Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides تحفز موت الخلايا المبرمج في Eca ‑ 109 خلايا عبر المسار المعتمد على الميتوكوندريا

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

تشانغشوانغ فو ، وجينيو لي ، وأديلا أيبير ، وليجي شيا ، ويي يانغ ، وكيويان تشين ، وجي إل في ، وشينوي وانغ ، وجينياو لي

الملخص

Cistanche tubulosaله وظائف بيولوجية مختلفة. في هذه الدراسة ، تم فحص التأثير المضاد للأورام للجليكوسيدات الفينيليثانية القابلة للذوبان في الماء من C. tubulosa (CTPG-W) على سرطان المريء. تمت معالجة خلايا Eca -109 باستخدام CTPG-W وتم قياس صلاحية الخلية بمقايسة MTT. تم تحليل موت الخلايا المبرمج ، ودورة الخلية ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) ، وأنواع الأكسجين التفاعلي عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم الكشف عن مستويات البروتينات في مسارات موت الخلايا المبرمج عن طريق تحليل لطخة غربية. تم تحديد أن CTPG-W قلل بشكل كبير من صلاحية خلايا Eca -109 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية. بعد علاج CTPG-W ، انخفض Δψm من Eca -109 بشكل ملحوظ ، وهو ما يرتبط بالمستويات المنتظمة من سرطان الغدد الليمفاوية B-cell -2 (Bcl -2) - المرتبط X والمستويات غير المنظمة من Bcl -2. نتيجة لذلك ، تمت زيادة مستويات السيتوكروم c و c-Jun NH 2- الكيناز الطرفي ، مما أدى إلى تنظيم مستويات بوليميراز البولي المشقوق (ADP-ribose) والبوليميراز المشقوق -3 ، {{18} } و -9 ، ولكن ليس caspase -8. في المقابل ، أظهرت مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا Eca -109 تغيرات ملحوظة. أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG-W يسبب موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 من خلال مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

مقدمة

يعد سرطان المريء أحد أكثر أنواع السرطانات شيوعًا حيث يحتل المرتبة 11 من حيث أعلى معدل مراضة وسادس أعلى معدل للوفيات على مستوى العالم وتسبب في وفاة 439 تقريبًا 000 في عام 2015 (1). يختلف معدل الإصابة بسرطان المريء بشكل ملحوظ بين المناطق المختلفة ، حيث أظهر شرق آسيا وشرق وجنوب إفريقيا أعلى معدلات الإصابة وأظهر غرب إفريقيا أدنى المعدلات في عام 2012 (1،2). في الصين ، بلغت حالات سرطان المريء والوفيات المقدرة 477 و 000 و 375 000 على التوالي في عام 2015 (3). على الرغم من انخفاض معدل الإصابة بسرطان المريء في البلدان ذات المؤشر الاجتماعي الديموغرافي المتوسط ​​والعالي المتوسط ​​بين عامي 2005 و 2015 ، إلا أن معدل الوفيات لا يزال مرتفعًا بسبب سوء التشخيص (1،4). تم استخدام الجمع بين الاستئصال الجراحي والعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي لعلاج سرطان المريء ، ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن بقاء معدل البقاء على قيد الحياة بين عامي 2003 و 2014 5- عام<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">

تم استخدام طب الأعشاب الصيني التقليدي (CHM) لعلاج أنواع مختلفة من السرطان ، بما في ذلك سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (6) وسرطان القولون والمستقيم (7) وسرطان الخلايا الكبدية (8). في الآونة الأخيرة ، أفادت التجارب السريرية أن الجمع بين CHM والعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي لم يظهر فقط عددًا من الفوائد على جودة الحياة وتخفيف الآثار الجانبية الناجمة عن العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي (9،10) ، ولكن أيضًا أدى إلى تحسين معدل بقاء المرضى. مع سرطان الخلايا غير الصغيرة في الرئة أو الكبد أو المعدة أو القولون والمستقيم أو البلعوم الأنفي أو سرطان عنق الرحم (9). ومع ذلك ، هناك أدلة متضاربة بشأن فعالية علاج CHM على سرطان المريء (10،11). حددت العديد من الدراسات أن عددًا من الأدوية أو المكونات العشبية يمكن أن تمنع نمو خلايا سرطان المريء في المختبر وفي الجسم الحي ، بما في ذلك Andrographis paniculata (12،13) و Daikenchuto (14) و icariin (15) و Rosa Roxburghii Tratt و Fagopyrum Cymosum (16) ، Jaridonin (17) ، Marsdenia tenacissima (18) ، OP16 (رواية ent-kaurene diterpenoid) (19) ، Qigesan (20) و Tonglian ديكوتيون (21). Cistanche هو نوع من CHM ويمارس وظائف بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك مضادات الأكسدة ومضادات الالتهاب والحماية العصبية (22 ، 23). أظهرت دراستنا السابقة ذلكCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) يمكن أن يثبط نمو خلايا الورم الميلانيني B 16- F10 في المختبر وفي الجسم الحي (24). ومع ذلك ، فإن ضعف قابلية الذوبان في الماء لـ CTPG المستخدم سابقًا يحد من تطوير الدواء (24). لذلك ، تم استخدام CTPG القابل للذوبان في الماء (CTPG-W) وتم التحقيق في التأثير المضاد للأورام على خلايا سرطان المريء (Eca -109). تم تحديد أن CTPG-W يمكن أن يمنع اعتمادًا على الجرعة قابلية خلايا Eca -109 للحياة من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

المواد والأساليب الحيوانات.

تم شراء أنثى C57BL / 6 فئران (6-8 أسبوعًا ، 25 جم تقريبًا) من مركز أبحاث حيوانات المختبر في بكين (بكين ، الصين) وتم وضعها في درجة حرارة مضبوطة (25 درجة مئوية) ، ودورة خفيفة (12 / 12) مرفق الحيوان بجامعة شينجيانغ (أورومتشي ، الصين). حصلت جميع الحيوانات على مياه وغذاء خالٍ من مسببات الأمراض.

خط الخلية والثقافة. تم الحفاظ على خط خلية سرطان المريء البشري (Eca -109) بواسطة مختبر Xinjiang الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية (كلية علوم وتكنولوجيا الحياة ، جامعة شينجيانغ ، أورومتشي ، الصين) وتم تربيته في RPMI {{1} } متوسط ​​(Gibco ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc. ، Waltham ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS ؛ MRC ، EN MOASAI Biological Technology Co. ، Ltd ، Jiangsu ، الصين) ، 1 بالمائة L - الجلوتامين (100 ملم) ، 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). تم شراء CTPG-W (رقم القط SGJG2 0 170410) من Shanghai Upbio Tech Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين). تم تأهيل المركبات الرئيسية لـ CTPG وقياسها بواسطة HPLC وفقًا لدراستنا السابقة (24). باختصار ، تم إجراء HPLC على عمود ZORBAX SB-C18 (250 × 4.6 مم ؛ 5 ميكرومتر) عند 30 درجة مئوية وتم التصفية التتابعية باستخدام محلول حمض الفورميك بنسبة 0.2 بالمائة وتدرج ميثانول بدءًا من 23 بالمائة ، حيث تمت إضافة 1 مل كل دقيقة لمدة 45 دقيقة حتى تصل إلى 31 بالمائة. تم حقن ما مجموعه 10 ميكرولتر من العينة وكشفها عند 330 نانومتر. تم شراء معيار echinacoside من Shanghai Baoban Biotech Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين) ، وتم شراء معيار acteoside من Sigma-Aldrich (Merck KGaA ، Darmstadt ، ألمانيا). تم استخدام المعايير لتحليل مكونات CTPG-W.

فحص MTT. تم قياس تكاثر الخلايا بمقايسة MTT. تم تلقيح خلايا Eca {0} في 96- ألواح بئر بكثافة 5x1 0 3 خلايا في 1 0 0 ميكرولتر RPMI {{5 }} متوسط ​​/ جيد ومُزرع عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ثم معالجته بتركيزات مختلفة (0 ، 200 ، 400 ، 600 ، 800 ميكروغرام / مل) من CTPG-W أو 0.4 في المائة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 24 ، 48 و 72 ساعة. تم استخدام DMSO كعنصر تحكم في المذيبات (800 ميكروغرام / مل CTPG-W تحتوي على 0.4 بالمائة DMSO). تم استخدام سيسبلاتين (20 ميكروغرام / مل) كعنصر تحكم إيجابي. بعد ذلك ، تم التخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي عند 225 × جم لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ، وأضيف 100 ميكرولتر من محلول MTT (0.5 مجم / مل في وسط RPMI -1640 بدون FBS) إلى كل بئر وحضنت عند 37 درجة مئوية. لمدة 3 ساعات. تم إذابة بلورات فورمازان المتكونة في 200 ميكرولتر من DMSO. تم قياس قيم الكثافة الضوئية بطول موجة 490 نانومتر بواسطة 96- قارئ صفيح دقيق (Bio-Rad Laboratories، Inc.، Hercules، CA، USA). تم حساب صلاحية الخلية النسبية وفقًا للصيغة: قابلية بقاء الخلية (نسبة مئوية)=(معالجة OD / معالجة OD غير معالجة) × 100 بالمائة. لوحظ التشكل لخلايا Eca ‑ 109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (تكبير ، x200) (Nikon Eclipse Ti E ؛ شركة Nikon ، طوكيو ، اليابان).

لتكاثر الخلايا الطحالية ، تم التخلص من الفئران C57BL / 6 عن طريق خلع عنق الرحم ، وتم عزل الطحال. تم عمل المعلق أحادي الخلية وزُرعت الخلايا الطحالية في 96- ألواح بئر بكثافة 1 × 1 0 5 خلايا / بئر في وسط 100 ميكرولتر من RPMI -1640 ، ثم تمت معالجتها بتركيزات مختلفة (0 ، 200 ، 400 ، 600 ، 800 ميكروغرام / مل) من CTPG-W لمدة 24 و 48 و 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تم قياس تكاثر الخلايا الطحالية بواسطة مقايسة MTT ، وفقًا للبروتوكول المذكور أعلاه. مؤشر التحفيز=ODtreated / ODuntreated.

قياس موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية. تمت زراعة خلايا Eca {0} في أطباق بحجم 6 0 مم بكثافة 2.5 × 1 0 5 خلايا / طبق لمدة 24 ساعة وتم معالجتها بتركيزات مختلفة ({{31} } ، 2 0 0 ، 400 ، 600 ، 800 ميكروغرام / مل) من CTPG-W أو 0.4 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تم جمع الخلايا وتلطيخها باستخدام مجموعة أدوات اكتشاف موت الخلايا المبرمج (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co. ، Ltd. ، شنغهاي ، الصين) ، وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم جمع العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur؛ BD Biosciences، Franklin Lakes، NJ، USA) وتحليلها بواسطة FlowJo 7.6 (Tree Star، Inc.، Ashland، OR، USA). لتحليل تأثير CTPG-W على دورة الخلية ، تم زرع 2.5 × 105 من خلايا Eca -109 في أطباق زراعة 60 مم وتم معالجتها باستخدام CTPG-W (0 ، 100 ، 200 ، و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.4 في المئة DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. تم حصاد جميع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام PBS المثلج (Gibco ؛ Thermo Fisher Scientific ، Inc.) ، ثم تم تثبيتها في 70 بالمائة من الإيثانول المثلج - البارد عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS المثلج ، تم تعليق الخلايا في محلول تلطيخ 300 ميكرولتر PI / RNase (BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم تحليل توزيع دورة الخلية باستخدام برنامج ModFit LT 3.0 عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur).

تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). لتحليل Δψm ، تمت معالجة خلايا Eca {0} باستخدام CTPG-W (0 ، 4 0 0 ، 600 و 800 ميكروغرام / مل) أو 0.4 بالمائة DMSO لمدة 24 h عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، وملطخة بمجموعة الفحص المحتملة لغشاء الميتوكوندريا باستخدام JC -1 (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية ، شنغهاي ، الصين) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة ، لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية . بعد الغسيل مرتين باستخدام محلول الغسيل JC -1 (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية) ، تم تعليق العينات باستخدام محلول غسيل 300 ميكرولتر JC 1 وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur). ولوحظ أيضًا تألق صبغة JC 1 في خلايا Eca ‑ 109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (التكبير ، × 200 ؛ نيكون Eclipse Ti - E). لتحليل ROS ، تمت معالجة خلايا Eca -109 باستخدام CTPG-W (0 ، 400 ، 600 ، و 800 ميكروغرام / مل) لمدة 2 و 4 و 6 و 12 و 24 ساعة ، وتم تلوينها بأنواع الأكسجين التفاعلية طقم الفحص (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة ، لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد - بارد ، تم جمع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur) وتحليلها بواسطة برنامج FlowJo 7.6.

2،2 ‑ ثنائي فينيل 1 بيكريل هيدرازيل (DPPH) نشاط كسح جذري. تم تحديد نشاط مسح الجذور الحرة لـ CTPG-W بمقايسة الجذور الحرة DPPH وفقًا للبروتوكول المنشور مع تعديل طفيف ، حيث تم استبدال الميثانول بالإيثانول لإذابة DPPH (25 ، 26). لقياسات الحالة المستقرة ، تم خلط 15 0 ميكرولتر DPPH (1 0 0 مليمول / لتر) في الإيثانول بتركيزات مختلفة من CTPG-W (25 ، 50 ، 75 ، 100 ، 250 ، 300 ، 400 ، 500 ، و 600 ميكروغرام / مل) في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ، وحضنت في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم الكشف عن الامتصاصية عند 517 نانومتر في وجود وغياب CTPG-W. تم استخدام ما مجموعه 50 ميكرولتر من فيتامين ج كعنصر تحكم إيجابي. تم حساب نشاط الكسح الجذري لـ DPPH باستخدام الصيغة: الكسح (النسبة المئوية)=[1- (A sample-Ablank) / A0] x100 ، حيث Ablank هو الامتصاص لعنصر التحكم (بدون DPPH) ، العينة هي امتصاص العينة و A0 هي امتصاص PBS مع DPPH.

تحليل لطخة غربية. تمت معالجة خلايا Eca {0} باستخدام CTPG-W (0 ، 200 ، 600 ميكروغرام / مل) أو 0.4 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. الغسل التالي مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم فصل الخلايا في محلول تحلل ترسيب مناعي إشعاعي (Beijing ComWin Biotech Co. ، Ltd. ، بكين ، الصين) لمدة 20 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 10 ، 000 xg لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، تم جمع المواد الطافية واكتشاف تركيزات البروتين باستخدام مجموعة حمض bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific ، Inc.) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم إجراء تحليل اللطخة الغربية وفقًا لوصفنا السابق (24). الأجسام المضادة ضد caspase -7 (cat. no. D120077)، caspase -8 (cat. no. D155240)، caspase -9 (cat. no. D220078)، B-cell lymphoma { {24}} (Bcl -2) - مرتبط X (Bax) (cat. no. D220073) و Bcl -2 (cat. no. D260117) ، وبيروكسيداز IgG-horseradish peroxidase المضاد للفأر (HRP ) (cat. no. D111050) و Anti-rabbit IgG-HRP (cat. no. D110058) تم شراؤها من BBI Life Sciences (شنغهاي ، الصين). تم شراء الأجسام المضادة ضد caspase -3 (cat. no. E-AB -10050) و caspase النشط -3 (cat. no. E-AB -22115) من Elabscience ( ووهان ، الصين). الأجسام المضادة الأخرى ضد الكاسبيز -7 (القط رقم 9492) ، بولي (ADP-الريبوز) بوليميريز (PARP) (القط رقم 9542) ، السيتوكروم ج (القط رقم AC909) ، ج-جون NH { تم الحصول على {48}} كيناز طرفي (JNK) (القط رقم 9252S) و -اكتين (رقم 58169) من شركة Cell Signaling Technology، Inc. (Danvers، MA، USA). تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية والثانوية عند 1: 1 ، 000. تم تحضين الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية طوال الليل وتم تحضين الأجسام المضادة الثانوية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

تم الكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام مجموعة مقايسة التلألؤ الكيميائي المحسن (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تحليل احصائي. تم حساب الدلالة الإحصائية من خلال تحليل أحادي الاتجاه للتباين مع اختبار Tukey اللاحق وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج GraphPad Prism 5. 0 (برنامج GraphPad ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) بين مجموعات المعالجة والمراقبة. تم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري. ص<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG)

نتائج

يمنع CTPG-W نمو خلايا Eca ‑ 109. تم تأهيل مكونات CTPG-W وتحديد كميتها بواسطة HPLC (الشكل 1) ، والتي تمت مقارنتها بمعايير إشيناكوسيد وأكتيوسيد. وفقًا لأوقات الاحتفاظ الذروة ومناطق الذروة ، احتوت CTPG-W على 39.16 في المائة من إشنكوسايد و 2.44 في المائة من أكتيوسيد. أولاً ، تم تحديد تأثير CTPG-W على صلاحية خلايا Eca -109 بمقايسة MTT. تم إذابة CTPG-W في DMSO عند 200 مجم / مل وتم تخفيفه باستخدام وسط RPMI -1640 المحتوي على 10 بالمائة من FBS المعطل بالحرارة لتركيزات محددة. تمت معالجة خلايا Eca -109 باستخدام CTPG-W وتم تحليل صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT في النقاط الزمنية المحددة. قلل علاج CTPG-W بشكل كبير من صلاحية خلايا Eca -109 بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">

CTPG-W يستحث موت الخلايا المبرمج في خلايا Eca ‑ 109. للتحقق مما إذا كان CTPG-W يثبط نمو خلايا Eca -109 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج أو النخر ، تم علاج الخلايا بتركيزات مختلفة من CTPG-W. بعد 24 ساعة ، تم اكتشاف موت الخلايا المبرمج ونخر خلايا Eca -109 مع تلطيخ Annexin V / PI. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، فإن خلايا أنكسين V- / PI plus كانت بوابات كخلايا نخرية ، وخلايا أنكسين V plus / PI plus و Annexin V plus / PI كانت بوابات كخلايا موت الخلايا المبرمج. تسبب CTPG-W بشكل أساسي في موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 بطريقة تعتمد على الجرعة ، على الرغم من أن خلايا Eca النخرية -109 زادت أيضًا بشكل ملحوظ تحت علاج 600 و 800 ميكروغرام / مل من CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">

CTPG-W يحث على إيقاف دورة الخلية في المرحلة S في Eca ‑ 1 0 9 خلايا. سيؤدي اضطراب دورة الخلايا السرطانية إلى قمع نمو الخلايا وتعزيز موت الخلايا المبرمج (27). تم اكتشاف توزيع دورة الخلية في خلايا Eca -109 مع تلطيخ PI بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة. لوحظ أن الخلايا في المرحلة S زادت وأن الخلايا في مرحلتي G0 / G1 أشارت إلى انخفاض كبير بشكل عام في علاج CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">

يقلل CTPG ‑ W ميكرومتر ويحث على إطلاق السيتوكروم ج. يمكن أن يحدث موت الخلايا المبرمج عن طريق مسار يعتمد على الميتوكوندريا (28 ، 29). يلعب الأعضاء المؤيدون والمضادون للاستماتة من عائلة بروتين BCL -2 أدوارًا مهمة في تنظيم سلامة غشاء الميتوكوندريا (30،31). بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة ، تم تقييم ميكرومتر باستخدام تلطيخ JC 1. سوف يتفكك مجموع JC ‑ 1 (تم الكشف عن مضان أحمر في FL 2) إلى مونومر (تم الكشف عن مضان أخضر في FL -1) عندما يتم تقليل Δψm (32). كما هو موضح في الشكل 5 أ ، زادت ترددات خلايا FL -1 بالإضافة إلى FL -2- / plus بشكل ملحوظ بطريقة تعتمد على الجرعة ، مما يشير إلى أن ميكرومتر من خلايا Eca ‑ 109 انخفضت. كما لوحظت تغيرات التألق في خلايا Eca ‑ 109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (الشكل 5 ب). مع زيادة تركيزات CTPG-W ، انخفض التألق الأحمر وزاد التألق الأخضر ، وهو ما يتوافق مع البيانات من قياس التدفق الخلوي. وقد لوحظ أيضًا أن مستوى السيتوكروم ج في العصارة الخلوية قد زاد بشكل ملحوظ (الشكل 5 ج) ، نتيجة لانخفاض ميكرومتر. هذا يعزز النتيجة المستخلصة من زيادة عدد خلايا FL -1 زائد FL -2- / plus التي انخفضت ميكرومتر نتيجة لعلاج CTPG-W. تم الإبلاغ عن أن JNK يمكن أن ينظم تنشيط عائلة البروتين BCL -2 مما يتسبب في إطلاق السيتوكروم ج (33-35). تم تحديد أيضًا أن مستوى JNK قد تم تنظيمه بشكل ملحوظ بعد علاج CTPG-W (الشكل 5C). أشارت النتائج إلى أن CTPG-W قد يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 من خلال مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

تأثير CTPG-W على توليد ROS داخل الخلايا. يمكن أن يقلل ROS ميكرومتر للحث على موت الخلايا المبرمج (36). للتحقق مما إذا كان CTPG-W يمكنه زيادة إنتاج ROS ، تمت معالجة خلايا Eca -109 بتركيزات مختلفة من CTPG-W. تم جمع الخلايا في النقاط الزمنية المحددة وملطخة بـ DCFH-DA. تم تحديد إنتاج ROS داخل الخلايا في خلايا Eca -109 عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما هو موضح في الشكل 6 أ ، أدى 800 ميكروغرام / مل من CTPG-W إلى زيادة إنتاج ROS بشكل ملحوظ من 2-6 ساعة وانخفض من 12-24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، أدى 400 ميكروغرام / مل من CTPG-W إلى زيادة إنتاج ROS بشكل ملحوظ من 12-24 ساعة. علاوة على ذلك ، فإن 200 ميكروغرام / مل من CTPG-W لا يغير بشكل ملحوظ إنتاج ROS. قد تترافق التغييرات الديناميكية في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مع موت الخلايا المبرمج Eca -109. تم تحديد أيضًا أن CTPG-W له نشاط تنظيف الجذور الحرة (الشكل 6 ب) ، والذي قد يترافق مع انخفاض إنتاج ROS في خلايا Eca -109 المعالجة بـ 800 ميكروغرام / مل من CTPG-W بعد 12 ساعة.

CTPG ‑ W ينظم نشاط caspase ‑ 3 و caspase ‑ 7 و caspase ‑ 9 و PARP. يمكن أن يؤدي إطلاق السيتوكروم ج بسبب تقليل ميكرومتر إلى تنشيط إنزيم كاسباس للحث على موت الخلايا المبرمج (29،30،37). بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة ، تم اكتشاف تنشيط caspase -3 و 7 و 8 و 9 و PARP من خلال تحليل لطخة ويسترن. بالمقارنة مع عنصر التحكم ، فإن مستويات الكاسبيز المشقوق -9 ، و كاسباس المشقوق -7 ، و كاسباس المشقوق -3 ، و المشقوق- PARP ، ولكن ليس مستويات الكاسبيز المشقوق {{ 20}} ، تم تنظيمها بواسطة علاج CTPG بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 7). أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG-W خفض ميكرومتر وعزز إطلاق السيتوكروم ج لتنشيط الكاسبيسات التي تحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109.

مستخلص سيستانش توبولوسا

مناقشة

CHM التقليدية يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية للمريء من خلال مسارات مختلفة ، بما في ذلك مستقبلات الموت الخارجي ، ومسارات الإجهاد الشبكي الداخلي للميتوكوندريا والميتوكوندريا الداخلية (29). أظهرت دراستنا السابقة أن CTPG ، باعتباره المكون الرئيسي لـ C. tubulosa ، يثبط نمو خلايا الورم الميلانيني B 16- F1 0 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا (24). في هذه الدراسة ، تم التحقيق في التأثير المضاد للورم لـ CTPG-W على خلايا Eca -109 وتقرر أن CTPG-W يثبط نمو خلايا Eca -109 ، والاستماتة المستحثة ، وتوقف دورة الخلية ، انخفاض ميكرومتر ، وزيادة إطلاق السيتوكروم ج وتنشيط الكاسبيسات. يمكن أن يؤدي CTPG و CTPG-W إلى موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية في الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، تختلف الآليات الدقيقة بسبب المكونات المختلفة لـ CTPG (26.64 بالمائة إشنكوسايد ، 10.19 بالمائة أكتيوسيد ، 1.71 بالمائة إيزوكتيوسيد) و CTPG-W (39.16 بالمائة إشنكوسايد و 2.44 بالمائة أكتيوسيد). ألقت CTPG القبض على خلايا B 16- F10 في مراحل G0 / G1 ، لكن CTPG-W ألقت القبض على خلايا Eca -109 في المرحلة S (24). تمت زيادة إنتاج ROS اعتمادًا على الجرعة بواسطة CTPG ، لكنه أشار إلى حدوث تغيير بطريقة تعتمد على الوقت بجرعة عالية من CTPG-W ، والتي زادت بشكل ملحوظ في بداية علاج CTPG-W (2-6 ساعة) و انخفض بشكل ملحوظ بعد 12 ساعة ، مقارنة مع السيطرة. أحد الأسباب المحتملة هو أن المكون الرئيسي لـ CTPG-W هو إشنكوسايد. أفاد عدد من الدراسات أن إشنكوسايد يمكن أن يثبط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وموت الخلايا المبرمج الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية لممارسة آثاره الوقائية العصبية ومكافحة الشيخوخة (38-40). وبالمثل ، لوحظ نشاط إزالة الجذور الحرة في هذه الدراسة. لذلك ، تم التكهن بأن بعض المكونات ، بما في ذلك verbascoside و iso-verbascoside و salidroside بجرعة عالية من CTPG-W قد تحفز على الفور توليد ROS للتسبب في موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 (41،42) ، ثم تم مسح ROS بواسطة echinacoside. سبب آخر محتمل للاختلافات في إنتاج ROS بواسطة CTPG و CTPG-W هو أنه تم استخدام خطوط خلوية مختلفة في هذه الدراسة ودراسة سابقة (24). أفاد Dong et al (43) أن إشنكوسايد يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية SW480 من خلال توليد أضرار مؤكسدة للحمض النووي دون زيادة مستويات ROS.

خفضت معالجة CTPG-W ميكرومتر وتسبب في إطلاق السيتوكروم ج ، مما يعزز انقسام الكاسبيز -9 (28). باستمرار ، تم تنظيم مستويات الكاسبيز المشقوق -9 بواسطة علاج CTPG-W. بعد ذلك ، يمكن لـ caspase النشط -9 تنشيط caspase -3 للحث على موت الخلايا المبرمج (44). تم أيضًا تنظيم مستويات الكاسبيز المشقوق -3 بواسطة علاج CTPG-W. ومع ذلك ، لم يتم تنشيط caspase -8 بواسطة CTPG-W ، مما يشير إلى أن مسار مستقبلات الموت الخارجي لم يكن متورطًا في موت الخلايا المبرمج الناجم عن CTPG-W. تشير هذه الملاحظات إلى أن CTPG-W يحث على موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 من خلال تنشيط مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

تؤدي PARP أدوارًا مهمة في الاستقرار الجيني ويمكن تشققها بواسطة الكاسبيسات النشطة ، خاصة الكاسبيز -3 و -7 (45). تم تحديد أن علاج CTPG-W ينشط الكاسبيز -3 و -7 ، مما قد يشق PARP لمنع إصلاح الحمض النووي ويسبب موت الخلايا المبرمج.

يعمل CTPG-W أيضًا على منع نمو خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية -7404 حسب الجرعة والوقت (بيانات غير منشورة). على الرغم من أن CTPG-W يثبط نمو خلايا Eca -109 و BEL -7404 ، فإنه يعزز تكاثر الخلايا الطحالية ، والتي قد تكون بسبب محتوى السكريات المتعددة (حوالي 50 بالمائة) في CTPG-W (46 ). وبالمثل ، أفاد عدد من الدراسات أن السكريات يمكن أن تعزز تكاثر الخلايا الطحالية (46-49). في نموذج الفأر ، تم تحديد أن CTPG-W زاد بشكل كبير من مؤشر الطحال ، مقارنة بمجموعة التحكم ، لكنه لم يؤثر على وزن الجسم ومؤشرات الأعضاء الأخرى بما في ذلك القلب والكبد والكلى والرئة (بيانات غير منشورة) ، مما يشير إلى أن CTPG-W ليس له تأثير سام للخلايا على الخلايا الطبيعية.

بشكل جماعي ، أشارت البيانات إلى أن CTPG-W يثبط نمو خلايا Eca -109 عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

فوائد cistanche: مكافحة موت الخلايا المبرمج

شكر وتقدير

الكتاب يود أن يشكر الدكتور جيانهوا يانغ (كلية بايلور للطب) لتلميع المخطوطة.

التمويل

تم دعم هذه الدراسة من خلال الخطة الخمسية الثالثة عشرة لمشروع مناقصة بيولوجيا الانضباط الأساسي (المنحة رقم 17SDKD0202) ، وجامعة شينجيانغ للمعلمين والمختبر الرئيسي لتطبيق وتنظيم التنوع البيولوجي الخاص بالبيئة في شينجيانغ (المنحة رقم XJTSWZ -2017-04) إلى JL والمنحة الصينية الوطنية للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 31760260) إلى XW.

توافر البيانات والمواد

البيانات والمواد المستخدمة والمحللة خلال الدراسة الحالية متاحة من المؤلف المقابل بناء على طلب معقول.

مساهمات المؤلفين

أجرى CF و AA و YY و QC التجارب. حللت LX و JLv و XW البيانات والأرقام المعدة. صمم JinyuL و JinyaoL المشروع وكتبوا المخطوطة.

موافقة الأخلاق والموافقة على المشاركة

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات في مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية (الموافقة ، رقم BRGE-AE001 ، جامعة شينجيانغ).

موافقة المريض للنشر

لا ينطبق.

تضارب المصالح

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

مراجع

1. Wu CR و Lin HC و Su MH: انعكاس بواسطة مائيمقتطفات من Cistanche tubulosaمن العجز السلوكي في نموذج الفئران الشبيه بمرض الزهايمر: الصلة بترسب الأميلويد ووظيفة الناقل العصبي المركزي. BMC Complement Altern Med 14: 202 ، 2014.

2. Li J و Aspire A و Gao L و Huo S و Luo J و Zhang F:جليكوسيدات فينيلثانويد من Cistanche tubulosaيمنع نمو الخلايا B 16- F10 في كل من المختبر والحي عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج عبر المسار المعتمد على الميتوكوندريا. J كانسر 7: 1877-1887 ، 2016.

3. Brand-Williams W و Culver ME و Berset C: استخدام طريقة الجذور الحرة لتقييم نشاط مضادات الأكسدة. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30 ، 1995.

   ---