة UHPLC-DAD المتصلة بـ Q-orbitrap MS / MS فائقة الدقة من أجل اكتشاف التغييرات المعقدة في هياكل PA. تم تحديد المناطق المحمية بناءً على أيوناتها المشحونة الفردية و / أو المضاعفة مع كتلتها الدقيقة والصيغة الجزيئية المقابلة لها. تم إجراء التحليلات بواسطة LC ذي المرحلة العكسية ، وبالتالي ، كانت المناطق المحمية قليلة القسيمات والبوليمرية موجودة بشكل أساسي على شكل حدبات غير محسومة في كروماتوجرام الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، انظر مستخلص أوراق Ruprechtia salicifolia في الشكل 2A على سبيل المثال. في إجمالي كروماتوجرام الأيونات ، كان تأين المركبات الفينولية الأخرى أكثر كثافة من تلك الموجودة في المناطق المحمية ، وبالتالي ، لم يكن سنام السلطة الفلسطينية واضحًا (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، فإن دقة المدار تجعل تفسير نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد أسهل حيث يتم تحديد الأنماط النظيرية للأيونات المشحونة المضاعفة بوضوح ، ويمكن اكتشاف التداخل المحتمل للقمم ، مما يتيح تحديد الكتل الدقيقة والصيغ الجزيئية للقليل المختلف. والمناطق المحمية البوليمرية. على سبيل المثال ، يُظهر الكاتشين المرطب (epi) عند m / z 441 ، و PCat m / z729 ثنائي الطبقات ، وجهاز كمبيوتر ثلاثي الأبعاد مغطى بالمرور عند m / z 1017 قممًا منفصلة جيدًا في كروماتوجرام أيون مستخرج (EICs) في الشكل 2C-E ، وهم يمكن اكتشافها بسهولة بناءً على الأشعة فوق البنفسجية وأطياف الكتلة ، بما في ذلك الكتل الدقيقة والصيغة الجزيئية المقابلة. كانت النتائج التي تم الحصول عليها هنا متوافقة مع النتائج السابقة التي تم الحصول عليها بواسطة MS / MS ، والتي توضح أن أوراق Ruprechtia salicifolia تحتوي على 24 مجم / جم من المناطق المحمية ، منها 3 بالمائة فقط كانت تحتوي على مناطق محمية تحتوي على PD ، وبعضها مرصع ، وتم العثور على mDP ليكون 7 [13].

أجهزة الكمبيوتر من النوع 2.1.B في المستخلصات النباتية الأولية غير المؤكسدة

تم اكتشاف أجهزة الكمبيوتر من النوع B في المستخلصات النباتية بناءً على أيوناتها الجزيئية المفردة والمضاعفة بالإضافة إلى أنماط التجزئة المميزة. على سبيل المثال ، أجهزة الكمبيوتر في تعريشة Begonia عبارة عن مستخلص "Nigra" يعرض سلسلة مميزة من أيونات [MH] مفصولة بـ 288 Da من m / z289 إلى m / z 1729 المطابقة لأجهزة الكمبيوتر من النوع B من المونومر إلى السداسي و [M {{ 6}} H] 'أيونات مفصولة بـ 144 Da من m / z 1008 إلى m / z 1296 تتوافق مع أجهزة الكمبيوتر من النوع B من سباعي إلى غير سامين (الجدول S1). أظهرت الأطياف الكتلية لأجهزة الكمبيوتر الأحادية ، مثل flavan -3- ols catechin و epicatechin ، أيونًا شظيًا مميزًا عند m / z 245 كما ورد سابقًا [3132،36].

بشكل عام ، أظهر MS / MS من ثنائيات الكمبيوتر من النوع B أنماط التجزئة المميزة التي تنتج أيونات عند m / z 287 و 289 (انقسام QM) ، و m / z 425 ، و 407 (تجزئة RDA والتخلص المتسلسل من الماء) و m / z 451 (HRF ؛ الشكل 3). يعتبر تجزئة RDA أهم نمط تجزئة لتوصيف ثنائيات أجهزة الكمبيوتر من النوع B ، ويُعتقد أن التجزئة على وحدة الامتداد أكثر ملاءمة من حيث الطاقة لأنها تنتج أيونات مجزأة بنظام π-π مترافق أكبر من تجزئة RDA على الوحدة الطرفية [31-33].

2.2 أجهزة الكمبيوتر من النوع A في المستخلصات النباتية الأولية غير المؤكسدة

تم تأكيد وجود المناطق المحمية من النوع A في المستخلصات النباتية الأولية من خلال أنماط التجزئة المميزة التي تشبه المناطق المحمية من النوع B. كأمثلة ، يتم عرض ومناقشة مسارات التجزئة المميزة وبيانات MS / MS الخاصة بجهاز الكمبيوتر الشخصي من النوع A والرابط الذي له ارتباط من النوع A ومناقشته بالتفصيل (الشكلان 4 و 5). أنتج تجزئة ثنائيات الكمبيوتر من النوع A أربعة شظايا أيونات (الشكل 4). أنتج تجزئة RDA للوحدة الطرفية أيونًا عند m / z 423 ، مما يؤكد وجود ارتباط من النوع A [26،34،35]. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح أن تجزئة RDA لوحدة التمديد والفقد المتسلسل للماء يمكن أن ينتج أيون عند m / z 407. الأيون عند m / z 449 هو إنتاج HRF ، أي نتيجة فقدان وحدة الفلوروجلوسينول [26]. تتوافق الأيونات عند m / z 285 و 289 مع انقسام QM. وبالمثل ، أظهر قاطع الكمبيوتر الشخصي من النوع A أيونًا جزيئيًا عند m / z 863 وأيونات شظية مميزة في MS / MS عند m / z 711.693.573.559،451،411 و 289 كما ورد سابقًا بواسطة Sui et al. (2016 ) [26]. أنتج تجزئة RDA لأداة تقليم الكمبيوتر الشخصي من النوع A أيونًا عند m / z 711 ، مما يؤكد مرة أخرى وجود ارتباط من النوع A وفقًا للدراسة السابقة [26] ويلمح إلى أن الارتباط من النوع A يمكن أن يكون بين امتدادين الوحدات. نقترح أن الأيون عند m / z 693 يتوافق مع الفقد المتسلسل للماء ويدعم موضع الارتباط من النوع A ، كما هو موضح في الشكل 5. بالإضافة إلى ذلك ، نقترح أن يكون RDA الإضافي للحلقة C الحلقية غير المتجانسة تعرض الوحدة الطرفية flavan -3- ol الأيون عند m / z559. كان هذا الأيون طفيفًا في دراساتنا. تتوافق الأيونات عند m / z573 و 289 مع انقسام QM للرابطة السفلية بين الفلافانويد [26]. اكتشفنا أيضًا أيونات عند m / z 575 و 287. نقترح أن الأيونات عند m / z 451 و 411 يمكن أن تتوافق مع HRF للحلقة C غير المتجانسة لوحدة flavan الأوسط -3- التي تدعم موقع وصلة من النوع A بين وحدات الامتداد وفقًا للشكل 5.

2.3 تعديلات أجهزة الكمبيوتر من النوع B في المستخلصات النباتية بسبب الأكسدة القلوية

بعد الأكسدة ، تم تعديل أجهزة الكمبيوتر من النوع B في المستخلصات النباتية المختلفة بشكل مختلف. لم تظهر بعض العينات أي تعديلات طفيفة ؛ انظر الشكل 6 أ ، ب ، على سبيل المثال ، بالنسبة إلى أوليغومرات الكمبيوتر من النوع B الأقصر في مستخلص أوراق نبات بيجونيا هي "نيجرا" قبل وبعد الأكسدة. عندما تتأكسد هذه الأنواع من المستخلصات النباتية ، كانت أطياف الكتلة الكلية للمستخلصات النباتية الأولية والمؤكسدة متشابهة. ومع ذلك ، تم الكشف عن اختلافات طفيفة في البيانات التفصيلية الكتلة الطيفية. على سبيل المثال ، تم إرفاق dimer PC at m / z 577 مع m / z575 ، وأداة قطع الكمبيوتر في m / z 865 مع m / z 863 ، على التوالي. عندما كانت كميات أجهزة الكمبيوتر الشخصية منخفضة قبل الأكسدة ، بعد الأكسدة ، اختفت إشاراتها تقريبًا من أطياف الكتلة ، مما يشير إلى أنها تحولت إلى غير قابلة للتحديد أو تدهورت بسبب الأكسدة. لوحظت هذه الظاهرة ، على سبيل المثال ، بالنسبة لمستخلصات أوراق Combretum Indicum و Euphorbia characias التي تحتوي على كميات منخفضة من القليل من أوليغومرات الكمبيوتر القصيرة ومدعومة ببيانات MS / MS السابقة التي أظهرت أن محتوى PA انخفض من 4 مجم / مل إلى 1 مجم. / مل و 7 ملغ / مل إلى 1 ملغ / مل ، على التوالي ، بسبب الأكسدة [13]. قد تكون هذه الظاهرة مرتبطة بالظروف التجريبية المستخدمة ، مما يعني أنها كانت أكثر شدة عندما كانت محتويات PA الأولية منخفضة. في بعض العينات ، تم تعديل جزء من أجهزة الكمبيوتر من النوع B أكثر ، انظر الشكل 6C ، D ، على سبيل المثال ، من أجل PColigomers من النوع B الأقصر في مستخلص نشرة Cyperus owoaii قبل وبعد الأكسدة. عندما تتأكسد هذه الأنواع من المستخلصات النباتية ، تم اكتشاف اختلافات واضحة في أطياف الكتلة الإجمالية التي توضح الفرق الكتلي البالغ 2 Da مقارنة بأجهزة الكمبيوتر الأولية (الشكل 6C ، D ، الجدول S2).

من المعروف جيدًا أن أكسدة البوليفينول o-dihydroxy ، أي الحلقة الكاتيكول B لأجهزة الكمبيوتر ، ينتج عادةً o-quinones بفارق كتلة 2 Da. في الواقع ، لقد لاحظنا أن هذا النوع من الأكسدة يمكن أن يحدث أيضًا في تحليلات قياس الطيف الكتلي. يمكن أن تكون هناك إشارات ثانوية في أطياف الكتلة لها قيم m / z 2 Da أصغر من قيم m / z لأجهزة الكمبيوتر المقابلة للأكسدة المحتملة أو تكوين أشكال الكينون لأجهزة الكمبيوتر أثناء التأين (البيانات غير منشورة). من الممكن هنا في الأكسدة القلوية أن تشكل البوليفينول o-dihydroxy أول o-quinones. ومع ذلك ، فإن 0- أشكال الكينون المتكونة غير مستقرة وعلى الأرجح تتفاعل بسرعة أكبر. يمكن أن تكون إحدى النتائج المحتملة هي التحويل المؤكسد لأجهزة الكمبيوتر من النوع B إلى أجهزة الكمبيوتر من النوع A ، كما ورد سابقًا في الأدبيات [15]. يتضمن تحويل أجهزة الكمبيوتر من النوع B إلى أجهزة الكمبيوتر من النوع A الإزالة المؤكسدة لأيون الهيدريد في C2 من الحلقة C كخطوة أولية: تؤدي الظروف الأساسية السائدة إلى أكسدة وظيفة o-dihydroxy للحلقة B إلى o-quinone ، والذي يعمل لاحقًا كملفمؤكسدلتحويل ثنائي بروسيانيدين من النوع ب إلى النوع الأول [15] (الشكل 7). تم إثبات آلية ميثيد الكينون هذه أيضًا في درجات حرارة مختلفة ، ودرجة حموضة ، وظروف تحفيزية [37] ، عن طريق الأكسدة الجذرية باستخدام جذور 1 ، 1- ثنائي فينيل -2- بيكريل هيدرازيل تحت ظروف متعادلة [38] وعن طريق اللاكيز ( EC1.10.3.2) [39].

عندما درسنا أجهزة الكمبيوتر المعدلة مع اختلاف الكتلة بمقدار 2 Da في المستخلصات المؤكسدة وإنتاجها الذي تم الحصول عليه بواسطة MS / MS ، تم التوصل إلى أنها مماثلة لأجهزة الكمبيوتر من النوع A وأيوناتها الشظية (كما نوقش أعلاه في القسم 2.2) ، تُظهر أنماط التجزئة المميزة التي تنتج أيونات عند m / z 285 و 289 (انقسام QM) ، و m / z 423 (تجزئة RDA) و m / z449 (HRF). على سبيل المثال ، نعرض تحويل ثنائيات PC من النوع B لمستخلص نشرة Microgramma Mauritania إلى ثنائيات PC من النوع A في الشكل 8. في الشكل 8.غير مؤكسداستخراج ، اكتشفنا أربعة ثنائيات PC من النوع B بقيم m / z 577 (الشكل 8 أ) ولكن لا يوجد ثنائيات كمبيوتر من النوع A بقيم m / z 575 (الشكل 8B). من المفترض أن القمم الصغيرة في EIC عند m / z575 تتوافق مع أكسدة أجهزة الكمبيوتر من النوع B في مصدر الأيونات لأن أوقات الاحتفاظ هي نفسها تمامًا لأجهزة الكمبيوتر من النوع B. في المستخلص المؤكسد ، اكتشفنا فقط آثارًا لأجهزة الكمبيوتر الأولية من النوع B عند m / z 577 (الشكل 8C) ، ولكن بدلاً من ذلك ، اكتشفنا قممًا مكثفة في أوقات الاحتفاظ اللاحقة التي تتوافق مع أجهزة الكمبيوتر من النوع A عند m / z 575 (الشكل 8). 8D). القمم الصغيرة في EIC عند m / z577 التي لها نفس أوقات الاحتفاظ تتوافق مع الإشارات النظيرية لـ m / z 575. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسة كانت نوعية ، مما يعني أن وفرة الأيونات لا يمكن أن تكون بالمقارنة على هذا النحو. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ملاحظة أن تحويل أجهزة الكمبيوتر من النوع B إلى أجهزة الكمبيوتر من النوع A لم يكن دائمًا كاملاً كما في هذا المثال وأن جميع أجهزة الكمبيوتر من النوع B لم يتم تحويلها إلى أجهزة كمبيوتر من النوع A ؛ تم تقدير وفرة أيونات أوليغومرات الكمبيوتر من النوع A و B من النوع B تقريبًا. من ناحية أخرى ، في بعض العينات ، اكتشفنا المزيد من الاختلافات في 2 Da ؛ على سبيل المثال ، يمكن أن يصاحب heptamer PC في m / z 2017 أيونات في m / z2015 و 2013 ، مما يشير إلى تكوين رابط واحد واثنان من النوع A ، على التوالي.

على الرغم من أن تحويل أجهزة الكمبيوتر من النوع B إلى النوع A يبدو أنه آلية التفاعل الرئيسية ، لا يمكننا استبعاد تفاعلات التعديل الأخرى تمامًا. كانت المناطق المحمية موجودة كمخاليط معقدة في المستخلصات الأولية غير المؤكسدة ، وكانت هذه الخلائط أكثر تعقيدًا بعد الأكسدة القلوية التي أنتجت كمية هائلة من بيانات MS. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة حول تفاعلات الأكسدة المحفزة بالقاعدة وإعادة ترتيب المناطق المحمية أن ثنائيات الكمبيوتر الشخصي يمكن أن تتحدث إلى منتجات مختلفة من أزمرة الحلقة C ، بما في ذلك رباعي هيدروكسي بيرانوكرومينيس ، المعروف أيضًا باسم فلوروتانينات [15]. ستظهر هذه المنتجات قيم m / z متشابهة جدًا عند 577 ولكن أوقات استبقاء مختلفة في LC وأنماط تجزئة مختلفة في MS. استنادًا إلى EICs عند m / z 577 ، لم نكتشف إعادة ترتيب من هذا النوع في ظروف التفاعل المستخدمة. يمكن أن تؤدي عمليات إعادة ترتيب وفتح الحلقة C الحلقية غير المتجانسة أيضًا إلى إنتاج منتجات أخرى عبر أزمرة regio ، أو epimerization ، أو 13- ترحيل aryl [15]. ترتبط عملية إزالة الشعر بشكل أساسي بعمليات التصنيع ، وعلى سبيل المثال ، تؤدي درجات الحرارة المرتفعة المرتبطة بتحميص الكاكاو إلى فقد -3- فلافان ، ولكن أيضًا إلى إزالة فلافان -3- مونومرات أول ، ثنائيات و أدوات التشذيب [40]. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن مادة البوليفينول أوكسيديز في لب ثمار الموز تسبب في إزالة (-) - epigallocatechin إلى (-) - gallocatechin [41]. لقد نظرنا في إمكانية إزالة فلافان -3- ols باستخدام EICs في m / z289 ، وبشكل عام ، لم نكتشف إزالة كبيرة بسبب الأكسدة القلوية المستخدمة. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد الإزالة تمامًا لأننا اكتشفنا كميات أعلى من (زائد) - كاتشين فيما يتعلق بـ (-) - يبيكاتشين في المستخلص المؤكسد لزهور القرنبيط بافونيا مقارنة بالمستخلص الأولي غير المؤكسد (الشكل S1). يجب أيضًا ملاحظة أن المستخلصات المؤكسدة قد تم تحييدها قبل UHPLC-MS / MS ، والتي ربما تسببت في تفاعلات الأكسدة والاختزال. في الأشكال المؤكسدة ، الكينونات عبارة عن مركبات كهربائية يمكن أن تتفاعل مع المياه المحبة للنواة الموجودة ، وقد يؤدي هذا ببساطة إلى تفاعل الاختزال الذي ينتج عنه أجهزة كمبيوتر من النوع B ، وهو ما قد يفسر أيضًا سبب عدم تأثر بعض أجهزة الكمبيوتر من النوع B.

2.4 تعديلات على أجهزة الكمبيوتر من النوع A في المستخلصات النباتية بسبب الأكسدة القلوية

تفاعلت أجهزة الكمبيوتر من النوع A في المستخلصات النباتية المختلفة بشكل مختلف بسبب الأكسدة القلوية. لم تظهر بعض العينات أي تعديلات طفيفة. عندما تعرضت هذه الأنواع من المستخلصات النباتية للأكسدة القلوية ، لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية في أطياف الكتلة الكلية (على سبيل المثال ، انظر الجدول S3 للأيونات الرئيسية التي لوحظت في مستخلص أوراق Aglaonema commutatum var. maculatum قبل وبعد الأكسدة). ومع ذلك ، يمكن الكشف عن اختلافات طفيفة في البيانات التفصيلية لقياس الطيف الكتلي مع اختلاف الكتلة بمقدار 2 Da والتلميح إلى أنه يمكن تكوين روابط إضافية من نوع A من الأثير. كانت هذه الظاهرة أكثر وضوحًا بالنسبة لبعض العينات التي تحتوي على أجهزة كمبيوتر من النوع A ؛ لوحظ أن هذه الحواسيب الشخصية من النوع A تشكل روابط إيثر إضافية من النوع A بسبب الأكسدة القلوية (الشكل 9). عندما تم أكسدة هذه الأنواع من المستخلصات النباتية ، تم اكتشاف اختلافات واضحة في أطياف الكتلة الكلية توضح الفرق في الكتلة بمقدار 2 Da مقارنة بأجهزة الكمبيوتر الأولية من النوع A. يتوافق [MH] -ion at m / z 863 مع أداة اقتطاع الكمبيوتر الشخصي بها رابطة إيثر واحدة من النوع A والأيون عند m / z 861 لأداة اقتطاع أجهزة الكمبيوتر بها رابطان إيثر (الشكل 9 أ ). وبالمثل ، تم الكشف عن أجهزة الكمبيوتر الرباعية التي تحتوي على واحد ، واثنين ، وثلاثة روابط إيثر بواسطة أيونات [M -H] عند m / z 1151 و 1149 و 1147 على التوالي (الشكل 9 ب). تم اكتشاف روابط إيثرية واثنين وثلاثة بواسطة أيونات [M -H] عند m / z 1439 و 1437 و 1435 وعند m / z 1727،1725 و 1723 ، على التوالي (الشكل 9C ، D ؛ ومع ذلك ، كان [M -2 H] 2- ion at m / z 861 من سداسي الكمبيوتر أكثر وفرة بشكل صريح من إصدار [MH] عند m / z 1723 ، وبالتالي ، يظهر في الشكل).

كما أثر تكوين روابط إضافية من النوع A على أوقات استبقاء هذه القسيمات قليلة. يبدو أن عدد روابط الأثير الإضافية يزداد إلى حد ما مع زيادة درجات البلمرة في أجهزة الكمبيوتر ، وهو أمر متوقع نظرًا لوجود المزيد من المواضع للروابط الإضافية. ومع ذلك ، يجب أيضًا ملاحظة أنه يمكن أن تكون هناك إشارات طفيفة مع اختلاف الكتلة البالغ 2 Da المقابلة للأكسدة المحتملة أو تكوين أشكال الكينون لأجهزة الكمبيوتر أثناء التأين ، كما تمت مناقشته أعلاه. تظهر هذه القمم أيضًا في أطياف الكتلة في الشكل 9 قبل القمم الرئيسية المقابلة لأجهزة الكمبيوتر من النوع A. أكدت وفرة الأيونات ، وأشكال الأنماط النظيرية ، وأيونات الشظايا المميزة التي تم الحصول عليها بواسطة MS / MS ، ملاحظة روابط إيثر إضافية من النوع A. من المهم أيضًا ملاحظة أن هذه التفاعلات الجزيئية التي لوحظت لا يبدو أنها تؤثر على متوسط ​​درجة البلمرة حيث لم يتم اكتشاف أوليغومرات أو بوليمرات PA الأعلى في المستخلصات المؤكسدة مقارنة بالمستخلصات غير المؤكسدة. هذه الملاحظة مدعومة من قبل Mouls و Fulcrand (2012) [14].

2.5 المستخلصات النباتية ذات المناطق المحمية التي تحتوي على كل من الوحدات الفرعية PC و PD وتعديلاتها بسبب أكسدة الأكالين

احتوت العديد من العينات على المناطق المحمية مع كل من وحدات كاتشين (epi) و (epi) gallocatechin ، أي أن المناطق المحمية كانت عبارة عن مخاليط PC / PD. كان مصير مخاليط PC / PD بسبب التعديل عبر الأكسدة القلوية مختلفًا مقارنة بأجهزة الكمبيوتر. تم اكتشاف مخاليط PC / PD بوضوح في المستخلصات النباتية قبل الأكسدة بواسطة كل من الأشعة فوق البنفسجية ومرض التصلب العصبي المتعدد ؛ انظر ، على سبيل المثال ، أوليغومرات السلطة الفلسطينية الصغيرة في مستخلص الأوراق الأولي لبودوكاربوس ماكروفيلوس (الشكل 10 أ والجدول S4). بعد الأكسدة ، تم اكتشاف المناطق المحمية المعدلة بواسطة UVat 280 نانومتر كنوع مختلف و / أو سنام متأخر (الشكل S2) ، ولكن لم يتم اكتشافها بعد الآن بواسطة MS ، انظر ، على سبيل المثال ، أوليغومرات PA المفقودة في الورقة المؤكسدة مقتطف من بودوكاربوس ميكروفالوس (الشكل 10 ب والجدول S4). لم نكتشف أي إشارات أخرى يمكن أن تتوافق مع مخاليط PC / PD المعدلة ولا مع نواتج تدهورها المحتملة. على سبيل المثال ، بالنسبة لثنائي جهاز الكمبيوتر عند m / z 577 ، يمكننا اكتشاف ثنائيات جهاز الكمبيوتر من النوع A المقابل عند m / z 575 في المستخلص المؤكسد ، ولكن لا يمكن إجراء ملاحظات مميزة مماثلة لأجهزة ثنائيات PC / PD أو أدوات التشذيب (الشكل 10 ب). يمكن أن يكون سبب فقدان أوليغومرات PC / PD القابلة للاكتشاف في ESI-MS ، على سبيل المثال ، التفاعلات بين الجزيئات بين المناطق المحمية [13-15 ، 24،25]. من المعروف أن التفاعلات بين الجزيئات تؤدي إلى تكوين المناطق المحمية المعدلة عن طريق توصيل سلسلتين مختلفتين من القسيمات الصغيرة ، وعادةً ما تؤدي إلى زيادة متوسط ​​درجة البلمرة [14]. على سبيل المثال ، Vernhet et al. لاحظ (2014) من خلال تجارب تشتت الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة أنه إذا تم أكسدة المناطق المحمية في المحاليل المركزة ، فإن المناطق المحمية المعدلة عبارة عن بوليمرات عالية ذات سلاسل خطية أو متفرعة طويلة [25]. يمكن أن يؤدي المزيد من الأكسدة أيضًا إلى الدوران بين الحلقات A و B من المناطق المحمية المختلفة [24]. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن هذه الروابط والهياكل الجديدة مقاومة للانقسام المحفز بالحمض ، وبالتالي ، يمكن تقدير الزيادة في متوسط ​​درجة البلمرة فقط من خلال طرق غير إزالة البلمرة [14 ، 24. ومع ذلك ، أظهرت نتائجنا أن هذه المناطق المحمية المعدلة لم يتم اكتشافها إما بموجب شروط ESI-MS القياسية المستخدمة في المناطق المحمية (الشكل 10). في دراستنا السابقة ، استخدمنا طريقة تعتمد على رصد التفاعل المحدد بواسطة رباعي الأضلاع للكشف عن المناطق المحمية في العينات غير المؤكسدة والمؤكسدة ولاحظنا أن تكوين الوحدة الفرعية قد تغير بسبب الأكسدة القلوية وبالتالي لم تعد الطريقة قادرة على الكشف المناطق المحمية المعدلة [13]. تدعم نتائج MS عالية الدقة الحالية ملاحظاتنا السابقة من خلال رباعي الأقطاب الثلاثية بأن المناطق المحمية المعدلة في المستخلصات المؤكسدة أكثر تعقيدًا بكثير من المناطق المحمية الأولية في المستخلصات غير المؤكسدة وأنه لم يتم اكتشافها في ظل ظروف UPLC-MS / MS مماثلة [13].

تختلف الطرق المستخدمة لأكسدة المناطق المحمية في الأدبيات إلى حد ما عن طريقتنا ، وبالتالي ، قد لا تكون النتائج قابلة للمقارنة بشكل مباشر [14 ، 24 ، 25]. في الدراسات السابقة ، تم إجراء الأكسدة في الماء المحمض بحمض الخليك ثلاثي الفلور عند درجة حموضة 3.5 من أجل محاكاة درجة حموضة النبيذ ، وتم الحصول على الأكسدة الفعلية عن طريق تحريك العينة في وجود الهواء لعدة أيام [14 ، 24 ، 25]. استخدمنا الأكسدة القلوية بواسطة محلول كربونات عند درجة الحموضة 10 لمدة ساعة واحدة فقط.

تضمنت معظم المستخلصات النباتية المناطق المحمية مع كل من الوحدات الفرعية للكمبيوتر الشخصي و PD ، وفي عينتين فقط ، يمكن اعتبار المناطق المحمية نقية تقريبًا. كانت هاتان العينات من مستخلصات Callisia gentlei varelegans و Pellaea ooata. تم اكتشاف PDs من النوع B في Callisia gentle var. استخراج الليغان قبل الأكسدة. انظر ، على سبيل المثال ، أوليغومرات PD الصغيرة في الجدول S5 ، ولكن بعد الأكسدة ، لم يتم اكتشاف هذه PDs بعد الآن بواسطة MS. لم نكتشف أي إشارات أخرى يمكن أن تتوافق مع PDs المعدلة ولا مع نواتج تدهورها المحتملة. ومع ذلك ، لا تزال الأشعة فوق البنفسجية تكتشف بعض المناطق المحمية المعدلة عند 280 نانومتر كحدبة منخفضة ومتأخرة (الشكل S3). ومن المثير للاهتمام أنه قبل الأكسدة ، تم اكتشاف PDs ثلاثي الأبعاد من النوع A في مستخلص بيانات Pellaea ، وبعد الأكسدة ، كانت هذه الإشارات لا تزال موجودة ، لكن شدتها كانت أقل بكثير

بواسطة MS ، بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف قيم m / z المقابلة لتشكيل روابط إضافية من النوع A في أدوات تقليم PD بشكل مشابه لأجهزة الكمبيوتر من النوع A (الجدول S6). قد يشير هذا إلى أنه بالإضافة إلى التفاعلات الجزيئية التي لوحظت بالنسبة إلى PDs المتماثل وغير المتجانسة من النوع B ، يمكن أن تحتوي PDs من النوع A أيضًا على تفاعلات جزيئية مماثلة تم اكتشافها لأجهزة الكمبيوتر من النوع A.

2.6. المحاصرات المحمية في المستخلصات النباتية وتعديلاتها بسبب الأكسدة القلوية

احتوت بعض النباتات على المناطق المحمية المرطبة. تم تأكيد وجود أجهزة الكمبيوتر الشخصية و PD و PC / PDs المخصصة في المستخلصات النباتية من خلال أنماط التجزئة المميزة لها. بشكل عام ، حدث تجزئة المناطق المحمية المرصوفة في تحليل MS بشكل مشابه عبر آليات RDA. و HRF و QM كما تمت مناقشته أعلاه [31-33]. على سبيل المثال ، يتم عرض ومناقشة مسار التجزئة المميز وبيانات MS / MS الخاصة بجهاز الكمبيوتر المرهم في مستخلص أوراق Ruprechtia salicifolia ومناقشتها بالتفصيل (الشكل 11). يعتبر موضع مجموعة galloyl إرشاديًا فقط ، ويمكن ربطه بأي مجموعة هيدروكسيل حرة أخرى في الوحدة الطرفية. الأيون عند m / z603 هو إنتاج HRF. تتوافق الأيونات عند m / z 287 و 441 مع انقسام QM. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا انقسام مجموعة galloyl مما أدى إلى وجود أيون مطابق لثنائي PC عند m / z577 وتجزئة RDA اللاحقة بأيون عند m / z425 والانقسام الإضافي للماء مع أيون عند m / z 407. أنتج HRF لـ m / z 577 أيون الشظايا عند m / z 451. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أيونات شظية صغيرة عند m / z 109،123 و 125 ، المقابلة للحلقات العطرية. يمكن أن تحتوي المناطق المحمية المرانعة على العديد من مجموعات الغالويل في هياكلها (الجدول S7).

تصرفت المناطق المحمية المختلفة التي تحتوي على المرارة بشكل مختلف أثناء الأكسدة الهوائية في ظل الظروف القلوية. كانت أجهزة الكمبيوتر التي تحتوي على غالويل مستقرة نوعًا ما وتتفاعل بشكل مشابه مع أجهزة الكمبيوتر غير المحتوية على مركبات. على سبيل المثال ، لم يتم الكشف عن أي تغييرات ملحوظة لأجهزة الكمبيوتر ذات المرارة التي تحتوي على مجموعة غالويل واحدة في هياكلها في مستخلص الأوراق المؤكسدة من Nepenthes maxima (الجدول S7). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن شدة الأيونات لأجهزة الكمبيوتر ذات المرارة التي تحتوي على مجموعتين أو أكثر من مجموعات Galloyl كانت أقل في المستخلص المؤكسد لـ Nepenthes maxima ، وعلى سبيل المثال ، لم يعد من الممكن اكتشاف أجهزة pentamers PC التي تحتوي على العديد من مجموعات المطبخ (الجدول) S7). تتشابه قيم m / z الصحيحة لبعض أجهزة الكمبيوتر المرنة مع قيم m / z لأجهزة الكمبيوتر / أجهزة PD ، وبالتالي ، يلزم توفر MS عالي الدقة. على سبيل المثال ، يتوافق m / z 881 مع PA ثلاثي يتكون من جهازي كمبيوتر ووحدة PD واحدة (C4sH3 ؛ O19 ، mcalculated 882.20074) وجهاز ثنائى مرئي به مجموعتان من Galloyl (C44H34O20 ، mcalculated ، 882.16435). في بعض العينات ، كما هو الحال في مستخلص الأوراق المؤكسدة من Coccoloba uvifera ، تم تحويل أجهزة الكمبيوتر المرشوشة إلى أجهزة كمبيوتر شخصية من النوع A بسبب الأكسدة ، على الرغم من أن المناطق المحمية المرطبة في المستخلص الأولي تبدو مشابهة لتلك الموجودة في Nepenthes maxima. على سبيل المثال ، كان ديمر الكمبيوتر المخصص الذي يحتوي على مجموعة جالويل واحدة ويظهر أيون م / ض 729 (الجدول S7) مستقرًا أثناء الأكسدة القلوية في مستخلص أوراق نبات النبتة القصوى ولكن تم تعديله جزئيًا في مستخلص أوراق نبات كوكولوبا أوجيفيرا الذي يعرض أيونات في كل من م. / z 727 و 729. الأيون السابق يتوافق مع جهاز PCdimer من النوع A المرالي (m / z727.13148 ، C37H2O16) وأظهر شظايا MS / MS مميزة تدعم الوصلة من النوع A: m / z601 (منتج HRF لـ m / z 727) ، 575 (A-type PCdimer) ، 557 (انقسام الماء من m / z575) ، 449 (HRF of m / z575 ، انظر الشكل 4) ، 423 (RDA لـ m / z 575 ، انظر الشكل 4) ، 285 (QM لـ m / z575 ، انظر الشكل 4) ، 169 (حمض الغاليك) ، 125 (انظر الشكل 11) و 109 (انظر الشكل 11). يمكن أن يكون أحد أسباب هذه الاختلافات في المناطق المحمية المماثلة بين المستخلصات النباتية هو المركبات الأخرى الموجودة في المستخلصات والتي تؤثر على تفاعلات المناطق المحمية.

كانت مخاليط PC / PDs و PDs التي تحتوي على Galloylated تفاعلية وتعديلها بشكل مشابه لمخاليط PC / PD غير المطلية بالكروم و PDs. بعد الأكسدة ، لم يتم اكتشاف هذه المناطق المحمية بواسطة MS على الرغم من أنها كانت لا تزال مرئية عند الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. لم نكتشف أي إشارات أخرى يمكن أن تتوافق مع المناطق المحمية المعدلة هذه ولا مع نواتج التحلل المحتملة. في عينة واحدة ، وبالتحديد في أوراق Acacia karroo ، لم يتم الكشف عن PDs المعدلة والمغلفة وغير المطلية بواسطة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر أيضًا.

في دراستنا السابقة [13] ، حيث تم تحليل المناطق المحمية في المستخلصات غير المؤكسدة والمؤكسدة من خلال طرق مراقبة التفاعل المختارة ، لاحظنا أنه تم الكشف عن حدبة جويلويل واضحة باستخدام طريقة MS / MS الخاصة بجالويل في العينات المؤكسدة ، ولكن الشكل من الحدبة قد تغيرت وتحولت وفقًا لذلك إلى الحدبة المرصودة في الكروماتوجرام فوق البنفسجي. تم تعديل المناطق المحمية الأصلية المليئة بالمرور بطريقة تجعل من الممكن اكتشاف مجموعة galloylgroup باستخدام طريقة مراقبة التفاعل المحددة [13]. أظهرت الدراسات السابقة على (-) - epigallocatechin gallate و (-) - epigallocatechin أن الحلقة ثلاثية هيدروكسيفينيل B هي الموقع الرئيسي لعمل الأكسدة وأنه لا توجد منتجات يمكن اكتشافها ناتجة عن أكسدة مجموعة المرارة [42]. ومع ذلك ، فإن ظروف التفاعل المستخدمة ومنتجات الأكسدة التي تم الحصول عليها كانت مختلفة إلى حد ما مقارنة بدراستنا حيث تم إجراء الأكسدة مع جذور البيروكسيل الناتجة عن التحلل الحراري لبادئ azo 2،2'-azobis (2 ، 4- ثنائي ميثيل فاليرونيتريل) [42].

بالإضافة إلى المناطق المحمية المرشوشة ، عينتان ، وهما Cephalotaxus harringtomia subsp. يبدو أن منشورات drupaceous وأوراق Laurus nobilis تحتوي على أجهزة كمبيوتر جليكوزيلاتي تحتوي على وحدة سكر واحدة متصلة بهيكل كمبيوتر شخصي واحد. وقد لوحظت بعض أجهزة الكمبيوتر من النوع B الغليكوزيلاتي تتحول إلى أجهزة كمبيوتر من النوع A الغليكوزيلاتي أثناء الأكسدة القلوية دون انقسام وحدة السكر. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن تكوين روابط إيثر إضافية بأجهزة الكمبيوتر من النوع A.

3. المواد والطرق

تم إجراء جمع المواد النباتية ومعالجتها واستخراجها ، بالإضافة إلى الأكسدة عند درجة الحموضة 1 {{1 0} ، كما ورد سابقًا [13]. احتوت الدراسة الأولية على عينة واحدة 0 2 ، حللنا منها 55 عينة أخرى (الجدول S8). بالنسبة للأكسدة الهوائية ، تم أكسدة 2 0 ميكرولتر من كل مستخلص باستخدام 18 {{4 0} uL من درجة الحموضة 1 {{6 0}} عازلة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم إيقاف الأكسدة بإضافة 100 ميكرولتر من 0.6 في المائة من HCOOH المائي. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 280 ميكرولتر من الماء إلى 20 ميكرولتر من المادة الأولية غير المؤكسدة قبل التحليل من أجل الحصول على الحجم النهائي 300 ميكرولتر لكل من العينات المؤكسدة وغير المؤكسدة. تم إجراء تحليل الطيف الكتلي عالي الدقة بواسطة UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS / MS. تتكون الأداة من نظام Acquity UPLC (Waters Corp. ، ميلفورد ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى جانب مطياف الكتلة رباعي القطب (QExactiveTM ، Thermo Fisher Scientific GmbH ، بريمن ، ألمانيا). كان العمود المستخدم عبارة عن عمود Acquity UPLC BEH Phenyl (2.1 × 100 مم ، 1.7 um ، Waters Corp. ، Wexford ، Ireland). كانت العناصر المذابة عبارة عن=أسيتونيتريل وباء =0. تم ​​استخدام 1 في المائة من HCOOH. تم استخدام معدل تدفق قدره 0.5 مل دقيقة -1 ، وكان ملف تعريف الشطف كالتالي: 0-0. 5 دقائق ، 0.1 بالمائة أ في ب (متوازنة) ؛ 0. 5-5 دقيقة ، 0. 1-30 بالمائة أ في ب (التدرج الخطي) ؛ 5-6 دقيقة ، 30 بالمائة {{44} } النسبة المئوية أ في ب (التدرج الخطي) ؛ 6-6. دقيقة واحدة ، 35-90 في المائة أ في ب (التدرج الخطي) ؛ 6 - 1-9. 5 دقائق، غسيل العمود وإعادة الموازنة. كان حجم الحقن 5 ميكرولتر. تم تسجيل بيانات UV （λ =190-500 نانومتر） و MS طوال التحليل. تم استخدام التأين السالب في مصدر ESI ساخن بجهد رش يبلغ -3. 0 كيلو فولت ، معدل تدفق غاز الغمد (N2) 60 ، معدل تدفق الغاز الإضافي (N2) 20 ، معدل تدفق غاز المسح 0 ، درجة حرارة الشعيرات الدموية التي تزيد عن 380 درجة والتفكك الناجم عن الاصطدام (CID) من 30 فولت. بالنسبة لمسح MS كامل ، كان النطاق الكتلي للمدار m / z 150-2250 ، والدقة 35 ، 000 ، والتحكم التلقائي في الكسب 3 × 10 *. بالنسبة لتحليلات MS / MS ، وبالتحديد dd-MS2 (TopN) ، كانت المعلمات كما يلي: TopN 3؛ طاقات الاصطدام المعيارية المتدرجة 20 و 50 و 80 فولت ، والقرار 17500 ، والتحكم التلقائي في الكسب 1 × 105. تم إجراء المعايرة بواسطة Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت معالجة البيانات باستخدام برنامج Thermo Xcalibur Oral Browser (الإصدار 3.0.63 ، Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). كما تم الحصول على العينات المؤكسدة باستخدام محلول كربونات الصوديوم (pH 10) ، أيونات الكتلة المكونة للصوديوم مع حمض الفورميك أثناء تحليل UHPLC-MS / MS. لذلك ، في بداية كل مخطط كروماتوجرام أيوني إجمالي للعينات المؤكسدة ، تم اكتشاف ذروة قوية لمجموعات فورمات الصوديوم (الجدول S9). تم اكتشاف النمط بسهولة ولم يؤثر على تحليل المناطق المحمية. يتم عرض أيونات شظية MS / MS لأوليجومرات PA الصغيرة في الجدول S10.

4 - نتائج

في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل تركيبة PA لـ 55 مستخلصًا نباتيًا قبل وبعد الأكسدة القلوية بواسطة UHPLC-MS / MS عالي الدقة (الجدول S8). احتوت هياكل PA الطبيعية على أجهزة كمبيوتر من النوع A و B ، وأجهزة PD ، وخلائط PC / PD بالإضافة إلى تلك المخصصة. كانت تركيبات PA معقدة ، وكانت هناك حاجة إلى MS عالية الدقة لقياس الكتل الدقيقة والصيغ الجزيئية المقابلة للمناطق المحمية المتنوعة. كانت أجهزة الكمبيوتر من النوع B في المستخلصات النباتية المختلفة مستقرة إلى حد ما ولم تظهر أي تعديل أو تعديل طفيف بسبب الأكسدة القلوية. بالنسبة لبعض العينات ، اكتشفنا التفاعلات الجزيئية لأجهزة الكمبيوتر التي تنتج روابط إيثر من النوع A. كانت أجهزة الكمبيوتر من النوع A أيضًا مستقرة إلى حد ما مع عدم وجود تعديل أو تعديل طفيف ، ولكن في بعض النباتات ، تم اكتشاف تكوين روابط إيثر إضافية. كانت المستخلصات النباتية التي تحتوي على وحدات PD في المناطق المحمية (إما PDs نقية أو مخاليط PC / PD) أكثر تفاعلية. بعد الأكسدة القلوية ، لم يعد يتم اكتشاف هذه المناطق المحمية أو منتجات الأكسدة الخاصة بها بواسطة MSeven على الرغم من وجود نوع مختلف و / أو حدبة PA المتأخرة لا تزال تكتشف بواسطة الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. من المحتمل أن تكون التفاعلات بين الجزيئات بين المناطق المحمية قد عدلت هذه المناطق المحمية بحيث لا يتم اكتشافها في ظل ظروف ESI-MS القياسية. أظهرت الدراسات السابقة أن هذه المناطق المحمية المعدلة لا يمكن دراستها إما عن طريق طرق التحلل. لذلك ، ستكون هناك حاجة إلى طريقة تحليلية جديدة لتحديدها وتوصيفها. كانت المناطق المحمية بالغالويل مستقرة نسبيًا تحت الأكسدة القلوية إذا كانت قائمة على الكمبيوتر الشخصي ، ولكن تم تشكيل روابط إيثر إضافية تدعم تحويل المناطق المحمية من النوع B المرالي إلى المناطق المحمية من النوع A المرارة. كانت المناطق المحمية التي تحتوي على مجموعتين أو أكثر من مجموعات الغالويل أكثر تفاعلًا من تلك التي تحتوي على مجموعة واحدة فقط. كانت مخاليط PC / PD و PDs المطلية بالغالف أكثر تفاعلًا وتفاعلت بشكل مشابه مع تلك التي لا تحتوي على مواد صفراء. ومع ذلك ، يجب ملاحظة أن التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات لم تكن إقصائية ، ويمكن أن تحدث هذه التفاعلات في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، أثرت مصفوفة النبات والمركبات الأخرى الموجودة في هذه التفاعلات.