تصوير الكلى بوضوح وتقديرها بأبعاد ثلاثية

edmund.chen@wecistanche.com

لعقود من الزمان ، كانت قياساتالكلىعلم التشريح الدقيق باستخدام أقسام الأبعاد 2- بمعرفة تفصيلية عن الكلى مورفولوجيا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. ومع ذلك ، فإن التطور السريع لأساليب إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة ، جنبًا إلى جنب مع تطوير طرائق جديدة للتصوير 3- بالأبعاد قد قدمت رؤى جديدة حولالكلىالتركيب والوظيفة. تصف مقالة المراجعة هذه مجموعة من الأفكار الجديدة حولالكلىالتطور والمرض الذي تم الحصول عليه مؤخرًا باستخدام هذه الأساليب المنهجية الجديدة. على سبيل المثال ، في البلدان الناميةالكلىوقد وفرت هذه الأساليب مفاهيم جديدة لتشكل تشعب الحالب ، وتكاثر الخلايا السلفية النيفرون والالتزام ، والتفاعلات بين خلايا طرف الحالب وخلايا سلف النيفرون ، وإنشاء تجزئة النيفرون. في فأر بالغ كاملالكلى، يمكن لمسح الأنسجة جنبًا إلى جنب مع الفحص المجهري للورقة الضوئية تصوير وتحديد العدد الإجمالي للكبيبات ، وهو تقدم كبير في هذا المجال. قدمت مناهج مماثلة رؤى جديدة حول بنية الأوعية الدموية الكلوية والتعصيب ، وإعادة التشكيل الأنبوبي الخلالي ، وفقدان الخلايا البادوسية وتضخمها ، وتشكيل الكيس ، وتطور الهلال الخلوي ، وهيكل حاجز الترشيح الكبيبي. العديد من التطورات في فهمالكلىيمكن توقع علم الأحياء وعلم الأمراض حيث يتم تطوير تقنيات المقاصة والتصوير الإضافية واعتمادها من قبل المزيد من الباحثين.

الكلمات الدالة:التصوير ثلاثي الأبعاد الكبيبة. تطور الكلى أمراض الكلى. تطهير الأنسجة نبيبات. كلوي

سيحسن الكستانش الكلية / الكلية

إجمالي عدد النيفرون في كل إنسان عاديالكلىيتراوح من 200 تقريبًا ، 000 إلى أكثر من 2 مليون ، 1 بمتوسط ​​1 مليون تقريبًا. هذه النيفرون بالإضافة إلى المكونات الأخرى لـالكلىبما في ذلك قنوات التجميع والأوعية الدموية والخلل والألياف العصبية مرتبة بدقة تشريحية دقيقة. 2 هذا النمط الدقيق يدعم الوضع الطبيعيوظائف الكلىوالصحة ، والتي يمكن أن تتأثر بشدة عندما يتم تغيير بنية الأنسجة بسبب تضخم أو انكماش الكبيبات أو الأنبوب ، وفقدان النيفرون ، والتشوهات الخلقية ، وخلخلة الأوعية الدموية ، والتليف الخلالي. ساهمت مجموعة من أساليب التصوير في فهمنا الشامل لـالكلىعلم التشريح المجهري أثناء النمو وفي البالغين الأصحاء والمرضىالكلى. بالنسبة للجزء الأكبر ، جاء هذا الفهم من تحليل 2- أقسام الأبعاد (2D) سواء كانت أقسامًا فيزيائية خفيفة أو إلكترونية مجهرية أو مقاطع بصرية متحد البؤر. اعتمد التحديد الكمي لهذا التشريح المجهري في الغالب على التحليلات المجسمة للأقسام التي قدمت تقديرات للأعداد والأطوال والمساحات السطحية وأحجام الكبيبات والأنابيب والأوعية والخلل ومكوناتها الخلوية. 3،4 حتى وقت قريب ، كان التصور ثلاثي الأبعاد لـالكلىاقتصرت البنية المجهرية إلى حد كبير على الفحص المجهري متحد البؤر ، والذي يتيح التقسيم البصري وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد حتى عمق 50 إلى 80 مترًا. لسوء الحظ ، فإن الخصائص الانكسارية للبروتين ومكونات الدهون داخل الأنسجة تبعثر الضوء وتقلل بشكل كبير من جودة الصورة مع زيادة العمق. في السنوات الأخيرة ، تم تطوير مجموعة من طرق المقاصة لإزالة محتوى الدهون والصبغ من الأنسجة ومطابقة الخصائص الانكسارية للأنسجة والوسائط المتصاعدة لجعل الأنسجة شفافة. 5 تتراوح طرق المقاصة في التعقيد من احتضان الأنسجة في حلول مختلفة على مدى ساعات إلى الإجراءات الممتدة التي تتضمن معدات كهروكيميائية مخصصة. نوجه القراء إلى المراجعات الأخيرة 5،6 للحصول على نظرة عامة مفصلة عن الأساليب الحالية ، والأوراق المذكورة هنا للطرق المحددة وحالات الاستخدام.

يمكن حل الهياكل دون الخلوية ومجموعات الخلايا بأكملها داخل أعضاء كاملة أو أقسام سميكة. يتطلب التصوير الدقيق للميزات داخل الأنسجة التي تم تطهيرها مجاهر متخصصة ومعالجة الصور لالتقاط وإعادة بناء البيانات الحجمية من العينات التي يمكن أن تتراوح من مئات الميكرونات إلى السنتيمترات في الحجم. تم استخدام مجاهر المسح الضوئي والقرص المتحد البؤر بشكل فعال لتصوير الميزات داخل مسحهاالكلىالأنسجة ولكنها تعاني من انخفاض الدقة في المحور Z وانخفاض تدريجي في شدة التألق في العمق بسبب محور واحد للإضاءة والتصوير. تعد تقنيات الفحص المجهري للورق الضوئي مناسبة بشكل خاص لتصوير الأنسجة التي تم تنظيفها لأنها تتيح الحصول السريع على أحجام كبيرة ثلاثية الأبعاد ويمكن أن تشمل الإضاءة والتصوير متعدد الزوايا. التصوير المقطعي بالإسقاط البصري هو نهج آخر يتضمن التصوير متعدد الزوايا وإعادة البناء الرقمي لإنتاج البيانات التي تكون فيها محاور X و Y و Z لكل فوكسل بنفس الدقة. بغض النظر عن النهج المحدد ، توفر إزالة الأنسجة والتصوير الكامل للحمل فرصة جديدة لاستكشاف البيئات الخلوية المجهرية المجهولة وبنية الأنسجة عالية الترتيب. في هذا الاستعراض ، نسلط الضوء على بعض الأفكار الجديدة فيالكلىتنمية الكبارالكلىالهيكل ، وعلم الأمراض الذي نتج عن تطهير الأنسجة متبوعًا بتحليل كمي ثلاثي الأبعاد.

رؤى جديدة في تطور الكلىأدت عقود من التنميط الجيني للتعبير الجيني ودراسات الضربة القاضية إلى فهم مفصل لأنواع الخلايا ، وشبكات تنظيم الجينات ، ومسارات الإشارات التي تتحكم في الثديياتالكلىتطوير. أبلغت هذه المعرفة بتشخيص الأمراض الخلقية وتمكين إنتاجالكلىأنواع الخلايا من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. 7 ومع ذلك ، فإن حجم وشفافية وتعقيد البلدان الناميةالكلىقدم حاجزًا كبيرًا للقياس الدقيق لتكوين هذا العضو والتوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا والبروتينات داخله. تطبيق تطهير الأنسجة والتصوير متعدد النطاقات فيالكلىقد أتاح التصور والتحليل الكمي لتشكل المتفرعة الحالب ، ومجموعات الخلايا السلفية ، وهبات النيفرون داخل الأعضاء السليمة (الشكل 1). 8 تدعم هذه الأساليب قدرة جديدة على التنميط الظاهري الدقيق والسبل المفتوحة لتحليل الدوافع الخلوية والجزيئية لـالكلىالتطور والأمراض الخلقية.

تصوير وتحليل التشكل المتفرّع ثلاثي الأبعاد.يعد إنشاء شجرة الحالب سمة مميزة لـالكلىتم تطويره ودراسته على نطاق واسع باستخدام علم الوراثة للفأر وتم تسويتهالكلىالثقافات النباتية. ومع ذلك ، فإن فهم كيفية مساهمة الجينات الفردية في نمو وتشكيل ونمذجة بنية القناة الظهارية المتفرعة في الجسم الحي تتطلب القدرة على تصوير هذه الشبكة المعقدة وتحليلها عبر مجموعة واسعة من أحجام العينات. شورت وآخرون. تناول 8 هذه المشكلات باستخدام الفلورة المناعية الكاملة ، المقاصة القائمة على المذيبات (كحول بنزيل بنزيل بنزوات) وتصوير الأعضاء بأكملها باستخدام التصوير المقطعي بالإسقاط البصري. استخدام هذا الأسلوب لالتقاط لقطات ثلاثية الأبعاد من وقت مبكر إلى منتصفالكلىفي التطوير ، طور الفريق برنامج تحليل مخصص لاستخلاص تفاصيل غير مسبوقة حول شجرة الحالب بما في ذلك رقم الطرف وزوايا الفرع وطوله وأحجام الفروع وعدد أجيال التفرع من أشجار الحالب السليمة (الشكل 1 ج ود). 8 تستخدم في البداية لتوصيف وتحديد الجوانب الجديدة للتفرع الكلوي ، 9،10 الجهود الجارية تسعى إلى تحديد المبادئ والمنظمين الرئيسيين التي تحكم نمذجة الفروع في الجسم الحي. 1

ربط ديناميكيات السلف بتشكيل الأعضاء بالتصوير متعدد النطاقات.تلعب التفاعلات الجزيئية بين خلايا ureterictip وخلايا سلف النيفرون دورًا رئيسيًا في إنشاء مكمل النيفرون الذي يسهلوظائف الكلىفي حياة الكبار. تنتج أسلاف النيفرون غير المستحثة عوامل تعززالكلىالنمو من خلال تفرع الحالب بينما تحافظ الإشارات المقيدة مكانيًا داخل طرف الحالب على حالة سلف النيفرون وتحفز مجموعة فرعية من هذه الأسلاف على التمايز إلى نيفرون مبكر. تقود هذه التفاعلات دورة التفرع وتحريض النيفرون التي تتوقف عند الولادة ، عندما تتمايز أسلاف النيفرون المتبقية. قبل أساليب تطهير الأنسجة ، فهمنا لدينامياتالكلىكان التشكل والوفرة النسبية لمجموعات الخلايا السلفية عبر الزمن محدودة للغاية. تغير هذا مع تطوير أساليب التصوير متعددة النطاقات باستخدام بروتوكولات التألق المناعي الموسعة ، وتطهير الأنسجة ، وأساليب التصوير لتحديد الكمية.الكلىالتطور على المستوى الخلوي (متحد البؤر) والعضو بأكمله (التصوير المقطعي بالإسقاط البصري ، الورقة الضوئية). 9،10 أصبح من الواضح أن معدلاتالكلىيتنوع النمو بشكل كبير مع التفرع السريع في البداية ومعدلات الانتشار التي تنخفض في مراحل ترتبط بانخفاض عدد الخلايا السلفية داخل مكانة كلوية. 10 تصوير ثلاثي الأبعاد متحد البؤر لجنين بشري كاملالكلى(الأسبوع 11) أو عينات منالكلىتؤكد القشرة (الأسابيع 11-23) أن هذا الانخفاض في حجم المكان المخصص يتم الحفاظ عليه عبر الأنواع. 12 أدى التحليل المقارن الإضافي للمكانة الكلوية للإنسان والفأر في الأنسجة التي تم تطهيرها إلى نموذج توظيف جديد قائم على الوقت لتشكيل النيفرون ، حيث يتم إضافة الخلايا السلفية تدريجياً إلى نيفرون مبكر وتبني هوية قطاعية وفقًا للترتيب الذي وصلت به . 13 في دراسة أخرى ركزت على التزام السلف النيفرون ، تم استخدام طريقة تطهير الأنسجة القائمة على الهيدروجيل (التصوير الجامد السلبي المبادل للأكريل أميد المهجن / التهجين المناعي / التهجين المتوافق مع التهجين في الموقع [CLARITY] 14) القدرة على الاحتفاظ باللمعان لمراسل tdTomato الداخلي. أظهر تحليل وسم tdTomato داخل الأنسجة التي تم تطهيرها أن الخلايا الموجودة في نيفرون الالتزام المبكر يمكن أن تعود إلى حالة السلف ، حيث تشير النتائج السابقة إلى أن الالتزام كان أحادي الاتجاه. 15 وهكذا ، فإن تطهير الأنسجة قد حسن فهمنا لعمليات التنمية الديناميكية عبر المقاييس والأنواع.

النمط الظاهري الدقيق. أتاح التقدم في تطهير الأنسجة والتحليل الكمي قدرة جديدة على التنميط الظاهري الدقيق. تم تحديد تغييرات قوية إحصائيًا في التفرع وعدد النيفرون في نماذج الفئران ذات الأنماط الظاهرية الدقيقة مثل Ret þ /؟ وستة 2 þ /؟ الفئران (الشكل 2) ، والتي تم تصنيفها سابقًا على أنها "طبيعية". 10،16 عالية الدقة التصوير (كنفوكل) من مسح Wnt11؟ /؟الكلىحدد نمطًا خلويًا جديدًا حيث يبدو أن أسلاف النيفرون غير منظمين بسبب عدم القدرة على تكوين روابط خلوية ثابتة مع طرف الحالب والتمييز قبل الأوان. تم استخدام هذه الطرق أيضًا لتحديد كيفية تأثير المنظمين الجدد لحالة الخلية السلفية للنيفرون مثل DNA methyltransferase 1 و microRNAs Lin28 و Let7 و TSC1الكلىالتنمية وعدد النيفرون. 18-20 من المحتمل أن يصبح التنميط الظاهري الدقيق أداة مهمة في جهودنا لفهم التأثير الإضافي للعوامل الوراثية والبيئية التي تساهم في انخفاض عدد النيفرون والاستعداد للإصابة المزمنةمرض كلوي.

النمذجة الرياضيةالكلىالتشكل. البيانات التي يتم إنتاجها من المطهر الناميةالكلىتغذي موجة من النمذجة الرياضية القائمة على الصور التي تحاول تمييز كيفية ظهور الشكل العياني ووظيفة الأنسجة من التفاعلات الجزيئية بين مجموعات الخلايا السلفية. سيكون التطبيق الإضافي لتصوير الأعضاء بالكامل في الأنسجة التي تم تطهيرها أمرًا بالغ الأهمية لفهم الدوافع الجزيئية والخلوية لنمذجة الأنسجة ثلاثية الأبعاد وقد يكون مفتاح تحسين بنية ودقة نماذج الخلايا الجذعية فيالكلى.

3D مورفولوجيا وأمراض الكلى الكبارالتشكل المعقد للكبارالكلىتحد من استخدام الأدوات المورفولوجية ثنائية الأبعاد لأنها قد تنقل تصورات غير كاملة أو مضللة للبنية ثلاثية الأبعاد. هنا ، نناقش بعض التطورات المنهجية الهامة في السنوات الأخيرة والتي تسمح الآن بتحليل ثلاثي الأبعاد قوي للهياكل عند البالغينالكلى، بدءا من سليمةالكلىعلى طول الطريق إلى مكونات حاجز الترشيح الكبيبي (الشكل 3). 2

سيحسن الكستانش الفشل الكلوي / الفشل الكلوي

عدد وحجم نفرون.الانسانالكلىيُظهر مستوى عالٍ من التباين داخل وداخل الكائن في عدد وحجم النيفرون ، والذي تم وصفه في دراسات تشريح الجثة من الأشخاص دون صراحةأمراض الكلى1،30،31 وقد ارتبطت باضطرابات النمو. لعقود من الزمان ، كانت الأداة المعيارية الذهبية لتحديد عدد النيفرون في العينات التجريبية والبشرية هي طريقة الكاشف / المجزئ ، وهي طريقة مجسمة قائمة على التصميم. 3،4 في حين أن هذا النهج دقيق ودقيق ، فهو أيضًا عملي ويستغرق وقتًا طويلاً ويتطلب تدريبًا كبيرًا. لهذا السبب ، تم اقتراح طرق بديلة لابتكار طرق فعالة يمكن أن توفر نقاط نهاية عالية الجودة: 32 على سبيل المثال ، مجموعات من طرق المقاصة الضوئية ، بما في ذلك الكارهة للماء (المعروفة سابقًا باسم المذيبات) ، المحبة للماء أو المستندة إلى الهيدروجيل ، مع الفحص المجهري الضوئي (على سبيل المثال ، متحد البؤر أو متعدد الفوتون أو الصفيحة الضوئية).

على حد علمنا ، تم نشر التقرير الأول الذي جمع بين المقاصة الضوئية والفحص المجهري للورقة الضوئية لتحليل عدد وحجم النيفرون بواسطة Klingberg et al. 24 في ورقة تاريخية تميزت بالعديد من التطورات المهمة. أولاً ، قدم هذا التقرير إيثيل سينامات ، وهو مذيب غير خطير يمكن أن يحل محل المواد الكيميائية السامة مثل كحول البنزيل - بنزوات البنزيل ، والتي كانت تستخدم حتى ذلك الحين بانتظام في بروتوكولات المقاصة الكارهة للماء. ثانيًا ، أجرى المحققون عد النيفرون في الفأر السليمالكلى أناn نموذج عدواني وتقدمي بوساطة المناعةمرض كلوي، تحديد فقدان النيفرون أثناء مسار المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقديم خطوات مهمة نحو الأتمتة المحوسبة لخوارزميات تجزئة الصور ، مما يوفر مسارًا لتحسين الكفاءة بشكل كبير. في الآونة الأخيرة ، أوسترجارد وآخرون. قدم 25 طريقة مقاصة مسعورة مماثلة جنبًا إلى جنب مع الفحص المجهري للورقة الضوئية وتجزئة الصور الآلية التي توفر كلاً من إجمالي عدد النيفرون والحجم الكبيبي الفردي في نموذج فأر لاعتلال الكلية السكري. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الدراسة وضع العلامات الوظيفية الأنيقة للنبيبات القريبة عبر حقن الألبومين في الجسم الحي لتصور الوصل الكبيبي الأنبوبي وبروتوكول بسيط لعلم الأنسجة المترابط في نفس العينات التي تم مسحها بصريًا. يوضح هذا التقرير مرونة هذه البروتوكولات ، والتي أصبحت خطوط أنابيب متعددة الطبقات لتحديد ملامح الأنسجة الشاملة.

الأوعية الدموية الكلوية والتعصيب.تتبع مسارات الأوعية الدموية المتفرعة أو الألياف العصبية في البالغينالكلىيكاد يكون من المستحيل في الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد حيث أن حجم العضو وتعقيد التوزيع الهيكلي يتطلب تقطيع تسلسلي واسع النطاق وخبير. في الآونة الأخيرة ، هوانغ وآخرون. أبلغ رقم ​​33 عن صبغة الفلورسنت الموجبة القريبة من الأشعة تحت الحمراء (MHI 148- PEI) لتسمية الأوعية الدموية على وجه التحديد ، والتي يمكن دمجها مع بروتوكول المقاصة المعدل والمعجل استنادًا إلى إيثيل سينامات لتقصير وقت معالجة الأنسجة. يفتح هذا النهج آفاقًا جديدة لأبحاث الأوعية الدموية فيالكلى،خاصة عند الحاجة إلى تصوير عالي الدقة ثلاثي الأبعاد. وبالمثل ، فإن Hasegawa et al. استخدم 26 كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الشفافة والتحليل الحسابي (CUBIC) جنبًا إلى جنب مع نظام الفحص المجهري للورق الضوئي المصمم خصيصًا لتحديد توزيع التعصيب الودي في كلية الفأر السليمة. تم توزيع الأعصاب السمبثاوية بشكل أساسي حول الشرايين. بعد 10 أيام من الإصابة بنقص التروية أو إصابة ضخه ، انخفضت كثافة التعصيب الودي بشكل كبير ، مما ارتبط بانخفاض مستويات النورإبينفرين فيأنسجة الكلى. استمرت هذه التغييرات جزئيًا بعد 28 يومًا من الإصابة الأولية ، مما يشير إلى أنه يمكن العثور على تغييرات متعاطفة مستمرة أثناء تطور الحالة المزمنة.مرض كلوي.

إعادة عرض Tubulointerstitial.يصعب تحليل الجهاز الأنبوبي الكلوي بشكل خاص في صورة ثلاثية الأبعاد. تشكل البنية المعقدة والمعقدة تحديات متعددة للطرق التقليدية القائمة على التقسيم التسلسلي والفحص المجهري للضوء القياسي. ومع ذلك ، فإن المقاصة الضوئية تسمح بتحليل النبيبات السليمة والبيئة المكروية المحيطة بها. ساريتاس وآخرون 34 أجرى مزيجًا من المقاصة الضوئية القائمة على الهيدروجيل والمقاومة للماء متبوعًا بالمجهر الضوئي المتقدم والتحليل ثلاثي الأبعاد شبه التلقائي لتوصيف إعادة النمذجة الأنبوبية البعيدة بسبب الحرمان الغذائي من البوتاسيوم. قام الباحثون بتحديد كمية تضخم أنبوبي واكتشاف زيادة في تكاثر الخلايا داخل tubulointerstitium. استخدمت هذه الدراسة براعة كل من المقاصة الضوئية و

الشكل 3|ثلاثي الأبعاد (3D) مورفومتري في الكلية البالغة. (أ) عد النيفرون في الكلى بأكملها باستخدام وسم CD31 للخلايا البطانية. تعرض اللوحة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (على اليسار) ، وقسمًا بصريًا في عرض ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) (وسط) ، ومناطق خاصة تظهر الكبيبات المفردة في مقارنة بين الفحص المجهري للورقة الضوئية (LSFM) ومتحد البؤر و 2- الفحص المجهري للفوتون (2P). مقتبس بإذن من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، من مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، التقييم الآلي بالكامل لعدد الكبيبات الكلي وحجم خصل الشعيرات الدموية في الكلى الكلوية باستخدام المجهر الضوئي ، Klingberg A ، Hasenberg A ، Ludwig-Portugal I ، وآخرون . ، المجلد 28 ، العدد 2 ، 2 0 17 ؛ تم الحصول على إذن من خلال Copyright Clearance Center، Inc. 24 (ب) تحجيم الكبيبات بالتسجيل المكاني - يمثل الترميز اللوني الحجم الكبيبي ، حيث يمثل اللون الأحمر أكبر كائن بينما يمثل اللون الوردي أصغر حجم. مقتبس بإذن من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، من Kidney36 0 ، تحليلات الصور الآلية للتضخم الكبيبي في نموذج الماوس لاعتلال الكلية السكري ، Østergaard MV ، Sembach FE ، Skytte JL ، وآخرون ، المجلد 6 ، الإصدار 6 ، 2020 ؛ تم الحصول على إذن من خلال Copyright Clearance Center، Inc. 25 (c) تتبع الأوعية الدموية والتعصيب ، والذي يتميز بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكلية سليمة مع وضع العلامات المناعية على الأعصاب المتعاطفة (الخضراء) والأوعية الدموية (الأرجواني) والمندمجة (على اليسار). مقتبس من Kidney International ، المجلد 96 ، الإصدار 1 ، Hasegawa S ، Susaki EA ، Tanaka T ، وآخرون ، التحليل الشامل ثلاثي الأبعاد (CUBIC-الكلى) يصور الأعصاب الكلوية المتعاطفة غير الطبيعية بعد إصابة نقص التروية / إعادة ضخ الدم ، الصفحات 129-138 ، حقوق النشر ª 2019 بإذن من الجمعية الدولية لأمراض الكلى. 26 (د) قياس شكل خلايا بودوسيت في الكبيبات الفردية باستخدام الوسم المناعي للعلامة الخاصة بكريات القدم p57 (باللون الأخضر) وعلامة الحمض النووي 4 0 ، 6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI). تعرض اللوحات (على اليسار) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد و (يمين) الأسطح المعروضة. مقتبس بإذن من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، من مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى ، التحقق من صحة طريقة ثلاثية الأبعاد لعد وحجم كريات الدم في الكبيبات الكاملة ، Puelles VG ، van der Wolde JW ، Schulze KE ، وآخرون ، المجلد 27 ، الإصدار 10 ، 2016 ؛ تم نقل الإذن من خلال Copyright Clearance Center، Inc. 27 (هـ) الديناميكيات الخلوية باستخدام تتبع النسب ، والتي تُظهر الخلايا البودوسية (أقصى اليسار) ، الخلايا الظهارية الجدارية (PECs) التي تشكل الهلال الخلوي ثلاثي الأبعاد (وسط اليسار) ، منظر ثنائي الأبعاد لغزو PECs الجانب الكبيبي مع إصابة الأوعية الدموية (وسط اليمين) ، وتصور ثنائي الأبعاد للمخرج الأنبوبي (أقصى اليمين). مقتبس من Kidney International ، المجلد 96 ، الإصدار 2 ، Puelles VG ، Fleck D ، Ortz L ، وآخرون ، تحليل Novel 3D باستخدام تطهير الأنسجة البصرية يوثق تطور التهاب كبيبات الكلى سريع التقدم في الفئران ، الصفحات 505-516 ، حقوق الطبع والنشر ª 2019 ، الدولية جمعية أمراض الكلى ، بموجب ترخيص CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (و) تصور الحجاب الحاجز عند زيادة التكبير من اليسار إلى اليمين. مقتبس من Kidney International ، المجلد 99 ، الإصدار 4 ، Unnersjö-Jess D ، Butt L ، Höhne M ، وآخرون ، بروتوكول مسح وتورم سريع وبسيط للتصوير ثلاثي الأبعاد للكلية عبر المقاييس ، الصفحات 1010-1020 ، حقوق النشر ª 2021 ، الجمعية الدولية لأمراض الكلى ، بموجب ترخيص CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 لتحسين عرض هذه الصورة ، يرجى الاطلاع على النسخة الموجودة على الإنترنت من هذه المقالة علىwww.kidney-international.org.

الفحص المجهري الضوئي لإجراء تحليل أنبوبي في الكلى السليمة باستخدام تقنية دمج الهيدروجيل والفحص المجهري للورقة الضوئية ، بالإضافة إلى القياس الكمي أحادي الخلية في شرائح الكلى باستخدام المقاصة الكارهة للماء والفحص المجهري متحد البؤر ، حيث كانت كل مجموعة مناسبة بشكل أفضل لسؤال البحث المحدد. تم استخدام مجموعات من المقاصة الضوئية والفحص المجهري للضوء المتقدم بواسطة Tahaei et al. 35 الذي ميز مثنوية الشكل الجنسية في طول النبيب الملتوي البعيد ، والذي قد يحدد قدرته على التكيف مع الإجهاد الفسيولوجي ، وشوه وآخرون. 36 الذي كشف عن اختلافات محورية في امتصاص النبيب القريب ووظيفة endolysosomal ، وسلط الضوء على أن الجزء S1 متخصص للغاية في إعادة امتصاص البروتينات عبر الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات. في دراسة حديثة ، Blanc et al. قام 2 بتحليل نموذج لتكوين الكيس ، موضحًا أن الأكياس تطورت فقط في مقاطع نيفرون معينة ، والتي تحدد شكلها وتقع بالقرب من الأنابيب غير المتضخمة الطبيعية. بشكل عام ، لدينا الآن أمثلة متعددة للتطبيق المباشر للمسح الضوئي للتحليل المنهجي للمقصورة tubulointerstitial.

فقدان بودوسيت وتضخم.يوفر الكبيبة مثالًا فريدًا لتحليل الوحدات الوظيفية السليمة داخل العضو. على وجه الخصوص ، استفادت دراسة استنفاد البودوسيت بشكل مباشر من هذه التطورات التكنولوجية حيث تتطلب المنهجيات القائمة على التصميم القياسي الذهبي استثمارًا كبيرًا للوقت والموارد. 37 الأداة الأولى للتحليل المورفومتري ثلاثي الأبعاد لكبيبات الفأر السليمة مجتمعةالكلىشرائح باستخدام بروتوكول معدل من التألق المناعي غير المباشر ، والتصفية الضوئية الكارهة للماء ، والفحص المجهري متحد البؤر ، مما سهّل القياس الكمي لإجمالي عدد البودوسيت في الكبيبات الفردية الكاملة ذات الحجم المعروف. نعتقد أن هذا النهج مثالي لدراسة العمليات التي تؤثر على مجموعة فرعية معينة من الهياكل (على سبيل المثال ، فقدان خلية البودوسيت الذي يؤدي إلى تصلب الكبيبات البؤري والقطعي). تم تطبيق نفس التقنية فيما بعد لتوصيف دور تضخم الخلايا البودوسية كاستجابة تعويضية بعد فقدان خلية البودوسيت ، وهي آلية يتوسطها هدف الثدييات لمسار إشارات الرابامايسين. 38 بينما ركزت هاتان الدراستان على تحليل الخلايا الكبيبية الكبيبية ، يمكن استخدام خط الأنابيب هذا المستند إلى الوسم المناعي التقليدي لوصف التغيرات المورفولوجية لأي نوع من الخلايا بدقة مكانية عالية.

تطور الهلال الخلوي.أداة مهمة أخرى يجب دمجها بنجاح في صندوق الأدوات للأبعاد الثلاثيةالكلىقياس الشكل هو تتبع النسب الجينية. تميل معظم طرق المقاصة الضوئية إلى إحداث درجة معينة من التبريد الفلوري (والتي تختلف من خفيفة إلى شديدة). 6 لقد قدمنا ​​مؤخرًا بروتوكولًا يجمع بين تتبع النسب والمسح الضوئي والفحص المجهري متعدد الفوتونات من أجل التحليل الشامل لفقدان الخلايا البودوسية وتنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. 28 في هذه الدراسة ، تم تحديد فقدان الخلايا البودوسية كميزة لالتهاب الكلية الهلالي التجريبي باستخدام وضع العلامات الأيضية لخلايا القدم مع بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. تم تصور تطور الهلال الخلوي وقياسه كمياً بناءً على تكاثر الخلايا الظهارية الجدارية وهجرةها ، والتي تميزت أيضًا ببروتين الفلوريسنت الأخضر المعزز وتم تتبعها أثناء نموذج تجريبي لالتهاب الكلية الهلالي. سمح تحليل الكبيبات السليمة بتحديد فقدان الخلايا البؤرية وتشكيل الآفة ، والتي تطورت إلى انسداد أنبوبي بواسطة الخلايا الظهارية الجدارية ، مما أدى إلى تكوين الكبيبات الأذينية. تمهد هذه الدراسة الطريق للدراسات المستقبلية للتفاعلات المناعية الظهارية المعقدة داخل سليمةالكلى.

سيحسن الكستانش الكلى / الكلى

حاجز الترشيح الكبيبي.من الأدوات التشخيصية الهامة للتقييم الروتيني لأمراض الكبيبات التحليل الهيكلي الفائق لخزعات الكلى عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني. يمكن العثور على بديل للمجهر الإلكتروني في مجال الفحص المجهري التوسعي ، والذي يهدف بحكم تعريفه إلى زيادة الدقة الضوئية عن طريق زيادة أبعاد الأنسجة. على مر السنين ، Unnersjo-Jess et al. قدمت 39،40 بروتوكولات متعددة لتصور الهياكل النانوية فيالكلى.في الآونة الأخيرة ، أبلغ هؤلاء المحققون عن إجراء سريع وبسيط للتصور ثلاثي الأبعاد لـالكلىعلم التشكل ، والجمع بين مفاهيم المقاصة البصرية وتوسيع الأنسجة لحل الهياكل النانوية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي. 29 تم تطبيق هذا البروتوكول لتصور وقياس السمات المرضية المتعددة في الماوس والبشرالكلىالخزعات بما في ذلك إفساد عملية القدم ، وتغييرات في الغشاء القاعدي الكبيبي ، وطول الحجاب الحاجز الشق ، ورواسب IgG ، وخصائص علم الأمراض الكلاسيكية (على سبيل المثال ، التصلب الكبيبي ، والتليف البيني الخلالي ، والضمور الأنبوبي). باختصار ، تسمح هذه الطريقة بالتخيل متعدد النطاقات والقياس الكمي لأمراض الكلى باستخدام طريقة بسيطة وأدوات تحليل الصور التي يمكن الوصول إليها. من المحتمل أن تتحدد قابلية التوسع والتنفيذ لهذا النهج في الممارسة السريرية من خلال الحاجة إلى معدات الفحص المجهري للضوء المتقدمة وتطوير أدوات تحليل الصور الآلية.

استنتاج

يتضمن الطيف الحالي لطرق إزالة الأنسجة تقنيات بسيطة يمكن تنفيذها في معظم المختبرات لتحسين التصوير ثلاثي الأبعاد على المجاهر المتاحة بشكل شائع. نظرًا لأن الفرص التي تتيحها هذه الأساليب الجديدة أصبحت واضحة ، فإننا نتوقع استيعابًا أوسع لأنظمة الفحص المجهري المتخصصة لتصوير الأنسجة التي تم تطهيرها بدقة عالية وتطوير أبحاث مخصصة وسير عمل سريري لمعالجة أسئلة محددة. لقد خدم مجال علم الأعصاب كأرض اختبار لأساليب وتطبيقات تصوير الأنسجة النظيفة. تم تطوير تحليل الصور الآلي ، والنهج الجديدة لدراسة الاتصال الخلوي ، ومشاريع أطلس التعبير الجيني والبروتيني على مستوى الأنسجة في هذا السياق. من المحتمل أن تؤدي الأساليب المماثلة إلى رؤى جديدة في علم التشريح الخلوي والاعتماد المتبادل بين مجموعات الخلايا في النامي والبالغين.الكلى.

تشمل القيود العملية على هذه التطورات تكلفة أجهزة التصوير والصعوبات في التعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة وتخزينها وتحليلها. تنشأ قيود أخرى من عدم القدرة على استنساخ التلوين بالأنسجة التي تتأثر بشكل متنوع بظروف التثبيت ووسم الجسم المضاد. نتيجة لذلك ، هناك حاجة لتقييم نقدي لتحليلات ثلاثية الأبعاد جديدة ومقارنتها بالطرق المعمول بها. على الرغم من التقدم الرائع في التقييمالكلىالتنمية والكبارالكلىالهيكل والمرض الذي تم إبرازه في هذه المراجعة ، نعتقد أن أفضل ما في إزالة الأنسجة والتصوير ثلاثي الأبعاد لم يأت بعد ومن المحتمل أن يكون مجالًا مثيرًا للنمو بالنسبة لـالكلىالبحث لعقود قادمة.