علم الوراثة للأستيوبونتين لدى المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن: الدراسة الألمانية لأمراض الكلى المزمنة Ⅳ

المتغيرات والقياسات الأساسية

تم قياس مجموعة موحدة من المؤشرات الحيوية في مختبر مركزي معتمد باستخدام بروتوكولات موحدة [81]. من بين أشياء أخرى، تم قياس كمية الكرياتينين والألبومين من المصل والبول باستخدام منهجية IDMS التي يمكن تتبعها (الكرياتينين بلس، روش، ألمانيا) وطريقة قياس العكر (تينا كوانت، روش، ألمانيا) Roche/Hitachi MODULAR P، على التوالي. تم تقدير معدل الترشيح الكبيبي (GFR) باستخدام CKD-EPI القائم على الكرياتينين للمولا (الوحدة: مل/دقيقة/1.73 م2، [82]). تم حساب UACR على أنه قياس الألبومين البولي / الكرياتينين البولي ناري (مجم / جم، [83]). تم الإبلاغ عن العمر والجنس ذاتيًا في الزيارة الأساسية. في عام 2015، تم قياس OPN من عينات المصل الأساسية لمجموعة دراسة GCKD الكاملة باستخدام تقنية المقايسة المناعية لإنزيم الساندويتش الكمي (ELISA للمرحلة الصلبة؛ Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 من R&D Systems (R&D Systems Europe، Abingdon، UK )). تم إجراء القياس الكمي في معهد الكيمياء السريرية والطب الخطابي المعملي، جرايفسفالد، ألمانيا. كانت معاملات التباين (المقايسة البينية) 4.5% و5.3% و3.5% للمستويات المنخفضة والمتوسطة والعالية على التوالي. وكان معامل التباين بين الفحص 6.4٪. تم استخدام الكواشف والمعايير الثانوية على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.

عشبة تقليدية عضوية لصحة الكلى

التنميط الجيني ومراقبة الجودة والإسناد

تم وصف المعلومات التفصيلية حول التنميط الجيني وتنظيف البيانات في دراسة GCKD سابقًا [18]. باختصار، تم عزل الحمض النووي من الدم الكامل وتم تنميطه وراثيًا عند 2,612,357 مجموعة متنوعة لـ 5,123 مشاركًا في GCKD باستخدام مصفوفة Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina، GenomeStudio، Genotyping Module Version 1.9.4) في مركز هيلمهولتز في ميونيخ. تم إجراء تنظيف البيانات بشكل منفصل لمحتوى Omni2.5 ومحتوى شريحة exome الخاصة بالمصفوفة. استنادًا إلى البروتوكولات الموحدة [84]، تم استخدام البرامج النصية المكتوبة المخصصة (R، Perl) وبرنامج Plink1.9 [85] لمراقبة الجودة (QC) لمحتوى Omni2.5. وتضمنت خطوات مراقبة الجودة المبنية على العينات فحوصات معدل الاتصال والجنس وتغاير الزيجوت والأصل الوراثي والارتباط، مما أدى إلى استبعاد 89 عينة. على مستوى المتغير، تم استبعاد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) إذا كان معدل الاتصال كذلك<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

دراسة الارتباط على مستوى الجينوم للمتغيرات الشائعة

كما تم الإبلاغ سابقًا [17،18]، تم إجراء GWAS للمشاركين في GCKD باستخدام بيانات التنميط الجيني الكامل (Omni2.5) وeGFR وUACR وlog2(OPN) (N=4,897) باستخدام انحدار خط الأذن لـ log2 (OPN) على SNPs (النموذج الوراثي الإضافي) مع MAF بنسبة 1٪، معدلة حسب العمر والجنس والسجل (eGFR) والسجل (UACR) (S1 الشكل). تم إجراء تحليل الارتباط باستخدام SNPTEST v2.5 [89]. تم فحص الإحصائيات الموجزة للتأكد من الجودة باستخدام GWAtoolbox [90] وللتضخم باستخدام التحكم الجيني [91]. ومع ذلك، لم يُطلب تصحيح التحكم الجينومي ( lect=1.01). الجمعيات ذات القيمة p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

تم إجراء شرح وظيفي للمتغيرات باستخدام ANNOVAR [92]، وSNiPA [93]، وOpen Targets Genetics [94]، وFAVOR [95]، وRegulomeDB [96]. تم رسم مؤامرات الارتباط الإقليمي باستخدام LocusZoom v1.3 [97].

رسم الخرائط الدقيقة

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

تحليلات التوطين المشترك

من أجل فهم الآليات الجزيئية والأنماط الظاهرية المرتبطة بها الكامنة وراء الارتباطات بشكل أكبر، أجرينا تحليلات التوطين المشترك لإحصائيات ملخص OPN GWAS المتعلقة بموقعي OPN المكررين مع إحصائيات ملخص GWAS من ثلاثة مصادر أخرى كما هو موضح أدناه. بالنسبة لجميع تحليلات التعريب المشترك، استخدمنا وظيفة "coloc.fast" من حزمة R gtx مع المعلمات الافتراضية والتعريفات السابقة (https://github.com/ tobyjohnson/gtx)، وهو تطبيق تم تقديم نسخة معدلة من طريقة التعريب المشترك بواسطة جيامبارتولومي وآخرون. [98]. نحن نعتبر التوطين المشترك إيجابيًا عندما يكون الاحتمال المحتمل للمتغير السببي المشترك في موضع الارتباط لكلتا السمتين (H4، p12) > 0.8.

التعبير الجيني.

أولاً، استخدمنا إحصائيات ملخص GWAS لبيانات التعبير الجيني من مشروع GTEx [99] ودراسة NEPTUNE [100). تم تنزيل بيانات eQTL من GTEx V8 (49 من الأنسجة) ودراسة NEPTUNE (NephQTL من الكبيبة وأجزاء الكلى tubulointerstitial) من بوابة GTEx (https://www.gtexportal.org/home/) وموقع الويب NephQTL (http //nephqtl.org/)، على التوالي. تم وصف خطوات تحليل التوطين المشترك بالتفصيل في مكان آخر [17]. أولاً، تم استخراج ملخصات GWAS لـ GTEx وNephQTL في المناطق الجينومية ± 100 كيلو بايت من OPN SNPs. يتم تحديد الجينات الموجودة في GWAS المستخرجة ولكل جين، يتم تحديد نافذة رابطة الدول المستقلة بحجم 500 كيلو بايت تحيط ببداية ونهاية الجين. بعد ذلك، بالنسبة لكل نافذة جينات رابطة الدول المستقلة، مع وجود SNP واحد على الأقل له قيمة p أقل من 0.001، تم استخراج ملخصات GWAS لأنسجة GTEx وNephQTL بالإضافة إلى OPN GWAS واستخدامها كمدخل لتحليل التوطين المشترك.