النشاط الاستروجين للجليكوسيدات من Cistanche Deserticola كمستقبلات هرمون الاستروجين المساعدة في المختبر

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song و Wen-Lan Li و Xiang-Ming Sun و Yang Hu و Jing-Xin Ding و Yu-Bin Ji و Jing-Ya Wang

المقدمة

Cistanche Deserticola("Rou Cong Rong" باللغة الصينية) ، وهو دواء عشبي صيني تقليدي تم تسجيله لأول مرة في ShenNongBenCaoJing ، وقد تم استخدامه لعلاج نقص الكلى والعجز الجنسي والإمساك الخرف ونقص الدم لآلاف السنين. يتم توزيعه بشكل أساسي في المناطق الصحراوية في شمال غرب الصين ، مثل قانسو وشينجيانغ. أظهرت الأبحاث الصيدلانية الحديثة أن بكتيريا المطثية العسيرة يمكن أن تقدم وظائف طبية واسعة ، مثل تنظيم الهرمونات ، وتنظيم المناعة ، ومضادات الأكسدة ، والحماية العصبية ، ومضاد الالتهاب ، والنشاط الاستروجين. المكونات النشطة الرئيسية مع تأثيرات بيولوجية مختلفة. [5،6]

مستقبلات الأستروجين‑ (ERs‑) و ER هي الأنواع الفرعية من ERs التي يمكن أن تنظم الوظائف الفسيولوجية. يمكن أن تنظم هذه البروتينات نسخ الجينات المستهدفة عن طريق الارتباط بالتسلسلات التنظيمية للحمض النووي المرتبطة بها في نواة الخلية. يتم التعبير عن كلا النوعين الفرعيين بشكل ملحوظ في القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي المركزي. [8،9] يوجد ER بشكل رئيسي في الغدة الثديية والرحم والمبيض والعظام والجهاز التناسلي الذكري والبروستاتا. يوجد ER بشكل رئيسي في البروستاتا والمبيض والمثانة. [١٠.١١] علاوة على ذلك ، هناك بعض الأدوار الفسيولوجية الشائعة للنوعين الفرعيين ، مثل تطور ووظيفة المبيضين وحماية نظام القلب والأوعية الدموية. [12،13] كشفت الأبحاث السابقة في مجموعتنا عن آلية شبيهة بالإستروجين للـ GCs عن طريق طريقة التحليل الأيضي. في دراسة مستمرة ، قمنا بتحليل آلية نشاط هرمون الاستروجين في الخلايا الجذعية السرطانية على خطوط خلايا MCF ‑ 7 المتعلقة بـ ERs.

المواد والأساليب

الادوات

حاضنة ECO ‑ 170P ‑ 230 كانت من شركة New Brunswick Scientific (الصين) المحدودة ، وقارئ الصفيحة الدقيقة Bio Rad 680 ، وجهاز الرحلان الكهربائي من شركة Bio ‑ Rad Laboratories ، Inc. ، وكان مجهر CX21 من شركة أوليمبوس المحدودة. ، GIS ‑ 2019 نظام التصوير بالهلام من شركة Tanon Science and Technology Co. كان نظام (PCR) من Thermo Fisher Scientific.

المواد الكيميائية والكواشف

تم تحضير GCs في مختبرنا بالطريقة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا ، [14] وتم تحديد نقاء GCs بنسبة 52 بالمائة (تم استخدام acteoside كعلامة لتحديد GCs) بواسطة القياس الطيفي فوق البنفسجي. تم شراء Estradiol (E2) من شركة Yuanye Biotechnology Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين). مصل بقري الجنين (FBS) و RPMI ‑ 1640 كانا من شركة Gibco Co.، Ltd. ، صفيحة سفلية مسطحة بئر 96 من شركة Corning Inc. ، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 3 [4،5 ثنائي ميثيل ‑ 2 ثيازوليل تم شراء ‑2،5 ‑ بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) من شركة سيجما-ألدريتش. تم شراء كاشف TRIzol ومجموعة النسخ العكسي (RT) ومجموعة TB Green ™ RT ‑ PCR من شركة TaKaRa Co.، Ltd. ، داليان ، الصين. تم شراء الأجسام المضادة لـ Anti ‑ ER Rabbit pAb و anti ‑ ER Rabbit pAb و ‑actin من Wanlei Biotechnology Co.، Ltd. تم شراء جميع المواد الكيميائية الشائعة الأخرى من الموردين التجاريين المعياريين.

إعداد عينة

تحضير جليكوسيدات محلول مخزون Cistanches

تم إذابة مستخلص GCs في DMSO لعمل محلول مخزون بتركيز 0. 1051 جم / مل وتخزينه عند 4 درجات. تم استخدام RPMI ‑ 1640 الخالي من الفينول الأحمر لتخفيف محلول المخزون إلى تركيزات مختلفة قبل الاستخدام.

تحضير محلول مخزون استراديول

تمت إذابة مستخلص E2 في DMSO لعمل محلول مخزون بتركيز 0 .27 مجم / مل وتخزينه عند 4 درجات. تم استخدام RPMI ‑ 1640 الخالي من الفينول الأحمر لتخفيف محلول المخزون إلى تركيزات مختلفة قبل الاستخدام.

تحضير ديكستران الفحم المعالج ‑ مصل بقري جنيني

تم خلط مئات المليلتر من FBS مع 250 مجم من مسحوق الفحم النشط و 25 مجم من ديكستران. بعد الحضن لمدة 45 دقيقة عند 55 درجة ، يطرد الخليط عند 4 درجات ، 1000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. تم ترشيح المادة الطافية باستخدام غشاء Millipore Express PES للحصول على ديكستران الفحم المعامل (CDT) ‑FBS وتخزينه عند −20 درجة.

زراعة الخلايا

تم الحصول على خطوط خلايا MCF-7 لسرطان الثدي البشري من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC). علاوة على ذلك ، تمت زراعة الخلايا باستخدام وسيط RPMI 1640 يحتوي على 10 في المائة من FBS و 1 في المائة بنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة تحت جو مرطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تمت زراعة الخلايا في وسط RPMI 1640 الخالي من الأحمر الفينول الذي يحتوي على 5 بالمائة CDT ‑ FBS قبل 4 أيام من اختبار MTT بحيث يجب إزالة هرمون الاستروجين في الخلايا.

تحليل تكاثر الخلايا للإستراديول على سلالات خلايا MCF -7

تم قياس تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة MTT لخلايا MCF 7. [15،16] تم إذابة E2 في وسائط مستنبت RPMI ‑ 164 0 تحتوي على 0. 1 بالمائة DMSO بتركيزات نهائية من {{27) }}. 1 و 1 و 10 و 100 و 1000 نانومتر. تمت زراعة خطوط خلايا MCF ‑ 7 في وسط RPMI 1640 خالي من الفينول الأحمر لمدة 4 أيام. بعد الغسيل بواسطة محلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) ثلاث مرات ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من وسط RPMI الخالي من FBS 1640 إلى 96 طبق جيدًا عند 1.5 × 104 لكل بئر وحضنت عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من محلول E2 لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT (0.5 مجم / مل) إلى كل بئر. تم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات. أخيرًا ، تمت إضافة 150 ميكرولتر من DMSO لإذابة بلورات فورمازان. تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية ، وتم حساب معدل الانتشار (PR).

تحليل تكاثر الخلايا لجليكوسيدات Cistanches على خطوط خلايا MCF -7

تم قياس تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة MTT لخلايا MCF 7. تم حل GCs في وسائط RPMI ‑ 164 0 المزروعة التي تحتوي على 0. 1 بالمائة DMSO بتركيزات نهائية من 0. 0 175 ، 0.175 ، 1.75 ، 17.5 ، و 175 ميكروغرام / مل. تمت زراعة خطوط خلايا MCF ‑ 7 في وسط RPMI 1640 خالي من الفينول يحتوي على 5 بالمائة CDT FBS لمدة 4 أيام. بعد الغسل بواسطة PBS ثلاث مرات ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الخالي من FBS إلى أطباق بئر 96 ‑ عند 1.5 × 104 لكل بئر وحضنت عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من محلول GCs لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT (0.5 مجم / مل) إلى كل بئر. تم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات. أخيرًا ، تمت إضافة 150 ميكرولتر من DMSO لإذابة بلورات فورمازان. تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية ، وتم حساب العلاقات العامة. كان الفينول الأحمر الخالي من RPMI ‑ 1640 والوسيط المحتوي على E2 (2.725 × 10 ميكروغرام / مل) المجموعتين السلبية والإيجابية على التوالي.

تحليل تكاثر الخلايا لجليكوسيدات Cistanches مع fulvestrant على خطوط خلايا MCF -7

تم قياس تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة MTT لخلايا MCF 7. تم إذابة GCs في وسائط RPMI ‑ 164 {2}} المزروعة التي تحتوي على 0. 1 بالمائة DMSO بتركيزات نهائية 1.75 و 17.5 و 175 ميكروغرام / مل. تمت زراعة خطوط خلايا MCF ‑ 7 في وسط RPMI 1640 خالي من الفينول يحتوي على 5 بالمائة CDT FBS لمدة 4 أيام. بعد الغسل بواسطة PBS ثلاث مرات ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الخالي من FBS إلى أطباق بئر 96 ‑ عند 1.5 × 104 لكل بئر وحضنت عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من محلول GCs وحضنت بالفولفيسترانت (6.06 × 10−5 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT (0.5 مجم / مل) إلى كل بئر. تم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات. أخيرًا ، تمت إضافة 150 ميكرولتر من DMSO لإذابة بلورات فورمازان. تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية ، وتم حساب العلاقات العامة. كان الفينول الأحمر الخالي من RPMI ‑ 1640 والوسيط المحتوي على E2 (2.725 × 10−3 ميكروغرام / مل) المجموعتين السالبة والموجبة على التوالي.

فحص دورة الخلية

تم إذابة GCs في وسائط RPMI ‑ 164 0 المزروعة التي تحتوي على 0. 1٪ DMSO بتركيزات نهائية 1.75 و 17.5 و 175 ميكروغرام / مل. تمت زراعة خطوط خلايا MCF ‑ 7 في وسط RPMI 164 0 خالي من الفينول الأحمر يحتوي على 5 بالمائة CDT ‑ FBS لمدة 4 أيام. بعد الغسيل بواسطة PBS ثلاث مرات ، تمت إضافة 1 مل من وسط RPMI 1640 الخالي من FBS إلى 6 أطباق بئر عند 2.5 × 105 لكل بئر وحضنت عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من محلول GCs وحضنت بالفولفيسترانت (6.06 × 10−5 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، تم جمع الخلايا وغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات ، وطردها بالطرد المركزي عند 4 درجات ، و 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وتثبيتها بنسبة 70 في المائة من الإيثانول عند -20 درجة ، طوال الليل. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين ، تم تلوين الخلايا بمحلول PI (50 مجم / مل) يحتوي على 1 مجم / مل من RNase A و 0.1 بالمائة Triton X 100 لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات. تم اكتشاف دورة الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وتم حساب مؤشر الانتشار (PI) على النحو التالي. كان الفينول الأحمر الخالي من RPMI ‑ 1640 والوسيط المحتوي على E2 (2.725 × 10 ميكروغرام / مل) المجموعتين السلبية والإيجابية على التوالي. PI=(S plus G2 M) / (G0 / G1 plus S plus G2 M) × 100 بالمائة

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل تفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي

لقياس مستوى mRNA ، تم استخدام اختبار RT الكمي PCR (qPCR). تم استخراج الحمض النووي الريبي الخلوي الكلي باستخدام كاشف TRIzol. بالنسبة لـ qPCR ، تم نسخ الحمض النووي الريبي العكسي إلى (كدنا) من 4 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RT. تم إجراء تحليلات RT-PCR باستخدام مجموعة TB Green ™ RT-PCR. تم تنفيذ جميع البروتوكولات وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كان زوج التمهيدي المستخدم لتضخيم ER هو 5'‑ GGGAAGTATGCTATGGAATCTG ‑ 3 '(للأمام) و 5'‑ TGGCTGGACACATAGTCGTT 3' (عكسيًا) ؛ كان زوج التمهيدي المستخدم لتضخيم ER هو 5'AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG ‑ 3 '(إلى الأمام) و 5'‑ CCTGGGTCGCTGTGACCAGA ‑ 3' (عكسيًا). كانت ظروف PCR لـ ER و ER 94 درجة لمدة 3 دقائق تليها 37 و 40 دورة ، على التوالي ، 94 درجة لمدة 30 ثانية ، و 58 درجة لمدة دقيقتين ، و 72 درجة لمدة دقيقتين. كان زوج التمهيدي المستخدم لتضخيم GAPDH 5'‑ GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3 '(للأمام) و 5'GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG ‑ 3' (عكسيًا). كانت شروط PCR لـ GAPDH 94 درجة لمدة 3 دقائق تليها 30 دورة من 94 درجة لمدة 30 ثانية و 58 درجة لمدة دقيقتين و 72 درجة لمدة دقيقتين. في كل مرة تم تكرار تجربة RT ‑ qPCR أكثر من مرتين. لهذا ، تم استخدام GAPDH كرقابة داخلية. تم حساب التعبير الجيني النسبي لـ ER / ER للمضادات الحيوية فيما يتعلق بخلايا التحكم: 2− (Ct).

النشاف الغربي

تم الكشف عن التعبير عن بروتينات ER و ER من خلال تحليل اللطخة الغربية كطريقة تم الإبلاغ عنها مع تعديلات طفيفة. باختصار ، نمت خلايا MCF 7 في 6 أطباق بئر عند 2.5 × 105 خلية لكل بئر وعولجت بـ GCs بتركيز نهائي قدره 1.75 و 17.5 و 175 ميكروغرام / مل لمدة 48 ساعة على التوالي. بعد الحضانة ، تم تحضير مستخلصات الخلية الكاملة باستخدام محلول RIPA يحتوي على 1 ملي مولار من PMSF. تم فصل البروتينات الموجودة في مستخلصات الخلية الكاملة بنسبة 12 بالمائة من كبريتات دوديسيل الصوديوم ‑ بولي أكريلاميد جل كهربي ثم نقلها إلى أغشية ثنائي فلوريد متعدد الفينيل. تم حظر الغشاء باستخدام 5 في المائة (وزن / حجم) من الحليب منزوع الدسم المذاب في محلول TBST وحضنته بالأجسام المضادة الأولية والثانوية بدورها. وقد لوحظت الأجسام المضادة المقيدة.

تحليل احصائي

تم التعبير عن النتائج كوسائل وانحرافات معيارية ، وتم إجراء دلالة إحصائية باستخدام اختبار الطالب t مع برنامج SPSS 21. 0 (شركة IBM Co.، Ltd. America). ص<0.05 was="" considered="" statistically="">

النتائج

بعد 24 ساعة من العلاج E2 ، تم تعزيز تكاثر خلايا MCF 7 بشكل واضح [الشكل 1 أ]. 10 نانومتر من محلول E2 يمكن أن يحفز نمو الخلايا بشكل واضح (123.89 بالمائة). ومع ذلك ، مع زيادة تركيز E2 ، ضعفت قدرة تكاثر الخلايا. ومن ثم ، كان 10 نانومتر هو التركيز الأمثل لـ E2 في هذه التجربة.

يمكن لمجموعة GCs بتركيزات 1.75 و 17.5 و 175 ميكروغرام / ملجم أن تعزز تكاثر خطوط الخلايا MCF 7 بطريقة تعتمد على الوقت والجرعة وتظهر فرقًا كبيرًا مع المجموعة السلبية [الشكل 1 ب]. مقارنة بالمجموعة السلبية ، أظهرت مجموعة E2 انتشارًا واضحًا (120.06 بالمائة).

تم تحضين مجموعة الأدوية المشتركة (CMG) (فولفيسترانت مع E2 أو GCs) في وسط CDT-FBS بخلايا MCF 4. بعد 72 ساعة من الحضانة ، يمكن أن يؤدي CMG إلى ميل العلاقات العامة مقارنة بمجموعة الأدوية الفردية (IMG) (P <0. 01)="" [الشكل="" 1="">

أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن الخلايا الجذعية السرطانية يمكن أن تزيد بشكل طفيف من قيمة PI مما يشير إلى أن الخلايا الجذعية السرطانية يمكن أن تقدم خلايا الطور G {0} / G1 إلى مرحلتي S و G2 / M [الشكل 2 والجدول 1] وتعزز الحمض النووي للخلية تركيب. تشير النتيجة إلى أن آلية GCs على MCF 7 كانت مماثلة لتلك الخاصة بـ E2. في CMG (fulvestrant مع GCs) ، كانت قيمة PI للخلية PI تنخفض إلى قيمة IMG قليلاً (P <>

أشار تحليل RT-PCR إلى زيادة تعبيرات ER و ER mRNA مقارنة بمجموعة التحكم (P <0. 01) بطريقة تعتمد على الجرعة بعد معالجتها بتركيزات مختلفة من GCs لمدة 48 ساعة [الشكل 3 أ و ب].

تشير نتيجة اللطخة الغربية إلى أنه بعد المعالجة بتركيزات مختلفة من GCs لمدة 48 ساعة ، تزداد محتويات بروتينات ER و ER في MCF 7 مع زيادة GCs كطريقة تعتمد على الجرعة [الشكل 3 ج ‑ هـ]

استنتاج

في هذا البحث ، تم تقييم تأثير الخلايا السرطانية على تكاثر ودورة خلية MCF 7 بواسطة طريقة MTT وقياس التدفق الخلوي على التوالي. يمكن أن تزيد الخلايا السرطانية من تكاثر خلايا MCF 7 بتركيز 1.75 و 17.5 و 175 ميكروغرام / مل بعد الحضانة لمدة 72 ساعة. ومع ذلك ، تميل الزيادة إلى التباطؤ عند استخدام CC و fulvestrant معًا. يمكن لـ GCs زيادة قيمة PI لخلايا MCF 7 ، وتقليل خلية المرحلة G1 ، وزيادة خلية مرحلتي S و G2.

فولفيسترانت هو مضاد خاص بـ ER ، والذي يمنع التوطين النووي لـ ER من خلال إضعاف ثنائيات المستقبل والنقل النووي المعتمد على الطاقة. في هذا البحث ، أكد الاستنتاج أن فولفيسترانت يمكن أن يضعف تكاثر الخلايا الجذعية السرطانية على خلايا MCF-7 ، ويمكن أن يؤثر على تحول دورة الخلية. ومن ثم ، أشارت هذه الدراسة إلى نشاط هرمون الاستروجين لـ GCs ، وأيضًا ، ER هو هدف GCs. في تجربة RT-PCR و Western blot ، زادت تعبيرات mRNA والبروتين من ER و ER في خلايا MCF ‑ 7 مع زيادة تركيز الخلايا الجذعية السرطانية. وبالتالي ، يمكن أن تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا في نشاط هرمون الاستروجين وفقًا لمرنا المرنا المنتظم وبروتينات ER و ER.