الاستنساخ الجزيئي والتوصيف الكيميائي الحيوي للكومارين Glycosyltransferase الجديد CtUGT1 من Cistanche Tubulosa
Mar 17, 2022
لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com
Xiping Xu وآخرون
نبذة مختصرة
UDP-glycosyltransferases (UGTs) هي عائلة مهمة ومتنوعة وظيفيًا من الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي. الكومارين هو أحد الهياكل العظمية الأكثر شيوعًا للمنتجات الطبيعية ذات الأنشطة الدوائية المرشحة. ومع ذلك ، حتى الآن ، تم الإبلاغ عن العديد من GTs من النباتات التي اعترفت بشكل أساسي بمركبات الفلافونويد على أنها متقبلات للسكر. فقط GTs محدودة يمكنها تحفيز الارتباط بالجليكوزيل في الكومارين. في هذه الدراسة ، تم استنساخ UGT جديد منCistanche tubulosa، عشب صيني تقليدي ذو قيمة ، وهو غني بمواد جليكوسيدات متنوعة مثل جليكوسيدات فينيلثانويد ، جليكوسيدات الليغنان ، وجليكوسيدات إيريدويد. أظهر محاذاة التسلسل وتحليل النشوء والتطور ذلكCtUGT1هو بعيد من الناحية التطورية عن معظم UGTs الفلافونويد المبلغ عنها والمجاورة لـ UGTs phenylpropanoid. وجدت فحوصات الإنزيم المكثفة في المختبر أنه بالرغم من ذلكCtUGT1لم تشارك في التخليق الحيوي للجليكوزيدات النشطة بيولوجيا فيCistanche tubulosa، يمكن أن يحفز الارتباط بالجلوكوز للكومارين umbelliferone 1 و esculetin 2 و hymecromone 3 في عائد كبير. تم تحديد المنتجات المعالجة بالجليكوزيلات عن طريق المقارنة مع المعايير المرجعية أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، وأظهرت النتائج أنCtUGT1يمكن أن يحفز بشكل منظم الارتباط بالجلوكوز لهيدروكسيل الكومارين عند C 7- موضع OH. المخلفات الرئيسية التي تم تحديدهاCtUGT1تمت مناقشة نشاطه بشكل أكبر بناءً على نمذجة التماثل وتحليلات الالتحام الجزيئي. بالاقتران مع نتائج الطفرات الموجهة بالموقع ، وجد أن H19 لعب دورًا لا يمكن الاستغناء عنه كأساس تحفيزي حاسم.CtUGT1يمكن استخدامها في التحضير الأنزيمي لجليكوسيدات الكومارين النشطة بيولوجيًا.
الكلمات الدالة:النبات glycosyltransferases ، الكومارين glycosides ،Cistanche tubulosa، نمذجة التنادد ، الطفرات الموجهة بالموقع
مقدمة
يعد الارتباط بالجليكوزيل أحد أكثر أنواع تعديل الهيكل شيوعًا للمنتجات الطبيعية الثانوية. يمكن أن يغير الارتباط بالجليكوزيل استقرار و / أو قابلية الذوبان في aglycon ، ويساهم كثيرًا في تنوع المنتجات الطبيعية / غير الطبيعية بسبب أنواع الاقتران المتعددة. في النباتات ، تُجرى هذه التفاعلات عادةً بواسطة اليوريدين ثنائي فوسفات (UDP) - إنزيمات ناقلة الجليكوزيل المعتمد على (UGTs) ، وهو نوع من الإنزيمات التي تحفز نقل شقوق السكريات الأحادية من سكر النوكليوتيدات المنشط إلى جزيء متقبل للجليكوزيل والذي يمكن أن يكون كربوهيدرات ، وأوليجليكوسيد. ، أو عديد السكاريد [1،2]
حتى الآن ، تم عزل العديد من الجينات المشفرة لـ UGTs من عدة نباتات [3]. يحدث الارتباط بالجليكوزيل بشكل رئيسي في مجموعات الهيدروكسيل أو مجموعات الكربوكسيل لمجموعة واسعة من المنتجات الثانوية ، مثل الفلافونويد [4] ، فينيل بروبانويد [5] ، التربينويدات [6] ، المنشطات [7] ، القلويات [8] ، وما إلى ذلك. الكومارين هو مستقلبات فينيل بروبانويد موزعة على نطاق واسع في العديد من الأنواع النباتية. غالبًا ما توجد الكومارين الموجودة بشكل طبيعي في صورة مركبات جليكوكونجة ، وقد أظهرت هذه المشتقات مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية ، بما في ذلك مضادات الأكسدة [9] ، ومضادات الفيروسات [10،11] ، والحماية الكبدية [12] ، ومضادات الالتهاب [13] ، ومضادة للسرطان [14] ] ، ومضادات الجراثيم [15] ، والكولينستراز (ChE) وأوكسيداز أحادي الأمين (MAO) الأنشطة المثبطة [14،15] ، وما إلى ذلك ، ومع ذلك ، حتى الآن ، بالمقارنة مع مركبات الفلافونويد UGTs التي تم الإبلاغ عنها بشكل متكرر والتي تم التحقيق فيها على نطاق واسع ، فإن UGTs محدودة فقط ذكرت أنها قادرة على نقل جزء السكر إلى الكومارين [16-18].
يمكن للنباتات الغنية بالجليكوسيدات المتنوعة أن تكون بمثابة تجمع جيني مثالي لـ UGTs مع أنشطة تحفيز جديدة. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن العديد من UGTs التي تمتلك اختلاطًا كبيرًا في القبول لتحفيز الارتباط بالجليكوزيل من ركائز متعددة ، حتى أن بعضها لم يتم فصله في النباتات [19]. في هذه المقالة ، رواية glycosyltransferaseCtUGT1تم التعرف عليه منCistanche tubulosa، عشب طبي تقليدي وفير مع جليكوسيدات متنوعة مثل جليكوسيدات فينيليثانويد (PhGs) ، جليكوسيدات اللجنان ، وجليكوسيدات إيريدويد. أظهر التعبير غير المتجانسة وتوصيف الوظيفة أنه على الرغم من المؤتلفCtUGT1لم يشارك في التخليق الحيوي لهذه الجليكوسيدات فيCistanche tubulosa، يمكن أن يحفز الارتباط بالجلوكوز في هيدروكسيل الكومارين ، وقد حدث التفاعل بشكل منتظم على 7- موضع OH للكومارين أومبيليفيرون 1 ، المتصاعد 2 ، و hymecromone 3 لإنتاج ثلاثة مركبات نشطة دوائيًا كشط (1 أ) ، سيشوريين (2 أ) ، و 4- غلوكوزيد ميثيلومبيليريل (3 أ) مع عائد كبير ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا قبول ركيزة benzophenone 4،4′-dihydroxy benzophenone (4) ، وركيزة isoflavone genistein (5) ، وركيزة anthraquinone aloe-emodin (6) بواسطةCtUGT1. الخصائص التحفيزية والمخلفات الرئيسية التي تؤكد قدرة التحفيز لـCtUGT1تم تقييمها أيضًا بناءً على نمذجة التماثل ، وتحليل AutoDock ، والطفرات الموجهة للموقع.
2. التجريبية
2.1. المواد والكيماويات النباتية
Cistanche tubulosaالمستخدمة في هذه الدراسة تم جمعها من المناطق الصحراوية في منطقة هيتيان وشينجيانغ ذاتية الحكم. تم تأكيد هويتهم النباتية من قبل الأستاذ Pengfei Tu في جامعة بكين. تم شراء الكومارين والركائز الأخرى التي تم اختبارها في هذه الدراسة من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وشركة Chengdu Push Biotechnology Co. ، Ltd. (تشنغدو ، الصين) ، وشركة Chengdu Biopurify Phytochemicals Co.، Ltd. (تشنغدو ، الصين) ) ما لم ينص على خلاف ذلك. تم شراء المعايير المرجعية للقشط (1 أ) و cichoriin (2a) من Wuhan Chem Faces Biochemical Co.، Ltd. (ووهان ، الصين).
2.2. الاستنساخ الجزيئي لـ CtUGT1 من Cistanche tubulosa
مجموع الحمض النووي الريبيCistanche tubulosaتم استخراجه من الجذع اللحمي باستخدام مجموعة OMEGA Plant RNA Kit (GA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ونسخها عكسيًا إلى cDNA باستخدام مجموعة كاشف PrimeScript ™ RT (TaKaRa ، اليابان) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تصميم التمهيدي المتدهور لـ 3′RACE بناءً على تسلسل الأحماض الأمينية في PSPG المحفوظ (منتج ثانوي للنباتات Glycosyltransferases) من نباتات glycosyltransferases. التضخيم 3′-end و 5′-end لـCtUGT1تم تنفيذها باستخدام Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الاشعال (الجدول S1). كامل طول (كدنا) منCtUGT1تم تضخيمه بواسطة PCR باستخدام KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO ، اليابان) مع أزواج التمهيدي الخاصة بالجينات (الجدول S1) في ظل الظروف التالية: خطوة تمسخ أولية عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 35 دورة تمسخ في 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، التلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 55 ثانية ، مع خطوة تمديد نهائية عند 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. تم استنساخ جميع شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها في ناقل pEASY-Blunt (TransGen Biotech ، الصين) وتسلسلها.
2.3 محاذاة التسلسل وتحليل النشوء والتطور
محاذاة تسلسلCtUGT1باستخدام حزمة برامج DNAMAN 4. 0 (Lynnon Biosoft ، كندا). تم تحليل الأشكال والمجالات باستخدام أداة المجال المحفوظة (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). تم إنشاء شجرة النشوء والتطور عن طريق bootstrapping MEGA 7. 0. 14 برنامجًا باستخدام طريقة ربط الجوار مع 1000 تكرار من bootstrap [20]. تسلسل البروتين المترجمCtUGT1تمت مواءمته مع ترانسفيرازات الجليكوزيل النباتية المعروفة المودعة في قاعدة بيانات NCBI GenBank (الجدول S3) مع ClustalW.
2.4 تعبير غير متجانس وتنقية البروتين لـ CtUGT1 في الإشريكية القولونية
منطقة الترميزCtUGT1تم تضخيمه باستخدام BamH I و Not I كمواقع تقييد باستخدام الاشعال الموضحة في الجدول S1. أجريت تفاعلات PCR باستخدام KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO ، أوساكا ، اليابان). تم التحقق من التسلسلات التي تم الحصول عليها عن طريق الاستنساخ في ناقل pEASY-Blunt (TransGen Biotech ، الصين). منتج التضخيم المؤكد لـCtUGT1تم هضمه واستنساخه لاحقًا في ناقل التعبير pET -28 a (زائد) (Novagen ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم بعد ذلك تحويل البنية التي تم التحقق منها إلى E. coli Transetta (DE3) للحصول على السلالة المؤتلفة. تم تلقيح مزرعة بين عشية وضحاها من السلالة المؤتلفة في وسط Luria-Bertani (LB) الذي يحتوي على 5 0 ug⋅mL− 1 كاناميسين و 4 0 ug⋅mL1 كلوروميسيتين بنسبة 1: 1 {{ 19}} 0. نمت الثقافات عند 37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة حتى وصلت قيمة OD إلى 0.4-0.6. تمت إضافة Isopropyl - - D-thiogalactopyranoside (IPTG) لاحقًا إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملي مولار ونمت الخلايا لمدة 16 ساعة عند 18 درجة مئوية ، 180 دورة في الدقيقة. ثم تم حصاد كريات الخلايا بالطرد المركزي (7600 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، وإعادة تعليقها في محلول تحلل مبرد 3 مل / جم (ملاحظة البيانات التكميلية 1) ، وتعطيلها صوتنة على الجليد. تمت إزالة حطام الخلية بالطرد المركزي عند 7600 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبًا. تم استخدام عمود Histrap تمت معايرته مسبقًا (GE Healthcare ، Uppsala ، السويد) لكروماتوجرافيا التقارب وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تمت تصفية البروتين المؤتلف بواسطة 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للشطف (ملاحظة البيانات التكميلية 1) التي تحتوي على 250 ملي إيميدازول. تم تحليل نقاء البروتين بنسبة 10 بالمائة SDS-PAGE. تم تركيز البروتين المنقى بواسطة أنبوب ترشيح فائق 30 كيلو دالتون (Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحليته باستخدام عمود PD – 10 (GE Healthcare ، Uppsala ، السويد) مع محلول إزالة الملوحة (ملاحظة البيانات التكميلية 1). تم تحديد تركيز البروتين بطريقة برادفورد باستخدام مساحة سطح الجسم كمعيار.
2.5 فحوصات النشاط الأنزيمي وخصوصية الركيزة لـ CtUGT1
للتحقيق في نشاط الارتباط بالجليكوزيل لـCtUGT1، تم إجراء فحوصات الإنزيم في خليط تفاعل (15 0 ميكرولتر) مكوّن من 0. 4 ملي مولار من aglycone ، 0.8 ملي UDP- جلوكوز (UDPG) ، و 50 ميكروغرام من المنقىCtUGT1البروتين في محلول التحلية. تم تحضين جميع التفاعلات عند 3 0 درجة مئوية لمدة 12 ساعة وتنتهي بإضافة 300 ميكرولتر من الميثانول البارد. تم طرد المخاليط عند 15 ، 000 × جم لمدة 30 دقيقة لتجميع المادة الطافية لتحليلات HPLC-UV / ESI-MS. تم إجراء ثلاث فحوصات متوازية بشكل روتيني لكل تفاعل. تم تجهيز HPLC (Agilent 1260 ، الولايات المتحدة الأمريكية) بكاشف صفيف الصمام الثنائي وعمود CAPCELL PAK C18 (250 مم × 4.6 مم ، 5 ميكرومتر ؛ شيسيدو ، اليابان) بمعدل تدفق 1 مل دقيقة ، ودرجة حرارة العمود تم الحفاظ عليه عند 30 درجة مئوية. يتكون الطور المتحرك من A (أي 0.1 بالمائة محلول مائي لحمض الفورميك) و B (أي أسيتونيتريل). تم سرد برامج التدرج في الجدول S4. تم تسجيل بيانات HRESI-MS على نظام LCMS-IT-TOF ، مزود بواجهة ESI (شيمادزو ، كيوتو ، اليابان) بنقاوة عالية للغاية هي غاز الاصطدام ، و N2 كغاز البخاخات. كانت معلمات مصدر ESI المحسّنة على النحو التالي: معدل تدفق غاز الغمد ، 1.5 مل دقيقة ؛ معدل تدفق الغاز الإضافي ، 1.5 مل دقيقة ؛ جهد الرش ، 4.5 كيلو فولت ؛ درجة حرارة الشعيرات الدموية ، 200 درجة مئوية. تم تسجيل الأطياف في نطاق 100-1500 م / ض لتحليل MS مسح كامل.
2.6. تأثيرات زمن التفاعل وقيمة الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة على نشاط الإنزيم والدراسات الحركية لـ CtUGT1
تأثيرات زمن التفاعل وقيمة الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة على نشاط إنزيمCtUGT1تم اختباره باستخدام UDPG كمانح للسكر و 3 كمتقبل للسكر في ظروف التفاعل كما هو موضح أعلاه. لتحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل ، تمت مقارنة نشاط الإنزيم في محلول مؤقت واحد 0 0 ملي مولار (حامض الستريك - سترات الصوديوم) بقيم أس هيدروجيني تتراوح من 3. 0 إلى 6. {{{100 0}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}. 14}} ، 1 0 {{2 0} مم مخزن مؤقت (KH2PO 4- K2HPO4) مع قيم pH تتراوح من 6. 0 إلى 8. {{29} } ، 1 0 0 ملي مولار (Tris-HCl) مع قيم pH تتراوح من 7.0 إلى 9.0 ، 100 ملي مولار (Na2CO 3- NaHCO3) مع قيم pH تتراوح من 9.0 إلى 11.0. للمعايرة لدرجة حرارة التفاعل المثلى ، تم تحضين التفاعلات عند درجات حرارة مختلفة تتراوح من 0 إلى 65 درجة مئوية. تم تقييم الدورات الزمنية للتفاعل في 12 نقطة زمنية مختلفة بين 0 و 24 ساعة. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ. تم تحليل مخاليط التفاعل بواسطة HPLC-MS كما هو موصوف أعلاه. للدراسات الحركيةCtUGT1، تم إجراء الاختبارات الأنزيمية في حجم نهائي قدره 1 0 0 ميكرولتر يحتوي على 100 ملي مولار KH2PO 4- K2HPO4 عازلة (درجة الحموضة 8.0) ، 25 ميكروغرام من المنقىCtUGT1، 3 ملي مولار من UDPG ، وتركيزات مختلفة (50-3000 ميكرومتر) من 3. أجريت التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم انتهت بـ 100 ميكرولتر من الميثانول المثلج. تم إجراء كل هذه التفاعلات في ثلاث نسخ ، وتم تقييم نشاط الإنزيم من خلال التقدير الكمي لمشتقات الجلوكوزيلات المناظرة. تم حساب المعلمات الحركية ، بما في ذلك ثابت Michaelis-Menten (Km) و Vmax ، عن طريق تحليل الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج GraphPad Prism 5.
2.7. انتقائية الجهات المانحة الركيزة والسكر لـ CtUGT1
لاستكشاف تفضيلات الركيزةCtUGT1، تم اختبار ما مجموعه 27 ركيزة تنتمي إلى أنواع هيكلية مختلفة باستخدام UDPG كمانح. تم إدراج معلوماتهم الكيميائية في الجدول S5 ، وتم عرض هياكلهم في التين. S1 و S2. للتحقيق في انتقائية المتبرعين بالسكرCtUGT1، أجريت الاختبارات باستخدام أومبيليفيرون (1) ، إسكوليتين (2) ، هيميكرومون (3) ، 4،4-ديهيدروكسي بنزوفينون (4) ، جينيستين (5) ، والألوة إيمودين (6) كركائز مع UDPG ، UDP- N أسيتيل جالاكتوزامين ، UDP-galactose ، الناتج المحلي الإجمالي- مانوز ، الناتج المحلي الإجمالي الفوكوز ، حمض الجالاكتورونيك UDP ، UDP-rhamnose كمانحين للسكر ، على التوالي. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ. تم تحليل مخاليط التفاعل بواسطة HPLC-MS كما هو موصوف أعلاه.
2.8. تحضير 4- غلوكوزيد methylumbelliferyl (مركب 3 أ) بواسطة CtUGT1
يتكون خليط التفاعل التحضيري من {0}. 034 ملي مول من مركب الركيزة 3 ، 0.04 ملي مول UDPG ، 5 مجم منقىCtUGT1في 5 0 عازلة رد فعل. تم تحريك التفاعلات برفق في الظروف المثلى (100 ملي KH2PO 4- K2HPO4 مع درجة الحموضة 8.0 ؛ 37 درجة مئوية). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، تم فصل المادة الطافية للتفاعل بواسطة كروماتوجرافيا العمود باستخدام راتينج كبير المسام (MCI GEL CHP) بعد الطرد المركزي عند 12 ، 000 × جم لمدة 30 دقيقة. كانت المرحلة المتنقلة عبارة عن شطف متدرج من 100 في المائة من الماء إلى 100 في المائة من الميثانول. تم تحليل كل جزء بواسطة HPLC-UV. تم تبخير الأجزاء التي تحتوي على منتجات مستهدفة فقط حتى تجف تحت ضغط منخفض وتتميز بمطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتحليل الطيفي 13C NMR.
2.9 الالتحام الجزيئي والطفرات الموجهة للموقع لـ CtUGT1
نموذج البروتينCtUGT1باستخدام SWISS-MODEL [21-25]. تم اختيار التركيب البلوري لـ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) ليكون هيكل القالب [26]. تم تقييم النموذج الذي تم إنشاؤه بواسطة VERIFY -3 D [27،28]. تم استخدام Auto-Dock Vina في دراسات الالتحام الجزيئي [29]. تم استخدام التركيب البلوري لـ UGT74F2 [3 0] ، وهو عبارة عن ناقلة غليكوزيل من Arabidopsis thaliana ، في مركب مع ligand UDP وحمض الساليسيليك (PDB ID 5U6M) كهيكل تحكم لجيب مانح السكر وتحليل جيب متقبل السكر ، على التوالي . تم استخدام Auto-Dock-Tools 1.5.6 من MGLTools (أدوات مختبر الرسومات الجزيئية) لإعداد مانح السكر UDPG والركيزة 1 ، 2 لرسو السفن الجزيئي. تم ضبط السلاسل الجانبية للمخلفات حول تجويف الموقع النشط بشكل مرن ، وتركت الروابط القابلة للدوران الخاصة بالرابطات حرة للتدوير. تعرض الوضع الأعلى مرتبة كما تم الحكم عليه من خلال نموذج Vina لرسو السفن مع أعلى تقارب (kcat / mol) للتحليل المرئي باستخدام برنامج PyMOL 2.0.
لتحقيقات الطفرات ، تسلسل الجين الأمثلCtUGT1(ملاحظة البيانات التكميلية 2) تم تصنيعه واختباره كنوع بري. الطفرات الموجهة للموقع منCtUGT1أجري باستخدام نظام الطفرات السريعة (TransGen Biotech). تم تضخيم الطفرات من قالب الجين المحسن الذي تم إنشاؤه في ناقل pET -28 باستخدام البادئات المحددة الموضحة في الجدول S1. تم التحقق من الطفرات المنشأة بواسطة PCR والتسلسل قبل أن تتحول إلى E. coli (DE3) للتعبير غير المتجانسة. تم إجراء تنقية البروتين وتفاعلات الإنزيم وتحليلها كما هو موضح أعلاه.
3. النتائج والمناقشة
3.1. استنساخ (كدنا) كامل الطول للجين CtUGT1 منCistanche tubulosa
Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) هو عشب طبي صيني تقليدي ينتج مجموعة متنوعة من الجليكوسيدات الطبيعية النشطة بيولوجيًا. يجب أن يكون هناك عدد كبير من جينات ناقلات الجليكوزيل الجديدة التي كانت موجودة في جينومها. للبحث عن ترانسفيرازات جليكوزيل جديدة مع أنشطة تحفيز مثيرة للاهتمام ، تم تصميم برايمر متدهور لـ 3′-RACE بناءً على فكرة PSPG المحفوظة لاستنساخ UGTs المسموح بها منCistanche tubulosa. تم تحليل التسلسل ثلاثي النهاية الذي تم الحصول عليه بواسطة انفجار NCBI وتم تصميم التمهيدي المحدد لـ 5-RACE بناءً على التسلسل الذي تم الحصول عليه. تم تقطيع النهايات المكبرة 5 cDNA ونهايات 3 cDNA والطول الكاملCtUGT1تم الحصول على تسلسل ، بما في ذلك 1739 نيوكليوتيدات ، (الشكل S3) وأدرج في البيانات التكميلية ملاحظة 3. بعد ذلك ، إطار قراءة مفتوح (ORF) منCtUGT1تم العثور عليه بواسطة أدوات NCBI ORF Finder وتم استنساخ تسلسل الترميز 1482 نقطة أساس بنجاح بواسطة تضخيم RT-PCR باستخدام بادئات محددة في الجدول S1. تم تقديم تسلسل cDNA لـ CtUGT1 إلى NCBI (رقم الانضمام MW629113).
3.2 تحليل التسلسل والتعبير غير المتجانسة عن CtUGT1
الCtUGT1كان من المتوقع أن يقوم الجين بتشفير بروتين مكون من 493 من بقايا الأحماض الأمينية بكتلة جزيئية تقدر بـ 55.78 كيلو دالتون. كشف انفجار NCBI أن تسلسل البروتين المستخلص منCtUGT1يشترك في أعلى هوية (76.39 بالمائة) مع UGT 86 A 1- مثل الإنزيمات. لم يتم توصيف الوظائف البيوكيميائية لهذا النوع من الإنزيم بشكل كامل. من المتوقع أنهم قد يشاركون في تكيف النبات مع الضغوط اللاأحيائية. يظهر في الشكل S4 محاذاة متواليات الأحماض الأمينية لـ CtUGT1 وغيرها من ترانسفيرازات الجليكوزيل النباتية.
تم العثور على 44 من البقايا المحفوظة للغاية لعنصر PSPG في المحطة C فيCtUGT1. داخل صندوق PSPG ، تم تحديد تسلسل الببتيد لـ HCGWNS في الحمض الأميني 373 ، والذي تم اكتشافه في 95 بالمائة من جميع ناقلات الجليكوزيل [31]. كانت البقايا النهائية لعزر PSPG هي الجلوتامين ، مما يشير إلى أن هذا الإنزيم يميل إلى استخدام UDPG كمانح للسكر [32] (الشكل S4). تم إنشاء شجرة النشوء والتطور بناءً على تسلسل متعدد الببتيد المتوقع لـCtUGT1وأنواع مختلفة من الجليكوزيل ترانسفيرازات ذات الأصل النباتي والتي شاركت في التخليق الحيوي للعديد من المستقلبات الثانوية. حتى الآن ، تعرفت معظم ترانسفيرازات الغليكوزيل من النباتات على مركبات الفلافونويد باعتبارها ركائزها ، مثل فلافون 7- O-glycosyltransferases و flavonoid 3- O-glucosyltransferases و isoflavone 7- O-glycosyltransferases و ترانسفيرازات جليكوزيل كالكون. أظهرت نتائج تحليل النشوء والتطور ذلكCtUGT1لم يتم تجميعها في كليد من مركبات الفلافونويد جي تي. بدلاً من ذلك ، يقع بالقرب من UGT74T1 و UGT74S1 (lignan glycosyltransferases من Linum usitatissimum) و NtGT2 (أحد مركبات الكومارين glycosyltransferase من Nicotiana tabacum) ، مما يشير إلى ذلكCtUGT1قد يكون لها بعض أنشطة التحفيز الجديدة تجاه ركائز فينيل بروبانويد (الشكل 1) ، ولا سيما أنه تم تحديد أعضاء محدودة فقط من الناحية الوظيفية التي تنتمي إلى هذه الواجهات.
لمزيد من الكشف عن نشاطه التحفيزي ، فإنCtUGT1تم التعبير عن التسلسل تحت سيطرة محفز T7 lac في خلايا E. coli Transetta (DE3) باعتباره بروتين الاندماج الموسوم 6- الخاص به. المؤتلف له الموسومةCtUGT1تم تنقيته بكفاءة إلى التجانس بواسطة كروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA. كان الوزن الجزيئي للمادة المؤتلفة CtUGT1 حوالي 55 كيلو دالتون (الشكل S5) ، وهو ما يتوافق مع الكتلة الجزيئية المتوقعة.
3.3 خصوصية الركيزة في المختبر من CtUGT1
لاختبار نشاط الارتباط بالجليكوزيلCtUGT1، في المختبر تم إجراء فحوصات الأنزيمية. تم استخدام UDPG كمانح السكر. تم اختيار متقبلات السكر بناءً على اهتمامات مختلفة. أولا ،CtUGT1تم استنساخ الجين منCistanche tubulosaمكوناتها الكيميائية الرئيسية هي PhGs. للتحقق مما إذا كانCtUGT1يشارك في التخليق الحيوي لـ PhGs ، وهي مركبات aglycones الشائعة في PhGsCistanche tubulosaمثل التيروزول (NP1 ، الشكل S2) والساليدروزيد (NP2 ، الشكل S2) تم اختيارهم أولاً كركائز. لسوء الحظ ، لم تجد تحليلات HPLC و HRESI-MS أي منتجات معالجة بالجليكوزيلات ، مما يشير إلى ذلكCtUGT1قد لا تشارك في التخليق الحيوي لـ PhGs.
ثانيًا ، بناءً على محاذاة التسلسل ونتائج تحليل النشوء والتطور (الشكل 1) ،CtUGT1كانت مرتبطة نسبيًا بـ lignanoid و coumarin glycosyltransferases ، مما يشير إلى أنCtUGT1من المحتمل أن يكون فينيل بروبانويد غليكوزيل ترانسفيراز. للتحقق من هذا التنبؤ ، تم اختبار ثلاث ركائز من الكومارين 1 و 2 و 3 مع ركيزة ليجنانويد واحدة ماغنولول NP17 كمقبلات للسكر ، على التوالي. تم استخدام الإنزيمات المعطلة بالحرارة (100 درجة مئوية ، 10 دقائق) كعنصر تحكم سلبي. لم يجد تحليل HPLC-HRESI-MS للتفاعلات باستخدام NP17 كركيزة أي منتج. على نقيض ذلك،CtUGT1أظهر قدرات واضحة على الارتباط بالجلوكوز ضد ركائز الكومارين المختبرة (1،2،3). باستخدام الركيزة 1 كمثال ، كما هو مبين في الشكل 2 أ ، تم إنتاج ذروة جديدة (1 أ) مع وقت استبقاء منخفض (11.46 دقيقة) مقارنة مع الركيزة 1 (19.75 دقيقة) بواسطةCtUGT1بعائد 37.78٪. يتوافق طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الخاص به مع 1. أظهر طيف HRESI-MS أن ذروة 1 أ أظهرت [M زائد H] زائد عند m / z 325.1029 ، و [M plus Na] زائد عند m / z 347.0710 (calcd. 347.0737 لـ C15H16O8Na ) مع الصيغة المتوقعة لـ C15H16O8 ، والتي كانت أكبر بـ162 وحدة من 1 وتتوافق مع الصيغة النظرية لمنتج معالج بالجلوكوز (الشكل 2 أ). وبالمثل ، تم العثور أيضًا على منتج الجلوكوزيلاتي للركيزة 2 (14.21 دقيقة ، الشكل 2 ب) و 3 (21.92 دقيقة ، الشكل 2 ج) في وقت الاحتفاظ البالغ 10.85 دقيقة و 13.80 دقيقة ، بمعدل تحويل 22.03 بالمائة و 68.67 بالمائة ، على التوالى. تطابق الكتلة الجزيئية للمنتجات مع الكتلة المحسوبة للمنتجات التي تحتوي على الجلوكوزيلات بالضبط ، مما يؤكد ذلكCtUGT1يمكن أن يحفز الارتباط بالجلوكوز لمركبات الكومارين 1-3 (الجدول 1).
في وقت لاحق ، مع الأخذ في الاعتبار أن معظم الإنزيمات التي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا أظهرت اختلالًا في التحفيز في المختبر ، لمواصلة استكشاف طيف الركيزة منCtUGT1، تم إجراء فحوصات الإنزيمات الموسعة نحو مركبات متنوعة تنتمي إلى أنواع مختلفة من المنتجات الطبيعية ، بما في ذلك مركبات الفلافونويد ، والمركبات الفينولية ، والكومارين ، والستيلبين ، والأنثراكينون ، والبنزوفينون ، والنفثالين ، والإيريويد (التين. S 1- S2) ، باستخدام UDPG مثل المتبرع بالسكر. وجد أن ركيزة benzophenone 4،4′-dihydroxy benzophenone (4) ، وركيزة isoflavone genistein (5) ، وركيزة anthraquinone aloe-emodin (6) يمكن أيضًا تحفيزها بواسطةCtUGT1لتشكيل منتج الجلوكوزيلاتيد المقابل 4 أ ، 5 أ ، 6 أ مع قطبية أعلى (الشكل 3). أظهر تحليل HRESI-MS أن القمم الأيونية للمنتجات كانت جميعها أكبر بـ 162 وحدة من تلك الموجودة في الركائز ، مما يشير إلى أنCtUGT1يمكن أن تحفز عملية الارتباط بالجلوكوز لهذه المركبات لتشكيل منتجها الأحادي الجلوكوزيد المقابل. كانت معدلات التحويل 4 و 5 و 6 4.12 بالمائة و 14.14 بالمائة و 23.33 بالمائة على التوالي (الجدول 1).
انتقائية المتبرع بالسكرCtUGT1تم استكشافه أيضًا. بالإضافة إلى UDPG ، تم اختبار ستة مانحين آخرين ، بما في ذلك UDP-N-acetyl galactosamine ، و UDP galactose ، و GDP-mannose ، و GDP-fucose ، و UDP-galacturonic acid ، و UDP rhamnose ، باستخدام ركائز 1-6 كمقبلات. أظهرت النتائج أنCtUGT1تم اختيار UDPG حصريًا كمانح للسكر. لم يلاحظ أي منتج عند اختبار السكريات المنشطة الأخرى (البيانات غير معروضة).
3.4. الخصائص البيوكيميائية والمعلمات الحركية لـ CtUGT1
الخصائص البيوكيميائية لCtUGT1تم فحصها باستخدام 3 كمتقبل للسكر و UDPG كمانح للسكر كما هو موضح في الشكل 4. نشاط التحفيزCtUGT1تم اختباره في نطاق درجة حرارة 4-6 0 درجة مئوية ، وتم اكتشاف النشاط الأمثل عند 37 درجة مئوية (الشكل 4 أ). أظهر تحليل نشاط الإنزيم بين الرقم الهيدروجيني 3. 0 و 9. 0 أنه تم ملاحظة قيمة الأس الهيدروجيني المثلى عند درجة الحموضة 8.0 (100 ملي مولار KH2PO 4- K2HPO4 ، الشكل 4C). زاد محصول منتج الارتباط بالجلوكوز 3 أ خطيًا خلال ساعة واحدة واستقر معدل النمو بعد 5 ساعات (الشكل 4 ب). القيمة الواضحة لـ KmCtUGT1لـ 3 كان 218.7 ± 7.176 ميكرومتر ، وكان Vmax 0. 0 2255 ± 0.0001796 نانومول⋅ دقيقة 1⋅ug− 1.
3.5 التحضير الأنزيمي والتعرف الهيكلي على منتجات الجلوكوزيلاتيد
بناءً على نتائج فحوصات الإنزيم ،CtUGT1يميل إلى أن يكون عبارة عن ناقلة جلوكوزيل معينة يمكنها تحفيز الارتباط بالجلوكوز لأنواع مختلفة من المنتجات الطبيعية. تم تلخيص معلومات HPLC-HR-MS للمنتجات في الجدول 1. من بينها ، أظهرت ركائز الكومارين معدل تحويل كبير. تم تحليل نشاط الإنزيم ضد الكومارين بشكل أكبر. وتجدر الإشارة إلى أن جميع ركائز الكومارين المختبرة مقبولة من قبلCtUGT1تحتوي على مجموعة هيدروكسيل في الموضع C -7 ، بينما يحتوي esculetin (2) على مجموعة هيدروكسيل إضافية في الموضع C -6. يوضح الشكل 2. ملف تعريف HPLC للمنتج المعالج بالغلوكوزيلات من esculetin. وقد لوحظ منتج واحد فقط ، مما يشير إلى أن تفاعل الارتباط بالجلوكوز بشكل منظم حدث في الموضع C -6 أو C -7. لتأكيد موقع الارتباط بالجليكوزيل ، تم تحديد المنتج 2 أ عن طريق المقارنة مع الجلوكوزيدات الأصلية عن طريق تحليل HPLC-UV / HRESI-MS. عند إضافة الجلوكوزيد الأصلي cichoriin (غلوكوزيلاتيد على 7- موضع OH 2) في نظام التفاعل ، فإن الذروة تتداخل مع 2 أ ، وملف تعريف HPLC المشترك أكد أيضًا أن منتج الجليكوزيلات 2 المحفز بواسطةCtUGT1هو cichoriin [33] ، والذي أثبت أن جزء الجلوكوزيل قد تم نقله تحديدًا في موضع C 7- OH. تم تحديد المنتج 1 أ أيضًا من خلال المقارنة مع المعيار المرجعي. كشفت أطياف UV-HPLC جنبًا إلى جنب مع تحليل HPLC المشترك (الشكل 2) أن التركيب الكيميائي لـ 1 أ يُعزى إلى القشط [34] ، وهو منتج غلوكوزيلي لـ 1 على C 7- موضع OH.
تم تحضير المنتج 3 أ من تفاعل موسع وتميز هيكليًا بواسطة مطيافية HRESI-MS و 1 H NMR و 13 C NMR (الأشكال S13 و S14 و Note 4). في إشارة 1H NMR ، مقارنةً بالركيزة 3 ، اختفت إشارة هيدروكسيل الفينول في الموضع C {{1 0} ، وتحولت إشارة الكربون لـ C -7 بمقدار δ 1. {{25} } جزء في المليون إلى الحقل العالي ، بينما تحولت إشارات C -6 و C -8 إلى الحقل المنخفض في 13C NMR. أكدت هذه النتائج أن بقايا الجلوكوبيرانوزيل كانت مرتبطة بمجموعة هيدروكسيل الفينول في الموضع C -7 من 3 [35]. إلى جانب ذلك ، أظهر طيف 1H NMR إشارات بروتون شاذة عند δH 5. 00 (1H ، d ، J=7. 0 هرتز) ؛ تمت الإشارة إلى أن مكون السكر هو -D-glucopyranose. أظهرت هذه النتيجةCtUGT1هو عبارة عن كومارين O-glucosyltransferase الذي يحفز الارتباط بالجلوكوز لهيدروكسيل الكومارين في 7- موضع OH.
3.6 نمذجة التنادد ، الالتحام الجزيئي ، والطفرات الموجهة للموقع لبروتين CtUGT1
كشفت تفاعلات الإنزيم الواسعة ذلكCtUGT1يمكن أن يحفز الارتباط بالغلوكوزيل لثلاثة من الكومارين في منتجها المطابق للجلوكوزيلات ، ويحدث وضع الجلوكوزيلات تحديدًا في موضع OH 7-. لتحديد المخلفات الرئيسية التي حددت أنشطة التحفيز منCtUGT1، ونمذجة التماثل ، والالتحام الجزيئي ، وتحقيقات الطفرات الموجهة للموقع من CtUGT1. تم إنشاء النمذجة الجزيئية المتماثلة لـ CtUGT1 باستخدام SWISS-MODEL [21-25]. التركيب البلوري لـ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) ، الذي تم تحديده بدقة 2.1 Å ، أظهر أعلى درجة إجمالية مع أقصى تماثل تسلسل وقيمة E منخفضة ، تم اختياره كهيكل القالب [26]. تم عرض تقييم العقلانية للنموذج المعمول به في مؤامرة راماشاندران (الشكل S6) ، 88.5 بالمائة من المخلفات في النموذج المعمول به في المنطقة الأكثر تفضيلًا. يتكون نموذج التماثل لـ CtUGT1 من شكلين متشابهين من نوع Rossmann عند طرفي N- و C ، على التوالي (الشكل 5A). يحتوي المجال N-terminal على صفائح متوازية من سبع خيوط حولها عشر حلزونات. يحتوي المجال الطرفي C على صفائح من ستة خيوط محاطة بتسع حلزونات (الشكل 5 أ ، S7).
لمزيد من التوضيح الجيب النشطCtUGT1، تم إجراء الالتحام الجزيئي. نظرًا لأن UGT85H2 لا يحتوي إلا على بنية شكل apo ، فقد تم تحديد UGT74F2 متماثل آخر مع كل من UDP وحمض الساليسيليك حيث تم اختيار رابطين كقالب تحكم. تم إعداد UDPG كمانح السكر. تم تحضير ركيزتين من الكومارين 1 و 2 كمتقبلات للسكر على التوالي. تم حساب مواقع الربط للمانح والمقبول للجليكوزيل بشكل منفصل كما هو موضح في الشكل 5. أشارت النتائج إلى أن كلا جيبي الربط يقعان داخل الشق العميق في منطقة التفاعل للمجال N-terminus المعبأ بإحكام و C -المجال المدى منCtUGT1وقريبًا مكانيًا من بعضهما البعض (الشكل 5 أ). المحطة C منCtUGT1تشارك بشكل أساسي في التلامس مع المتبرع بالجليكوزيل كما هو موصوف في UGTs للنباتات الأخرى ، ومعظم المخلفات المحيطة محبة للماء ومحفوظة للغاية. مثل صندوق PSPG النموذجي ، يمكن أن تشكل البقايا W377 في هذا الشكل روابط هيدروجينية مع مجموعة الجلوكوز في UDPG (الشكل 5 ب) ؛ يمكن أن يشكل N378 و S379 في هذا الشكل روابط هيدروجينية مع مجموعة ثنائي الفوسفات من UDPG (الشكل 5 ب). بالإضافة إلى ذلك ، وفقًا لنتائج الإرساء ، قد تتفاعل بقايا W356 و Q359 مع مجموعة اليوريدين من خلال تفاعل رابطة الهيدروجين لتثبيت المتبرع في الجيب النشط. للتحقق من وظيفة هذه المخلفات الرئيسية المتوقعة ، تم اختيار ما مجموعه 16 موقعًا وتعرضوا لطفرات مسح الألانين. تم اختبار أنشطة التحفيز لهذه المسوخ باستخدام جميع الركائز الإيجابية الست المذكورة أعلاه. أظهرت تحليلات HPLC أنه عندما تم تحور بقايا G18 و H19 و S295 و F296 و W356 و C357 و Q359 و H374 و G376 و W377 و N378 و S379 و E382 و Y397 و D398 إلى ألانين ، كان نشاط الارتباط بالجليكوزيل للبروتين. ضاع تمامًا تجاه جميع الركائز المختبرة. تشير هذه النتائج إلى أن البقايا الستة عشر المذكورة أعلاه هي البقايا الرئيسية التي تحدد ارتباط مانح UDPG ونشاط الارتباط بالجليكوزيل لـCtUGT1.
To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 بالمائة) مثل V14 و V132 و E153 و T212 و I209 (الشكل S8). من المتوقع أن هذه البقايا الكارهة للماء المحيطة بالحلقة العطرية يمكن أن تشكل تفاعلات فان دير فالس مع الركيزة في جيب الربط.
4. مناقشة
يعد الارتباط بالجليكوزيل أحد أهم خطوات التعديل في العديد من مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية. يمكن أن يزيد الارتباط بالجليكوزيل من التوافر البيولوجي للمنتجات الطبيعية عن طريق تحسين قابليتها للذوبان في الماء وتقليل سميتها. يعتبر الكومارين أبسط شكل ضمن فئة ضخمة من المواقف الفرعية الفينولية التي تحدث بشكل طبيعي والتي تم إنشاؤها من حلقة بايرون مدمجة بحلقة بنزين. جذبت كل من المركبات الطبيعية والاصطناعية القائمة على الكومارين اهتمامًا كبيرًا من الكيميائيين الطبيين وعلماء تصميم الأدوية نتيجة لخصائصها الدوائية والبيولوجية المتنوعة [36]. يمكن أن يساعد التعديل الإضافي للكومارين بالجليكوزيلات في إثراء التنوع الهيكلي لهذه المركبات وكذلك تحسين قابليتها للذوبان والتوافر البيولوجي. في النباتات ، يتم تحفيز عملية الارتباط بالجليكوزيل بواسطة UDP-glycosyltransferase. على الرغم من أنه تم تحديد UGTs المتعددة من نباتات مختلفة ، حتى الآن ، فإن معظم UGTs المبلغ عنها كان متورطًا في تعديل الفلافونويد بالجليكوزيلات. تم الإبلاغ عن UGTs محدودة فقط لتكون قادرة على قبول الكومارين كركائز. في هذه الدراسة ، جين جديد glycosyltransferaseCtUGT1تم استنساخه من عشب صيني تقليديCistanche tubulosa. أظهرت نتائج محاذاة التسلسل وتحليل النشوء والتطور ذلكCtUGT1هو بعيد من الناحية التطورية عن معظم UGTs الفلافونويد المبلغ عنها ، وهو قريب جدًا من فينيل بروبانويد UGTs. كشفت فحوصات الإنزيم المكثفة أن CtUGT1 لا يمكن أن يحفز الارتباط بالجليكوزيل لمركبات فينيل الإيثانول لتكوين دكتوراه ، وهو المكون الكيميائي الرئيسي لمركبات فينيل الإيثانول.Cistanche tubulosa. بدلاً من ذلك ، يمكنه التعرف على الكومارين باعتباره ركائزه ، وإجراء تفاعل الارتباط بالجليكوزيل. أظهر توضيح هيكل المنتجات أن موقع الارتباط بالجليكوزيل محفز بواسطةCtUGT1حدث بشكل رسمي في موقع C 7- OH للكومارين. باستخدام CtUGT1 ، تم تصنيع ثلاثة جليكوسيدات الكومارين بما في ذلك القشط (1 أ) وسيشوريين (2 أ) و 4- ميثيلومبيليفيريل جلوكوزيد (3 أ) بنجاح وتم تخليقها هيكليًا. تم الإبلاغ عن كل هذه المركبات الثلاثة كجزيئات نشطة صيدلانيًا. على سبيل المثال ، تم اعتبار أن 1 أ تمتلك العديد من الأنشطة الدوائية ، بما في ذلك النشاط الوقائي للكلية ، ومضادات الالتهاب ، ومضادة للسرطان ، والخصائص المضادة للأميبا [37]. أظهر الشكل 2 أ نشاطًا عاليًا مضادًا للبكتيريا ضد بعض البكتيريا موجبة الجرام مثل Bacillus cereus و Staphylococcus aureus [38]. 3 أ يمكن أن تساعد النباتات على تحسين قدرتها على الاستجابة للمواد الكيميائية والسموم [39].
بالإضافة إلى الكومارين ، وجدت فحوصات الإنزيم الواسعة ذلكCtUGT1أظهر أيضًا نشاط ارتباط الجلوكوز الملحوظ تجاه ركيزة البنزوفينون 4 ، وركيزة الايسوفلافون 5 ، وركيزة أنثراكينون 6 ، مما يشير إلى أن CtUGT1 لديه بعض تحمل الركيزة. مع ذلك،CtUGT1لا يمكن أن تحفز التخليق الحيوي لمكونات الجليكوزيدات فيCistanche tubulosaمثل جليكوسيدات فينيل إيثانويد (PhGs) ، جليكوسيدات اللجنانويد ، و جليكوسيدات إيريدويد. إلى جانب ذلك ، وفقًا للتحقيقات السابقة ، لم يتم عزل جليكوسيدات الكومارين منCistanche tubulosa. لذا ، فإن الوظيفة في الجسم الحي لـCtUGT1لا يزال بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف. إن نشاط الارتباط بالجلوكوزيل لـ CtUGT1 تجاه ركائز الكومارين يجعل هذا الإنزيم أداة مفيدة لتعديل الارتباط بالجليكوزيل الإنزيمي للكومارين ، وأشار أيضًا إلى أن إنزيمات التمثيل الغذائي الثانوية للنبات يمكن أن تؤدي أنشطة تحفيز لا تقدر بثمن تتجاوز وظائفها الأصلية.
إعلان تضارب المصالح
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
إعتراف
تلقى هذا العمل دعماً مالياً من مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 7192112) ؛ برنامج رعاية العلماء الشباب من CAST (المنحة رقم CACM− 2018− QNRC1− 02) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81402809) ؛ صندوق المنح الدراسية التابع لمجلس الدولة الصيني للمنح الدراسية (المنحة رقم 201906555010) ومؤسسة العلوم لعلماء النخبة الشباب بجامعة بكين للطب الصيني (رقم المنحة 2018- JYB-XJQ006).
الملحق أ. البيانات التكميلية
يمكن العثور على البيانات التكميلية لهذه المقالة عبر الإنترنت على https: // doi. org / 10.1016 / j.fitote.2021.104995.
من: "الاستنساخ الجزيئي والتوصيف الكيميائي الحيوي لأنزيم الكومارين glycosyltransferase الجديدCtUGT1منCistanche tubulosa' بواسطةXiping Xu وآخرون
---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995
مراجع
[1] Y. Li ، S. Baldauf ، EK Lim ، DJ Bowles ، تحليل النشوء والتطور لعائلة UDPglycosyltransferase متعددة الجينات من Arabidopsis thaliana ، J. Biol. تشيم. 276 (2001) 4338-4343 ، https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie، Q. Wang، RAJ Warren، SG Withers، Glycosynthases: المتحولة glycosidases لتخليق oligosaccharide ، J. Am. تشيم. شركة 120 (1998) 5583–5584 ، https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux، CE Melancon، HW Liu، التخليق الحيوي غير العادي للسكر وتنويع السكر في المنتجات الطبيعية ، Nature 446 (2007) 1008-1016 ، https://doi.org/ 10.1038 / nature05814.
[4] Y. Ji، B. Li، M. Qiao، J. Li، H. Xu، L. Zhang، X. Zhang، Advances on the in vivo and in vitro glycosylations of flavonoids، Appl. ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 104 (2020) 6587-6600 ، https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka ، Y. Ueyama ، S. Kitajima ، T. Ohnishi ، K. Matsui ، الاستنساخ الجزيئي وتوصيف UDP-glucose: benzenoid / phenylpropanoid glucosyltransferase في زهور البطونية ، J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245 ، https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi ، J. Kim ، I. Mijakovic ، KH Jung ، G. Choi ، SC Kim ، YJ Kim ، Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases من النباتات ، Biotechnol. حال. 37 (2019) 107394 ، https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh، YV Dhar، MH Asif، P. Misra، استكشاف الأهمية الوظيفية لإنزيمات ستيرول غليكوزيل ترانسفيراز ، Prog. الدقة الدهنية. 69 (2018) 1–10 ، https: // doi. org / 10.1016 / j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue، PV Allen، LV Shepherd، A. Blake، J. Whitworth، MM Maccree، DR Rockhold، D. Stewart، HV Davies، WR Belknap، الأساسي في الجسم الحي الستيرويد قلويد غلوكوسيل ترانسفيراز من البطاطس، فيتوكيمياء. 67 (2006) 1590-1597 ، https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu ، L. Wang ، RL Walzem ، EG Miller ، LM Pike ، BS Patil ، النشاط المضاد للأكسدة لليمونويد الحمضيات ، الفلافونويد ، والكومارين ، J. Agric. الغذاء تشيم. 53 (2005) 2009-2014 ، https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho ، SG Jeong ، JE Park ، JA Han ، HR Kang ، D. Lee ، MJ Song ، النشاط المضاد للفيروسات من Angelicin ضد فيروسات جاما ، Antivir. الدقة. 100 (2013) 75–83 ، https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu ، Q. Chen ، Y. Zhang ، C. Liang ، مشتقات الكومارين مع نشاط فعال لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية ، Fitoterapia. 150 (2021) 104863 ، https://doi.org/10.1016/j. فيتوت 2021.104863.
[12] AT Mossa، TM Heikal، M. Belaiba، EG Raoelison، H. Ferhout، J. Bouajila ، نشاط مضادات الأكسدة وإمكانات حماية الكبد من Cedrelopsis grevei على الإجهاد التأكسدي الناجم عن cypermethrin وتلف الكبد في ذكور الفئران ، مكمل BMC. بديل. ميد. 15 (2015) 251 ، https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal ، P. Sethi ، G. Bansal ، Coumarin: نواة محتملة للجزيئات المضادة للالتهابات ، Med. تشيم. الدقة. 22 (2013) 3049-3060 ، https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar ، R. Singla ، J. Dandriyal ، V. Jaitak ، مشتقات الكومارين كعوامل مضادة للسرطان لعلاج سرطان الرئة: مراجعة ، Anti Cancer Agents Med. تشيم. 18 (2018) 964-984 ، https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi ، F. Leonetti ، L.Pisani ، M. Catto ، A. Carotti ، Coumarin: سقالة طبيعية ، مميزة ومتعددة الاستخدامات للمركبات النشطة بيولوجيًا ، الجزيئات 23 (2018) 250 ، https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi ، N. Ubukata ، H. Hayashida ، M. Yamamoto ، Okazaki ، استنساخ وتوصيف الجلوكوزيل ترانسفيراز الذي يتفاعل مع 7- مجموعة الهيدروكسيل من الفلافونول و 3- مجموعة الهيدروكسيل من الكومارين من خلايا التبغ ، القوس. بيوتشيم. بيوفيز. 420 (2003) 95-102 ، https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou ، T. Tian ، B. Xue ، L. Song ، L. Liu ، R. Yu ، التخليق الحيوي لجليكوسيدات الكومارين بواسطة الجذور المشعرة المعدلة وراثيًا لـ Polygonum multiflorum ، Biosci. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 76 (2012) 1008-1010 ، https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh ، M. Kawauchi ، M. Kuroyanagi ، T. Arima ، الاستنساخ الجزيئي وتوصيف الكومارين الجلوكوزيل ترانسفيراز في الجذور المشعرة لـ Pharbitis nil (Ipomoea nil) ، عبادة الأنسجة النباتية. بادئة رسالة. 31 (2014) 21-28 ، https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He ، P. Zhao ، ZM Hu ، S. Liu ، Y. Kuang ، M. Zhang ، B. Li ، CH Yun ، X. Qiao ، M. Ye ، الخصائص الجزيئية والهيكلية لـ Cglycosyltransferase مختلط من Trollius تشينينسيس ، أنجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. م. 58 (2019) 11513-11520 ، https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[2 0] S. Kumar ، G. Stecher ، K. Tamura ، MEGA7: تحليل الجينات التطورية الجزيئية ، الإصدار 7.0 لمجموعات البيانات الأكبر ، Mol. بيول. Evol. 33 (2016) 1870-1874 ، https: // doi. أورغ / 10.1093 / مولبيف / مسو 054.
[21] A. Waterhouse، M. Bertoni، S. Bienert، G. Studer، G. Tauriello، R. Gumienny، FT Heer، TAP de Beer، C. Rempfer، L. Bordoli، R. Lepore، T. Schwede، SWISS-MODEL: نمذجة التماثل للبروتينات والمجمعات ، والأحماض النووية الدقة. 46 (2018) W296-W303 ، https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex ، MC Peitsch ، T. Schwede ، النمذجة الآلية لهيكل البروتين المقارن باستخدام SWISS-MODEL و Swiss-Pdb viewer: منظور تاريخي ، الرحلان الكهربائي 30 (2009) S162 – S173 ، https://doi.org/ 10.1002 / الالبس .200900140.
[23] S. Bienert، A. Waterhouse، TAP de Beer، G. Tauriello، G. Studer، L. Bordoli، T. Schwede، The SWISS-MODEL repository - new features and Function، Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313-D319 ، https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer، C. Rempfer، AM Waterhouse، G. Gumienny، J. Haas، T. Schwede، QMEANDisCo- مسافة قيود المطبقة على تقدير جودة النموذج ، المعلوماتية الحيوية. 36 (2020) 1765-1771 ، https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni ، F. Kiefer ، M. Biasini ، L. Bordoli ، T. Schwede ، نمذجة التركيب الرباعي للبروتين من أوليغومرات متجانسة ومتجانسة تتجاوز التفاعلات الثنائية عن طريق التنادد ، علم. ممثل رقم 7 (2017) 10480 ، https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li، LV Modolo، LL Escamilla-Trevino، L. Achnine، RA Dixon، X. Wang، التركيب البلوري لرؤى Medicago truncatula UGT85H 2- في الأساس الهيكلي لفلافونويد متعدد الوظائف (iso) جليكوزيل ترانسفيراز ، جيه مول. بيول. 370 (2007) 951-963 ، https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy ، JU Bowie ، D. Eisenberg ، تقييم نماذج البروتين ذات الملامح ثلاثية الأبعاد ، Nature 356 (1992) 83-85 ، https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski، MW MacArthur، DS Moss، JM Thornton، PROCHECK: برنامج لفحص الجودة الفراغية الكيميائية لهياكل البروتين ، J.Apple. بلوريلوجر. 26 (1993) 283-291 ، https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott ، AJ Olson ، AutoDock Vina: تحسين سرعة ودقة الإرساء بوظيفة تسجيل جديدة وتحسين فعال وتعدد مؤشرات الترابط ، J. Comput. تشيم. 31 (2010) 455–461 ، https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson، CV Iancu، KE Neet، JV Dean، JY Choe، الاختلافات في اقتران الجلوكوز بحمض الساليسيليك بواسطة UGT74F1 و UGT74F2 من Arabidopsis thaliana، Sci. ممثل رقم 7 (2017) 46629 ، https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt ، P. Jones ، Glycosyltransferases في تخليق المنتجات الطبيعية النباتية: توصيف عائلة الجينات الفائقة ، Trends Plant Sci. 5 (2 00 0) 380–386 ، https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo ، Y. Arai ، S. Nagashima ، T. Yoshikawa ، تغيير خصائص مانح السكر من نباتات glycosyltransferases من خلال طفرة نقطة واحدة ، Arch. بيوتشيم. بيوفيز. 429 (2004) 198-203 ، https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho، S. Yaoya، T. Itani، T. Nakane، N. Kawahara، Y. Takase، K. Masuda، M. Kuroyanagi، Glucosylation of phenolic compounds by Pharbitis nil hairy root: I. Glucosylation of coumarin ومشتقات الفلافون ، Biosci. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 68 (2004) 2032-2039 ، https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre ، EH Nielsen ، M. Bols ، التحلل المائي للجلوكوزيدات الطبيعية السامة المحفزة بواسطة cyclodextrin dicyanohydrins ، Eur. J. Org. تشيم. 2008 (2010) 745-752 ، HTTPS: // doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue ، LB Zhou ، JW Liu ، RM Yu ، التحول الأحيائي لمشتقات الهيدروكسي كومارين عن طريق الخلايا المعلقة المستزرعة من Catharanthus roseus ، Pharmazie 67 (2012) 467–471 ، https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi ، A. Sabt ، EB Elkaeed ، WM Eldehna ، التطورات الحديثة في العوامل المضادة للسرطان القائمة على الكومارين: مراجعة حديثة ، Bioorg. تشيم. 103 (2020) 104163 ، https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li ، MY Gruber ، DD Hegedus ، DJ Lydiate ، MJ Gao ، تأثيرات مشتق الكومارين ، 4- methylumbelliferone ، على إنبات البذور ومؤسسة الشتلات في Arabidopsis ، J. Chem. ايكول. 37 (2011) 880–890 ، https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu ، ZM Feng ، YN Yang ، JS Jiang ، PC Zhang ، ثمانية أنواع جديدة من نوع eudesmane و eremophilane sesquiterpenoids من Atractylodes lancea و Fitoterapia. 114 (2016) 115–121 ، https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou، H. Wu، J. Zheng، X. He، Z. Wu، X. Lu، Y. Qiu، التحديد والدراسة الحركية الدوائية للقشط بواسطة UHPLC-MS / MS في بلازما الفئران ، J. Pharm . بيوميد. شرجي. 179 (2020) 112969 ، https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.