اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides تحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الخلايا الكبدية H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية

Pengfei يوان¹ وآخرون

الملخص

خلفية: Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight هو دواء صيني تقليدي يتطفل على جذور نبات Tamarix ويستخدم لعلاج الضعف الجنسي والعقم وضعف الجسم وكمقوي. ومع ذلك ، فإن تأثيره المضاد للأورام على سرطان الخلايا الكبدية لا يزال بعيد المنال. هنا ، قمنا بالتحقيق في التأثير المضاد للورمCistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد(CTPG) على خلايا سرطان الخلايا الكبدية H22 في المختبر وفي الجسم الحي وآلياته.

طُرق:التشكل ، والبقاء ،موت الخلايا المبرمجودورة الخلية وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر) لخلايا H22 بواسطة الفحص المجهري المقلوب ومقايسة MTT وقياس التدفق الخلوي على التوالي. التعبير وتفعيل البروتينات فيموت الخلايا المبرمجتم الكشف عن المسار بواسطة لطخة ويسترن. تم تقييم التأثير المضاد للورم في الجسم الحي في نموذج فأر للورم تم إنشاؤه باستخدام ذكور فئران كونمينغ.

نتائج:أدى علاج CTPG إلى تثبيط نمو خلايا H22 بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت ، والتي ارتبطت بزيادةموت الخلايا المبرمجوتوقف دورة الخلية في مراحل G 0 / G1 و G2 / M. علاوة على ذلك ، لوحظ تكاثف الكروموسومات في خلايا H22 المعالجة بـ CTPG. أدى علاج CTPG إلى زيادة كبيرة في نسبة Bax / Bcl -2 ، وخفض ميكرومتر ، وتعزيز إطلاق السيتوكروم ج. تم زيادة مستويات caspase المشقوق -8 و caspase -9 في كل من مسارات الإشارات الخارجية والداخلية بشكل كبير عن طريق caspase التي يتم تنشيطها بالتتابع -7 و -3 لتقسيم PARP. أخيرًا ، منع CTPG نمو خلايا H22 في الفئران وحسن معدل بقاء الفئران المصابة بالورم.

الاستنتاجات: تشير هذه النتائج إلى أن CTPG يحد من نمو خلايا H22 من خلال كل من الخارجية والداخليةموت الخلايا المبرمجالمسارات.

الكلمات الدالة: Cistanche tubulosa, جليكوسيدات فينيلثانويد, موت الخلايا المبرمج، مسار الإشارات ، نموذج الفأر الورم

Cistanche tubulosaجليكوسيدات فينيلثانويد

خلفية

يحتل سرطان الكبد المرتبة السادسة في حالات الإصابة بالسرطان والرابعة في الوفيات الناجمة عن السرطان على مستوى العالم. علاوة على ذلك ، فقد احتلت المرتبة الرابعة من حيث الإصابة بالسرطان والأول من حيث الوفيات بالسرطان في البلدان ذات المؤشر الاجتماعي الديموغرافي المنخفض [1]. يُعد سرطان الكبد في الصين ثالث سبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في عام 2015 [2]. أكثر من 90 بالمائة من سرطانات الكبد الأولية هي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) في العالم [3]. حاليًا ، يعتبر الاستئصال الكبدي هو الخيار الرئيسي لعلاج سرطان الكبد. ومع ذلك ، فإن أقل من 30 في المائة من المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد يستوفون معايير الاستئصال الكبدي العلاجي ولا يزال معدل البقاء على قيد الحياة العام 5- منخفضًا مثل 35-50 في المائة بسبب معدل التكرار المرتفع [4 ، 5] . إن توفر خيارات العلاج لمرضى سرطان الكبد (HCC) من المستوى المتوسط ​​إلى المتقدم محدود للغاية. تمت الموافقة على سورافينيب ، وهو دواء موجه جزيئيًا ، من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية كخط العلاج الأول لمرض سرطان الكبد (HCC) المتقدم. ومع ذلك ، فإن سورافينيب يطيل فقط حوالي 3 أشهر من البقاء على قيد الحياة ومعدل الاستجابة أقل من 4 في المائة [6 ، 7]. من الضروري تطوير عقاقير أو استراتيجيات جديدة ضد سرطان الكبد.

تم استخدام الطب الصيني التقليدي (TCM) بمفرده أو مع استراتيجيات أخرى لعلاج سرطان الكبد وأظهر الفوائد السريرية بما في ذلك فترة البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة ، وتحسين نوعية الحياة ، وتقليل التفاعلات الضائرة ، وما إلى ذلك [8 ، 9]. Cistanche ، وهو نوع من الطب الصيني التقليدي ، له وظائف بيولوجية مختلفة ، مثل مضادات الأكسدة ، ومكافحة الالتهاب ، ومكافحة الشيخوخة ، والحماية العصبية [10 ، 11].جليكوسيدات فينيلثانويدتم اعتبار المكونات النشطة الرئيسية لـ Cistanche ، والتي لها أنشطة متنوعة بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومكافحة الالتهاب ، وحماية الكبد ، والحماية العصبية [12-15]. لقد أبلغت مجموعتنا عن ذلكCistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد(CTPG) يمكن أن تحفزموت الخلايا المبرمجفي الورم الميلانيني B 16- خلايا F10 وتمنع نمو الأورام في الفئران [16]. في هذه الدراسة ، قمنا بقياس التأثير المضاد للورم لـ CTPG على خلايا HCC H22 في المختبر وفي الجسم الحي وبحثنا في آلياته. وجدنا أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)الناجم عنموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية على حد سواء وقمعت نمو أورام H22 في الفئران.

طُرق

خط الخلية

تم الحصول على خلايا سرطان الخلايا الكبدية للفأر H22 من مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية بجامعة شينجيانغ (أورومكي ، شينجيانغ ، الصين) وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 (Gibco) مع 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، ومصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10 في المائة (جيبكو) عند 37 درجة في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

فحص MTT

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم شراؤها من Hetian Dichen Biotech Co.، Ltd. (Hetian ، Xinjiang ، الصين) ، والمركبات الرئيسية لـ CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم تأهيلها وقياسها بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء [16]. تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- yl) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) (Sigma، St. ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تلقيح خلايا H22 في 96- ألواح بئر بكثافة 2 × 1 0 4 خلايا في وسط 1 0 مايكرولتر لكل بئر وتم تربيتها عند 37 درجة. بعد 24 ساعة ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من CTPG (0.100 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO (يساوي 400 ميكروغرام / مل CTPG) لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. بعد الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق ، تم التخلص من المادة الطافية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT (5 مجم / مل في PBS) إلى كل بئر. تم تحضين الصفائح عند 37 درجة لمدة 4 ساعات وأضيف 100 مايكرولتر DMSO لإذابة بلورات فورمازان المتكونة. تم الكشف عن قيم OD490 بواسطة 96- قارئ جيد للصفيحة الدقيقة (مختبرات Bio-Rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب صلاحية الخلية وفقًا للصيغة: قابلية بقاء الخلية (النسبة المئوية)=(معالجة OD / معالجة OD غير معالجة) × 100 بالمائة.

Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides

الكشف عن موت الخلايا المبرمج

عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)({0} ، 100 ، 200 ، 300 ، 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة ، ثم ملطخة بـ Annexin VFITC / Propidium iodide (PI)موت الخلايا المبرمجطقم الكشف (YEASEN ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية).

الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا

عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)(0 و 200 و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، ثم تم صبغها بصبغة JC -1 المنفذة للغشاء (بيوتايم ، الصين) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة. بعد الغسيل مرتين باستخدام محلول JC -1 ، تم تعليق العينات باستخدام 300 مايكرولتر من محلول JC -1 وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل دورة الخلية

تم تلقيح خلايا H22 في أطباق استنبات بحجم 6 0 ملم وعولجت بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 1 0 0،200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة . تم جمع جميع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تثبيت الخلايا في 70 في المائة من الإيثانول المثلج عند - 20 درجة لمدة ساعتين وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم أعيد تعليقها في محلول تلطيخ يوديد بروبيديوم / RNase 300 ميكرولتر (BD Biosciences). بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تم جمع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تحليل توزيع دورة الخلية باستخدام برنامج ModFit LT 3.0.

جليكوسيدات فينيلثانويدفيCistanche tubulosa

Hoechst 33258 تلطيخ

تم تحليل التغيرات المورفولوجية لنواة خلية H22 بواسطة صبغة Hoechst 33258 التي يمكن نفاذها بالغشاء. تم زرع خلايا H22 في 6- صفيحة بئر بتركيز 1 × 105 خلية / بئر في وسط 2 مل. بعد التقاء 60 في المائة ~ 70 في المائة ، عولجت الخلايا باستخدام CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)(0 و 100 و 200 و 300 و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة. تم جمع الخلايا وتثبيتها باستخدام 4 في المائة من بارافورمالدهيد جليدي بارد عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم تلوين الخلايا بـ Hoechst 33258 (Beyotime ، الصين) عند 4 درجات لمدة 10 دقائق. تمت ملاحظة العينات بواسطة مجهر مضان مقلوب (Nikon Eclipse Ti-E ، اليابان).

لطخة غربية

تم شراء Anti-caspase -3 و anti-cleaved caspase -3 و Anti-Bcl -2 و anti-Bax من Beyotime Biotech Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين). Anti-caspase -7، anti-cleaved-caspase -7، anti-caspase -8، anti-cleaved-caspase -8، anti-caspase -9، anti تم شراء Caspase المشقوق -9 ومضاد PARP ومضاد PARP ومضاد IgG-HRP المضاد للفيروس ومضاد الأرانب IgG-HRP من Cell Signaling Technology. تم شراء Anti - - actin من شركة Beijing ComWin Biotech Co.، Ltd. (بكين ، الصين).

عولجت خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)({0} ، 100 ، 200 ، 300 و 400 ميكروغرام / مل) أو 0.3 بالمائة DMSO لمدة 24 ساعة. تم جمع الخلايا وفصلها باستخدام Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co. ، Ltd) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم تدوير العينات (12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات) لجمع المواد الطافية وتم قياس تركيزات البروتين بواسطة مجموعة BCA (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عزل كمية متساوية من البروتين في كل عينة بنسبة 12 بالمائة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF (Biosharp ، الصين). بعد الحجب باستخدام محلول TBST يحتوي على 5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم ، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الأولية المقابلة والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل (HRP) ، على التوالي. بعد الغسل باستخدام TBST ، تم اكتشاف البروتينات المستهدفة بواسطة مجموعة اختبار ECL (Beyotime ، الصين).

بيان الحيوانات والأخلاق

تم شراء 6-8 أسبوع من فئران كونمينغ من الذكور من مركز مختبر الحيوان بجامعة شينجيانغ الطبية (أورومتشي ، شينجيانغ ، الصين). تم الاحتفاظ بالفئران في منشأة حيوانية قياسية يتم التحكم في درجة حرارتها ودورة ضوئية في جامعة شينجيانغ. تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة شينجيانغ. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية (BRGE-AE001) ، جامعة شينجيانغ.

دراسة ورم الفأر

لتحريض نموذج فأر الورم ، تم حقن ذكور فئران كونمينغ تحت الجلد باستخدام 1 × 1 0 6 خلايا H22 في 100 ul PBS في الجناح الأيمن. بعد 3 أيام ، تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى 3 مجموعات (7 فئران / مجموعة). تم حقن مجموعة التحكم بـ 0.1 مل DMSO تحت الجلد حول الورم. تم حقن مجموعات CTPG -200 و CTPG -400 تحت الجلد باستخدام 200 أو 400 مجم / كجم من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)في 0. 1 مل DMSO حول الورم. تم علاج الفئران كل يومين لمدة تصل إلى 21 يومًا. تم قياس أحجام الورم باستخدام الفرجار حتى 25 يومًا وتم حساب حجم الورم وفقًا للصيغة: حجم الورم (مم 3)=(الطول × العرض 2) / 2. بعد 25 يومًا ، تمت مراقبة بقاء الفئران المصابة بالورم يوميًا حتى نهاية هذه الدراسة.

تحليل احصائي

تم حساب الدلالة الإحصائية من خلال تحليل أحادي الاتجاه للتباين بين العلاج ومجموعات المراقبة. تم التعبير عن جميع البيانات على أنها متوسط ​​الانحراف المعياري (SD). p <0. 05="" اعتبرت="" ذات="" دلالة="">

نتائج

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قلل من جدوى خلايا H22 في المختبر

من أجل استكشاف التأثير المضاد للورم لـ CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم علاج خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 و 100 و 200 و 300 و 400 ميكروغرام / مل) في المختبر. بعد 24 ساعة ، لوحظ شكل خلايا H22 باستخدام مجهر مقلوب. وجدنا أن مورفولوجيا خلايا H22 قد تغيرت بشكل كبير من خلال علاج CTPG. مع زيادة تركيز CTPG ، أصبحت الخلايا صغيرة ومستديرة وانخفض عدد الخلايا أيضًا بشكل كبير (الشكل 1 أ). تم استخدام اختبار MTT لتحليل صلاحية خلايا H22 بعد علاج CTPG لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قلل بشكل كبير من قابلية بقاء خلية H22 بطريقة تعتمد على الجرعة وتعتمد على الوقت (الشكل 1 ب). CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)عند 300 ميكروغرام / مل وصلت إلى أفضل معدل مثبط (الشكل 1 ج). قيم IC50 من CTPG لخلايا H22 هي 236 ميكروغرام / مل عند 24 ساعة و 169.8 ميكروغرام / مل عند 48 ساعة.

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)المستحثة في الخلايا H22

لاستكشاف ما إذا كان يتم التوسط في انخفاض قابلية خلايا H22 عن طريق تحريضموت الخلايا المبرمج، تم معالجة خلايا H22 بتركيزات مختلفة من CTPG (0 ، 100 ، 200 ، 300 ، و 400 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة وملطخة بـ PI و Annexin V. وأظهرت نتائج قياس التدفق الخلوي أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)المستحثة بشكل كبيرموت الخلايا المبرمجمن خلايا H22 (بما في ذلك الخلايا المبكرة والمتأخرةموت الخلايا المبرمج) بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 2 أ). على الرغم من أن الجرعة العالية من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)يؤدي أيضًا إلى زيادة نخر خلايا H22 بشكل كبير ، ويلعب النخر دورًا ثانويًا في تثبيط نمو خلايا H22 نظرًا لانخفاض نسبته (8.3 بالمائة) مقارنةً بنسبه.موت الخلايا المبرمج(52.6 في المائة). علاوة على ذلك ، تم عزل البروتينات الكلية لخلايا H22 بعد CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم الكشف عن العلاج والتعبير عن سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية 2 المضادة للاستماتة (Bcl -2) والبروتين X المرتبط -2- ببروتين X (Bax) بواسطة لطخة ويسترن. أظهرت بيانات المسح بتدرج الرمادي أن مستويات التعبير عن Bax و Bcl -2 زادت وانخفضت على التوالي. تمت زيادة نسبة Bax / Bcl -2 بشكل ملحوظ (الشكل 2 ب). تشير هذه النتائج إلى أن CTPG يستحثموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22.

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)يحث على تكثيف الكروموسومات وتوقف دورة الخلية في خلايا H22

تم الإبلاغ عن أن تلف الحمض النووي وتوقف دورة الخلية الناجم عن الأدوية يمكن أن يمنع نمو خلايا الورم ويسببموت الخلايا المبرمجفي الخلايا السرطانية [17 ، 18]. للكشف عن مورفولوجيا النوى في خلايا H22 بعد CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)العلاج لمدة 24 ساعة ، تم تلوين خلايا H22 بواسطة Hoechst 33،342 ولوحظ باستخدام الفحص المجهري الفلوري المقلوب. CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)أظهرت الخلايا المعالجة زيادة تعتمد على الجرعة من كروماتين النوى المكثف بشكل مشرق ، بينما أظهرت الخلايا غير المعالجة نوى ملطخة بشكل متجانس (الشكل 3 أ). تم تحليل توزيع دورة الخلية في خلايا H22 بشكل أكبر عن طريق تلطيخ PI بعد علاج CTPG لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)أدى العلاج إلى زيادة كبيرة في نسبة الخلايا G {{0} / G 1- وخلايا G2 / M-phase وقلل بشكل ملحوظ نسبة خلايا المرحلة S ، مما يشير إلى أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)يسبب توقف طور G 0 / G1 و G2 / M في خلايا H22. كما أدت الجرعة العالية من CTPG إلى زيادة كبيرة في نسبة خلايا G1 الفرعية.

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قلل من إمكانات غشاء الميتوكوندريا وزاد من إطلاق السيتوكروم ج

يلعب المسار المعتمد على الميتوكوندريا دورًا مهمًا في تحريضموت الخلايا المبرمج[19 ، 20]. يمكن أن تكون التغييرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ميكرومتر)

التي تمت مراقبتها بواسطة تلطيخ JC -1 بسبب JC -1 يمكن أن يتفكك (التألق الأحمر) إلى مونومر (مضان أخضر) مع تقليل ميكرومتر [21]. بعد CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)العلاج لمدة 24 ساعة ، تلطخت خلايا H22 بصبغة JC -1. أظهرت بيانات قياس التدفق الخلوي أن التألق الأحمر في قناة FL -2 والتألق الأخضر في قناة FL -1 قد انخفض بشكل كبير وزاد عند CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)علاج او معاملة. تمت زيادة نسبة خلايا PE-FITC plus بشكل كبير (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)خفض ميكرومتر في خلايا H22. وهذا يتوافق مع نسبة Bax / Bcl المتزايدة -2. ونتيجة لذلك ، لاحظنا زيادة كبيرة في إطلاق السيتوكروم ج عند CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)العلاج (الشكل 4 ب). أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG قد يحفز جزئيًاموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22 عبر مسار (جوهري) يعتمد على الميتوكوندريا.

قام CTPG بتنشيط مسار caspase ومنع إصلاح الحمض النووي

بعد ذلك ، يتم تنشيط كاسباس الناجم عن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)عبر كل من مسارات الإشارات الخارجية والداخلية تم تحليلها. بعد CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)لمدة 24 ساعة ، تم عزل البروتينات الكلية من خلايا H22 وتم الكشف عن مستويات الكاسبيز المؤيد والمشقوق بواسطة لطخة ويسترن. بالمقارنة مع التحكم غير المعالج أو DMSO ، CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)عزز العلاج بشكل كبير ليس فقط مستوى الكاسبيز المشقوق -8 (المسار الخارجي) ولكن أيضًا مستوى الكاسبيز المشقوق -9 (المسار الداخلي) (الشكل 5). بالتتابع ، قام caspase المنشط -8 و -9 بتقسيم pro-caspase المصب -3 و -7 اللذان تم ملاحظتهما في الشكل 5. caspase المنشط -3 شق الحمض النووي إصلاح إنزيم بوليميريز بولي (ADP-ribose) (PARP) لمنع إصلاح الحمض النووي وتراكم تلف الحمض النووي كما لوحظ في الشكل 3 أ. أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)الناجم عنموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية.

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)يمنع نمو H22 HCC في الجسم الحي ويحسن معدل بقاء الفئران المصابة بالورم

أخيرًا ، التأثير المضاد للورم لـ CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم تقييم سرطان الخلايا الكبدية في نموذج فأر الورم ، والذي تم إنشاؤه عن طريق الحقن تحت الجلد لخلايا H22. بعد 3 أيام من حقن الخلايا H22 ، تم علاج الفئران المصابة بالورم باستخدام CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)8 مرات. تمت مراقبة وزن جسم الفئران وأحجام الورم في النقاط الزمنية المحددة. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، لا يوجد فرق كبير في وزن جسم الفئران في كل مجموعة ، مما يشير إلى أن الجرعات المختارة من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)ليس لها آثار جانبية واضحة. ومن المثير للاهتمام أن نمو الورم في الفئران التي عولجت بكل من 200 مجم / كجم و 400 مجم / كجم من CTPG قد تم تثبيطه بشكل كبير (الشكل 6 ب). علاوة على ذلك ، جرعتان من CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)أدى العلاج إلى تحسن كبير في بقاء الفئران المصابة بالورم (3/7 ، 3/7) مقارنةً بالمجموعة الضابطة (0 / 7) في نهاية التجربة (الشكل 6 ب). وجدنا أيضًا أن CTPG عزز بشكل كبير تكاثر الخلايا الطحالية المعزولة من فئران كونمينغ الذكرية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6 ج) ، مما يشير إلى أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)له تأثير مناعي.

مناقشة

تم استخدام الطب الصيني التقليدي لعلاج أمراض مختلفة بما في ذلك السرطانات على مدى تاريخ طويل. تم الإبلاغ عن أن الطب الصيني التقليدي يمكن أن يحفزموت الخلايا المبرمجفي أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية من خلال مسارات إشارات خارجية (بوساطة مستقبلات الموت) وداخلية (تعتمد على الميتوكوندريا) لممارسة تأثيرات مضادة للأورام [22-25]. يمكن للمسارين تنشيط caspase -8 و -9 على التوالي [24 ، 26]. هنا ، وجدنا أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قمع بشكل كبير نمو خلايا H22 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية. تم تنظيم مستويات caspase المشقوق -8 و -9 بشكل كبير بواسطة CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)العلاج ، مما يشير إلى أن كلا من مسارات الإشارات الخارجية والداخلية كانت متورطة في تحريضموت الخلايا المبرمج. أظهرت دراستنا السابقة أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)المستحثة في موت الخلايا المبرمج في الورم الميلانيني B 16- خلايا F10 من خلال مسار يعتمد على الميتوكوندريا أدى إلى زيادة مستوى الكاسبيز المشقوق -9 ولكن ليس الكاسبيز -8 [16]. CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قد ينشط مسارات إشارات مميزة في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية.

يتم تنظيم سلامة غشاء الميتوكوندريا بإحكام من قبل أعضاء عائلة بروتين BCL {{0} بما في ذلك Bax و Bcl -2 [27 ، 28]. تلعب نسبة Bax إلى Bcl -2 دورًا مهمًا في الاعتماد على الميتوكوندرياموت الخلايا المبرمجالمسار [29]. في خلايا H22 المعالجة بواسطة CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)تم تنظيم نسبة Bax / Bcl -2 بشكل كبير ، مما قد يتسبب في تقليل ميكرومتر وإطلاق السيتوكروم ج الذي لوحظ في هذه الدراسة. نتيجة لذلك ، تم شق وتفعيل pro-caspase -9. أخيرًا ، قام منشئو caspase النشط -8 و -9 بتنشيط منفّذ caspase -3 لشق PARP لمنع إصلاح الحمض النووي. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن CTPG مستحثموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية. في نموذج فأر الورم ، قام CTPG بقمع نمو H22 HCC بشكل كبير وحسن بشكل كبير من بقاء الفئران المصابة بالورم. ومن المثير للاهتمام أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)شجع الاعتماد على الجرعة تكاثر الخلايا الطحالية من فئران كونمينغ ، وهو ما يتوافق مع دراستنا السابقة [16]. تشير هذه النتائج إلى أن CTPG قد يثبط نمو H22 HCC في الفئران من خلال التأثير المباشر المضاد للورم وتعزيز المناعة غير المباشر.

Cistanche tululosaمنتجات

الاستنتاجات

CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قمع نمو خلايا H22 في المختبر وفي الجسم الحي والمستحثموت الخلايا المبرمجفي خلايا H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية. أشارت هذه البيانات إلى أن CTPG(Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد)قد يكون مرشحًا محتملًا لعلاج سرطان الكبد.

الاختصارات

Bax: BCL -2- بروتين X مرتبط ؛ Bcl -2: سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية 2 ؛ CTPG:Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويد؛ سرطان الكبد: سرطان الخلايا الكبدية. HRP: بيروكسيداز الفجل ؛ MTT: 3- (4، 5- dimethylthiazol -2- yl) -2، 5- diphenyltetrazolium bromide؛ PARP: إنزيم إصلاح DNA لبوليميراز بولي (ADP-ribose) ؛ الطب الصيني التقليدي: الطب الصيني التقليدي ؛ Δψm: إمكانات غشاء الميتوكوندريا

التمويل

تم دعم هذا العمل من خلال مشروع تقديم المواهب عالية المستوى لمنطقة Xinjiang Uygur ذاتية الحكم إلى JL ، ومنحة مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31460241) إلى JL ، وصندوق بدء الدكتوراه بجامعة شينجيانغ (BS160261 إلى XW و BS150236 إلى YL).

توافر البيانات والمواد

البيانات الأولية لهذه الدراسة متاحة بناء على طلب معقول للمؤلف المقابل.

مساهمات المؤلفين

صممت JL و JL التجارب. أجرى PY و JL و AA و YY التجارب. حللت LX و XW و YL البيانات. كتب PY و JL و JL المخطوطة. ساهم جميع المؤلفين بالمخطوطة النهائية ووافقوا عليها.

موافقة الأخلاق

تمت الموافقة على الدراسة التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية بجامعة شينجيانغ

تضارب المصالح

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

تفاصيل المؤلف

¹مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية ، كلية علوم وتكنولوجيا الحياة ، جامعة شينجيانغ ، 666 Shengli Road ، Urumqi ، Xinjiang 830046 ، الصين.²كلية علوم الحياة ، جامعة شينجيانغ نورمال ، 102 طريق شينيى ، أورومتشي 830054 ، شينجيانغ ، الصين.³مستشفى الأورام التابع لجامعة شينجيانغ الطبية ، أورومتشي 830011 ، الصين.

Cistanche tululosaمنتجات

من: 'Cistanche tubulosa جليكوسيدات فينيلثانويدإستنتجموت الخلايا المبرمجفي خلايا سرطان الخلايا الكبدية H22 من خلال مسارات الإشارات الخارجية والداخلية على حد سواء بواسطة Pengfei Yuan1 et al

--- يوان وآخرون الطب التكميلي والبديل BMC (2018) 18: 275 https://doi.org/10.1186/s12906-018-2201-1

مراجع

1. التعاون العالمي للعبء المرضي للسرطان ، Fitzmaurice C ، Allen C ، Barber RM ، Barregard L ، Bhutta ZA ، Brenner H ، Dicker DJ ، Chimed-Orchid O ، Dandona R ، et al. معدل الإصابة بالسرطان العالمي والإقليمي والوطني ، والوفيات ، وسنوات العمر المفقودة ، والسنوات التي عاشها مع الإعاقة ، وسنوات العمر المعدلة حسب الإعاقة لـ 32 مجموعة من مجموعات السرطان ، من 1990 إلى 2015: تحليل منهجي للعبء العالمي لدراسة المرض. جاما أونكول. 2017 ؛ 3: 524–48.

2. Chen W، Zheng R، Baade PD، Zhang S، Zeng H، Bray F، Jemal A، Yu XQ، He J.Cancer Statistics in China، 2015. CA Cancer J Clin. 2016 ؛ 66: 115-32.3. الرابطة الأوروبية لدراسة الكبد ، المنظمة الأوروبية لأبحاث وعلاج السرطان. إرشادات الممارسة السريرية EASL-EORTC: إدارة سرطان الخلايا الكبدية. JHepatol. 2012 ؛ 56: 908–43.

4. Roayaie S، Obeidat K، Sposito C، Mariani L، Bhoori S، Pellegrinelli A، Labow D، Llovet JM، Schwartz M، Mazzaferro V. استئصال سرطان الخلايا الكبدية أقل من أو يساوي 2 سم: ينتج من مركزين غربيين. أمراض الكبد. 2013 ؛ 57: 1426–35.

5. Ting CT، Cheng YY، Tsai TH. التفاعل بين الأدوية والأعشاب بين التركيبة الواقية للكبد التقليدية و Sorafenib على السمية الكبدية ، والتشريح المرضي ، والحركية الدوائية في الفئران. جزيئات. 2017 ؛ 22: E1034.

6. Llovet JM و Ricci S و Mazzaferro V و Hilgard P و Gane E و Blanc JF و de Oliveira AC و Santoro A و Raoul JL و Forner A et al. سورافينيب في سرطان الخلايا الكبدية المتقدمة. إن إنجل جي ميد. 2008 ؛ 359: 378-90.

7. Cheng AL و Kang YK و Chen Z و Tsao CJ و Qin S و Kim JS و Luo R و Feng J و Ye S و Yang TS وآخرون. فعالية وسلامة سورافينيب في المرضى في منطقة آسيا والمحيط الهادئ مع سرطان الخلايا الكبدية المتقدمة: المرحلة الثالثة العشوائية ، مزدوجة التعمية ، وهمي تسيطر عليها تجربة. لانسيت أونكول. 2009 ؛ 10: 25–34.

8. شي Z ، Song T ، Wan Y ، Xie J ، Yan Y ، Shi K ، Du Y ، Shang L. مراجعة منهجية وتحليل تلوي للأدوية الصينية التقليدية للحشرات مجتمعة بين العلاج الكيميائي لعلاج سرطان الخلايا الكبدية غير الجراحية. مندوب علوم 2017 ؛ 7: 4355.

9. Yang Z ، Liao X ، Lu Y ، Xu Q ، Tang B ، Chen X ، Yu Y. يحسن العلاج الإضافي بالطب الصيني التقليدي النتائج ويقلل من الأحداث الضائرة في سرطان الخلايا الكبدية: تحليل تلوي للتجارب المعشاة ذات الشواهد. مكمل قائم على الأدلة من التيرنات ميد. 2017 ؛ 2017: 3428253.

10. Lin LW، Hsieh MT، Tsai FH، Wang WH، Wu CR. النشاط المضاد للألم ومضاد الالتهاب الناجم عن Cistanche deserticola في القوارض. ي إثنوفارماكول. 2002 ؛ 83: 177-82.

11. وو كر ، لين HC ، سو MH. الانعكاس بالمستخلصات المائية لـCistanche tubulosaمن العجز السلوكي في نموذج الفئران الشبيه بمرض الزهايمر: الصلة بترسب الأميلويد ووظيفة الناقل العصبي المركزي. BMC تكملة البديل ميد. 2014 ؛ 14: 202.

12. جيانغ واي ، تو بي إف. تحليل المكونات الكيميائية في أنواع Cistanche. جي تشروماتوجر أ .2009 ؛ 1216: 1970-9.

13. Morikawa T ، Pan Y ، Ninomiya K ، Imura K ، Matsuda H ، Yoshikawa M ، Yuan D ، Muraoka O.Cistanche tubulosa.بيورج ميد كيم. 2010 ؛ 18: 1882-90.

14. Nan ZD، Zeng KW، Shi SP، Zhao MB، Jiang Y، Tu PF.جليكوسيدات فينيلثانويدمع أنشطة مضادة للالتهابات من سيقان Cistanche deserticola المزروعة في صحراء تاريم. فيتوتيرابيا 2013 ، 89: 167–74.

15. Deng M ، Zhao J ، Tu P ، Jiang Y ، Li Z ، Wang Y. Echinacoside يعيد الخلايا العصبية SHSY5Y من TNF المستحثةموت الخلايا المبرمج. فارماكول Eur J. 2004 ؛ 505: 11-8.

16. Li J، Li J، Aipire A، Gao L، Huo S، Luo J، Zhang F.جليكوسيدات فينيلثانويدمنCistanche tubulosaيمنع نمو الخلايا البائية 16- F10 في كل من المختبر وفي الجسم الحي عن طريق تحريضموت الخلايا المبرمجعبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا. ي السرطان. 2016 ؛ 7: 1877-1887.

17. Shang HS و Chang CH و Chou YR و Yeh MY و Au MK و Lu HF و Chu YL و Chou HM و Chou HC و Shih YL et al. يسبب الكركمين تلف الحمض النووي ويؤثر على التعبير البروتيني المرتبط في خلايا سرطان عنق الرحم البشرية هيلا. مندوب أونكول .2016 ؛ 36: 2207-15.

18. Wang R و Zhang Q و Peng X و Zhou C و Zhong Y و Chen X و Qiu Y و Jin M و Gong M و Kong D. Stellettin B يحث G1 على الاعتقال ،موت الخلايا المبرمج، والالتهام الذاتي في خلايا A549 لسرطان الرئة البشري ذو الخلايا غير الصغيرة عن طريق منع مسار PI3K / Akt / mTOR. مندوب علوم .2016؛ 6: 27071.

19. Sinha K، Das J، Pal PB، Sil PC. الإجهاد التأكسدي: المسارات المعتمدة على الميتوكوندريا والمستقلة عن الميتوكوندرياموت الخلايا المبرمج. قوس توكسيكول. 2013 ؛ 87: 1157 - 80.

20. Zhang YS، Shen Q، Li J. الطب الصيني التقليدي يستهدف آليات موت الخلايا المبرمج لعلاج سرطان المريء. أكتا فارماكول سين. 2016 ؛ 37: 295-302.

21. Chong ZZ ، Lin SH ، Li F ، Maiese K. يعزز مثبط sirtuin النيكوتيناميد بقاء الخلايا العصبية أثناء الإصابة بنقص الأكسجين الحاد من خلال مسارات AKT و BAD و PARP والميتوكوندريا المرتبطة "بمضادات موت الخلايا المبرمج". الدقة بالعملة نيوروفاسك. 2005 ؛ 2: 271-85.

22. Hu B ، Wang SS ، Du Q. الطب الصيني التقليدي للوقاية والعلاج من سرطان الكبد: من مقاعد البدلاء إلى السرير. العالم ياء هيباتول. 2015 ؛ 7: 1209–32.

23. Hu B، An HM، Wang SS، Chen JJ، Xu L. التأثيرات الوقائية والعلاجية للمركبات العشبية الصينية ضد سرطان الخلايا الكبدية. جزيئات. 2016 ؛ 21: 142.

24. Xu H ، Zhao X ، Liu X ، Xu P ، Zhang K ، Lin X. التأثيرات المضادة للأورام للطب الصيني التقليدي التي تستهدف مسار الاستماتة الخلوي. المخدرات Des Devel Ther. 2015 ؛ 9: 2735–44.

25. لي-ويبر م. الاستهدافموت الخلايا المبرمجمسارات في السرطان بالطب الصيني. ليت السرطان. 2013 ؛ 332: 304-12.

26. Xu G، Shi Y.موت الخلايا المبرمجمسارات الإشارات والتوازن اللمفاوي. دقة الخلية. 2007 ؛ 17: 759-71.

27. تايت سو ، جرين د. الميتوكوندريا وموت الخلايا: نفاذية الغشاء الخارجي وما بعدها. بيول ريف مول خلية نات. 2010 ؛ 11: 621-32.

28. Galluzzi L، Kepp O، Kroemer G. Mitochondria: المنظمون الرئيسيون لإشارات الخطر. بيول ريف مول خلية نات. 2012 ؛ 13: 780-8.

29. مارتينو جيه سي ، Youle RJ. الميتوكوندريا فيموت الخلايا المبرمج: Bcl -2 أفراد العائلة وديناميكيات الميتوكوندريا. خلية التطوير. 2011 ؛ 21: 92-101.