نورووجونين يخفف الإجهاد التأكسدي الناجم عن نقص الأكسجة وموت الخلايا المبرمج في خلايا PC12

للمزيد من المعلومات:ali.ma@wecistanche.com

الملخص

الخلفية: نوروجونين هو فلافون طبيعي مع ثلاث مجموعات هيدروكسيل الفينول في هيكل عظمي وله ممتازمضادات الأكسدةنشاط. ومع ذلك ، فإن التأثير الوقائي للنوروجونين لا يزال غير واضح. هنا ، قمنا بالتحقيق في القدرة الوقائية للنوروجونين ضد الأكسدة الناتجة عن نقص الأكسجة في خلايا PC12. الطريقة: تم فحص قابلية الخلية للحياة وموت الخلايا المبرمج بواسطة مقايسة MTT وتلطيخ Annexin V-FITC / PI ، على التوالي. تم قياس محتوى أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام مقايسة DCFH-DA. اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) ، مالونديالديهايد (MDA) ، ومضادات الأكسدةتم تحديد مستويات الإنزيم باستخدام أدوات تجارية. تم قياس التعبير عن الجينات والبروتينات ذات الصلة عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي والنشاف الغربي ، على التوالي. النتائج: وجدنا أن النوروجونين يخفف من الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة في خلايا PC12 عن طريق زيادة حيوية الخلية ، وتقليل إطلاق LDH ، وتخفيف التغييرات في مورفولوجيا الخلية. كان Norwogonin أيضًا بمثابةمضادات الأكسدةعن طريق مسح ROS ، وتقليل إنتاج MDA ، والحفاظ على أنشطة ديسموتاز الفائق (SOD) ، والكاتلاز (CAT) ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx) ، وتقليل مستويات التعبير عن HIF -1 و VEGF. بالإضافة إلى ذلك ، منع wogonin موت الخلايا المبرمج عن طريق تثبيط مستويات التعبير عن caspase -3 و cytochrome c و Bax مع زيادة مستويات تعبير Bcl -2 ونسبة Bcl -2 / Bax. الاستنتاجات: نوروجونين يخفف من الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة في خلايا PC12 عن طريق إخماد ROS ، والحفاظ على أنشطةمضادات الأكسدةالإنزيمات ، وتثبيط مسار موت الخلايا المبرمج للميتوكوندريا.

الكلمات الرئيسية: Norwogonin ،النشاط المضاد للأكسدة، نقص الأكسجة ، الاكسدة ، موت الخلايا المبرمج

خلفية

تحتاج الكائنات الهوائية إلى الأكسجين (O2) لإنتاج الطاقة. يُعرَّف نقص الأكسجين على أنه إمداد غير كافٍ من الأكسجين للحفاظ على الوظيفة الخلوية في الأنسجة ، وغالبًا ما يحدث في بعض المواقف الفسيولوجية مثل الارتفاعات العالية [1] ، وفي العديد من الحالات المرضية مثل السكتة الدماغية [2]. الدماغ حساس بشكل خاص للإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة بسبب استهلاكه العالي للأكسجين ، وغني بالأحماض الدهنية غير المشبعة ، وانخفاضمضادات الأكسدةالقدرة [3]. تشير الدلائل المتزايدة إلى أن نقص الأكسجة يمكن أن يؤدي إلى تأثيرات ضارة على الدماغ [4-6].

Linlin Jing و Rongmin Gao و Jie Zhang و Dongmei Zhang و Jin Shao و Zhengping Jia و Huiping Ma

قسم الصيدلة ، المستشفى رقم 940 التابع لقوة الدعم اللوجستي المشتركة لجيش التحرير الشعبى الصينى ، لانتشو 730050 ، جانسو ، الصين

يعتبر الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج عاملين مساهمين في الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة [7 ، 8]. تم الإبلاغ عن أن التعرض لنقص الأكسجة يزيد من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا (ROS) ، مما يسهل الإجهاد التأكسدي. ROS المفرط ، مثل أنيون الفائق (O2 − ˙) ، وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2) ، وجذر الهيدروكسيل (HO •) ، يؤدي إلى تغييرات خلوية هيكلية ووظيفية من خلال مهاجمة الدهون والأغشية والبروتينات والحمض النووي ، وبالتالي يتسبب في تلف الخلايا [ 9].

انقر فوق Cistanches لمضادات الأكسدة

في الوقت نفسه ، يسهل أيضًا إنتاج ROS المفرط فتح مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (mPTP) [10] ونقل البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج إلى غشاء الميتوكوندريا الخارجي ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب من أغشية الميتوكوندريا وإطلاق السيتوكروم ج [11]. تؤدي هذه التغييرات في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج المعتمد على الميتوكوندريا [12]. لذلك ، يعتقد أنمضادات الأكسدةمع القدرة على تثبيط أو القضاء على أنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة قد تمارس تأثيرها الوقائي عن طريق تخفيف الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج الناجم عن نقص الأكسجة. لقد أثبتت الكثير من الدراسات ذلكمضادات الأكسدةيمكن للمكملات الغذائية مثل فيتامين سي [13] ، والأيسوفلافون [8] ، وجذور النيتروكسيد [14] ، أن تحد من الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة في المختبر وفي الجسم الحي. مركبات الفلافونويد هي فئة كبيرة ومتنوعة من المستقلبات الثانوية النباتية في كل مكان. تعتبر دائما طبيعية ممتازةمضادات الأكسدةمع القدرة على نقب الجذور الحرة وتثبيط بيروكسيد الدهون.

في الوقت الحالي ، تم إيلاء المزيد والمزيد من الاهتمام لهذه الفئة من المركبات بسبب آثارها المفيدة على صحة الإنسان. لقد ثبت أن مركبات الفلافونويد تمتلك مجموعة واسعة من الإجراءات الدوائية ، مثل النشاط المضاد للالتهابات ، ومضاد للألم ، والنشاط الوقائي للأعصاب ، وما إلى ذلك ، والتي يمكن أن تُعزى جميعها إلى أنشطتها المضادة للأكسدة [15]. أشارت العديد من الدراسات إلى أن مركبات الفلافونويد تظهر تأثيرات وقائية ممتازة على الفشل الناجم عن نقص الأكسجة. على سبيل المثال ، للروتين تأثير قوي وقائي للأعصاب ضد موت خلايا العقدة الشبكية الناجم عن نقص الأكسجة [16]. توضح دراسة حديثة أيضًا أن روتين يمكن أن يخفف من ضرر نقص الأكسجة الناجم عن كلوريد الكوبالت عن طريق تثبيط الإجهاد التأكسدي والاستماتة في خلايا H9c2 [17]. علاوة على ذلك ، يقترح Liu et al أن nobiletin (3 ′، 4 ′، 5،6، 7، 8- hexamethoxy flavone) يخفف من إصابة عضلة القلب I / R عن طريق تنشيط مسار Akt / GSK -3 في خلية H9c2 [18]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للأكاسيتين حماية الخلايا العضلية القلبية للجرذان وأرومة عضلة القلب H9C2 ضد الإصابة التي يسببها نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة عن طريق التنشيط بوساطة AMPK لمسار إشارات Nrf2 [19].

Norwogonin (5،7 ، 8- ثلاثي هيدروكسي فلافون ، الشكل 1) هو فلافون نشط دوائيًا منفصل عن جذر Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" باللغة الصينية) ، وهو عشب صيني تقليدي يستخدم لعلاج الإنفلونزا والسرطان [20 ، 21]. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن دراسات محدودة حول الأنشطة البيولوجية للنوروجونين بسبب انخفاض مستوياته في النباتات الطبيعية. من أجل معالجة هذه المشكلة ، تم الإبلاغ عن عدة طرق تخليق للنوروجونين [22 ، 23].

أسست دراستنا السابقة أيضًا طريقة بسيطة للحصول على نوروجونين من الكريزين في أربع خطوات [24]. أثرت هذه الأبحاث بشكل إيجابي على التقييم الإضافي للأنشطة البيولوجية للنوروجونين. كشفت الدراسات أن النوروجونين يمتلك مضادات الأكسدة [25] ، ومضادات السرطان [26 ، 27] ، ومضادات الفيروسات [28] ، والأنشطة المضادة للميكروبات [29] بالإضافة إلى تثبيط إنتاج السيانيد المحفز لـ ROS [30]. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كان للنوروجونين قدرات وقائية ضد الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة. كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في التأثيرات الوقائية للنوروجونين ضد الإجهاد التأكسدي الناجم عن نقص الأكسجة وموت الخلايا المبرمج في خلايا PC12.

طُرق

المواد والكواشف

تم تصنيع Norwogonin (نقاء أكبر من أو يساوي 98 في المائة) وفقًا لطريقتنا المبلغ عنها سابقًا [24]. تم شراء Rutin (نقاء أكبر من أو يساوي 96 في المائة) من Ci Yuan Biotechnology Co.، Ltd. (Xian ، Shannxi ، الصين). تم إذابة Norwogonin و rutin في ثنائي ميثيل سلفوكسيد معقم (DMSO) ، وتخزينها عند -20 درجة ، وتم تخفيفها في وسط استنبات الخلية مباشرة قبل الاستخدام. تم شراء وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ومصل الأبقار الجنيني (FBS) والستربتومايسين والبنسلين من شركة Solarbio المحدودة (بكين ، الصين).

تم الحصول على مجموعات malondialdehyde (MDA) و lactate dehydrogenase (LDH) و superoxide disutase (SOD) و catalase (CAT) و glutathione peroxidase (GPx) من Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu ، الصين). 2 ′، 7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) و (3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل ثيازول -2- yl) -2 ، 5- diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium (MTT) من شركة Sigma-Aldrich Co (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). الأجسام المضادة الأولية للعامل المحرض لنقص التأكسج -1 (HIF -1) ، وعامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية -2 (Bcl -2) ، Bcl {{17 }} تم شراء بروتين X المرتبط (Bax) و Caspase -3 و Cytochrome C و -actin من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة). تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية من شركة ZsBio (بكين ، الصين).

تم الحصول على مجموعة أدوات تحليل موت الخلايا المبرمج من معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية (جيانغسو ، الصين). كانت جميع المواد الكيميائية والمذيبات ذات درجة تحليلية وتم الحصول عليها من مورد تجاري في الصين. زراعة الخلايا تم شراء خلايا PC12 من بنك الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (TCR 9 ، شنغهاي ، الصين) والمحافظة عليها في DMEM بنسبة 10 في المائة (ت / ت) FBS ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 وحدة / مل ستربتومايسين عند 37 درجة في حاضنة رطبة تحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. لتقييم السمية الخلوية للنوروجونين ، تم تحضين خلايا PC12 (الممر 4 ~ 6) مسبقًا بتركيزات مختلفة (10−8 ، 10−7 ، 10−6 ، 10−5 ، 10−4 مول / لتر) ولا ووغونين لـ 1 ساعة ثم مثقف لمدة 24 ساعة. التعرض لنقص الأكسجة للحث على نموذج إصابة نقص الأكسجة الخلوية ، تعرضت خلايا PC12 لبيئة نقص الأكسجة (1 بالمائة O2 ، 5 بالمائة CO2 ، و 94 بالمائة N2) عند 37 درجة لمدة 24 ساعة في غرفة رطبة. تمت زراعة خلايا التحكم نورموكسيك عند 37 درجة في حاضنة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

لتقييم التأثير الوقائي للنوروجونين ضد الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة ، تم تحضين خلايا PC12 مسبقًا بتركيزات مختلفة (1 0 - 8 ، 1 0 - 7 ، 10−6 ، 10− 5 مول / L) من norwogonin لمدة 1 ساعة قبل علاج نقص الأكسجة. قابلية بقاء الخلية تم قياس قابلية بقاء الخلايا بواسطة مقايسة MTT كما هو موضح سابقًا [31]. باختصار ، تم زرع خلايا PC12 (1 × 105 خلية / مل) في 96 لوحة ثقافة جيدة. ثم أضيفت تراكيز مختلفة من النوروجونين إلى الآبار. تمت إضافة كمية متساوية من DMSO للتحكم في الآبار. التركيز النهائي لـ DMSO في وسط زراعة الخلايا هو 0.1 بالمائة. بعد الحضانة في ظروف طبيعية أو نقص الأكسجة ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من MTT (5.0 مجم / مل) إلى كل بئر ، تليها الحضانة عند 37 درجة لمدة 4 ساعات. بعد ذلك ، تمت إزالة المادة الطافية باستخدام MTT وتم إذابة منتج فورمازان في 100 ميكرولتر من DMSO. تم قياس الامتصاصية على قارئ صفيحة ميكروسكوبية SpectraMax i3 (الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 570 نانومتر. تم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية نسبية للمجموعة الضابطة. تم تحضين خلايا PC12 المصبوغة على أغطية زجاجية لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) لمدة 24 ساعة قبل معالجتها بالنوروجونين بنفس الطريقة الموضحة أعلاه.

تمت إزالة الوسط وغسل الغطاء الزجاجي باستخدام PBS بارد ، متبوعًا بالتثبيت بالميثانول لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ، ثم غسله باستخدام PBS بارد ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. أخيرًا ، تم تلطيخ الخلايا وفقًا لبروتوكول تلطيخ HE [32]. تم إجراء تحليلات الخلية باستخدام مجهر OLYMPUS IX73 (100 ×) للتحقق من التغيرات المورفولوجية للخلية. تم الحصول على الصور الرقمية باستخدام الكاميرا الرقمية DXM 1200 C (نيكون) المرتبطة بالمجهر. تم تحديد مستوى ROS داخل الخلايا في خلايا PC12 باستخدام مقايسة DCFH-DA [33]. باختصار ، تم زرع خلايا PC12 (1 × 105 خلية / مل) في 6- أطباق جيدة. بعد علاج نقص الأكسجة ، تم غسل خلايا PC12 باستخدام PBS ثم تم تحضينها في وسط زراعة يحتوي على 10 ميكرومتر DCFH-DA لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 37 درجة. تمت ملاحظة الخلايا باستخدام مجهر أوليمبوس الفلوري المقلوب (طوكيو ، اليابان) وتم تحليلها بواسطة مقياس التدفق الخلوي Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 525 نانومتر. تم التعبير عن مستوى ROS كنسبة مئوية نسبية للتحكم. تم زرع خلايا تسرب LDH ومحتوى MDA ونشاط إنزيم مضادات الأكسدة PC12 (1 × 105 خلية / مل) في طبق 90 مم. بعد علاج نقص الأكسجة كما هو موصوف أعلاه ، تم جمع 50 ميكرولتر من مادة طافية للثقافة من كل طبق ، وتم اكتشاف نشاط LDH في الوسط باستخدام مجموعات الفحص التجارية (معهد Jiancheng للتكنولوجيا الحيوية ، نانجينغ ، الصين) وتم التعبير عنها على أنها U / mL. تم حصاد خلايا PC12 وتجانسها بعد غسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. تم قياس تركيز البروتين الكلي بواسطة مجموعة فحص البروتين BCA. تم تحديد محتوى MDA ونشاط إنزيم مضادات الأكسدة باستخدام مجموعات الفحص التجارية (معهد Jiancheng للتكنولوجيا الحيوية ، نانجينغ ، الصين).

تم تقديم محتوى MDA على شكل بروتين nmol / mg. تم تقديم أنشطة SOD و CAT و GPx كبروتين U / mg. موت الخلايا المبرمج (تلطيخ أنكسين- V / PI) بعد علاج نقص الأكسجة ، تم حصاد خلايا PC12 وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، ثم تعليقها باستخدام محلول ملزمة. تمت معالجة الخلايا بمحلول Annexin V-FITC و PI وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Beyotime ، شنغهاي ، الصين). تم إجراء عمليات جمع البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي لخلايا PC12 باستخدام كاشف Trizol (تاكارا ، داليان ، الصين) وتحويلها إلى (كدنا) باستخدام مجموعة كاشف PrimeScript TM RT (AK4301 ،

تاكارا ، داليان ، الصين). تم تضخيم جين HIF المشفر cDNA -1 و VEGF و Bcl -2 و Bax و caspase -3 و cytochrome C و glyceraldehyde -3- فوسفات ديهيدروجينيز (GAPDH) بواسطة الجين الكمي الحقيقي الوقت PCR باستخدام 7300 نظام الكشف في الوقت الحقيقي (Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عرض المواد الأولية المستخدمة في الجدول 1. كانت ظروف ركوب PCR 95 درجة لمدة 30 ثانية ، تليها 40 دورة من 95 درجة لمدة 5 ثوانٍ و 60 درجة لمدة 31 ثانية. تم حساب مستويات mRNA باستخدام طريقة 2- ΔΔCt وتم تطبيعها إلى GAPDH ، وهو الجين المرجعي. تم حصاد خلايا اللطخة الغربية PC12 وتجانسها في عوامل RIPA. تم تحديد كمية تركيز البروتينات الكلية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA. تم حل 30 ميكروغرام من العينات على 12 بالمائة من الرحلان الكهربي SDS-PAGE ثم نقلها إلى أغشية فلوريد البوليفينيلدين (PVDF) (ميليبور ، بيليريكا ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم حظر الأغشية باستخدام حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5 في المائة في محلول TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واحتضانها بالأجسام المضادة الأولية: مضاد HIF -1 (1: 3 0 0 ، ab179483 ، Abcam ، UK)، anti-VEGF (1: 1000، ab46154، Abcam، UK)، anti-Bcl -2 (1: 1000، ab59348، Abcam، UK)، anti-Bax (1: 500، ab32503، Abcam، المملكة المتحدة) ، مضاد كاسباس -3 (1: 300 ، ab44976 ، Abcam ، المملكة المتحدة) ، مضاد سيتوكروم سي (1: 1000 ، ab13575 ، Abcam ، المملكة المتحدة) ومضاد - - أكتين (1: 2000 ، ab8227 ، Abcam ، المملكة المتحدة) بدرجة 4 بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، تم غسل الأغشية واحتضانها بأجسام مضادة ثانوية (1: 2000 ، ZsBio ، بكين ، الصين ؛) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور العصابات المناعية باستخدام كواشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL). تم تطبيع الكثافة النسبية للنطاقات إلى عنصر التحكم الداخلي -actin وتحليلها باستخدام Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics ، Inc. ، Bethesda ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل احصائي

تم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SD مشتق من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تم تحليل الفرق بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا باختبار الطالب - نيومان - كيولس اللاحق. تم اعتبار القيمة الاحتمالية لـ <0. 05="" ذات="" دلالة="">

نتائج

خلايا نورووجونين واقية PC12 ضد الإصابة الناجمة عن نقص الأكسجة

أولاً ، لمنع النشاط التكاثري للنوروجونين ، تم تحديد سميته الخلوية على خلايا PC12 الطبيعية باستخدام اختبار MTT. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، لم يتغير الانتشار الخلوي بشكل كبير بعد العلاج بالنوروجونين بتركيزات 1 × 1 0 - 8 -1 × 1 0 - 5 مول / لتر (P> 0.05 ). ومع ذلك ، انخفضت قابلية الخلية للبقاء بشكل كبير عند زيادة تركيز النوروجونين إلى 1 × 10 4 مول / لتر (P <0.05). أشارت="" النتائج="" إلى="" أن="" النوروجونين="" لم="" يظهر="" سمية="" أو="" نشاطًا="" تكاثريًا="" على="" خلايا="" pc12="" بتركيزات="" 1="" ×="" 10="" 8="" -1="" ×="" 10="" 5="" مول="">

ثم قمنا بفحص التأثير الوقائي للنوروجونين ضد إصابة خلايا PC12 التي يسببها نقص الأكسجة. كما هو مبين في الشكل 2 ب ، مقارنة بمجموعة التحكم ، انخفضت قابلية بقاء الخلية في مجموعة نقص الأكسجة إلى 58.71 بالمائة (P <0. 0="" 1).="" بالمقارنة="" مع="" علاج="" نقص="" الأكسجة="" ،="" تمت="" المعالجة="" المسبقة="" بـ="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 8="" ،="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 7="" ،="" و="" 1="" ×="" 1="" 0="" -="" 6="" مول="" لتر="" نوروجونين="" pc12="" المحمي="" بالجرعة="" بالاعتماد="" على="" الجرعة="" الخلايا="" ضد="" الإصابة="" التي="" يسببها="" نقص="" الأكسجة="" ،="" واستعادة="" قابلية="" بقاء="" الخلية="" من="" 58.71="" إلى="" 62.79="" في="" المائة="" (p=""><0.05) ،="" و="" 66.68="" في="" المائة="" (p=""><0.01) و="" 69.88="" في="" المائة="" (p=""><0.01) ،="" على="" التوالي.="" أظهرت="" المعالجة="" المسبقة="" بـ="" 1="" ×="" 10−6="" مول="" لتر="" روتين="" أيضًا="" تأثيرًا="" وقائيًا="" ،="" مما="" زاد="" بشكل="" كبير="" من="" قابلية="" بقاء="" الخلية="" إلى="" 63.78="" بالمائة="" مقارنة="" بمعالجة="" نقص="" الأكسجة.="" انخفضت="" الصلاحية="" المعالجة="" بـ="" 1="" ×="" 10−="" 5="" مول="" لتر="" نوروجونين="" إلى="" 63.43="" في="" المائة="" ،="" والتي="" لا="" تزال="" أعلى="" بكثير="" من="" تلك="" الموجودة="" في="" مجموعة="" نقص="" الأكسجة="" (p=""><0.05). أظهرت="" هذه="" النتائج="" أن="" النوروجونين="" أظهر="" حماية="" خلوية="" معنوية="" بتركيزات="" 1="" ×="" 10="" 8="" -1="" ×="" 10="" 5="" مول="" لتر="" والتركيز="" الأكثر="" فعالية="" هو="" 1="" ×="" 10−="" 6="" مول="" لتر.="" ثم="" تم="" استخدام="" هذه="" الجرعة="" كجرعة="" مثالية="" في="" التجارب="">

تم التحقق أيضًا من القدرة الوقائية للنوروجونين من خلال التعديلات المورفولوجية. كما هو مبين في الشكل 2 ج ، نمت خلايا PC12 بدون علاج نقص الأكسجة بشكل جيد بأشكال منتظمة (مغزلي) ، وأحجام موحدة. بعد التعرض لنقص الأكسجة ، أظهرت خلايا PC12 انكماشًا وشكلًا دائريًا وتقشرًا وانخفاض كثافة الخلايا. نمت الخلايا المعالجة بالنوروجونين أو الروتين قبل التعرض لنقص الأكسجة بشكل أفضل ، وانخفض عدد خلايا التقشر ، وتعافى شكل الخلية بشكل طبيعي. إلى جانب ذلك ، تم تأكيد القدرة الوقائية للنوروجونين من خلال تسرب LDH ، والذي يرتبط بفقدان سلامة غشاء الخلية. كما هو مبين في الشكل 2 د ، تم زيادة نشاط LDH في وسط الثقافة بشكل ملحوظ بعد التعرض لنقص الأكسجة (P <0.>

أدت المعالجة المسبقة بالنوروجونين أو الروتين إلى خفض تسرب LDH بشكل كبير ، مما يشير إلى أن النوروجونين وروتين أعادوا سلامة غشاء الخلية. يثبط نوروجونين إجهاد الأكسدة الناجم عن نقص الأكسجة في خلايا PC12 يعتبر ROS و MDA مؤشرين مهمين للإجهاد المؤكسد الخلوي الناجم عن نقص الأكسجة. كما هو مبين في الشكل 3 أ و ب ، لوحظ وجود زيادة كبيرة في محتوى ROS و MDA في خلايا PC12 بعد التعرض لنقص الأكسجة. أعاقت المعالجة المسبقة بالنورووجونين أو الروتين بشكل كبير إنتاج ROS و MDA.

تعتبر إنزيمات مضادات الأكسدة ، مثل SOD و CAT و GPx ، نظام الدفاع الرئيسي ضد الإجهاد التأكسدي في الخلايا. كما هو مبين في الشكل 3c-e ، أدى التعرض لنقص الأكسجة إلى تثبيط أنشطة SOD و CAT و GPx في خلايا PC12. أدى العلاج بالنوروجونين أو الروتين إلى عكس هذه التغييرات واستعادة أنشطة إنزيمات مضادات الأكسدة. كل هذه النتائج أشارت إلى أن النوروجونين يحمي خلايا PC12 من الإجهاد التأكسدي الناجم عن نقص الأكسجة.