تحريض مناعة الغشاء المخاطي عن طريق الإدارة الرئوية لجسيمات نانوية تستهدف الخلية

خلاصة

وجدنا سابقًا أن الجسيمات النانوية المكونة من مستضد ، كلوريد البنزالكونيوم (BK) وحمض البوليجلوتاميك سي (c-PGA) أظهرت تحفيزًا مناعيًا عاليًا من النوع Th1 و Th 2- بعد الإعطاء تحت الجلد. للوقاية من التهابات الجهاز التنفسي ، يجب تحفيز المناعة المخاطية. في هذه الدراسة ، بحثنا في تأثير الإعطاء الرئوي لجسيم نانوي يتكون من الألبومين البيضاوي (OVA) كمستضد نموذجي ، BK ، و c-PGA على تحريض مناعة الغشاء المخاطي في الرئتين والمصل.

تم تناول المجمع بقوة بواسطة خلايا RAW264.7 و DC2.4. بعد الإعطاء الرئوي ، كان احتباس الرئة أطول بالنسبة لمركب OVA / BK / c-PGA مقارنةً بـ OVA وحده. تم تحفيز الغلوبولين المناعي (Ig) G الخاص بـ OVA بشكل كبير بواسطة المركب. كما تم إحداث مستويات عالية من IgG و IgA في سائل غسل القصبات الهوائية ، وفي الجسم الحي ، لم يتم ملاحظة السمية. في الختام ، قمنا بتحفيز مناعة الغشاء المخاطي بشكل فعال وآمن عن طريق الإدارة الرئوية لمركب OVA / BK / c-PGA.

في السنوات الأخيرة ، أظهرت المزيد والمزيد من الدراسات أن مناعة الأغشية المخاطية تلعب دورًا مهمًا في جهاز المناعة في الجسم. تشير المناعة المخاطية إلى الجهاز المناعي القائم على الغشاء المخاطي في جسم الإنسان ، وتهدف قدراته الدفاعية بشكل أساسي إلى غزو مسببات الأمراض في الأغشية المخاطية للإنسان مثل الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والجهاز التناسلي.

مناعة الغشاء المخاطي في حد ذاتها لا تجعل الجسم أكثر مناعة ، ولكنها يمكن أن تساعد أجسامنا على التعامل مع غزو مسببات الأمراض الغريبة بشكل أكثر فعالية. من خلال التحفيز المستمر لمناعة الغشاء المخاطي ، ينتج أجسامنا المزيد من الأجسام المضادة ، مما يعزز مناعتنا.

فكيف يمكن تحفيز المناعة المخاطية؟ وفيما يلي بعض الاقتراحات:

1. احصل على ما يكفي من فيتامين ج. فيتامين ج هو أحد مضادات الأكسدة الطبيعية التي تعزز وظيفة الخلايا المناعية ، مما يساعد في مكافحة الالتهابات. الفواكه والخضروات ذات الأوراق الخضراء مثل الليمون والبرتقال والفراولة غنية بفيتامين سي.

2. زيادة تناول بكتيريا حمض اللاكتيك. يمكن أن تعزز بكتيريا حمض اللاكتيك توازن الجراثيم المعوية وتمنع نمو البكتيريا الضارة. تشمل الأطعمة الشائعة لبكتيريا حمض اللاكتيك الزبادي ومخلل الملفوف والكيمتشي وما إلى ذلك.

3. تمرن على التنفس العميق. يزيد التنفس العميق من إمداد الرئتين بالأكسجين والتهوية ، مما يساعد على إزالة مسببات الأمراض المتراكمة من الرئتين.

باختصار ، إن تحفيز المناعة المخاطية هو وسيلة مهمة لتحسين المناعة. يجب أن نبذل قصارى جهدنا لتحسين مناعتنا المخاطية من خلال النظام الغذائي والعادات المعيشية ، لحماية صحتنا. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين المناعة. يمكن أن يحسن الكستانش المناعة بشكل كبير لأن رماد اللحوم يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من عيش الغراب ، وهوانغ لي ، والتي يمكن أن تحفز جهاز المناعة. تعمل أنواع مختلفة من الخلايا على زيادة نشاطها المناعي.

انقر فوق الملحق cistanche deserticola

1 المقدمة

يكاد يكون من المؤكد أن التهابات الجهاز التنفسي الحادة هي السبب الرئيسي للوفاة بين الأطفال أقل من 5 سنوات في البلدان النامية (Williams et al.، 2002). تم تطوير العديد من اللقاحات ، مثل لقاحات الأنفلونزا والسعال الديكي والمكورات الرئوية ، لعدوى الجهاز التنفسي (White ، 1988 ؛ Pittman ، 1991 ؛ Chen et al. ، 2020). يتم إعطاء معظم هذه اللقاحات عن طريق الحقن العضلي وتحت الجلد ، والتي يمكن أن تحفز بشكل فعال الغلوبولين المناعي في الدم (Ig) G. ومع ذلك ، هناك طرق أخرى أكثر فائدة لتحفيز مناعة الغشاء المخاطي للوقاية من التهابات الجهاز التنفسي الحادة. تم الإبلاغ عن أن إدارات الغشاء المخاطي ، مثل الأنف والرئة ، تحفز بشكل فعال IgA المخاطي وتمنع التهابات الجهاز التنفسي (Giri et al. ، 2005 ؛ Ainai et al. ، 2017).

من ناحية أخرى ، يجب ألا تحتوي لقاحات الإعطاء عن طريق الأنف والرئة على مواد مساعدة تم الإبلاغ عن أنها تسبب تفاعلات التهابية وتقرح في موقع الإعطاء (Tamura et al. ، 1988 ؛ McKee et al. ، 2007). هناك طريقة أخرى لتحسين فعالية اللقاحات بدون المواد المساعدة وهي تطوير نظام يمكنه توصيل اللقاحات بشكل فعال إلى خلايا الغشاء المخاطي العارضة للمستضد (APCs).

في دراسة سابقة ، قمنا بتطوير ناقل لقاح جديد تم إنشاؤه باستخدام مستضد ، كلوريد البنزالكونيوم (BK) ، وحمض c-polyglutamic (c-PGA). مركب يتكون من البومين البيضاوي (OVA) كمستضد نموذجي ، BK و c-PGA (مجمع OVA / BK / c-PGA) قام بشكل فعال بتسليم OVA إلى الخلايا المتغصنة وتحسين تحريض IgG المصل الخاص بـ OVA بعد إعطاء الفئران تحت الجلد (كوروساكي وآخرون . ، 2012). هدفت الدراسة الحالية إلى دراسة تأثير الإعطاء الرئوي لمركب OVA / BK / c-PGA على تحريض المناعة المخاطية في الرئتين والمصل.

2. المواد والأساليب

2.1. مواد كيميائية

تم شراء OVA من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على BK من Nacalai Tesque، Inc. (كيوتو ، اليابان). تم توفير c-PGA من قبل شركة Yakult Pharmaceutical Industry Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان). تم الحصول على Fluorescein isothiocyanate المسمى OVA (FITC-OVA) و Alexa Fluor 647- المسمى OVA (Alexa 647- OVA) من Invitrogen (Carls ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مصل بقري الجنين (FBS) من شركة Biological Industries Ltd. (كيبوتس بيت هعيمق ، إسرائيل). تم الحصول على OPTI-MEM I من GIBCO BRL (Grand Island ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم الحصول على محلول مضادات حيوية سابقة الخلط يحتوي على البنسلين والستربتومايسين و L-glutamine من Wako Pure Chemical Industries، Ltd. (أوساكا ، اليابان). تم الحصول على وسيط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) و RPMI1640 من Nissui Pharmaceutical Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان).

2.2. تحضير معقد

في السابق ، أنشأنا مجمع OVA / BK / c-PGA بنسبة وزن 1: 0. 2: 0. 2 (كوروساكي وآخرون ، 2 0 12). لتحضير مركب OVA / BK ، تم خلط كمية مناسبة من محلول BK (الرقم الهيدروجيني 5. 0) المذاب في 5 بالمائة من الجلوكوز مع محلول OVA (الرقم الهيدروجيني 7. 0) مذاب في 5 بالمائة من الجلوكوز و يُترك لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية لتغليف مجمع OVA / BK باستخدام c-PGA ، تمت إضافة محلول c-PGA (درجة الحموضة 7.0) مذاب في 5 بالمائة من الجلوكوز إلى مجمع OVA / BK وتركه لمدة 15 دقيقة أخرى عند 4 ج. تم قياس حجم الجسيمات وإمكانات f لكل معقد باستخدام Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments، Ltd.، Malvern، UK).

2.3 الخلايا

تم استخدام خط خلية بلعم الفأر RAW264.7 وخط خلية شجيري DC2.4. تمت زراعة خلايا RAW264.7 في DMEM مع 10 بالمائة من FBS والمضادات الحيوية. نمت خلايا DC2.4 في وسط RPMI1640 مكملًا بنسبة 10 بالمائة من FBS والمضادات الحيوية و 1 ملي مولار من الأحماض الأمينية غير الأساسية و 1 نانومتر 2- مركابتو إيثانول. تم تقييم هذه الخلايا في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون في الهواء عند 37 درجة مئوية.

2.4 تجربة الامتصاص الخلوي في المختبر

تم طلاء خلايا RAW264.7 وخلايا DC2.4 على 24- ألواح بئر (كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) بكثافة 2. 0 104 خلية / بئر وتم زراعتها في 5 0 { {21}} مل من وسط الثقافة. بعد 24- ساعة من الحضانة المسبقة ، تم استبدال الوسيط بوسط OPTI-MEM I ، وتم تحضين الخلايا بـ 5 مجم FITC-OVA والمجمع الذي يحتوي على 5 مجم FITC-OVA لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، تم غسل هذه الخلايا ببرنامج تلفزيوني وتم ملاحظتها تحت مجهر الفلورسنت (BIOREVO BZ -9000 ؛ Keyence Co. ، أوساكا ، اليابان). بعد الملاحظة ، تم تحلل هذه الخلايا في 300 لتر من محلول التحلل (pH 7.8 و 0.1 M Tris / HCl المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.05 بالمائة Triton X -100 و 2 مم EDTA). تم وضع المحللات في 96- ألواح بئر ، وتم قياس تألق FITC-OVA بطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر بطول موجة إثارة يبلغ 480 نانومتر ، باستخدام قارئ صفيحة ميكروية فلورية (Infinite -200 Pro M-Plex، Tecan Japan Co.، Ltd. ، كاناغاوا ، اليابان). تم تحديد محتوى البروتين في المحللة بواسطة اختبار برادفورد باستخدام BSA كمعيار. تم قياس الامتصاصية باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة عند 570 نانومتر. تمت الإشارة إلى امتصاص FITC-OVA على شكل مجم لكل مجم بروتين.

2.5 الحيوانات

تم تنفيذ رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية من خلال المبادئ التوجيهية للتجربة الحيوانية بجامعة ناغازاكي بموافقة من لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها. تم شراء الفئران الذكور C57BL / 6N (عمرها 5 أسابيع) من Japan SLC (شيزوكا ، اليابان). بعد نقلها ، سُمح للفئران بالتأقلم مع بيئتها الجديدة لمدة يوم واحد قبل التجارب. تم إجراء الإدارة الرئوية (40 مل) باستخدام خافض اللسان بالضوء عن طريق التنفس التلقائي في الفئران التي تم تخديرها عن طريق استنشاق الأيزوفلورين (Horiguchi et al. ، 2015).

2.6. معقد تراكم الرئة

لفحص تراكم OVA ، تم إعطاء 40 mg Alexa 647- OVA والمركب المحتوي على 40 mg Alexa 647- OVA بحجم 40 مل لكل فأر في الفئران عن طريق المسار الرئوي. بعد ستة أيام من الإعطاء ، تم التضحية بالفئران وتشريح الرئتين. تمت ملاحظة كثافة الفلورسنت لـ Alexa 647- OVA في رئة الفأر باستخدام نظام Xenogen IVIS Lumina مقترنًا ببرنامج Living Image للحصول على البيانات (Xenogen ، Co ، Almeda ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الملاحظة ، تم تجانس تلك الرئتين مع محلول تحلل وتم تجانس الطرد المركزي عند 15 ، 000 دورة في الدقيقة (Kubota -3500 ، Kubota Corporation ، طوكيو ، اليابان) لمدة 5 دقائق ووميض Alexa647 في تلك المواد الطافية تم تحديده باستخدام زعيم الصفيحة الدقيقة عند الإثارة وطول موجة انبعاث يبلغ 640 و 670 نانومتر ، على التوالي.

2.7. تحصين

تم تحصين الفئران بمحلول جلوكوز بنسبة 5٪ ، و 40 مجم OVA ، ومركب فارغ من 8 مجم BK و 8 مجم c-PGA (مركبة) ، ومركب OVA / BK / c-PGA يحتوي على 40 مجم OVA بالإعطاء الرئوي ، 4 مرات أسبوعي. بعد أسبوعين من آخر تحصين ، تم الحصول على سائل غسيل القصبات الهوائية (BALF) والمصل. تم استخدام BALF والمصل لفحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

2.8 تحديد تحريض الأجسام المضادة الخاصة بـ OVA

بالنسبة لطلاء OVA ، تمت إضافة 1 0 0 مل من محلول OVA (10 مجم / مل ، في 1 مولار من كربونات هيدروجين الصوديوم) إلى كل بئر من ألواح ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحضينها طوال الليل عند 4 درجة مئوية ، تم غسل الأطباق ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات يحتوي على 0.05 بالمائة توين -20 (PBST) ، 200 مل من كاشف الحجب N 102 (Nichiyu ، Co. ، Ltd. ، طوكيو ، اليابان ) يضاف إلى كتلة الربط غير المحدد ثم يحتضن لمدة 6 ساعات عند 4 درجة مئوية. تم غسل الألواح مرتين باستخدام PBST. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 مل قسامات من 1000- مصل مخفف وعينات BALF غير مخففة إلى كل بئر وحضنت طوال الليل عند 4 درجة مئوية. - الفئران IgG و IgA و IgM و IgE و IgG1 و IgG2a و IgG2b و IgG3 (1:10 ، 000) (Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) - تمت إضافتها إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة و ثم تغسل خمس مرات مع PBST. تم استخدام محلول TMB One (Promega ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحضيره وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إيقاف التفاعل بعد ذلك عند 15 دقيقة بإضافة 1 عياري حمض هيدروكلوريك. تمت قراءة الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.

2.9 السمية في الجسم الحي لمركب OVA / BK / c-PGA

تم إعطاء مجمع OVA و OVA / BK / c-PGA للفئران بالطريق الرئوي. تم الحصول على BALF بعد 3 و 24 ساعة من تناوله من الفئران. بعد أربع وعشرين ساعة من تناوله ، تم تشريح الرئة أيضًا. تم قياس نشاط اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) في BALF باستخدام QuantiChrom TM Lactate Dehydrogenase Kit (BioAssay Systems ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات المصنع. تم إصلاح عينات الرئة في محلول عازل بارافورمالدهيد فوسفات 4 بالمائة. تم تكليف GenoStaff (طوكيو ، اليابان) بالتقسيم وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE). وقد لوحظت أقسام ملطخة من الرئة عن طريق الفحص المجهري عند تكبير 20.

2.10. تحليل احصائي

تم تقييم الدلالة الإحصائية للاختلافات بين المجموعتين من خلال إجراء اختبار الطالب t. تم إجراء مقارنات متعددة بين المجموعات عن طريق إجراء اختبار Tukey. تم اعتبار p-Values ​​<.05 لتكون مؤشرًا على الأهمية الإحصائية.

3. النتائج

3.1. الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمجمع

أنشأنا مركب OVA / BK / c-PGA الأنيوني بنسبة وزن 1: 0. 2: 0. 2. كان للمجمع المطلي بـ c-PGA حجم جسيمي يبلغ حوالي 105.4 نانومتر وإمكانية f تبلغ حوالي 35.5 مللي فولت.

3.2 الامتصاص الخلوي للمجمع

تمت معالجة خلايا RAW264.7 وخلايا DC2.4 بمركب FITC-OVA و FITC-OVA / BK / c-PGA ، وتم تصور الامتصاص الخلوي لـ FITC-OVA ، كما هو موضح في الشكل 1. FITC-OVA / BK / تم أخذ مجمع c-PGA بشكل كبير بواسطة خلايا RAW264.7 وخلايا DC2.4 ، ولوحظ مضان أخضر قوي لـ FITC-OVA (الشكل 1 (أ ، ب) ، على التوالي). في الوقت نفسه ، لوحظت كميات قليلة من FITC-OVA في كلتا الخليتين المعالجتين بـ FITC-OVA.

تم قياس كمية الامتصاص الخلوي لـ FITC-OVA في خلايا RAW264.7 وخلايا DC2.4 (الشكل 1 (C)). أظهر مجمع FITC-OVA / BK / c-PGA امتصاصًا أعلى بكثير من FITC-OVA في كلا الخليتين (p <.01).

3.3 تراكم الرئة لـ Alexa 647- OVA بعد الإعطاء الرئوي

تم إعطاء مركب Alexa 647- OVA و Alexa 647- OVA / BK / c-PGA للفئران عن طريق المسار الرئوي لتحديد تراكم الرئة لـ Alexa 647- OVA كمستضد. في 6 أيام بعد الإعطاء ، تم تشريح الرئتين ، وتم تصور شدة التألق باستخدام نظام Xenogen IVIS Lumina. يتم عرض صورة الفلورسنت خارج الجسم الحي في الشكل 2 (أ). لوحظ ارتفاع شدة التألق في جميع أنحاء الرئة بأكملها بعد 6 أيام من الإعطاء الرئوي ، على الرغم من عدم وجود كثافة مضان في الطحال والقلب والكلى والكبد (البيانات غير معروضة). كان تراكم الرئة أعلى بالنسبة لمركب Alexa 647- OVA / BK / c-PGA مقارنة بـ Alexa 647- OVA في اليوم 6. كما هو موضح في الشكل 2 (ب) ، كان تراكم الرئة أعلى بشكل ملحوظ بالنسبة لـ Alexa 647- مجمع OVA / BK / c-PGA مقارنة مع Alexa 647- OVA (p <.05).

3.4. جسم مضاد خاص بـ OVA في مصل الدم بعد الإدارة الرئوية للمركب

تم إعطاء محلول جلوكوز بنسبة 5 في المائة ، ومركب BK / c-PGA (مركبة) ، و OVA ، و OVA / BK / c-PGA بواسطة المسار الرئوي إلى الفئران أربع مرات ، ثم IgG ، IgA ، IgM ، المصل الخاص بـ OVA ، تم تحديد IgE و IgE بواسطة ELISA كما هو موضح في الشكل 3. أدت الإدارة الرئوية لـ OVA ومركب OVA / BK / c-PGA إلى زيادة مستويات IgG في الفئران ، على الرغم من عدم اكتشاف IgG الخاص بـ OVA في الفئران المعطاة بنسبة 5 بالمائة من الجلوكوز والمركبة. علاوة على ذلك ، كان إنتاج IgG و IgA أعلى بشكل ملحوظ بعد إعطاء مركب OVA / BK / c-PGA منه بعد إعطاء OVA (p <.05 أو .01). من ناحية أخرى ، لم يتم تحفيز IgM و IgE الخاصين بـ OVA بواسطة OVA أو مجمع OVA / BK / c-PGA.

3.5 جسم مضاد خاص بـ OVA في BALF بعد الإدارة الرئوية للمركب

كما تم تحديد IgG و IgA و IgM و IgE الخاص بـ OVA في BALF ، كما هو موضح في الشكل 4. تمت زيادة مستوى IgG بشكل ملحوظ بواسطة OVA بالنسبة إلى المستويات بعد إدارة التحكم والمركبة (p <.05 أو .01). ومع ذلك ، فإن مجمع OVA / BK / c-PGA زاد بشكل كبير ليس فقط IgG ولكن أيضًا IgA في BALF (p <.01). ومع ذلك ، لم يتم تحفيز IgM و IgE الخاصين بـ OVA بواسطة OVA أو مجمع OVA / BK / c-PGA.

3.6 الأنواع الفرعية IgG في مصل الدم بعد الإدارة الرئوية للمجمع

تم تحديد التأثيرات الحثية للأنواع الفرعية IgG الخاصة بـ OVA ، مثل IgG1 و IgG2a و IgG2b و IgG3 في المصل كما هو موضح في الشكل 5. بالمقارنة مع التحكم والمركبة ، زاد OVA بشكل ملحوظ فقط IgG1 (p <.01). كانت مستويات الأجسام المضادة لجميع الأنواع الفرعية التي يسببها معقد OVA / BK / c-PGA أعلى بكثير من المستويات التي يسببها التحكم والمركبة (p <.05 أو .01).

3.7 الأنواع الفرعية IgG في BALF بعد الإدارة الرئوية للمجمع

تم تحديد الأنواع الفرعية IgG الخاصة بـ OVA ، مثل IgG1 و IgG2a و IgG2b و IgG3 في BALF ، كما هو موضح في الشكل 6. زاد OVA بشكل كبير فقط من مستويات IgG1 بالنسبة لتلك التي يسببها التحكم والمركبة (p <.01) . بالمقارنة مع عنصر التحكم والمركبة و OVA ، تسبب مجمع OVA / BK / c-PGA في مستويات أجسام مضادة أعلى بكثير من جميع الأنواع الفرعية (p <.05 أو .01).

3.8 السمية في الجسم الحي لمركب OVA / BK / c-PGA

تم إعطاء الفئران محلول جلوكوز بنسبة 5 في المائة ، و OVA ، ومجمع OVA / BK / c-PGA. تم تحديد نشاط LDH في BALF 3 أو 24 ساعة بعد الإدارة (الشكل 7). كان لإدارة مركب OVA و OVA / BK / c-PGA تأثير ضئيل على مستويات LDH في BALF.

بعد أربع وعشرين ساعة من الإعطاء ، تم تشريح الرئتين من تلك الفئران للتحليل النسيجي. يتم عرض أقسام الرئة الملطخة HE في الشكل 8. لم يلاحظ أي تشوهات نسيجية في الفئران التي عولجت بـ OVA ومجمع OVA / BK / c-PGA.

4. مناقشة

تتحكم الرئة في التنفس وتتعرض للعديد من مسببات الأمراض مثل الفيروسات والبكتيريا التي تسبب التهابات الجهاز التنفسي. هذه العوامل الممرضة تصيب الغشاء المخاطي الرئوي ، لذلك يجب تحفيز المناعة المخاطية للحماية من التهابات الجهاز التنفسي. منع التهابات الجهاز التنفسي ، مناعة الغشاء المخاطي لها دور مهم ؛ ومع ذلك ، فإن إعطاء اللقاح داخل الأدمة والعضل لا يمكن أن يحفز بقوة المناعة المخاطية (Ito et al. ، 2003 ؛ Amorij et al. ، 2007). يتم تطوير جهاز المناعة المخاطي الذي يحفز إفراز IgA على سطح الغشاء المخاطي. تم الإبلاغ عن وجود العديد من الخلايا APCs ، مثل الخلايا التغصنية والضامة ، في سطح الغشاء المخاطي (Kopf et al. ، 2015). علاوة على ذلك ، تم العثور على النسيج الليمفاوي المرتبط بالقصبات الهوائية (BALT) في الغشاء المخاطي للقصبات الهوائية وهو جريب ليمفاوي له دور مركزي في مناعة الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي (Bienenstock ، 1980). من المتوقع أن يحفز التطعيم الرئوي جهاز المناعة المخاطي بشكل فعال. لذلك ، قمنا ببناء مجمع OVA / BK / c-PGA لتقييم فائدته كلقاح يتم إعطاؤه عبر المسار الرئوي.

يوضح الشكل 4 تركيز BALF للأجسام المضادة الخاصة بـ OVA بعد الإعطاء الرئوي لـ OVA ومركب OVA / BK / c-PGA. أدت الإدارة الرئوية لـ OVA إلى زيادة IgG ولكن كان لها تأثير ضئيل على IgA في BALF. من ناحية أخرى ، تسبب مجمع OVA / BK / c-PGA بشكل كبير في إفراز IgA في BALF. علاوة على ذلك ، كان تحريض IgG في المصل أعلى بكثير بعد إدارة مجمع OVA / BK / c-PGA مقارنةً بعد إعطاء OVA (الشكل 3). يعتبر Serum IgG مهمًا لمنع تفاقم أي عدوى تحدث (Huber et al. ، 2006 ؛ Schroeder & Cavacini ، 2010). تشير النتائج إلى أن مركب OVA / BK / c-PGA يمكن أن يمنع التهابات الجهاز التنفسي عن طريق تحريض الغشاء المخاطي العالي IgA وتفاقم عدوى الجهاز التنفسي عن طريق تحريض مصل IgG العالي. علاوة على ذلك ، لم يتم ملاحظة تحريض IgE بواسطة مجمع OVA / BK / c-PGA ، وتشير هذه النتيجة إلى خطر ضئيل من حدوث تفاعل تحسسي بواسطة مجمع OVA / BK / c-PGA.

يمكن أن يؤدي مجمع OVA / BK / c-PGA أيضًا ليس فقط إلى IgG1 و IgG2b ولكن أيضًا إلى IgG2a و IgG3 (الشكل 5). يُعرف IgG1 و IgG2b باسم 2- نوع الغلوبولين المناعي الذي يتوسط الاستجابة المناعية الخلطية ، ويُعرف IgG2a و IgG3 باسم 1- النوع من الغلوبولين المناعي الذي يتوسط الاستجابة المناعية الخلوية (Firacative et al.، 2018) . لذلك ، يمكن أن يؤدي مجمع OVA / BK / c-PGA إلى استجابات مناعية خلطية وخلوية. تشير هذه النتائج إلى أن هذا النظام يمكن أن يكون مفيدًا للقاحات ضد العدوى وكذلك ضد السرطانات. يجب تقييم التأثير الوقائي ، واستجابات السيتوكينات من النوع 1- والمستضد 2- في تحريض BALT و Treg و IL {17}} باستخدام مستضدات حقيقية من العدوى أو السرطانات في المستقبل دراسات.

يجب أن يكون الحث القوي بواسطة مجمع OVA / BK / c-PGA للاستجابة المناعية ناتجًا عن احتباس عالٍ للمركب في الرئة والتوصيل الفعال لـ OVA إلى APCs في الغشاء المخاطي الرئوي. أكدت نتائجنا ذلك من خلال إظهار أنه بعد 6 أيام من الإدارة ، ظل مجمع Alexa 647- OVA / BK / c-PGA في الرئة وأظهر مضانًا أعلى بكثير من Alexa 647- OVA (الشكل 2). قد يمنع التكوين المعقد انتشار OVA ويحمي OVA من التدهور بواسطة البروتياز في الغشاء المخاطي الرئوي. علاوة على ذلك ، كان مجمع OVA / BK / c-PGA قادرًا على تقديم OVA بشكل فعال إلى خلايا RAW264.7 الضامة وخلايا DC2.4 التغصنية (الشكل 1). أشارت هذه النتائج إلى أن مركب OVA / BK / c-PGA سوف يتم تناوله بواسطة APCs السنخية ويؤدي إلى استجابة مناعية عالية بعد الإعطاء الرئوي. تم الإبلاغ عن أن الجسيمات النانوية المغلفة بـ c-PGA قد تم تناولها بواسطة مسار الالتقام الخلوي بوساطة جاما-جلوتاميل ترانسببتيداز (دو وآخرون ، 2015). أكدنا أيضًا أن الجسيمات النانوية المغلفة بـ c-PGA قد تم تناولها بواسطة مسار الالتقام الخلوي النوعي لـ c-PGA (كوروساكي وآخرون ، 2009). قد يتم تناول مجمع OVA / BK / c-PGA بواسطة APCs في الرئة من خلال نفس الآليات. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما هي الخلايا المسؤولة عن امتصاص OVA والعرض اللاحق للمستضد في تحريض مناعة معينة. يجب إجراء مزيد من الدراسات حول آليات الحث المناعي المفصلة في المستقبل.

تم تطوير العديد من المواد المساعدة لتعزيز فعالية اللقاحات ؛ ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن المواد المساعدة تسبب تفاعلات التهابية في موقع الحقن (Tamura et al. ، 1988 ؛ McKee et al. ، 2007). لذلك ، فإن إعطاء مواد مساعدة للرئة قد يسبب آثارًا جانبية شديدة ، مثل الالتهاب الرئوي. بعد الإدارة الرئوية لمركب OVA / BK / c-PGA ، لم يتم زيادة مستويات LDH في BALF (الشكل 7) ولم يتم ملاحظة التشوهات النسيجية في القسم الملون HE (الشكل 8). يُقال أن c-PGA عبارة عن بوليمر متوافق حيويًا وقابل للتحلل الحيوي ولا يُظهر تفاعلات التهابية مناعية (Prodhomme et al. ، 2003 ؛ Ye et al. ، 2006). BK هو مركب أمونيوم رباعي آمن يستخدم على نطاق واسع سريريًا كمضاف مضاد للميكروبات (Marple et al. ، 2004). تدعم هذه التقارير أيضًا أمان مجمع OVA / BK / c-PGA. من ناحية أخرى ، لوحظ ارتفاع مستويات LDH في 3 ساعات بعد الإعطاء الرئوي مقارنة بـ 24 ساعة ، حتى في المجموعة الضابطة. تشير هذه النتائج إلى أن التهيج الطفيف كان ناتجًا عن الإعطاء الرئوي. هناك حاجة إلى مزيد من دراسات السلامة قبل التطبيق السريري لمركب OVA / BK / c-PGA.

في هذه الدراسة ، أظهرنا تحريضًا عاليًا للجهاز المناعي المخاطي بواسطة ناقل جديد لإيصال اللقاح تم إنشاؤه باستخدام بروتين مستضد ، BK ، و c-PGA بعد الإعطاء الرئوي. يمكن استخدام النظام للقاحات ضد التهابات الجهاز التنفسي المختلفة.

بيان الإفصاح عن المعلومات

لم يتم الإبلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح من قبل المؤلف (المؤلفين).

التمويل

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI بموجب منح [JP20K12649 و JP20K07156].

مراجع

1.Ainai A و Suzuki T و Tamura SI وآخرون. (2017). إعطاء اللقاح الكامل لفيروس الأنفلونزا المعطل عن طريق الأنف كمرشح واعد للقاح الأنفلونزا. المناعة الفيروسية 30: 451-62.

2.Amorij JP، Saluja V، Petersen AH، et al. (2007). إن التوصيل الرئوي للقاح الإنفلونزا المستقر بالأنولين المحضر عن طريق التجفيف بالتجميد بالرش يحفز الاستجابات المناعية الجهازية والمخاطية وكذلك الخلطية الخلوية في الفئران BALB / c. اللقاح 25: 8707-17.

3-بينينستوك ج. (1980). الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقصبات ومصدر الخلايا المحتوية على الغلوبولين المناعي في الغشاء المخاطي. إنفيرون هيلث منظور 35: 39-42.

4.Chen JR ، Liu YM ، Tseng YC ، وآخرون. (2020). لقاحات أفضل للإنفلونزا: منظور صناعي. J بيوميد سسي 27:11.

5. Du X ، Xiong L ، Dai S ، وآخرون. (2015). جسيمات السيليكا النانوية متوسطة المسام المطلية بـ c-PGA مع عقاقير أولية مرتبطة تساهميًا لتحسين الامتصاص الخلوي والإفراج المستجيب لـ GSH داخل الخلايا. أدف هيلثك ماتر 4: 771-81.

6. Firacative C ، Gressler AE ، Schubert K ، et al. (2018). تحديد المستضدات T المساعدة (ث) 1- و 2- المستضدات المرتبطة بالمكورات المستخفية الحديثة في نموذج الفئران للعدوى الرئوية. مندوب العلوم 8:14.

7. Giri PK و Sable SB و Verma I et al. (2005). التقييم المقارن لطريق التحصين عبر الأنف وتحت الجلد لتطوير لقاح مخاطي ضد السل التجريبي. FEMS Immunol Med Microbiol 45: 87-93.

8. Horiguchi M و Oiso Y و Sakai H وآخرون. (2015). إن الإعطاء الرئوي لمثبط الكيناز 3- هو علاج علاجي لمرض الانسداد الرئوي المزمن عن طريق التجديد السنخي. J إصدار التحكم 213: 112-9.

9. Huber VC ، McKeon RM ، Brackin MN ، وآخرون. (2006). مساهمات مميزة من الأجسام المضادة التي يسببها اللقاح G1 (IgG1) والأجسام المضادة IgG2a في المناعة الوقائية ضد الأنفلونزا. لقاح كلين إمونول 13: 981-90.

10. إيتو آر ، أوزاكي يا ، يوشيكاوا تي ، وآخرون. (2003). أدوار الأجسام المضادة IgA و IgG المضادة للهيماجلوتينين في مواقع مختلفة من الجهاز التنفسي للفئران المحصنة في الوقاية من الالتهاب الرئوي الأنفلونزا المميتة. اللقاح 21: 2362-71.

11.Kopf M، Schneider C، Nobs SP. (2015). تطوير ووظيفة الضامة والخلايا التغصنية المقيمة في الرئة. نات إمونول 16: 36-44.

12.Kurosaki T، Kitahara T، Fumoto S et al. (2009). المجمعات الثلاثية من حمض بدنا ، بولي إيثيلين أمين ، وحمض جاما بوليجلوتاميك لأنظمة توصيل الجينات. المواد الحيوية 30: 2846-53.

13.Kurosaki T، Kitahara T، Nakamura T، et al. (2012). تطوير لقاح فعال للسرطان باستخدام نظام استهداف بروتين المستضد لـ APCs. فارم الدقة 29: 483-9.

14. ماربل ب ، رولاند ف ، بينينجر م. (2004). مراجعة سلامة كلوريد البنزالكونيوم المستخدم كمواد حافظة في المحاليل الأنفية: نظرة عامة على البيانات والآراء المتضاربة. Otolaryngol Head Neck Surg 130: 131–41.

15.McKee AS، Munks MW، Marrack P. (2007). كيف تعمل المواد المساعدة؟ اعتبارات مهمة للجيل الجديد من المواد المساعدة. مناعة 27: 687-90.

For more information:1950477648nn@gmail.com