الجزء Ⅰ: تحفز جليكوسيدات Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان الخلايا الكبدية عن طريق مسارات تعتمد على الميتوكوندريا و MAPK وتعزز تأثير مضاد الأورام من خلال الدمج مع سيسبلاتين

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan و Changshuang Fu و Yi Yang و Aipire Adila و Fangfang Zhou و Xianxian Wei و Weilan Zhang و Jie Lv و Yijie Li و Lijie Xia و Jinyao Li

الملخص

Cistanche tubulosaهو نوع من الأدوية العشبية الصينية ويمارس وظائف بيولوجية مختلفة. وقد أثبتت الدراسات السابقة ذلكCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides (CTPG)تظهر تأثيرات مضادة للأورام على مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن التأثيرات المضادة للأورام لـ CTPG على خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2 و BEL -7404 لا تزال بعيدة المنال. أظهرت دراستنا أن CTPG يثبط بشكل كبير نمو خلايا HepG2 و BEL -7404 من خلال تحريض توقف دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج ، والذي ارتبط بتنشيط مسارات MAPK التي تتميز بالفسفرة المنتظمة لـ p38 ، JNK ، و ERK1 / 2 والمسار المعتمد على الميتوكوندريا الذي يتميز بتقليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا. تم بعد ذلك زيادة إطلاق السيتوكروم ج وانقسام الكاسبيز -3 و -7 و -9 و PARP بواسطة علاج CTPG. علاوة على ذلك ، قمع CTPG بشكل كبير هجرة HepG2 عن طريق تقليل مستويات البروتين المعدني المصفوفة -2 وعوامل نمو بطانة الأوعية الدموية. ومن المثير للاهتمام ، أن CTPG لم يعزز تكاثر الخلايا الطحالية فحسب ، بل قلل أيضًا من موت الخلايا المبرمج للخلايا الطحالية التي يسببها سيسبلاتين. في نموذج فأر الورم H22 ، منع CTPG مع سيسبلاتين نمو خلايا H22 وقلل من الآثار الجانبية للسيسبلاتين. مجتمعة ، تمنع CTPG نمو HCC من خلال التأثير المباشر المضاد للأورام والتأثير المناعي غير المباشر وتحسين الفعالية المضادة للورم لسيسبلاتين.

الكلمات الدالة

Cistanche tubulosaجليكوسيدات فينيل إيثانويد ، موت الخلايا المبرمج ، مسار MAPK ، المسار المعتمد على الميتوكوندريا ، سيسبلاتين ، تعزيز المناعة.

مقدمة

كان من المتوقع أن يكون سرطان الكبد سادس أكثر أنواع السرطان شيوعًا ورابع سبب رئيسي للوفاة بالسرطان في جميع أنحاء العالم في عام 2018 ، مع حوالي 841 000 حالات جديدة و 782000 حالة وفاة سنويًا في جنوب شرق آسيا (منغوليا وكمبوديا وفيتنام) .1 في الصين ، كان سرطان الكبد ثالث سبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في عام 2015.2 أكثر من 90 في المائة من سرطانات الكبد الأولية هي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) في جميع أنحاء العالم. حاليًا ، يعد استئصال الكبد وزرع الكبد والاستئصال عن طريق الجلد من الطرق الرئيسية لعلاج سرطان الكبد. لسوء الحظ ، فإن هذه العلاجات فعالة بالنسبة لـ 30 بالمائة من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الكبد المبكر ، في حين أن المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الكبد المتقدم (يمثل 40 بالمائة) يجب عليهم الاعتماد على العلاج الملطف لإطالة وقت بقائهم على قيد الحياة. يعد الانصمام الكيميائي الشرياني علاجًا مسكنًا شائعًا ومهمًا لمعظم المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد المتقدم في منطقة آسيا والمحيط الهادئ .5 سورافينيب ، الذي تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء في عام 2006 لعلاج سرطان الكبد المتقدم ، هو مثبط للكيناز المتعدد يمنع تكاثر الخلايا السرطانية والأوعية الدموية إنتاج الخلايا السرطانية ويعزز موت الخلايا المبرمج. يعمل سورافينيب على إطالة فترة بقاء المريض بشكل كبير من 3 إلى 5 أشهر ولكن له آثار جانبية خطيرة ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بحدوث مقاومة للأدوية .6 لذلك ، من الضروري تطوير عقاقير أو استراتيجيات جديدة لمرض سرطان الكبد.

تم استخدام الطب الصيني التقليدي (TCM) بمفرده أو بالاشتراك مع استراتيجيات أخرى لعلاج سرطان الكبد وأظهر فوائد سريرية بما في ذلك فترة البقاء على قيد الحياة وتحسين نوعية الحياة وتقليل التفاعلات الضائرة وما إلى ذلك.سيستانشهو عبارة عن الطب الصيني التقليدي الذي يحتوي على جليكوسيدات فينيلثانويد (PhGs) ، إيريديويد ، لجنين ، وعديد السكاريد التي لها وظائف بيولوجية مختلفة ، مثل مضادات الأكسدة ، ومكافحة الالتهاب ، ومكافحة الشيخوخة ، وتعزيز الذاكرة ، ووظائف تعزيز المناعة. المكونات النشطة الرئيسية لـسيستانش، ولها وظائف متعددة بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومكافحة الالتهاب ، ومقاومة موت الخلايا المبرمج ، وحماية الكبد ، والحماية العصبية. 10-12 أبلغت مجموعتنا أنCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) يمكن أن يثبط نمو خلايا الورم الميلانيني B 16- F10 وخلايا سرطان المريء Eca -109 وخلايا HCC H22 من خلال مسارات إشارات خارجية أو داخلية في المختبر أو في الجسم الحي ؛ بالإضافة إلى ذلك ، كان لـ CTPG تأثير منبه مناعي. 13-15

في هذه الدراسة ، درسنا التأثير المضاد للورم وآلية CTPG على خلايا HepG2 و BEL -7404 في المختبر ، وحلّلنا وظيفة تعديل المناعة لـ CTPG في المختبر وفي الجسم الحي ، وقمنا أيضًا بتقييم التأثير العلاجي لـ CTPG جنبًا إلى جنب مع العلاج الكيميائي عقار سيسبلاتين على الفئران السرطانية HCC H22 في الجسم الحي. وجدنا أن CTPG يمكن أن يمنع نمو الخلايا HepG2 و BEL -7404 من خلال موت الخلايا المبرمج المعتمد على الميتوكوندريا ومسار إشارات MAPK. منع CTPG بشكل كبير هجرة خلايا HepG2 عن طريق تقليل مستويات البروتين المعدني المصفوف -2 (MMP -2) ​​وعامل نمو البطانة الوعائية (VEGF). بالإضافة إلى ذلك ، عزز CTPG تكاثر وتنشيط الخلايا المناعية وعزز مناعة الفئران. الأهم من ذلك ، أن CTPG جنبًا إلى جنب مع سيسبلاتين يمكن أن يمنع نمو خلايا H22 في الجسم الحي ويقلل من الآثار الجانبية للسيسبلاتين.

المواد والأساليب

الحيوانات

تم شراء حوالي 6 إلى 8 أسابيع من الذكور BALB / c ، وفئران كونمينغ ، وفئران C57BL / 6 للإناث من مركز مختبر الحيوان ، جامعة شينجيانغ الطبية (أورومتشي ، شينجيانغ ، الصين) وتم إيواؤها في منشأة حيوانية بجامعة شينجيانغ مع درجة حرارة الغرفة (RT) 25 ± 3 درجة ، وفترة 12/12 ساعة مظلمة فاتحة.

خطوط الخلايا وزراعة الخلايا

تم شراء خلايا الفئران H22 من شركة Procell Life Science & Technology Co.، Ltd. (ووهان ، هوبي ، الصين) ، وتم الحصول على خلايا HCC HepG2 و BEL -7404 البشرية من مختبر Xinjiang الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية ، جامعة شينجيانغ (أورومتشي ، شينجيانغ ، الصين) وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 (Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو وسط Dulbecco's Eagle's (DMEM) (Gibco) الذي يحتوي على 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (MRC ، الصين) ، 1 بالمائة L - الجلوتامين (100 ملم) ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

جهاز استشراب سائل عالي الأداء (HPLC)

تم تأهيل المركبات الرئيسية لـ CTPG (Upbio Tech Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين) وقياسها كميًا بواسطة HPLC كما تم الإبلاغ سابقًا. 13 تم استخدام عمود ZORBAX SB-C18 (25 0 × 4.6 مم ؛ 5 ميكرومتر) وتتكون المرحلة المتنقلة من 0.2 في المائة من محلول حمض الفورميك والميثانول بتدرج من 23 في المائة إلى 31 في المائة. تم حقن ما مجموعه 10 ميكرولتر من العينة واكتشافها عند 330 نانومتر. تم استخدام معايير إشنكوسايد ومعايير أكتيوسيد (Yuanye ، شنغهاي ، الصين) لتحليل مكونات CTPG.

تحليل جدوى الخلية

تم تقييم التأثيرات المضادة للورم لـ CTPG على خلايا HepG2 و BEL -7404 باستخدام MTT (3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل -2- ثيازوليل) -2 ، {{7 }} diphenyl -2- H-tetrazolium bromide). تم طلاء خلايا HepG2 و BEL -7404 في 96- ألواح بئر (5 × 1 0 4 خلايا / بئر) وتم معالجتها بـ 0 ، 2 0 0 ، 400 و 600 ميكروغرام / مل من CTPG لمدة 24 و 48 ساعة على التوالي بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة. تم استخدام حوالي 35 ميكروغرام / مل من سيسبلاتين (Yuanye) كعنصر تحكم إيجابي. ثم تمت إضافة 100 ميكرولتر MTT (0.5 مجم / مل ، مخفف بالوسيط بدون وسط FBS) إلى كل بئر وزرعها لمدة 3 ساعات عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، تم طرد الألواح عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق ، تمت إزالة الوسط وإضافة 200 ميكروغرام / مل DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات فورمازان المتكونة. تم قياس قيم OD490 بواسطة 96- قارئ جيد للصفيحة الدقيقة (مختبرات Bio-Rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). لتقييم تأثيرات CTPG على خلايا الطحال ، تم عزل الخلايا من C57BL / 6 الفئران وطُليت في 96- ألواح بئر بكثافة 1 × 105 خلية / بئر. عولجت الخلايا الطحالية بـ 0 و 200 و 400 و 600 ميكروغرام / مل لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. تم حساب صلاحية الخلية على أنها الصيغة التالية: قابلية بقاء الخلية (النسبة المئوية)=(معالجة OD / معالجة OD) × 100 بالمائة.

الكشف عن كي -67

تم اكتشاف Ki {0} وفقًا لدراستنا السابقة .16 باختصار ، تمت معالجة خلايا BEL -7404 بتركيزات مختلفة (0 و 200 و 400 و 600 ميكروغرام / مل) من CTPG أو سيسبلاتين (35 ميكروغرام / مل). بعد 24 ساعة ، تم حصاد الخلايا وغسلها باستخدام PBS ، ثم تم تثبيتها ونفاذها باستخدام Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء التلوين داخل الخلايا باستخدام الجسم المضاد Ki المترافق مع FITC -67 (BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 15 دقيقة في RT. تم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية

تم زرع خلايا HepG2 و BEL -7404 بكثافة 2.5 × 105 خلية / طبق وتم تحضينها عند 37 درجة طوال الليل. تم تجريب الخلايا وحصادها بالطرد المركزي بعد معالجتها بتركيزات مختلفة من CTPG أو معالجتها مسبقًا باستخدام مثبط كاسباس (Z-VAD-FMK) أو كاسباس -3 مثبط (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime ، الصين) لمدة 2 ساعات قبل علاج CTPG. بعد 24 ساعة ، تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي. باختصار ، تم غسل الخلايا التي تم جمعها باستخدام PBS بارد (Gibco) وأعيد تعليقها في محلول ملحقة بربط 2.5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI-PE (سولاربيو ، بكين ، الصين) ، ثم تم تحضين الخلايا في RT في الظلام لمدة 15 دقيقة. لتحليل توزيع دورة الخلية ، تم حصاد الخلايا بعد معالجة CTPG وتثبيتها في إيثانول بارد بنسبة 70 في المائة عند 4 درجات لمدة 30 دقيقة. كانت الخلايا ملطخة بـ PI (BD Biosciences) في الظلام لمدة 30 دقيقة. تم تحليل العينات بواسطة التدفق الخلوي الأيتر (BD FACSCalibur). تم الكشف عن مستويات التعبير عن موت الخلايا المبرمج الخلوي والبروتينات المرتبطة بالدورة بواسطة لطخة ويسترن.

لطخة ويسترن

تم عمل لطخة غربية وفقًا لدراستنا السابقة. تم علاج 17 HCC باستخدام CTPG لمدة 24 ساعة. بعد الغسل باستخدام PBS المثلج مرتين ، تم جمع جميع الخلايا الملتصقة والعائمة وحلها في RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co.، Ltd) لمدة دقيقتين 0 على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة 4 درجة لمدة 10 دقائق ، تم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص حمض Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم فصل نفس تركيز البروتينات بنسبة 12 بالمائة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. بعد الغسيل باستخدام محلول PBST (PBS مع 0.05 بالمائة توين -20) ، تم حظر الأغشية باستخدام حليب خالٍ من الدهون بنسبة 5 بالمائة عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة ثم تم تحضينها بالأجسام المضادة الأولية (Cell Signaling Technology ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ) في التخفيفات المناسبة بين عشية وضحاها عند 4 درجات. بعد الغسيل 3 مرات باستخدام PBST ، تم تحضين الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP المقابلة (eBioscience) لمدة ساعتين عند 37 درجة. تم الكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام مجموعة فحص ECL (Beyotime). تم الحصول على بيانات المسح بتدرج الرمادي بواسطة Image J.

تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر)

تم تحديد ميكرومتر بواسطة صبغة JC -1 المنفذة للغشاء (Beyotime). باختصار ، تم علاج خلايا HepG2 و BEL -7404 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، و 200 ، و 400 ، و 600 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة. تم جمع جميع الخلايا وغسلها باستخدام محلول غسيل JC -1. كانت الخلايا ملطخة بمسبار الفلورسنت JC -1 وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 20 دقيقة في RT. بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين ، تم تحليل جميع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 تلطيخ

تم إجراء تلطيخ Hoechst 33342 وفقًا لدراستنا السابقة. تم فحص التغييرات المورفولوجية للنواة باستخدام صبغة ربط الحمض النووي الغشائية Hoechst 33342 (Beyotime). باختصار ، تم تلقيح الخلايا في لوحة بئر 6- بتركيز 1 × 105 خلية / بئر في وسط 2 مل. عند الوصول إلى التقاء 70 في المائة إلى 80 في المائة ، عولجت الخلايا بـ 200 و 400 و 600 ميكروغرام / مل من CTPG أو سيسبلاتين لمدة 24 ساعة. تم غسل الخلايا باستخدام PBS وتثبيتها بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد المثلج عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل باستخدام PBS ، تم تلوين الخلايا بـ Hoechst 33342 عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. تمت ملاحظة العينات بواسطة مجهر مقلوب مضان (Nikon Eclipse Ti-E ، اليابان).

فحص الهجرة

تم الكشف عن هجرة خلايا سرطان الكبد من خلال مقايسة التئام الجروح. باختصار ، تم زرع خلايا HepG2 (2 × 1 0 4 / بئر) في لوحة بئر 24-. بعد الوصول إلى نقطة التقاء 8 0 في المائة ، تم خدش مركز كل بئر مرة واحدة برأس ماصة 20 ميكرولتر. بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني ، عولجت الخلايا بسيسبلاتين (35 ميكروغرام / مل) أو تركيزات مختلفة (0 ، 200 ، 400 ، و 600 ميكروغرام / مل) من CTPG عند 37 درجة. بعد 24 ساعة ، تم التقاط صور لكل عينة تحت المجهر (Nikon Eclipse Ti-E). تم تحليل متوسط ​​مسافات ترحيل الخلايا بواسطة Image J. تم حساب النسبة المئوية لالتئام الجروح بواسطة المعادلة: التئام الجروح (النسبة المئوية)=(1 − منطقة خدش في نقطة زمنية محددة / منطقة خدش عند 0 ساعة) × 100 نسبه مئويه . تم الكشف عن مستويات التعبير عن البروتينات المرتبطة بهجرة الخلايا MMP -2 و VEGF بواسطة لطخة ويسترن.

تكاثر وموت الخلايا المبرمج للخلايا الطحالية

لتحليل الانتشار ، تم عزل خلايا الطحال من 3 C57BL / 6 فئران وملطخة بـ CFSE (eBioscience). تم تلقيح الخلايا التي تحمل علامة CFSE في 24- ألواح بئر بكثافة 2 × 10 خلايا في وسط 1 مل لكل بئر وتم معالجتها بتركيزات مختلفة من CTPG (200 ، و 400 ، و 600 ميكروغرام / مل) أو مجتمعة مع 35 ميكروغرام. / مل سيسبلاتين لمدة 72 ساعة. تم إجراء تحليل التدفق الخلوي بعد التلوين باستخدام CD 3- APC و CD 19- PE (BD Biosciences). لتحليل موت الخلايا المبرمج ، تم تلقيح الخلايا الطحالية في 24- ألواح بئر بكثافة 2 × 10 خلايا في وسط 1 مل لكل بئر ومعالجتها بتركيزات مختلفة من CTPG (200 و 400 و 600 ميكروغرام / مل) أو مجتمعة مع سيسبلاتين لمدة 24 ساعة. تم إجراء تحليل التدفق الخلوي بعد تلطيخ 2.5 ميكرولتر من الملحق V-FITC و 5 ميكرولتر من محلول PI-PE.

تقييم السلامة وأنشطة التحفيز المناعي لـ CTPG في الجسم الحي

لتقييم أنشطة التحفيز المناعي في الجسم الحي لـ CTPG ، تم تقسيم فئران كونمينغ الذكور بشكل عشوائي من 6 إلى 8 أسابيع إلى 7 مجموعات (5 فئران / مجموعة). تم تطبيق الحقن تحت الجلد (sc ، 200 ، 400 مجم / كجم) ، الحقن داخل الصفاق (ip ، 200 ، 400 مجم / كجم) ، والإعطاء داخل المعدة (ig ، 200 ، 400 مجم / كجم) كل يومين ليصبح المجموع 7 مرات بينما لم تتلق المجموعة الضابطة أي علاج. تزن الفئران كل يوم ويتم ملاحظة حالة الفئران كل يوم. بعد علاج CTPG ، تم فصل ووزن أعضاء الفئران. تم حساب فهارس الأعضاء وفقًا للصيغة: مؤشر العضو=وزن العضو (مجم) / وزن الجسم (جم). تم جمع وإحصاء الخلايا الطحالية وتلطيخها باستخدام مضاد CD 3- APC ، أو anti-CD 19- PE ، أو anti-CD49b FITC أو anti-CD 4- APC ، anti-CD {{ 22}} PE، anti-CD 8- FITC (BD Biosciences). تم الكشف عن العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur).

الفعالية المضادة للأورام لـ CTPG مع Cisplatin في الفئران الحاملة للورم H22

تم حقن ما يقرب من 6 إلى 8 أسابيع من فئران BALB / c الذكور تحت الجلد بخلايا H22 (1. 0 × 106 لكل فأر في 100 ميكرولتر PBS). عندما وصلت أحجام الورم إلى حوالي 60 مم 3 ، تم تقسيم الفئران الحاملة للورم بشكل عشوائي إلى 4 مجموعات (6 فئران / مجموعة) وعولجت بسيسبلاتين (4 مجم / كجم) ، CTPG (400 مجم / كجم) ، سيسبلاتين (4 مجم / كجم) بالإضافة إلى CTPG ( 400 مجم / كجم) أو بدون علاج (مجموعة التحكم) على التوالي. تم حقن فئران الورم داخل الصفاق باستخدام CTPG في اليوم الخامس والسابع والتاسع والحادي عشر والثالث عشر على التوالي. تم حقن سيسبلاتين عن طريق الوريد في اليومين السابع والحادي عشر. تم قياس حجم الورم ووزن الجسم كل يوم. تم حساب حجم الورم على النحو التالي: حجم الورم (V)=a × b2 / 2 ، حيث يمثل a و b القطر الأطول والأقصر للورم المقاس بواسطة الفرجار الورني ، على التوالي. في اليوم العشرين ، تم عزل ووزن الأعضاء والأورام. تم جمع خلايا الطحال وإحصائها وتلطيخها باستخدام مضاد CD 3- APC ومضاد CD 19- PE أو anti-CD 4- FITC و anti-CD 8- APC أو anti-CD11b-PE و anti-Gr -1- APC أو anti-CD 4- FITC و anti-CD 25- APC و anti-Foxp 3- PE (BD Biosciences) . بعد ذلك ، تم تحليل الترددات وأرقام الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur).

تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع البيانات على أنها تعني ± خطأ معياري للمتوسط ​​(SEM). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام برنامج Prism5. 0. ص<.05 was="" considered="" statistically="">

نتائج

منع CTPG تكاثر خلايا HCC في المختبر

تم تأهيل مكونات CTPG وتحديد كميتها بواسطة HPLC باستخدام معايير echinacoside و acteoside (الشكل التكميلي 1A) ، والتي كانت المكونات الرئيسية لجليكوسيدات فينيلثانويد من Cistanche. 18 وفقًا لأوقات الاحتفاظ الذروة ومناطق الذروة ، احتوت CTPG على 28 بالمائة إشنكوسايد و 9.9 بالمائة أكتيوسيد. إلى جانب ذلك ، كان محتوى السكريات في CTPG 34.8 في المائة بطريقة حمض الفينول-الكبريتيك .19 أظهر اختبار MTT أن CTPG قلل بشكل كبير من صلاحية خلايا BEL -7404 و HepG2 بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت ( الشكل 1 أ). باستمرار ، تم منع تكاثر خلايا BEL -7404 بشكل كبير عن طريق علاج CTPG ، والذي تم تحليله بواسطة تلطيخ Ki -67 (الشكل 1 ب). تم أيضًا تحليل تأثير CTPG على تكاثر الخلايا الطحالية في المختبر بواسطة اختبار MTT. لاحظنا أن CTPG عزز تكاثر الخلايا الطحالية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1C).

يلعب مسار إشارات البروتين كيناز (MAPK) المُنشط بالميتوجين دورًا محوريًا في بقاء الخلايا السرطانية البشرية وتمايزها ومقاومتها للأدوية. من خلايا HCC ، تم تحليل مستويات الفسفرة لبروتينات مختلفة من مسار إشارة MAPK في خلايا HepG2 بعد العلاج باستخدام CTPG بتركيزات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة. تم تعزيز فسفرة JNK (P-JNK) و p38 (P-p38) اعتمادًا على الجرعة بواسطة علاج CTPG. تم تنظيم فسفرة ERK (P-ERK) بواسطة علاج 200 و 400 ميكروغرام / مل CTPG ، بينما تم تنظيم P-ERK تحت علاج 600 ميكروغرام / مل CTPG (الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، تم تنظيم مستويات P-JNK و P-p38 و P-ERK بطريقة تعتمد على الوقت (الشكل 1 د). تشير هذه النتائج إلى أن CTPG قد يمنع تكاثر خلايا HCC من خلال مسار إشارات MAPK

توقيف دورة خلية HCC المستحث بـ CTPG في المرحلة S.

قمنا أيضًا بتحليل ما إذا كانت CTPG تمنع تكاثر خلايا HCC من خلال تحريض إيقاف دورة الخلية. بعد العلاج باستخدام CTPG ، لوحظ تراكم خلايا BEL -7404 في المرحلة S بطريقة تعتمد على الجرعة. وبالمثل ، تسبب CTPG أيضًا في إيقاف دورة الخلية HepG2 في المرحلة S وزادت الترددات من 40.66 بالمائة في المجموعة الضابطة إلى 61.90 بالمائة في المجموعة المعالجة 600ug / mL CTPG (الشكل 2 أ). تلعب Cyclins و kinases المعتمدة على cyclin (CDKs) أدوارًا مهمة في التحكم في انقسام الخلايا وتطويرها ، وقد ارتبط 21 منها بمرحلة G2 / M. تقدم المرحلة S. تم أيضًا تقليل مستويات التعبير عن Cyclin B1 و CDK1 و CDK2 ؛ ارتبطت هذه البروتينات بمرحلة G2 / M (الشكل 2B). تشير هذه النتائج إلى أن CTPG قمع تكاثر خلايا HCC عن طريق التسبب في توقف دورة الخلية.

CTPG المنشط مسار موت الخلايا المبرمج المعتمد على الميتوكوندريا في خلايا سرطان الكبد

اكتشفنا أيضًا ما إذا كان CTPG قد تسبب في موت الخلايا المبرمج في خلايا HCC ووجدنا أن CTPG يسبب موت الخلايا المبرمج في خلايا HepG2 و BEL -7404 بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 3 أ). بالإضافة إلى ذلك ، تم زيادة مستويات التعبير عن Bax و Bcl -2 وانخفضت بواسطة علاج CTPG بطريقة تعتمد على الجرعة ، على التوالي (الشكل 3 ب). تم تحديد موت الخلايا المبرمج لخلايا HepG2 بواسطة تلطيخ Hoechst 33342 بعد العلاج بـ CTPG لمدة 24 ساعة. لوحظ التشكل النووي بواسطة مجهر مضان مقلوب. كما هو مبين في الشكل 3 ج ، كانت خلايا HepG2 المسيطرة ملطخة بشكل متجانس بينما أظهرت خلايا HepG2 المعالجة بـ CTPG تكاثف الكروماتين والتجزئة بطريقة تعتمد على الجرعة ، والتي كانت مشابهة لخلايا HepG2 المعالجة بالسيسبلاتين. أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG يسبب موت الخلايا المبرمج لخلايا HCC.

يتم تنظيم سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي بشكل صارم من قبل عائلة Bcl -2 وتقليل Δψm يعزز إطلاق السيتوكروم ج الذي ينشط سلسلة كاسباس للحث على موت الخلايا المبرمج .23،24 عندما ينخفض ​​m ، فإن JC {{ يتحلل البوليمر (التألق الأحمر) 3}} إلى مونومرات (مضان أخضر) .25 لذلك ، تم اكتشاف ميكرومتر من خلايا HCC بواسطة تلطيخ JC -1 بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، تم زيادة شدة الإنقاذ الفلوري الأخضر لقناة FL -1 وفقًا للجرعة من خلال علاج CTPG بينما انخفضت كثافة التألق الأحمر لقناة FL -2 وفقًا للجرعة في كليهما خلايا BEL -7404 و HepG2. أظهرت ملاحظة مجهر مضان مقلوب نتيجة مماثلة (الشكل 4 ب) ، مما يشير إلى أن CTPG يقلل ميكرومتر من خلايا سرطان الكبد. بعد ذلك ، لاحظنا أن مستويات السيتوكروم ج قد زادت في كل من خلايا BEL -7404 و HepG2 بعد علاج CTPG (الشكل 4C) ، مما أكد أيضًا انخفاض ميكرومتر في خلايا HCC المعالجة بـ CTPG.

يمكن أن يؤدي إطلاق السيتوكروم ج إلى تنشيط كاسباس البادئ -9 للحث على موت الخلايا المبرمج. 26 اقترحت نتائج اختبار لطخة ويسترن أن مستويات الكاسبيز المشقوق -3 و -7 و {{4} } بينما لم يتغير مستوى الكاسبيز المشقوق -8 (الشكل 5). يمكن أن يشق الكاسبيز المنشط -3 إنزيم إصلاح الحمض النووي لبوليميراز بولي (ADP-ribose) (PARP) لمنع إصلاح الحمض النووي وتراكم تلف الحمض النووي .27 كما لاحظنا أيضًا مستويات منظمة من PARP المشقوق. تم تحديد دور شلال كاسباس في موت الخلايا المبرمج لخلية HCC الناجم عن CTPG باستخدام مثبط كاسباس (Z-VAD-FMK) ومثبط كاسباس -3 (Ac-DEVD-CHO) على التوالي. عكس Z-VAD-FMK بشكل ملحوظ موت الخلايا المبرمج للخلايا BEL -7404 وخلايا HepG2 التي يسببها CTPG (الشكل التكميلي 1B). وبالمثل ، عكست Ac-DEVD-CHO بشكل كبير موت الخلايا المبرمج لخلايا HepG2 التي يسببها CTPG (الشكل التكميلي 1C). أظهرت النتائج أن CTPG يسبب موت الخلايا المبرمج لخلايا HCC عن طريق مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

CTPG قمع ترحيل خلايا HCC في المختبر

تعتبر هجرة الخلايا السرطانية إحدى العمليات الحاسمة في ورم خبيث للورم. لتحديد ما إذا كان CTPG يؤثر على هجرة خلايا HCC ، تم تقييم حركة خلايا HepG2 عن طريق مقايسة التئام الجروح. كما هو مبين في الشكل 6 أ و ب ، تم منع هجرة الخلايا HepG2 بشكل كبير بواسطة علاج CTPG بطريقة تعتمد على الجرعة. تلعب عائلة MMP و VEGF دورًا مهمًا في هجرة الخلايا السرطانية. 28 بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة ، انخفضت مستويات MMP {7}} و VEGF بشكل كبير (الشكل 6C) ، مما يشير إلى أن CTPG قد يقمع الغزو والورم الخبيث من HCC.

يعزز CTPG مناعة الفئران

تم الإبلاغ عن أن عديد السكاريد Cistanche deserticola لها وظائف مناعية بما في ذلك تعزيز تكاثر الخلايا الليمفاوية وتنشيط الضامة. 29 الخلايا التائية والخلايا البائية هي الخلايا الليمفاوية الرئيسية ، التي تتوسط الاستجابات المناعية الخلوية والخلطية ، على التوالي. احتوى CTPG على 34.8 بالمائة من السكاريد. لذلك ، قمنا بفحص تأثيرات CTPG على تكاثر الخلايا التائية والخلايا البائية. كما هو مبين في الشكل التكميلي 2 أ ، زاد CTPG بشكل كبير من تكاثر الخلايا التائية والخلايا البائية بطريقة تعتمد على الجرعة ، حتى في وجود سيسبلاتين. ومن المثير للاهتمام ، أن CTPG منع بشكل كبير موت الخلايا المبرمج للخلايا الطحالية التي يسببها سيسبلاتين (الشكل التكميلي 2 ب) ، مما يشير إلى أن CTPG يمكن أن يحسن الآثار الجانبية للسيسبلاتين على الجهاز المناعي للفئران.

أكمل القراءة ، للجزء Ⅱ ...