استكشاف دور رواية Interleukin-17 المتجانسة من بلح البحر البحري اللافقاريات Mytilus Coruscus في الاستجابة المناعية الفطرية: هل التنظيم السلبي بواسطة Mc-Novel_miR_145 هو المفتاح؟

خلاصة: يمثل Interleukin-17 (IL-17) فئة من السيتوكينات المسببة للالتهابات المشاركة في الاضطرابات الالتهابية والتنكسية المزمنة. قبل هذه الدراسة، كان من المتوقع أن يتم استهداف متماثل IL-17 بواسطة Mc-novel_miR_145 للمشاركة في الاستجابة المناعية لـ Mytilus coruscus. استخدمت هذه الدراسة مجموعة متنوعة من أساليب البحث في علم الأحياء الجزيئي والخلوي لاستكشاف العلاقة بين تماثل Mc-novel_miR_145 وIL-17 وتأثيراتها المناعية. أكد تنبؤ المعلوماتية الحيوية انتماء متماثل IL-17 إلى عائلة بلح البحر IL-17، متبوعًا بمقايسات PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) لإثبات أنه تم التعبير عن McIL-17-3 بشكل كبير في الأنسجة المرتبطة بالمناعة واستجابت للتحديات البكتيرية. أكدت نتائج فحوصات مراسل luciferase قدرة McIL-17-3 على تنشيط NF-κb واستهدافه بواسطة Mc-novel_miR_145 في خلايا HEK293. أنتجت الدراسة أيضًا مصل McIL-17-3 المضاد ووجدت أن Mc-novel_miR_145 ينظم بشكل سلبي McIL-17-3 عبر النشاف الغربي ومقايسات qPCR. علاوة على ذلك، أشار تحليل التدفق الخلوي إلى أن Mc- Novel _ miR _145 ينظم بشكل سلبي McIL -17-3 للتخفيف من موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS. بشكل جماعي، أظهرت النتائج الحالية أن McIL-17-3 لعب دورًا مهمًا في الدفاع المناعي للرخويات ضد الهجوم البكتيري. علاوة على ذلك، تم تنظيم McIL- 17-3 سلبًا بواسطة Mc-novel_miR_145 للمشاركة في موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS. توفر النتائج التي توصلنا إليها رؤى جديدة حول تنظيم الحمض النووي الريبي (RNA) غير المشفر في نماذج اللافقاريات.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

الكلمات المفتاحية: كسكس ميتيلوس؛ انترلوكين -17; ميكرورنا؛ موت الخلايا المبرمج. المناعة الفطرية

1 المقدمة

يلعب الجهاز المناعي دورًا حاسمًا في دفاع الجسم ضد غزو مسببات الأمراض الخارجية. تقليديا، ينقسم نظام الدفاع إلى مناعة فطرية ومناعة مكتسبة. تمثل المناعة الفطرية خط الدفاع الأول للجسم ضد مسببات الأمراض، والتي يمكنها اكتشاف غزو مسببات الأمراض والقضاء عليها جزئيًا [1]. تتوسط المناعة الفطرية مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الوحيدة، والعدلات، والحمضات، والقاعدات، والخلايا الجذعية المنتشرة، والتي تُعرف مجتمعة بالخلايا المناعية الفطرية. تطلق هذه الخلايا عددًا كبيرًا من السيتوكينات التي تشارك في الاتصال الخلوي وبالتالي تساعد في تنسيق الاستجابات المناعية [2]. في حالة العدوى والالتهاب، تعمل السيتوكينات كمعدلات: فبعض السيتوكينات تجعل المرض أسوأ (مسبب للالتهابات)، بينما يعزز البعض الآخر الصحة (مضاد للالتهابات) [3]. تخضع السيتوكينات لمستويات عالية من الضغط التطوري وبالتالي تظهر تنوعًا في التسلسل [4]، في حين تُظهر عائلة السيتوكينات IL-17 درجة عالية من الحفظ، والذي يتجلى في طية عقدة السيستين في البنية الوظيفية التي تشكلت من خلال التفاعلات بين أربعة بقايا السيستين المحفوظة [5]. أثبتت الدراسات الحديثة أن IL-17 هو فئة من السيتوكينات المسببة للالتهابات المشاركة في الاضطرابات الالتهابية والتنكسية المزمنة [6]. تعمل IL{10}} من خلال الارتباط على وجه التحديد بالمستقبلات لتعزيز تطور الالتهاب والرفض المناعي وتكون الدم. تتكون عائلة السيتوكينات IL-17 في البشر من ستة أعضاء (IL-17A إلى IL-17F)، والتي يتم إنتاجها بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية المنشطة ومجموعات الخلايا الفطرية الأخرى استجابةً لـ IL -1 وايل-23 [7،8]. ومع ذلك، تشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن عائلة IL-17 شهدت توسعًا ملحوظًا في الرخويات البحرية وأنواع شوكيات الجلد. في جينوم قنفذ البحر الأرجواني Strongylocentrotus Purpuratus، تم اكتشاف حوالي 30 جينة IL-17 [9]. وبالمثل، تم العثور على 31 جينًا شبيهًا بالأخطبوط IL-17-في رأسيات الأرجل الغروانية، حيث يكون لـ 27 جينًا تعبيرًا قويًا في المصاصات والجلد [10]. ساكو، وآخرون. [11] تم استرداد 379 تسلسلًا فريدًا من نوع IL-17 من 15 جينوم بلح البحر مُعاد تسلسله والجينوم المرجعي لـ M.galloprovincialis [12] وقسمها إلى 23 شكلًا إسويًا من خلال التحليل التطوري. علاوة على ذلك، وجدوا أن الأشكال الإسوية IL-17 من أنواع Mytilidae كانت محفوظة بين الأفراد ومشتركة بين الأنواع ذات الصلة الوثيقة. بالإضافة إلى أنواع Mytilidae، تم العثور على عائلات IL-17 الكبيرة أيضًا في أنواع الرخويات الأخرى، بما في ذلك Crassostrea gigas وMizuhopecten Yessoensis وPinctada fucata martensii [13]. تعج مياه البحر بمسببات الأمراض، والرخويات البحرية على اتصال دائم بها، وبالتالي هناك حاجة إلى ترسانة قوية من الجزيئات المناعية، وبالتالي فإن توسع عائلة IL-17 يمنح هذه الحيوانات استجابات مناعية أكثر فعالية.

كانت هناك العديد من الدراسات التي تشير إلى الدور الهام الذي تلعبه IL-17 في المناعة الفطرية للحيوانات الرخوية. على سبيل المثال، وجدت الأبحاث أنه عند الإصابة بـ Vibrio harveyi، تم تنظيم مستوى mRNA لـ IL-17D بشكل كبير في Tegillarca granulosa [14]، بينما في C. gigas، أظهر CgIL17-5 مستوى رد فعل واضح على الضمة الرائعة [15]. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن IL-17 الرخويات تستجيب للعديد من الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs)، مثل عديد السكاريد الدهني (LPS)، والبولينوسينيك: حمض البوليسيتيديليك (polyI: C)، والببتيدوغليكان (PGN). يعد LPS مكونًا رئيسيًا للجدار الخارجي لجدران الخلايا البكتيرية سالبة الجرام ويمثل أحد المنشطات المناعية الأكثر استخدامًا. من ناحية أخرى، polyI: C هو نظير RNA مزدوج الشريط والذي يستخدم بشكل متكرر كمحاكي للفيروسات في البحث العلمي. بعد التحفيز بواسطة LPS، تم تحفيز التعبير النسخي لجينات عائلة IL-17 بسرعة في محار المحيط الهادئ C. gigas ومحار اللؤلؤ P. fucata [16,17]. وفي محار اللؤلؤ أيضًا، وجد أن PfIL-17 متورط في الاستجابة المناعية لتحفيز polyI: C [17].

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

بالإضافة إلى ذلك، أظهر اختبار اللوسيفيراز المزدوج أن PfIL-17 كان قادرًا على تنشيط الجينات المستهدفة للفقاريات التي تحتوي على مواقع ربط NF-kB والمشاركة في مسار إشارات NF-kB في خلايا HEK293 [17]. PGN موجود في جدار الخلية للبكتيريا إيجابية الجرام وغالبا ما يستخدم كمقلد للبكتيريا إيجابية الجرام. ثبت أن المؤتلف C. gigas IL17-5 له صلة قوية بـ PGN، والذي لم يتم الإبلاغ عنه مطلقًا في الإنترلوكينات الفقارية [18]. قدمت هذه الدراسات مقدمة للكشف عن وظيفة IL-17 المناعية في الرخويات. كفئة من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات، فإن التعبير المفرط عن IL-17 يمكن أن يسبب أضرارًا جسيمة للخلايا. طورت الكائنات الحية آليات مختلفة للتحكم في رد الفعل المفرط لـ IL-17، حيث تمثل الرناوات الدقيقة (miRNAs) الفئة الأكثر فعالية والمدروسة جيدًا من الرناوات غير المشفرة. MiRNAs هي عائلة مكونة من RNAs قصيرة يبلغ طولها حوالي 22 nt والتي يمكنها تنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة عن طريق القمع الترجمي أو تدهور mRNA [19]. يركز البحث الحالي حول تنظيم IL-17 بواسطة miRNAs بشكل أساسي على تأثيراتها التآزرية في أمراض المناعة الذاتية البشرية مثل التصلب المتعدد والتهاب المفاصل الروماتويدي والصدفية وغيرها [20]. إن تطوير تقنية التسلسل عالي الإنتاجية والحساب البيولوجي يجعل من الممكن مسح miRNAs الرخويات على المستوى الجينومي، وتم التعرف على عدد كبير من miRNAs المحفوظة والجديدة من أنواع الرخويات مثل المحار المسطح Ostrea edulis، ومحار المحيط الهادئ C. gigas. ، Lymnaea stagnalis، بلح البحر M. Galloprovincialis، الخ. [21-29]. توفر هذه الدراسات بيانات أساسية ودعمًا كبيرًا للتفسير الوظيفي للجزيئات الدقيقة في الرخويات. فيما يتعلق بالدور التنظيمي المناعي لبعض miRNAs في الرخويات، Tian، et al. [30] وجد أن Pm-miR-29a يمكن أن ينظم بشكل إيجابي IL-17 في Pinctada martensii؛ بعد الإفراط في التعبير عن Pm-miR-29a، تم تنظيم التعبير عن IL-17 في الوشاح والخياشيم للأنواع. في C. gigas، يعمل cgi-miR-2 d على زيادة بلعمة خلايا الدم البيضاء عن طريق التنظيم السلبي لـ CgIκB2 [31] والتنظيم السلبي للتعبير عن الجين الشبيه بناقل الكولين في المرحلة المبكرة من العدوى، والذي كان متورطًا في تعديل مناعي متطور [32].

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

أثناء الجفاف، تم العثور على cgi-miR-365 مستحثًا بواسطة النورإبينفرين ويتم تعزيزه بشكل مباشر لتعبير CgHSP90AA1 [33]. أظهرت الدراسات الحديثة أن سقالة ميرنا 659_26519 تستهدف الهدودولين لتنظيم تعبير IL-17 في المرحلة المبكرة من الاستجابة المناعية لـ C. gigas [34]. بالإضافة إلى ذلك، تم وصف وظائف محددة لبعض miRNAs في اللافقاريات الأخرى، مثل خيار البحر Apostichopus japonicus [35–39] والجمبري Litopenaeus vannamei [40]. لقد فتحت هذه الدراسات الحجاب أمام الآليات الأساسية للmiRNAs في اللافقاريات، كما قدمت مراجع تقنية ومنهجية لبحثنا الحالي. في دراستنا السابقة، تم حساب 26 miRNAs و667 جينًا من M. coruscus بيولوجيًا للتعبير التفاضلي بعد تحدي Vibrio alginolyticus، والتي يمكن لـ Mcnovel_miR_145 أن يستهدف متماثل IL-17 والمشاركة في الاستجابة المناعية للعدوى البكتيرية [41]. الهدف من هذه الدراسة هو تحديد جين IL-17 واستكشاف دوره المحتمل في المناعة الفطرية وتنظيمه بواسطة miRNA Mcnovel_miR_145 في M. coruscus. ونهدف من خلال هذه الدراسة إلى الحصول على فهم أفضل لآليات الاستجابة المناعية للرخويات وإلقاء الضوء على الأساس الجزيئي لدفاعها المناعي ضد مسببات الأمراض. يمكن أن يوفر هذا البحث أيضًا رؤى حول تنظيم الحمض النووي الريبي (RNA) غير المشفر في نماذج اللافقاريات.

2. النتائج

2.1. توصيف McIL-17-3

تم استنساخ تسلسل McIL-17-3 cDNA الذي يحتوي على ORF الكامل و30 -UTR و50 - UTR الجزئي في silico من نسخة M. coruscus كاملة الطول (رقم الانضمام: PRJNA798880، F{ {5}}النص_12404). يحتوي McIL-17-3 على منطقة ORF تبلغ 585 نقطة أساس والتي تشفر 194 حمضًا أمينيًا. الوزن الجزيئي المتوقع هو 21.77 كيلو دالتون، ونقطة الجهد الكهربي هي 5.21. كشف تحليل SMART عن مجال IL-17 نموذجي في هذا البروتين (الشكل 1A). تم إنشاء شجرة النشوء والتطور عن طريق تجنيد أعضاء IL-17 من الفقاريات وأنواع Mytilidae، وتم استخدام IL2s كمجموعة خارجية. كما هو موضح في الشكل 1ب، يتم تجميع IL-17 هذه في فرع محدد لتمييزها عن IL-2. داخل مجموعة IL-17، تم عرض صفين واضحين، أحدهما يتكون من الفقاريات IL-17 s والآخر يتكون من بلح البحر IL-17 s. في مجموعة بلح البحر IL-17، تجمع McIL-17-3 أولاً مع الجزيء المقابل من نوع Mytilus آخر، M.galloprovincialis (الشكل 1B).

2.2. المحاذاة المتعددة والتنبؤ بالهيكل الثالث

يتكون قلب McIL-17-3 من زوجين من الخيوط غير المتوازية؛ يتضمن زوج واحد الخيوط 1 (البقايا 52-58) و2 (البقايا 66-72 و77-79)، بينما يتضمن الآخر الخيوط 3 (البقايا 89-103) و4 (البقايا 110-125) (الشكل 2ب، ج) . اثنين من الجسور ثاني كبريتيد (Cys97/Cys134 وCys125/Cys169) ربط فروع 1 و 3 و 2 و 4، على التوالي (الشكل 2A، C). على نحو متسق، تمتلك الرخويات IL-17 الأخرى أيضًا هذين الجسرين ثنائي الكبريتيد بين الخيوط 1 و3 و2 و4 (الشكل 2A، C). والجدير بالذكر أنه على الرغم من أن الفقاريات IL-17 تحتوي أيضًا على جسرين من ثاني كبريتيد، إلا أنهما موجودان بين 2 و4 (الشكل 2A، C).

2.3. التعبير النسخي لـ McIL-17-3

تم تقييم ملف تعريف توزيع الأنسجة لنصوص McIL {{0}} بواسطة qPCR. تم التعبير عن نصوص McIL-17-3 في جميع الأنسجة التي تم اختبارها، وكانت مستويات التعبير في الخلايا الدموية والخياشيم أعلى بكثير من تلك الموجودة في العضلات المقربة (الشكل 3A). تم أيضًا تقييم التعبير الزمني لنصوص الكريات الدموية McIL-17-3 استجابةً لتحدي V. alginolyticus. تم تنظيم مستوى mRNA لـ McIL-17-3 بشكل ملحوظ عند 3 و12 HPC (3.13- أو 4.35- زيادة أضعاف مقارنة بـ 0 HPC، على التوالي)، ولكن لم يكن هناك انتظام زمني واضح بشكل عام (الشكل 3B).

الشكل 1. التوصيف الجزيئي لـ McIL-17-3. (أ) التحليل المعماري للنطاقات المحفوظة في McIL-17-3 باستخدام SMART. تم عرض مجال IL-17 محفوظ. ( ب ) التحليل التطوري لـ McIL -17-3. تم إنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام برنامج MEGAX مع 2000 نسخة متماثلة من التمهيد باستخدام طريقة الانضمام إلى الجوار. تمت تسمية McIL-17-3 بمثلث أخضر. تم استرجاع جميع الأنواع المدرجة في شجرة النشوء والتطور من قاعدة بيانات بنك الجينات، كما تم إدراج أرقام الانضمام في الشجرة أيضًا. المثلث الأخضر نيابة عن McIL-17-3. (لتفسير الإشارات إلى اللون في وسيلة إيضاح الشكل هذه، تتم إحالة القارئ إلى إصدار الويب من هذه المقالة.)

2.4. تنشيط المصب بواسطة McIL-17-3

كما هو مبين في الشكل 4، زاد McIL-17-3 المؤتلف من نشاط اللوسيفيراز لـ pGLNF-κB-luc بطريقة تعتمد على الجرعة. عند 0.5 و1.0 ميكروغرام/جيد، زاد نشاط اللوسيفيراز لـ pGLNF-κB-luc بمقدار 2.07- و11.07-أضعاف، على التوالي.

2.5. تأكيد McIL-17-3 باعتباره الجين المستهدف لـ Mc-novel_miR_145

من خلال التنبؤ بالمعلوماتية الحيوية، يحتوي جين McIL{{0}} على تسلسل مستهدف قياسي لـ Mc-novel_miR_145 عند 30 UTR (الشكل 5A). تم نقل تقليد ومثبط Mc-novel _ miR _145 بشكل مشترك مع بلازميد مراسل UTR من النوع McIL -17-3-30 إلى خلايا HEK293 لتأكيد الارتباط بينهما. كما هو موضح في الشكل 5ب، يمكن لمحاكاة Mc-novel_miR_145 أن تمنع نشاط اللوسيفيراز لـ McIL-17-3-30 UTR-WT ({{56}).{{2{{58} }}} انخفاض أضعاف مقارنة بالتحكم)، في حين أن مثبط Mc-novel_miR_145 يخفف التأثيرات بشكل ملحوظ (1.64-زيادة أضعاف مقارنة بـ Mc-novel_ miR_145 تقليد كمجموعة مضافة فقط). لتقييم ما إذا كان Mc-novel{{30}}miR_145 يستهدف جين McIL-17-3 مباشرة من خلال الموقع المستهدف في 30 UTR، قمنا ببناء النسخة المتحولة من بلازميدات مراسل luciferase التي أدت إلى تحور تسلسلات استهداف Mc-novel_miR_145 في McIL-17-3 30 UTR. كما هو مبين في الشكل 5C، أدى تقليد Mc-novel_miR_145 إلى تقليل نشاط اللوسيفيراز للخلايا المنقولة بواسطة McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-fold) انخفاض)، في حين لم يلاحظ أي تغيير في نشاط وسيفيراز في الخلايا المنقولة بواسطة McIL -17-3-30 UTR-MUT. بالإضافة إلى ذلك، فإن التأثيرات المعتمدة على الجرعة لـ Mc-novel_miR_145 تحاكي تثبيط نشاط McIL-17-3-30 UTR-WT luciferase ويمكن أيضًا ملاحظتها عند 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن (0 .71-، 0.43-، و0.20- أضعاف الانخفاض مقارنة بالتحكم، على التوالي، الشكل 5D).

الشكل 2. تحالفات متعددة لـ McIL-17-3 مع أفراد عائلة IL-17 الآخرين. (أ) تمت محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية لـ McIL-17-3 مع تسلسل IL-17s الأخرى التي تم استردادها من بلح البحر والفقاريات، بما في ذلك الفئران وسمك الزرد. تم تمييز هذه السيستين، التي تشكل عقدة أساسية، باللون الأخضر، مع تمييز بقايا الأحماض الأمينية المستبدلة باللون الأحمر. ويشار إلى عقدة السيستين بخطوط ملونة، الأزرق يعني وجودها في الرخويات والأحمر يعني وجودها في الفقاريات. ملاحظة: يتم الاحتفاظ فقط بالنصف الثاني من محاذاة التسلسل للتصور. (ب) تم التنبؤ بالبنية الثلاثية لبروتين McIL-17-3 باستخدام النموذج السويسري وبرنامج pyMol. تم وضع علامة على هذه السيستينات، التي تشكل عقدة قانونية. (ج) تمثيل كرتوني لأضعاف عقدة السيستين الكنسي. تمت الإشارة إلى بقايا السيستين بدوائر مملوءة. تلك الموجودة في بروتينات IL-17 كانت صفراء، بينما كانت البروتينات المفقودة باللون الرمادي. (لتفسير الإشارات إلى اللون في وسيلة إيضاح الشكل هذه، تتم إحالة القارئ إلى إصدار الويب من هذه المقالة.)

الشكل 3. تحليل ملف تعريف التعبير لنصوص McIL-17-3. (أ) توزيع نصوص McIL-17-3 في أنسجة بلح البحر الشائعة. (ب) تغييرات التعبير الزمني لنصوص McIL-17-3 استجابة لتحدي V. alginolyticus. تم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SD (n=3، * p < 0.05، ** p <0.01). (لتفسير الإشارات إلى اللون في وسيلة إيضاح الشكل هذه، تتم إحالة القارئ إلى إصدار الويب من هذه المقالة.)

الشكل 4. تفعيل مراسل NF-κB بواسطة McIL-17-3. تم نقل المتجه المؤتلف pEGFP-McIL- 17-3 في ثلاثة تركيزات (0.1 و0.5 و1.{{10}} ميكروغرام/بئر) بشكل مشترك في خلايا HEK293 باستخدام Lipo6000TM لمدة 24 ساعة. تم حساب أنشطة اللوسيفيراز النسبية عن طريق التطبيع إلى قيمة pRLTK. تم التعبير عن النتائج التجريبية كتغيرات أضعاف من خلال مقارنة أنشطة اللوسيفيراز للخلايا المؤتلفة الناجمة عن ناقلات الأمراض مع تلك الخاصة بالخلايا الفارغة المستحثة بالنواقل بنفس التركيز. تم عرض كل قيمة على أنها متوسط ​​± SD (n=3)، وكانت الأشرطة التي تحمل رمز النجمة مختلفة بشكل كبير (* p <0.05، ** p <0.01).

الشكل 5. استهدفت رواية Mc-novel_miR_145 McIL-17-3. (A) تم إدراج تسلسل McIL-17-3 30 UTR في ناقل pmiR-RB-Report™، والذي تم إنشاؤه على التوالي من البلازميدات البرية والمتحولة. تمت تسمية تسلسل Mcnovel _ miR {{1 0}} والموقع المستهدف McIL -17-3-30 UTR وتسلسل الموقع المتحول بعلامات حمراء. (ب) تم نقل البلازميد McIL-17-3-30 UTR-WT بشكل مشترك مع Mc-novel_miR_145 mimic أو Mc-novel_miR{{2{{37} }}} المانع في خلايا HEK293. (C) تم نقل خلايا HEK293 باستخدام McIL-17-3-30 UTR-WT أو النوع المتحول من McIL-17-3-30 UTR-MUT، إلى جانب Mc-novel_miR_145 أو NC ، لمدة 24 ساعة. تم قياس نشاط اللوسيفيراز باستخدام نظام فحص مراسل اللوسيفيراز المزدوج. (D) أجريت تجارب تدرج التركيز على عملية ترنسفكأيشن Mc-novel_miR_145. يتم تقديم جميع البيانات كوسيلة ± SD من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. **، ف < 0.01، *، ف < 0.05 مقابل الضوابط. (لتفسير الإشارات إلى اللون في وسيلة إيضاح الشكل هذه، تتم إحالة القارئ إلى إصدار الويب من هذه المقالة.)

2.6. Mc-novel_miR_145 ينظم بشكل سلبي تعبير McIL-17-3

تم نقل الخلايا الدموية لـ M. coruscus باستخدام مثبط Mc-novel _ miR _145 ومثبط Mcnovel _ miR _145 وعناصر التحكم الخاصة بها والتغييرات في McIL {{ 5}} تم تقييم التعبير على مستويات النسخ والبروتين. كما هو مبين في الشكل 6A، تم تنظيم تعبير Mc-novel_miR_145 بشكل كبير (زيادة 8.83-fold) من خلال تقليده وتنظيمه لأسفل ({{14 }}.41-تناقص الطيات) بواسطة مثبطه في الخلايا الدموية، مما يشير إلى التأثيرات الفعالة لهذه المواد المركبة الاصطناعية. في الشكل 6 ب، تم تثبيط التعبير عن McIL-17-3 بشكل كبير (0.51-تناقص أضعاف) بواسطة تقليد Mc-novel_miR_145 في المستوى النسخي وتسبب بشكل ملحوظ (زيادة 2.42- أضعاف) بواسطة مثبط Mcnovel _ miR _145 . للتحقيق في تأثيرات Mc-novel_miR_145 على تعبير McIL-17-3 على مستوى البروتين، تم إنتاج جسم مضاد متعدد النسيلة ضد McIL-17-3. كما هو موضح في الممرات 2 و3 في الشكل 6C، تم التعبير عن بروتين McIL-17-3 المؤتلف بنجاح في E. coli. تم فحص خصوصية الجسم المضاد باستخدام بروتين بلح البحر من الخلايا الدموية بواسطة لطخة غربية. ولوحظ وجود نطاق واحد يبلغ حوالي 22 كيلو دالتون، الموافق للكتلة الجزيئية لـ McIL-17-3، (الخط 4 في الشكل 6C). أظهرت نتائج اللطخة الغربية في الشكل 6D التنظيم السلبي لـ McIL-17-3 على مستوى البروتين بواسطة Mc-novel_miR_145.

Fالشكل 6. تمنع Mc-novel_miR_145 التعبير عن McIL-17-3 في الخلايا الدموية M. coruscus. ( A ) تم تقييم تعبير Mc-novel _ miR _145 بواسطة qPCR في الخلايا الدموية المنقولة بواسطة 145 تقليدًا و 145 مثبطًا والتحكم الخاص بكل منها. (ب) بعد ترنسفكأيشن لمدة 24 ساعة، تم تحديد مستويات النسخ من McIL -17-3 بواسطة qPCR. (C) التعبير المؤتلف، والتنقية، وإعداد المصل المضاد لـ McIL -17-3. لين M، معيار الوزن الجزيئي للبروتين. حارة 1، السيطرة السلبية (بدون تحريض). الخط 2، البروتين المؤتلف المستحث McIL-17-3. حارة 3، ماكيل منقى - 17-3. الخط 4، لطخة غربية تحتوي على جسم مضاد لـMcIL{{20}} في الخلايا الدموية لـ M. coruscus. (D) بعد ترنسفكأيشن لمدة 24 ساعة، تم تحديد مستويات البروتين من McIL -17-3 بواسطة لطخة غربية. ** ع <0.01 مقابل الضوابط

2.7. موت الخلايا المبرمج للخلايا الدموية

معدل موت الخلايا المبرمج في الكريات الدموية لأربع مجموعات، أي NC+LPS، وMcIL-17-3+LPS، وMcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS، وMc-novel{{6} تم تحليل } miR _145- i + McIL -17-3+ LPS عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام تلطيخ مزدوج. بعد الإفراط في التعبير عن McIL-17-3، تم تنظيم معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا الدموية التي تتحدى LPS بشكل كبير مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 7A (أ، ب)، B). عندما تم نقل McIL -17-3 مع Mc-novel _ miR _145، انخفض معدل موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS بشكل ملحوظ مقارنةً بمعدل McIL -17-3 المنقول بمفرده (الشكل 7A ( ب، ج)، ب). في المقابل، أظهر معدل موت الخلايا المبرمج في الكريات الدموية زيادة ملحوظة في مجموعة Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS مقارنة بمجموعة McIL-17-3+LPS (الشكل 7A) (ب، د)، ب).

الشكل 7. تم تقييم معدل موت الخلايا المبرمج في الكريات الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) وصبغة FITC-Annexin-V

3. المناقشة

يُعرف IL-17 بأنه أحد عائلات السيتوكينات المهمة المؤيدة للالتهابات، والتي يمكن أن تشارك بشكل فعال في التسبب في أمراض مختلفة [42]. في دراستنا السابقة، أظهر تجانس M. coruscus IL-17 تعبيرًا تفاضليًا قبل وبعد الإصابة بـ V. alginolyticus من خلال تسلسل النسخ [41]، مما يشير إلى دوره المحتمل في الاستجابة المناعية الفطرية للتحدي البكتيري. هنا، قمنا بتمييز متماثل IL-17 وأطلقنا عليه اسم McIL-17-3. كشف تنبؤ المجال الوظيفي عن مجال IL-17 نموذجي، مما يمنح الانتماء الجيني المحدد حاليًا لعائلة IL-17 السيتوكينات. في شجرة النشوء والتطور، أظهر جين IL-17 الجديد علاقة وثيقة جدًا مع IL-17- 3 من نوع Mytilus آخر، M.galloprovincialis. بالإضافة إلى ذلك، فقد شاركوا في هوية عالية جدًا من الأحماض الأمينية بنسبة 95%، وبالتالي قمنا بترشيح جين IL-17 الجديد الحالي باسم McIL-17-3 لمتابعة اصطلاح التسمية المستخدم في أنواع Mytilus. تتكون عائلة IL-17 من ستة أعضاء وخمسة مستقبلات في البشر [43]، ولكنها شهدت توسعًا وراثيًا هائلاً في اللافقاريات البحرية، وخاصة في بلح البحر [11]. وبناءً على ذلك، تشير بياناتنا إلى أن McIL-17-3 لم يكن مرتبطًا بشكل مباشر بجينات معينة في عائلة IL-17 البشرية. تعتبر طية عقدة السيستين الموجودة في -sheets هي السمة النموذجية لعائلة IL-17 [5]. من المتوقع أن يكشف التنبؤ بالبنية الثلاثية عن طية عقدة السيستين في بروتين McIL-17-3، مما يزيد من تعميق إسناد McIL-17-3 إلى عائلة السيتوكينات IL-17. لمزيد من استكشاف التمايز بين تسلسلات الأحماض الأمينية IL-17 بين الأنواع المختلفة، بعض بلح البحر النموذجي IL-17s وMus musculus IL-17-A إلى IL-17-F ودانيو ريريو تم اختيار IL-17-1 إلى IL-17-3 لإجراء تحليل المحاذاة المتعددة. أظهرت النتائج اكتشافًا مثيرًا للاهتمام وهو أن موضع ارتباط ثاني كبريتيد IL-17 s في بلح البحر والفقاريات كان غير متسق: كانت هاتان الوصلتان ثاني كبريتيد موجودتين بين -الخيوط 1 و3 و2 و4، على التوالي، في بلح البحر، ولكن فقط بين -الفرعان 2 و 4 في الفقاريات. في موقعي السيستين الأول والرابع، تستبدل الفقاريات IL-17 السيستين بالسيرين؛ على النقيض من ذلك، في موقع السيستين الثاني، يستبدل بلح البحر IL-17 السيستين بالثريونين في رابط ثاني كبريتيد في بلح البحر والفقاريات، والآلية الأساسية له غير واضحة وتحتاج إلى مزيد من الدراسة. نظرًا لتعدد أشكال IL-17 في بلح البحر، قد لا يكون ارتباط ثنائي الكبريتيد بين الخيوط 1 و3 بنفس قوة الارتباط بين 2 و4، مما يمنحها مرونة أكبر في بلح البحر. على أي حال، يشير تحليل المجالات الوظيفية والبنية الثلاثية إلى أن McIL-17-3 الذي تم تحديده حاليًا هو نموذجي لسيتوكينات بلح البحر IL-17 وقد يلعب دورًا وظيفيًا مشابهًا لنظيراته في الرخويات. يختلف التعبير عن جينات IL-17 في الأنسجة البشرية بشكل كبير، حيث يتم التعبير عن بعضها في عدد قليل فقط من الخلايا والبعض الآخر في عدد كبير من الأنسجة [44،45]. أظهرت معظم الدراسات التي أجريت على الرخويات أن IL-17 لديها ملف تعريف تكويني [13,15,17,46,47]. ومع ذلك، أظهر Li و Zhang و Zhang و Xiang و Tong و Qu و Yu [47] نتيجة غير متناسقة في C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} و -6 تم التعبير عنها بشكل كبير في خياشيم C. gigas والغدد الهضمية والوشاح، ولكن نادرًا ما يتم التعبير عنها في الأنسجة الأخرى. هنا، تم العثور على نسخ McIL-17-3 في جميع الأنسجة التي تم فحصها، مما يشير إلى أدواره الوظيفية المتعددة في مجموعة متنوعة من الأنشطة الفسيولوجية. ومع ذلك، فإن مستويات التعبير العالية لـ McIL-17-3 في بعض الأنسجة المرتبطة بالمناعة الرخويات، مثل الخلايا الدموية والخياشيم والغدد الهضمية، تشير إلى تورطه الوثيق في الاستجابة المناعية. وبعد ذلك، فإن استجابتها السريعة لهجوم V. alginolyticus تعمق هذه النقطة. أدى حقن V. alginolyticus إلى زيادة تنظيم التعبير عن McIL-17-3 بشكل ملحوظ، وقد لوحظت نتائج مماثلة أيضًا في الرخويات الأخرى IL-17. أدى حقن V. anguillarum في C. gigas إلى زيادة سريعة في وفرة نسخة CgIL-17 في الخلايا الدموية، مما يشير إلى أنه كان جينًا مناعيًا في المرحلة المبكرة [46]. عندما عانى C. gigas من هجوم من مسببات أمراض أخرى، V. splendidus، كان مستوى mRNA لـ CgIL-17-5) في الخلايا الدموية مرتفعًا أيضًا بشكل ملحوظ [15]. أدى تحفيز LPS، وهو المكون الممرض الرئيسي للبكتيريا، إلى زيادة كبيرة في التعبير عن PfIL-17 في الغدد الهضمية لمحار اللؤلؤ P. fucata [17]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحفز LPS تعبير CgIL-17-3 في C. gigas [47] وPmIL-17-2 في P. fucata martensii [13]. أشارت هذه النتائج بشكل جماعي إلى أن IL-17 لعب دورًا مهمًا في الدفاع المناعي للرخويات ضد الهجوم البكتيري. في هذه الدراسة، أظهر McIL-17-3 قدرة التنشيط لمسار NF-κB المصب. كما لوحظت نتائج مماثلة في بعض أنواع الرخويات. في محار اللؤلؤ P. fucata، أظهر PfIL-17 أيضًا تنشيط مسار NF-inB في خلايا HEK293 بواسطة فحوصات مراسل luciferase [17]. في C. gigas، عزز CgIL-17-5 تنشيط CgMAPKs والانتقال النووي لـ CgRel وCgAP-1 لتعزيز تعبير mRNA للسيتوكينات والببتيدات المضادة للبكتيريا [15]. لقد ثبت أن طريقة عمل IL-17 تعتمد على اتحادها في ثنائيات (ثنائيات متجانسة أو ثنائيات متغايرة)، والتي يعتمد نشاطها بشكل كبير على ارتباطها بالمستقبلات (IL-17Rs) هدف. تحتوي هذه المستقبلات على مجال سيتوبلازمي محفوظ (SEFIR) يتفاعل مع بروتينات المحول لبدء مسارات نقل الإشارة النهائية لتنشيط عوامل النسخ مثل NF-κB وتعزيز التعبير عن الجينات المستهدفة المناعية والمؤيدة للالتهابات، مثل السيتوكينات والببتيدات المضادة للميكروبات. 11،48،49].

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

تشير هذه النتائج إلى أن الرخويات IL-17 قد يكون لها نفس طريقة العمل مثل نظيراتها في الفقاريات. وهذا يحتاج إلى تأكيد في الدراسات المستقبلية. تم العثور على الارتباطات بين miRNAs وIL-17 في العديد من نماذج الأمراض البشرية. نيموتو، وآخرون. [50] أكد وجود علاقة إيجابية بين تعبير miR-146a وIL-17 في الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي والغشاء الزليلي من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي ولخص الوظيفة الحيوية لـ miR-146a في تمايز الخلايا المنتجة لـ IL-17-. في مرضى الصدفية، يعمل miR-146a كمثبط قوي لالتهاب الجلد الناجم عن IL-17-، وقد تساهم مستوياته المنخفضة في ظهور المرض مبكرًا لدى الأفراد المعرضين وراثيًا [51]. قد يعمل MiR-146a على تحسين التهاب اللثة عن طريق تنظيم التعبير عن IL-17 وتثبيط تكاثر الخلايا الجذعية في أربطة اللثة البشرية [52]. ينظم MiR -155 سلبًا التعبير عن IL -17 للمشاركة في الاستجابة المناعية للمضيف للالتهاب الرئوي الجرثومي التالي للفيروس في رئة الفئران؛ تُظهر الفئران المثبطة miR-155 تعبيرًا أقوى عن IL-17 في الرئة، مصحوبًا بتحسن في إزالة البكتيريا [53]. تشير هذه الدراسات إلى أن IL-17 يتم تنظيمه بواسطة miRNAs المتعددة ويختلف باختلاف المرض ونوع الخلية [20]. في دراسة سابقة، أجرينا تحليلًا متكاملاً للـ miRNAome والنسخة لاستكشاف التنظيم التفاعلي لـ miRNA-mRNA بواسطة M. coruscus استجابةً لعدوى V. alginolyticus. تنبأت النتائج بأن Mc-novel_miR_145 يمكن أن يستهدف McIL-17-3 للمشاركة في الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية [41]. بهدف استكشاف الآلية الأساسية لتنظيم Mcnovel_miR_145 لـ McIL-17-3 بشكل متعمق، تم إجراء سلسلة من التجارب المعملية في الدراسات الحالية. توقع الحساب أن Mc-novel_miR_145 يمكن أن يستهدف 30 UTR لـ McIL-17-3. تم إجراء فحوصات مراسل luciferase التالية في خلايا HEK293 التي تم نقلها بشكل مشترك بواسطة Mc-novel _ miR _145 التي تحاكي، تحاكي NC، المانع، المانع NC مع مراسل McIL -17-3-30 UTR-WT، -MUT وأكدت البلازميدات كذلك هذه النقطة. علاوة على ذلك، تم نقل Mc-novel _ miR _145 الذي يقلد ويقلد NC والمثبط والمثبط NC إلى خلايا دموية M. coruscus لتقييم آثارها على تعبير McIL -17-3 عند مستويات النسخ والبروتين . تم تنظيم تعبير McIL-17-3 بشكل ملحوظ في مجموعة Mc-novel_miR_145 التي تحاكي ترنسفكأيشن، في حين تم تنظيمه بشكل كبير في Mc-novel_miR _145 مجموعة مثبطات ترنسفكأيشن، مما يشير إلى تنظيم سلبي لـ McIL-17-3 بواسطة Mc-novel_miR_145. وكانت النتائج الحالية مخالفة لدراسة سابقة. في Pinctada martensii، وجد Tian وZheng وHuang وJiao وDu [30] أنه على الرغم من أن Pm-miR-29a يمكن أن يستهدف IL-17، إلا أن التنظيم كان إيجابيًا، حيث أن التعبير عن IL{{ 65}} في الوشاح والخياشيم لـ Pinctada martensii تم تنظيمه بعد الإفراط في التعبير عن Pm-miR-29a. بالنظر إلى أن P. martensii وM. coruscus كلاهما ينتميان إلى ذوات الصدفتين ويرتبطان ارتباطًا وثيقًا نسبيًا، تشير هذه النتائج غير المتسقة إلى أن تنظيم IL-17 في الرخويات قد يختلف باختلاف miRNAs. بخلاف هذا، لم تُبلغ أي أدبيات عن العلاقة بين miRNAs وIL-17 في الرخويات، وبالتالي لا توجد دراسات موازية أخرى لمقارنة النتائج الحالية. ومع ذلك، فقد أبلغت بعض الدراسات عن استهداف العلاقات بين miRNAs محددة وجينات محددة مرتبطة بالمناعة في الرخويات.

على سبيل المثال، cgi-miR-2d يزيد من بلعمة خلايا الدم البيضاء عن طريق التنظيم السلبي لـ CgIκB2 في Crassostrea gigas [31]. بالإضافة إلى ذلك، ينظم cgi-miR-2d أيضًا بشكل سلبي التعبير عن جين واحد يشبه ناقل الكولين للمشاركة في التعديل المناعي المتطور لخلايا الدم المحارية خلال المرحلة المبكرة من العدوى [32]. تشير هذه الدراسات على الأقل إلى أن miRNAs تلعب دورًا محتملًا في الإشارات المناعية الفطرية من خلال استهداف جينات معينة في الرخويات، تمامًا كما تفعل في الفقاريات. بعد ذلك، سعينا لاستكشاف الوظيفة المحتملة للتفاعل بين Mcnovel_miR_145 وMcIL{{10}} في المناعة الفطرية لـ M. coruscus، ودورهما في موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS هو محور اهتمامنا. LPS هو جزيء شديد الالتهاب وهو أحد مكونات الغلاف الخارجي لجميع البكتيريا سالبة الجرام. لقد ثبت أن LPS يحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا والأنسجة المختلفة، مثل الخلايا البلعمية [54]، والخلايا البطانية [55]، ورئة الفأر [56]. أثبتت تجربة أولية أن التعرض للـ LPS بتركيز اسمي قدره 0.1 ملغم/مل لمدة 24 ساعة قد أدى بشكل كبير إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا الدموية من M. coruscus. بعد الإفراط في التعبير عن McIL-17-3، تم زيادة مستوى موت الخلايا المبرمج للخلايا الدموية M. coruscus بشكل ملحوظ مقارنة مع مجموعة التحكم، مما يشير إلى أن McIL-17-3 قد يعزز موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS للخلايا الدموية في M. coruscus. وكانت النتائج الحالية متسقة مع بعض الدراسات السابقة. في العدلات البشرية، يمكن لـ IL-17A أن يقلل من التأثيرات المضادة لموت الخلايا المبرمج بوساطة عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة [57]. يستحث IL-17 موت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية الوعائية، وهي آلية محتملة لمتلازمة الشريان التاجي الحادة [58]. الحذف الجيني لـ IL-17A يقلل من موت الخلايا المبرمج للخلايا السنخية من النوع الثاني وبالتالي يخفف من مرض الانسداد الرئوي المزمن [59]. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض الحجج المعاكسة. عندما تصاب الفئران بفيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران ثيلر، فإن IL-6 و IL-17 يعملان بشكل تآزري على تعزيز الثبات الفيروسي عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج الخلوي [60]. تشير هذه التعارضات إلى أن الآلية الأساسية لموت الخلايا المبرمج بوساطة IL-17- معقدة، وقد تلعب IL-17 وظائف معاكسة اعتمادًا على نوع العدوى.

عندما تم نقل McIL-17-3 بشكل مشترك مع Mc-novel_miR_145، كان مستوى موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS منخفضًا بشكل ملحوظ مقارنة مع McIL-17-3 الوحيد المنقول المجموعة ، على التوالي ، تم تنظيم مستوى موت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ بعد أن تم نقل McIL -17-3 بشكل مشترك مع مثبط Mc-novel _ miR _145 . لقد ثبت أن Mc-novel_miR_145 ينظم بشكل سلبي McIL-17-3، وبالتالي استنتجنا أن McIL-17-3 يؤدي إلى تفاقم موت الخلايا المبرمج في خلايا الدم الناجم عن LPS، في حين أن Mc-novel _miR_145 خفف من التأثيرات. تم التعرف على العديد من miRNAs التي ثبت أنها متورطة في موت الخلايا المبرمج للخلايا البشرية والفأرية في الرخويات في السنوات القليلة الماضية. على سبيل المثال، تم العثور على miR-125b وmiR- 335 في المحار المسطح Ostrea edulis [21]، وتم العثور على miR-184 في الخلايا الدموية للمحار Crassostrea gigas [23]، وmiR{{ 26}}، -29، -96، -182، و -193 تم العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي المتجدد لـ L. stagnalis [25]. تؤكد هذه miRNAs المرتبطة بموت الخلايا المبرمج والتي تم تحديدها من خلال التسلسل عالي الإنتاجية وحسابات الأحياء وجود موت الخلايا المبرمج بوساطة miRNA في الرخويات. تشن وآخرون. تم الإبلاغ عن زيادة في تنظيم miR-2d بعد تحدي Vibrio splendidus في الخلايا الدموية في Crassostrea gigas. ارتبط الإفراط في التعبير عن miR -2 d بالتعبير المدمر لـ IκB2، وزيادة كبيرة في معدل بلعمة الكريات الدموية، المرتبط بقمع موت الخلايا المبرمج [31]. وكانت النتائج متسقة مع دراستنا الحالية، بشكل جماعي، ويبدو أنها تشير ضمنا إلى أن miRNAs تمارس وظيفة مثبطة على موت الخلايا المبرمج في الرخويات. في الواقع، أظهرت معظم miRNAs المرتبطة بموت الخلايا المبرمج في البشر تأثيرات مثبطة على موت الخلايا المبرمج. يحمي MiR -146 خلايا A549 وH1975 من موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS وإصابة الالتهابات من خلال تنظيم Sirt1 وبالتالي منع مسارات NF-κB وNotch [61]. علاوة على ذلك، فإن miR -146 يخفف من موت الخلايا المبرمج لخلايا الكبد الناجم عن التشعيع وLPS من خلال تثبيط مسار TLR4 [62]. يمنع MiR -93 موت الخلايا المبرمج للخلايا الغضروفية في التهاب المفاصل العظمي عن طريق استهداف مسار إشارات TLR4 / NF-κB [63]. MiR -129-5 p يخفف من إصابة الحبل الشوكي لدى الفئران عن طريق قمع موت الخلايا المبرمج من خلال مسار HMGB1 / TLR4 / NF-κB [64]. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض miRNAs المحددة التي تظهر إجراءات معززة على موت الخلايا المبرمج. على سبيل المثال، تم العثور على miR-203 لتسريع موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS من خلال استهداف PIK3CA في الخلايا الظهارية السنخية [65]. تشير هذه النتائج إلى مدى تعقيد الآلية الأساسية لموت الخلايا المبرمج بوساطة ميرنا.

4. المواد والأساليب

4.1. تصميم تجريبي

أولاً، تم التعرف على McIL-17-3 وتمييزه عن M. coruscus من خلال تحليل المعلومات الحيوية. بعد ذلك، تم تقييم توزيع الأنسجة لنصوص McIL-17-3 بالإضافة إلى استجابتها للتحدي البكتيري من خلال فحوصات PCR (qPCR) الكمية في الوقت الحقيقي. بعد ذلك، تم تحديد الارتباط بين McIL-17-3 وMc-novel_miR_145 من خلال تحليل مراسل luciferase الذي تم إجراؤه في خلايا HEK293 وخلايا الدم M. coruscus. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم دورها الوظيفي في موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS عن طريق قياس التدفق الخلوي.

4.2. مياه البحر الاصطناعية

بعد ثلاثة أيام من تهوية مياه الصنبور البلدية، تمت إضافة بلورة البحر الفورية (Haiding LTD، Ji'an، الصين)، وتقليبها جيدًا، وذوبانها للوصول إلى درجة ملوحة تبلغ 30‰. يجب تهوية مياه البحر الاصطناعية المكونة لمدة ساعتين قبل استخدامها.

4.3. الحيوانات

تم شراء بلح البحر ذو القشرة السميكة M. coruscus (طول الصدفة، 9.82 ± 0.53 سم؛ عرض الصدفة، 4.68 ± 0.45 سم؛ الوزن الرطب، 71.2 ± 2.7 جم) من سوق Donghe في تشوشان، مقاطعة تشجيانغ، الصين. تم الاحتفاظ بجميع بلح البحر في خزانات مملوءة بماء حار تبلغ درجة حرارته حوالي 25 درجة مئوية وملوحة تبلغ 30 درجة مئوية لأكثر من أسبوع قبل التجارب اللاحقة.

4.4. McIL -17-3 تحديد هوية [كدنا].

تم استنساخ متماثل IL-17 (McIL-17-3) في سيليكو من نسخة كاملة الطول لـ M. coruscus (رقم الانضمام: PRJNA798880، F01_نسخة _12404). تم تنفيذ إجراء الانفجار للتنبؤ بتسلسل الأحماض الأمينية McIL-17-3 المفترض، متبوعًا بتحليل المجال الوظيفي باستخدام SMART وتقييم العلاقة التطورية باستخدام MEGA-X. تم إجراء المحاذاة المتعددة باستخدام إجراء ClustalW. تم استخدام النموذج السويسري والمجمع للتنبؤ بالبنية الثلاثية لبروتين McIL-17-3. كان الإجراء التفصيلي وفقًا لدراستنا السابقة [66].

4.5. فحوصات PCR الكمية في الوقت الحقيقي

تعد فحوصات PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) أداة قوية لكشف وقياس مستويات التعبير الجيني. هنا، تم تقييم توزيع الأنسجة لـ McIL-17-3 باستخدام طريقة qPCR. بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا اكتشاف التغييرات في تعبير McIL-17-3 mRNA استجابةً للعدوى البكتيرية بواسطة qPCR. تم تحديد ملف توزيع الأنسجة لـ McIL-17-3 في الخياشيم والوشاح والغدد الهضمية والغدد التناسلية والعضلة المقربة والخلايا الدموية باستخدام qPCR مبرمج عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة من 95 ◦ درجة مئوية لمدة 10 ثوان، 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. تم تشريح هذه الأنسجة من تسعة أفراد من بلح البحر وتم تجميعها معًا للتخفيف من التمايز الفردي. في تجربة التحدي البكتيري، تم استخدام V. alginolyticus الحي كمحفز مناعي. تم حقن حجم 100 ميكرولتر من البكتيريا المذابة في مياه البحر (1 × 108 CFU mL−1) في مقرب بلح البحر. لم يتم استخدام بلح البحر المحقون كعنصر تحكم. تم أخذ عينات عشوائياً من تسعة بلح البحر من كل مجموعة عند 0، 3، 6، 12، 24، و 36 ساعة بعد التحدي (HPC). تم تجميع الخلايا الدموية من ثلاث بلح البحر معًا لاعتبارها عينة واحدة، وكانت هناك ثلاث عينات لكل نقطة زمنية. تم استخراج MicroRNAs باستخدام miRNA Extraction Kit (HaiGENE، Cat. رقم: B1802)، وتم تصنيع cDNA باستخدام miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen، Cat. رقم: 4992786) وتم إجراء qPCR باستخدام miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen، Cat. رقم: 4992887). تم استخدام جينات U6 و-actin كمراجع داخلية لـ qPCR وmiRNAs qPCR، على التوالي. يتم سرد أزواج التمهيدي المحددة المستخدمة في هذه التجربة في الجدول 1. وتم قياس مستويات التعبير النسبي باستخدام طريقة 2−∆∆Ct [67].

الجدول 1. استخدمت أزواج التمهيدي PCR في هذه الدراسة.

4.6. زراعة الخلايا

تم استخدام خلايا HEK293 للثدييات (RiboBio Ltd.، قوانغتشو، الصين) لإجراء فحوصات مراسل luciferase لتحديد التنشيط النهائي بواسطة McIL- 17-3 بالإضافة إلى الارتباط بين Mc-novel_miR{{ 4}} وMcIL-17-3. تمت زراعة خلايا HEK293 في وسط OPTI-MEM (GIBCO) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. لمزيد من استكشاف تنظيم McIL-17-3 بواسطة Mc-novel_miR_145 ودورها الوظيفي في موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS، تم استرجاع الخلايا الدموية لـ M. coruscus من العضلة المقربة لكل منها بلح البحر بإبرة يمكن التخلص منها بقطر 0.5 مم (25 جم) تحتوي على 0.5 مل من مضاد التخثر. تم جمع الخلايا الدموية بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 30} 00 دورة في الدقيقة، و4 ◦ مئوية، وأضيف 0.25٪ من التربسين (سولاربيو). تم تعليق الخلايا الدموية في وسط L -15 يحتوي على 15٪ من مصل الأبقار الجنيني (Solarbio) وتم زراعتها عند درجة حرارة 26 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

4.7. توليف ميرنا تقليد ومثبط

تم تكوين نيوكليوتيدات Mc-novel _ miR _145 المقلدة والمثبطة والتحكم بواسطة GenePharma (شنغهاي). تسلسلها كما يلي: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; مثبط Mc-novel_miR_145، 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (تم تعديله كيميائيًا بواسطة 20 Ome)؛ تقليد التحكم السلبي، 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; ومثبط التحكم السلبي، 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (تم تعديله كيميائيًا بواسطة 20 Ome).

4.8. تحليل مراسل لوسيفيراز

وتستخدم على نطاق واسع فحوصات مراسل لوسيفيراز لدراسة التعبير الجيني والنشاط التنظيمي. وتتناسب كمية الضوء المتولدة مع كمية إنزيم اللوسيفيراز المنتج، والذي بدوره يعكس نشاط العنصر التنظيمي. يتم بعد ذلك قياس نشاط اللوسيفيراز باستخدام مقياس الإضاءة، ويتم تحليل النتائج وتفسيرها لتحديد النشاط التنظيمي للعنصر المدروس. تم استخدام فحوصات مراسل Luciferase لتحليل التنشيط النهائي لـ McIL {{0}}. في هذه التجربة، تم استخدام البلازميد pEGFP-McIL-17-3 (0.1، 0.5، و1.0 ميكروغرام/بئر) مع pGLNF-κb- تم نقل بلازميد مراسل luc (0.25 ميكروغرام / بئر) إلى خلايا HEK293 باستخدام Lipo6000TM لمدة 24 ساعة. تم استخدام البلازميد pEGFP-N1 الفارغ كعنصر تحكم. تم قياس نشاط Luciferase باستخدام نظام الفحص Dual-Luciferase® Reporter (Promega، Madison، WI، USA) وفقًا للمواصفات، مع استخدام Renilla luciferase كعنصر تحكم داخلي. تم تأكيد استهداف Mc-novel_miR_145 لـ McIL-17-3 أيضًا من خلال فحوصات مراسل luciferase. توقع حساب المعلومات الحيوية أن Mc-novel_miR_145 يمكنه استهداف 30 -UTR لـ McIL-17-3، ثم استنساخ 30 -UTR لـ McIL{{ 29}} في ناقل مراسل pmiR-RB-ReportTM luciferase لإنشاء بلازميد مراسل McIL-17-3-30 UTR-WT البري. تم إنشاء ناقل مراسل McIL-17-3-30 UTR-MUT من النوع المتحول عن طريق تحور النوكليوتيدات في مواقع 1023-1040: TCCGAAGCGCTTTTCTGG إلى AGGCTTCGCGAAGACC. تم نقل RNA oligo (Mc-novel_miR_196 NC، mimic، NCi، المانع) مع McIL-17-3- 3 0 UTR-WT أو McIL-17-3-30 UTR-MUT إلى HEK293 الخلايا باستخدام Lipo6000TM.

4.9. التعبير المؤتلف والتنقية وإعداد المضاد

لتقييم تأثير Mc-novel_miR_145 على التعبير عن بروتين McIL-17-3، تم تحضير مصل مضاد لـ McIL-17-3. تم تضخيم جزء cDNA الذي يغطي إطار القراءة المفتوح (ORF) لـ McIL-17-3 بزوج تمهيدي محدد (الجدول 1) وإدراجه في ناقل pET-32. تم تحويل البلازميد المؤتلف pET -32 a-McIL {{1 0}} إلى الإشريكية القولونية (DE3) (تاكارا) وحضنت في وسط LB (يحتوي على 5 0 ملغم L−1) كاناميسين) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات. بعد أن وصلت الكثافة الضوئية إلى الامتصاص 0.6 عند 600 نانومتر، تمت إضافة الأيزوبروبيل-بيتا-D-ثيوجالاكتوبي بالداخل (IPTG) بتركيز نهائي قدره 1 مم إلى المحلول البكتيري للحث على التعبير عن McIL{ المؤتلف{ {24}} بروتين (rMcIL -17-3). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، تم طرد الوسط عند 8000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لجمع البكتيريا، يليه التعليق في المخزن المؤقت TBS (20 ملي مولار Tris-HCl، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 8.0). تمت تنقية rMcIL-17-3 بواسطة كروماتوجرافيا تقارب حمض Ni-nitrilotriacetic (NI-NTA)، وتمت غسيل البروتين المنقى من الإيميدازول لمدة 24 ساعة. تم عزل البروتين الناتج عن طريق تقليل 12٪ من SDS- بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). تمت إعادة تشكيل البروتين المنقى في محلول جلسرين يوريا-TBS متدرج (50 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 ملي مولار جلوتاثيون مخفض، 10٪ جلسرين، 0.2 ملي مولار جلوتاثيون أكسيد، تركيز يوريا متدرج قدره 6، 4، 3، 2). ، 1، و 0 مولار من اليوريا في كل تدرج، الرقم الهيدروجيني 7.4، كل تدرج عند 4 ◦م لمدة 12 ساعة). بعد ذلك، تم استخدام البروتين الناتج لتحصين الفئران البالغة من العمر أسبوعًا 6-لاكتساب أجسام مضادة متعددة النسيلة.

4.10. النشاف الغربي

تم استخراج عينات البروتين من الخلايا الدموية باستخدام RIPA تحلل العازلة (Beyotime)، ثم تم اكتشاف التركيز باستخدام مجموعة BCA. بعد العزل بواسطة SDS-PAGE، تم نقل البروتين إلى أغشية PVDF مع الختم بنسبة 5٪ من مسحوق الحليب الخالي من الدسم في TBST (2 0 Mm Tris-HCl، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1٪ توين -20، الرقم الهيدروجيني 8.0)، متبوعًا بالجسم المضاد ضد حضانة McIL-17-3 طوال الليل. بعد ذلك، تم تحضين الأغشية بمحلول مخفف من الجسم المضاد IgG المضاد للفأر للماعز ومترافق الفوسفاتيز القلوي (Thermo Fisher Scientific، Cat. رقم: 31324) في المخزن المؤقت لتخفيف الجسم المضاد الثانوي (Beyotime، P0258) لمدة 3 ساعات. وأخيرا، تم الكشف عن البروتينات المناعية بواسطة نظام الكشف ECL.

4.11. موت الخلايا المبرمج

تم تقييم موت الخلايا المبرمج في الخلايا الدموية باستخدام قياس التدفق الخلوي وفقًا لدليل مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج FITC-Annexin-V (Beyotime). باختصار، تمت معالجة الخلايا الدموية المجمعة لمدة 24 ساعة باستخدام LPS (0.1 مجم/مل)، 20 نانومتر من pEGFP-McIL-17-3 البلازميد، رواية Mc _ miR {{9} } تقليد، ومثبط Mc-novel_miR_145. بعد الغسيل باستخدام PBS، تم إعادة تعليق الخلايا في الوسط L15 بتركيز نهائي قدره 1 × 106 خلية مل وتم تلطيخها بـ FITC-Annexin-V وPI عن طريق حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة في الظلام. . أخيرًا، تم استخدام أداة قياس التدفق الخلوي (Beckman CytoFLEX FCM) للكشف عن موت الخلايا المبرمج، وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJoTM 10. 4.12. التحليل الإحصائي تم عرض النتائج التجريبية على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(SD). تمت معالجة النتائج باستخدام تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه للتباين مع اختبار مقارنات توكي المتعددة، وتم استخدام برنامج Origin2021 لتحليل البيانات وبناء الأرقام.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

5. الاستنتاجات

في هذه الدراسة، تم التعرف على تماثل IL-17 جديد، McIL-17-3، من M. coruscus ووجد أنه يلعب دورًا حاسمًا في الدفاع المناعي للرخويات ضد الهجوم البكتيري. علاوة على ذلك، تم اكتشاف أن McIL-17-3 يتم تنظيمه سلبًا بواسطة Mc-novel_miR_145، مما يساهم في مشاركته في موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS. توفر نتائج هذه الدراسة رؤى قيمة حول الدور التنظيمي لـ IL-17 في الاستجابة المناعية لبلح البحر وتسلط الضوء على إمكانات الحمض النووي الريبي غير المشفر في تنظيم آليات الدفاع المناعي لللافقاريات. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن بعض القيود موجودة في هذه الدراسة. على وجه التحديد، لم تتم دراسة الآلية الكامنة وراء وضع عمل McIL-17-3 وتتطلب مزيدًا من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك، ركزت هذه الدراسة فقط على التفاعل بين Mc-novel_miR_145 وMcIL-17-3 ولم تستكشف احتمال تورط miRNAs الأخرى في الاستجابة المناعية. بشكل عام، تؤكد هذه الدراسة على الدور الهام للحمض النووي الريبي غير المشفر في آليات الدفاع المناعي، وتشير إلى أن تعديله يمكن أن يكون بمثابة استراتيجية محتملة للعلاجات المستهدفة لمختلف الأمراض.

مراجع

1. مدجيتوف، ر.؛ جانواي، C.، الابن المناعة الفطرية. ن. إنجل. جيه ميد. 2000، 343، 338-344. [CrossRef] [مجلات]

2. لاسي، ب.؛ إطلاق Stow، JL Cytokine من الخلايا المناعية الفطرية: الارتباط بمسارات الاتجار بالأغشية المتنوعة. الدم ج. صباحا. شركة نفط الجنوب. الهيماتول. 2011، 118، 9-18. [CrossRef] [مجلات]

3. Dinarello، CA السيتوكينات المسببة للالتهابات. صدر 2000، 118، 503-508. [CrossRef] [مجلات]

4. راوتا، العلاقات العامة؛ ناياك، ب. Das، S. الجهاز المناعي والاستجابات المناعية في الأسماك ودورها في دراسة المناعة المقارنة: نموذج للكائنات الحية العليا. إيمونول. بادئة رسالة. 2012، 148، 23-33. [المرجع المتقاطع]

5. هيمويتز، سان جرمان؛ فيلفاروف، EH؛ يين، J.؛ لي، J.؛ كاي، L.؛ ريسر، ب. ماروكا، م.؛ ماو، دبليو؛ فوستر، J.؛ كيلي، RF IL-17 يتبنى طية عقدة السيستين: بنية ونشاط السيتوكين الجديد، IL-17F، والآثار المترتبة على ربط المستقبلات. إمبو ج. 2001، 20، 5332-5341. [المرجع المتقاطع]

6. باكلي، كم. هو، إيتش؛ هيبينو، T.؛ شرانكل، CS؛ شوه، شمال غرب؛ وانغ، جي زد؛ عوامل Rast، JP IL17 هي منظمات مبكرة في ظهارة الأمعاء أثناء الاستجابة الالتهابية لـ Vibrio في يرقة قنفذ البحر. إي لايف 2017، 6، e23481. [المرجع المتقاطع]

7. كوا، دي جي؛ تاتو، سي إم إنات إيل-17-الخلايا المنتجة: حراس الجهاز المناعي. نات. القس إيمونول. 2010، 10، 479-489. [المرجع المتقاطع]

8. ميلز، KH IL-17 و IL-17-ينتجان خلايا في مجال الحماية مقابل علم الأمراض. نات. القس إيمونول. 2022، 10، 479-489. [المرجع المتقاطع]

9. هيبينو، ت.؛ لوزا كول، م. ميسييه، C .؛ ماجيسكي، AJ. كوهين، آه؛ تيرويليجر، DP؛ باكلي، كم. بروكتون، V.؛ ناير، SV. بيرني، ك. تم ترميز ذخيرة الجينات المناعية في جينوم قنفذ البحر الأرجواني. ديف. بيول. 2006، 300، 349-365. [المرجع المتقاطع]

10. ألبرتين، سي بي؛ سيماكوف، O.؛ ميتروس، T.؛ وانغ، زي. بونجور، جي آر؛ إدسينجر غونزاليس، إي؛ برينر، س. راجسدال، CW. Rokhsar، DS جينوم الأخطبوط وتطور المستجدات العصبية والمورفولوجية لرأسيات الأرجل. طبيعة 2015، 524، 220-224. [المرجع المتقاطع]

11. ساكو، أ.؛ راي كامبوس، م.؛ روزاني، يو. نوفوا، ب. Figueras، A. إن تطور وتنوع الإنترلوكين -17 يسلط الضوء على التوسع في اللافقاريات البحرية ودوره المحافظ في مناعة الغشاء المخاطي. أمام. إيمونول. 2021، 12، 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. جيردول، م. موريرا، ر. كروز، ف. جوميز جاريدو، J .؛ فلاسوفا، أ.؛ روزاني، يو. فينير، ص. نارانجو أورتيز، MA؛ مورغاريلا، م.؛ Greco، S. يشكل التباين الضخم لوجود الجينات وغيابها جينومًا مفتوحًا في بلح البحر الأبيض المتوسط. الجينوم بيول. 2020, 21, 1–21. [المرجع المتقاطع]

13. كاو، ي.؛ يانغ، س.؛ فنغ، C.؛ زان، دبليو؛ تشنغ، Z.؛ وانغ، س. دينغ، Y.؛ جياو، Y.؛ Du، X. التطور والتحليل الوظيفي لجين الإنترلوكين -17 من Pinctada fucata martensii. الأسماك المحار Immunol. 2019, 88, 102-110. [CrossRef] [مجلات]

14. وانغ، س. شياو، ج. حضن.؛ تشن، ر. لي، م. يتوسط Teng, S. Interleukin-17D التغيرات المرتبطة بعدوى Vibrio harveyi في Tegillarca granulosa من خلال تنشيط البروتين المنشط 1 في الجسم الحي. تربية الأحياء المائية 2023، 566، 739178. [CrossRef]

15. المستوى العاشر؛ صن، ج. لي، Y.؛ يانغ، دبليو؛ وانغ، ل.؛ لينغ، J.؛ يان، X.؛ قوه، Z .؛ يانغ، س. ينظم Wang، L. CgIL17-5 تعبيرات mRNA للمؤثرات المناعية من خلال تحفيز الفسفرة لـ CgMAPKs والانتقال النووي لـ CgRel وCgAP-1 في محار المحيط الهادئ Crassostrea gigas. ديف. شركات. إيمونول. 2022، 127، 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. وانغ، ل.؛ صن، ج. وو، Z .؛ ليان، إكس؛ هان، س. هوانغ، S.؛ يانغ، C.؛ وانغ، ل.؛ ينظم Song، L. AP-1 التعبير عن IL17-4 وIL17-5 في محار المحيط الهادئ Crassostrea gigas. الأسماك المحار Immunol. 2020، 97، 554-563. [المرجع المتقاطع]

17. وو، س.-ز.؛ هوانغ، X.-D.؛ لي، س. هو، م.-X. إنترلوكين -17 في محار اللؤلؤ (Pinctada fucata): الاستنساخ الجزيئي والتوصيف الوظيفي. الأسماك المحار Immunol. 2013، 34، 1050-1056. [المرجع المتقاطع]

18. شين، ل.؛ تشانغ، ه.؛ تشانغ، ر. لي، ه.؛ وانغ، دبليو؛ وانغ، ل.؛ وانغ، ه.؛ تشيو، L.؛ Song, L. CgIL17-5، وهو سيتوكين التهابي قديم في Crassostrea gigas يظهر وظائف عدم التجانس مقارنة بجزيئات إنترلوكين 17 الفقارية. ديف. شركات. إيمونول. 2015، 53، 339-348. [المرجع المتقاطع]

19. دينلي، صباحا؛ بلايز، بب؛ بلاسترك، ر. كيتينغ، الترددات اللاسلكية؛ هانون، GJ معالجة microRNAs الأولية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة. طبيعة 2004، 432، 231-235. [المرجع المتقاطع]

20. خان، د.؛ أنصار أحمد، S. تنظيم IL-17 في أمراض المناعة الذاتية عن طريق عوامل النسخ والـ microRNAs. أمام. جينيت. 2015، 6، 236. [المرجع المتقاطع]

21. مارتن غوميز، ل.؛ فيلالبا، أ.؛ كيرخوفن، RH . Apollo، E. دور microRNAs في عملية مناعة المحار المسطح Ostrea edulis ضد تقبض الحدقة الجيد. تصيب. جينيت. تطور. 2014، 27، 40-50. [CrossRef] [مجلات]

22. شو، ف؛ وانغ، العاشر. فنغ، Y.؛ هوانغ، دبليو؛ وانغ، دبليو؛ لي، ل. فانغ، X.؛ كيو، ه؛ Zhang، G. تحديد الرناوات الدقيقة المحفوظة والجديدة في محار المحيط الهادئ Crassostrea gigas بواسطة التسلسل العميق. بلوس وان 2014، 9، e104371. [المرجع المتقاطع]

23. تشو، Z .؛ وانغ، ل.؛ سونغ، ل.؛ ليو، ر. تشانغ، ه.؛ هوانغ، م. Chen، H. تحديد وخصائص الرنا الميكروي ذات الصلة بالمناعة في خلايا الدم في المحار Crassostrea gigas. بلوس وان 2014، 9، e88397. [CrossRef] [مجلات]

24. بورغوس أسيفيس، ماساتشوستس؛ كوهين، أ. سميث، Y.؛ Faggio، C. تنظيم microRNA المحتمل للجينات المرتبطة بالمناعة في الخلايا الدموية اللافقارية. الخيال العلمي. مجموع البيئة. 2018، 621، 302-307. [المرجع المتقاطع]

25. ووكر، SE. سبنسر، جنرال الكتريك؛ نيكاكوف، أ. Carlone، RL تحديد وتوصيف microRNAs أثناء التجديد الناجم عن حمض الريتينويك للجهاز العصبي المركزي الرخويات. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2018، 19، 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. أبو العلا، ج.م. Faggio، C. استجابة الإجهاد بوساطة MicroRNA في الأنواع ذات الصدفتين. السمية البيئية. البيئة. ساف. 2021، 208، 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. هوانغ، س.؛ يوشيتاكي، ك. أسد الزمان، م.؛ كينوشيتا، س.؛ واتانابي، س. Asakawa، S. Discovery والفهم الوظيفي للmiRNAs في الرخويات: نهج التنميط على مستوى الجينوم. الحمض النووي الريبي بيول. 2021، 18، 1702-1715. [المرجع المتقاطع]

28. روزاني، يو. بورتوليتو، إي. باي، C.-M؛ نوفوا، ب. فيجويراس، أ.؛ فينير، ص. فروم، ب. الحفر في miRNAomes ذات الصدفتين: بين الحفظ والابتكار. فيلوس. عبر. ر. سوك. ب 2021، 376، 20200165. [المرجع المتقاطع]

29. صن، العاشر. تشانغ، T.؛ لي، ل. تو، ك؛ يو، ت.؛ وو، ب. تشو، L.؛ تيان، J.؛ توقيع تعبير Liu، Z. MicroRNA في العضلات المقربة المخططة والسلسة لـ Yesso scallop Patinopecten Yessoensis. علم الجينوم 2022، 114، 110409. [المرجع المتقاطع]

30. تيان، ر. تشنغ، Z.؛ هوانغ، ر. جياو، Y.؛ شارك Du, X. miR-29a في تكوين عرق اللؤلؤ والاستجابة المناعية من خلال استهداف Y2R في Pinctada martensii. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2015, 16, 29436–29445. [المرجع المتقاطع]

31. تشين، هـ؛ تشو، Z.؛ وانغ، ه.؛ وانغ، ل.؛ وانغ، دبليو؛ ليو، ر. تشيو، L.؛ Song، L. إن microRNA الخاص باللافقاريات والمستجيب للمناعة يزيد من بلعمة خلايا الدم البيضاء عن طريق استهداف CgIκB2. الخيال العلمي. مندوب 2016، 6، 1-10. [CrossRef] [مجلات]

32. تشين، هـ؛ تشو، Z.؛ وانغ، ل.؛ وانغ، ه.؛ ليو، ر. تشانغ، ه.؛ Song، L. استهدف miRNA الخاص باللافقاريات نظام الغدد الصم العصبية الكوليني القديم للمحار. افتح بيول. 2016، 6، 160059. [المرجع المتقاطع]

33. تشين، هـ؛ شين، ل.؛ أغنية، X.؛ وانغ، ل.؛ وانغ، دبليو؛ ليو، Z .؛ تشانغ، ه.؛ وانغ، ل.؛ تشو، Z.؛ Qiu، L. A miRNA المستجيب للنوربينفرين يعزز بشكل مباشر تعبير CgHSP90AA1 في خلايا دموية المحار أثناء الجفاف. الأسماك المحار Immunol. 2017، 64، 297-307. [CrossRef] [مجلات]

34. هان، Z .؛ لي، J.؛ وانغ، دبليو؛ لي، J.؛ تشاو، س؛ لي، م. وانغ، ل.؛ Song، L. ينظم الهدوءودولين الذي يستهدفه miRNA سقالة 659_26519 تعبير IL -17 في الاستجابة المناعية المبكرة للمحار Crassostrea gigas. ديف. شركات. إيمونول. 2021، 124، 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. الوقف، Z.؛ لي، C.؛ تشانغ، ب. وانغ، Z .؛ تشانغ، دبليو؛ جين، C.-H. يقوم miR -200 بتعديل الأنشطة المضادة للبكتيريا للخلايا الجوفانية وتحضير LPS من خلال استهداف Tollip في Apostichopus japonicus. الأسماك المحار Immunol. 2015، 45، 431-436. [المرجع المتقاطع]

36. لي، سي؛ تشاو، م. تشانغ، C.؛ تشانغ، دبليو؛ تشاو، العاشر. دوان، X.؛ يقوم Xu، W. miR210 بتعديل انفجار الجهاز التنفسي في خلايا Apostichopus japonicus coelomites عبر استهداف مستقبلات Toll-like. ديف. شركات. إيمونول. 2016، 65، 377-381. [المرجع المتقاطع]

37. الوقف، م. تشن، ه.؛ شاو، Y.؛ لي، C.؛ تشانغ، دبليو؛ تشاو، العاشر. جين، C.؛ Xiong، J. miR -92 a ينظم موت الخلايا المبرمج للخلايا السيلوميتية في خيار البحر Apostichopus japonicus عبر استهداف Aj 14-3-3 ζ في الجسم الحي. الأسماك المحار Immunol. 2017، 69، 211-217. [المرجع المتقاطع]

38. شاو، ي.؛ لي، C.؛ شو، دبليو؛ تشانغ، ب. تشانغ، دبليو؛ يربط Zhao، X. miR -31 استقلاب الدهون وموت الخلايا المبرمج في البكتيريا Apostichopus japonicus التي تتحدى البكتيريا عبر استهداف CTRP9. أمام. إيمونول. 2017، 8، 263. [المرجع المتقاطع]

39. قوه، م.؛ وانغ، Y.؛ فو، العاشر. تاو، دبليو. Li، C. circRNA1149 من Apostichopus japonicus يمنع موت الخلايا المبرمج للخلايا السيلوميتية بمثابة إسفنجة miR -92 لتنظيم تعبير Bax استجابةً لعدوى Vibrio splendidus. تربية الأحياء المائية 2023، 562، 738812. [المرجع المتقاطع]

40. زو، هـ؛ ونغ، ك. لو، م. يانغ، ل.؛ ونغ، S.؛ هو، ج. Xu, X. A MicroRNA-1 – تثبيط مسار NF-κB بواسطة مسار JAK-STAT في اللافقاريات Litopenaeus vannamei. جي إمونول. 2020، 204، 2918-2930. [المرجع المتقاطع]

41. يانغ، هـ؛ شو، Z.؛ قوه، ب. تشانغ، العاشر. لياو، Z .؛ تشى، ص. Yan، X. يكشف التحليل المتكامل لـ miRNAome والنسخة النصية عن تنظيم شبكة miRNA-mRNA في Vibrio alginolyticus المصابة بلح البحر ذو القشرة السميكة Mytilus coruscus. مول. إيمونول. 2021، 132، 217-226. [CrossRef] [مجلات]

42. دي موراليس، JMGR؛ بويج، L.؛ داودين، E.؛ كانيتي، دينار؛ بابلوس، جي إل؛ مارتن، AO؛ جواناتي، CG؛ أدان، أ؛ مونتالبان، إكس؛ Borruel، N. الدور الحاسم للإنترلوكين (IL) -17 في الاضطرابات الالتهابية والمناعية: مراجعة محدثة للأدلة التي تركز على الخلافات. المناعة الذاتية. القس 2020، 19، 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. كاواجوتشي، م.؛ أداتشي، م.؛ أودا، ن.؛ كوكوبو، ف؛ هوانغ، S.-K. IL-17 عائلة السيتوكينات. J. عيادة الحساسية. إيمونول. 2004، 114، 1265-1273. [CrossRef] [مجلات]

44. ستارنز، ت.؛ بروكسمير، سعادة؛ روبرتسون، إم جي؛ Hromas, R. أحدث التقنيات: IL-17D، عضو جديد في عائلة IL-17، يحفز إنتاج السيتوكينات ويمنع تكون الدم. جي إمونول. 2002، 169، 642-646. [CrossRef] [مجلات]

45. جافن، إس إل؛ كرامر، JM. جيفري، جي واي؛ Shen، F. عائلة IL-17 السيتوكينات. فيتام. هورم. 2006، 74، 255-282. [مجلات]

46. ​​روبرتس، س. جوجوين، Y.؛ دي لورجيريل، J .؛ Goetz، F. التراكم السريع لنسخة متجانسة من إنترلوكين 17 في خلايا دموية Crassostrea gigas بعد التعرض البكتيري. ديف. شركات. إيمونول. 2008، 32، 1099-1104. [CrossRef] [مجلات]

47. لي، ج.؛ تشانغ، Y.؛ تشانغ، Y.؛ شيانغ، Z .؛ تونغ، Y.؛ تشو، F.؛ Yu، Z. التوصيف الجينومي وتحليل التعبير لخمسة جينات IL-17 جديدة في محار المحيط الهادئ، Crassostrea gigas. الأسماك المحار Immunol. 2014، 40، 455-465. [المرجع المتقاطع]

48. جافن، SL البنية والإشارات في عائلة مستقبلات IL-17. نات. القس إيمونول. 2009، 9، 556-567. [المرجع المتقاطع]

49. هاتا، ك. أندوه، أ. شيمادا، م.؛ فوجينو، س. بامبا، س. أراكي، Y.؛ أوكونو، T.؛ فوجيياما، Y .؛ Bamba، T. IL-17 يحفز الاستجابات الالتهابية عبر مسارات NF-κB وMAP كيناز في الخلايا الليفية العضلية القولونية البشرية. أكون. جي فيسيول. - الجهاز الهضمي. فيزيول الكبد. 2002، 282، G1035 – G1044. [المرجع المتقاطع]

50. نيموتو، ت.؛ ناكاسا، ت.؛ إيشيكاوا، م.؛ أوكوهارا، أ.؛ إيزومي، ب. دي، م.؛ سوزوكي، O.؛ أداتشي، ن.؛ Ochi, M. MicroRNA-146a يعبر عن الخلايا التائية المنتجة للإنترلوكين-17 في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. BMC العضلي الهيكلي. اضطراب. 2010، 11، 1-11. [المرجع المتقاطع]

51. سريفاستافا، أ.؛ نيكامو، ب. لوهشاروينكال، دبليو؛ جفن العين.؛ ميسجين، F.؛ لاندين، NX؛ ستاهلي، م. بيفارسي، أ.؛ Sonkoly، E. MicroRNA- 146a يمنع IL-17-التهاب الجلد المتوسط ​​ويرتبط وراثيًا بالصدفية. J. عيادة الحساسية. إيمونول. 2017، 139، 550-561. [CrossRef] [مجلات]

52. تشاو، س.؛ تشنغ، Y.؛ Kim، JG microRNA-146a يقلل من تنظيم IL-17 وIL-35 ويمنع تكاثر الخلايا الجذعية في أربطة اللثة البشرية. جي سيل. الكيمياء الحيوية. 2019، 120، 13861-13866. [CrossRef] [مجلات]

53. بودسياد، أ.؛ ستانديفورد، تي جيه؛ بالينجر، مينيسوتا؛ إيكين، ر. بارك، ص. كونكل، إس إل؛ مور، بب. Bhan، U. MicroRNA-155 ينظم الاستجابة المناعية للمضيف للالتهاب الرئوي الجرثومي بعد الفيروس عبر مسار IL-23/IL-17. أكون. جي فيسيول. -خلية الرئة. مول. فيزيول. 2016، 310، L465 – L475. [المرجع المتقاطع]

54. زوس، ج.؛ كومالادا، م.؛ فاليدور، بالعربية؛ لوبيراس، J.؛ لوبيز سوريانو، ف.؛ أرجيليس، JM. بوجدان، سي. Celada، A. LPS يستحث موت الخلايا المبرمج في البلاعم في الغالب من خلال إنتاج الاستبداد لـ TNF-. الدم ج. صباحا. شركة نفط الجنوب. الهيماتول. 2000، 95، 3823-3831.

55. بانرمان، د.د. Goldblum، SE آليات موت الخلايا المبرمج البطانية الناجم عن عديد السكاريد الدهني البكتيري. أكون. J. Physiol.-خلايا الرئة. مول. فيزيول. 2003، 284، L899 – L914. [المرجع المتقاطع]

56. براس، مارك ألماني؛ هولينجسورث، جي دبليو؛ سينك، م.؛ لي، Z .؛ بوتس، E.؛ تولوزا، إي. فوستر، وم. Schwartz، DA استنشاق LPS المزمن يسبب تغيرات تشبه انتفاخ الرئة في رئة الفأر المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. أكون. جيه ريسبير. خلية مول. بيول. 2008، 39، 584-590. [المرجع المتقاطع]

57. التنين، س.؛ صفار، ع. شان، ل.؛ Gounni، AS IL-17 يخفف من التأثيرات المضادة لموت الخلايا المبرمج لـ GM-CSF في العدلات البشرية. مول. إيمونول. 2008، 45، 160-168. [CrossRef] [مجلات]

58. تشو، ف. وانغ، س. قوه، C.؛ وانغ، العاشر. تساو، X.؛ شي، ي.؛ جاو، ف. ماك.؛ Zhang، L. IL-17 يستحث موت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية الوعائية - وهي آلية محتملة لمتلازمة الشريان التاجي الحادة البشرية. كلين. إيمونول. 2011، 141، 152-160. [المرجع المتقاطع]

59. تشانغ، Y.؛ العلوان، ل.؛ أودوسو، إس؛ شويالي، ف؛ كارليفارو فيتا، J .؛ إيواكورا، Y.؛ باجلول، سي جيه؛ إيدلمان، دي إتش؛ حميد، Q. الحذف الجيني لـ IL-17A يقلل من الالتهاب الناجم عن دخان السجائر وموت الخلايا المبرمج للخلايا السنخية من النوع الثاني. أكون. جي فيسيول. -خلية الرئة. مول. فيزيول. 2014، 306، L132 – L143. [المرجع المتقاطع]

60. هو، دبليو. جين، Y.-H؛ كانغ، HS. يعمل Kim و BS Interleukin -6 (IL -6) و IL -17 بشكل تآزري على تعزيز الثبات الفيروسي عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج الخلوي ووظيفة الخلايا التائية السامة للخلايا. جي فيرول. 2014، 88، 8479-8489. [المرجع المتقاطع]

61. وانغ، س. جفن العين.؛ هان، Y.؛ دينغ، العاشر. شو، T.؛ Tang، B. MicroRNA -146 يحمي الخلايا A549 و H1975 من موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS وإصابة الالتهاب. جيه بيوسشي. 2017، 42، 637-645. [CrossRef] [مجلات]

62. تشين، ي.؛ وو، Z .؛ يوان، ب. دونغ ذ.؛ تشانغ، L.؛ Zeng، Z. MicroRNA-146a-5p يخفف من تنشيط الخلايا النجمية الكبدية الناجم عن التشعيع و LPS وموت الخلايا المبرمج لخلايا الكبد من خلال تثبيط مسار TLR4. ديس موت الخلية 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [مجلات]

63. دينغ، واي؛ وانغ، ل.؛ تشاو، س؛ وو، Z .؛ يمنع Kong، L. MicroRNA-93 موت الخلايا المبرمج للخلايا الغضروفية والالتهاب في التهاب المفاصل العظمي عن طريق استهداف مسار إشارات TLR4/NF-κB. كثافة العمليات. جيه مول. ميد. 2019، 43، 779-790. [المرجع المتقاطع]

64. وان، ج. أي.؛ تاو، J.؛ وانغ، Y.؛ تشو، س. يانغ، ر. Liang, Q. MicroRNA-129-5p يخفف من إصابة الحبل الشوكي لدى الفئران عن طريق قمع موت الخلايا المبرمج والاستجابة الالتهابية من خلال مسار HMGB1/TLR4/NF-κB. بيوسسي. النائب 2020، 40، BSR20193315. [CrossRef] [مجلات]

65. كه، X.-F.؛ فانغ، J.؛ وو، X.-N.؛ يو، سي.-ه. يعمل MicroRNA -203 على تسريع موت الخلايا المبرمج في الخلايا الظهارية السنخية المحفزة بـ LPS من خلال استهداف PIK3CA. الكيمياء الحيوية. بيوفيس. الدقة. مشترك. 2014، 450، 1297-1303. [CrossRef] [مجلات]

66. تشى، ب. Tang، Z. يؤدي جزيء Nrf2 إلى تحفيز دفاع مضاد للأكسدة ضد التعرض الحاد للبنزو (أ) بيرين في بلح البحر ذو القشرة السميكة Mytilus coruscus. أكوات توكسيكول 2020، 226، 105554. [CrossRef]

67. شميتجن، تي دي؛ Livak، KJ تحليل بيانات PCR في الوقت الحقيقي باستخدام طريقة التصوير المقطعي المقارن. نات. بروتوك. 2008، 3، 1101-1108. [المرجع المتقاطع]