الجزء 1: التأثير المضاد للتليف لـ 6- Bromo-indirubin -3 ′ -oxime (6- BIO) عبر تنظيم بروتين المنشط -1 (AP -1) ونوعية البروتين -1 (SP -1) عوامل النسخ في خلايا الكلى

التأثير المضاد للتليف لـ 6- Bromo-indirubin -3 ′ -oxime (6- BIO) من خلال تنظيم البروتين المنشط -1 (AP -1) وبروتين الخصوصية -1 (SP -1) عوامل النسخ في خلايا الكلى

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

الكلمات الدالة:الكلى, تليف،سمد ،مضاد تليف

نبذة مختصرة

يتم التعبير عن PAI -1 و CTGF بشكل زائد فيالكلىالأمراضوالسببتليفمن الرئتين والكبد والكلى. استخدمنا نموذج الفئران لانسداد الحالب أحادي الجانب (UUO) للتحقق مما إذا كان6- السيرة الذاتية، وهو مثبط للجليكوجين سينثيز كيناز -3 موهنتليفبتثبيط PAI -1 و CTGF في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، الخلوية التي يسببها TGFتليفلوحظ في المختبر باستخدام الإنسانالكلىالخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (HK -2) ، والأرومات الليفية الخلالية للفئران (NRK49F). التعبير عنتليف- البروتينات ذات الصلة وجزيئات الإشارات مثل PAI -1 ، و CTGF ، و TGF ، و SMA ،SMAD، و MAPK في خلايا HK -2 و NRK49F باستخدام التكتل المناعي. لتحديد عوامل النسخ التي تنظم التعبير عن PAI -1 و CTGF ، تم تحليل أنشطة المروج لـ AP -1 و SP -1 باستخدام فحوصات luciferase. تم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لمراقبة التوطين المشترك لـ AP -1 و SP -1 إلى PAI -1 و CTGF. زاد التعبير عن PAI -1 و CTGF و TGF و -SMA في نموذج UUO وكذلك في خلايا HK -2 و NRK49F التي تمت معالجتها بواسطة TGF. علاوة على ذلك ، تسبب علاج UUO و TGF في تنشيط P-SMAD2/3, SMADمسارات إشارات P-ERK 1/2 و P-P38 و P-JNK MAPK. زاد نشاط معزز PAI -1 و CTGF و AP -1 و SP -1 استجابةً لعلاج عامل النمو في الأنسجة (TGF). ومع ذلك ، العلاج مع6- السيرة الذاتيةانخفض التعبير عن البروتينات ومسارات الإشارات المرتبطة بـتليففي نموذج UUO وكذلك في خلايا HK -2 و NRK49F التي تمت معالجتها بواسطة TGF. علاوة على ذلك ، 6- خففت المعالجة الحيوية من تعبير PAI -1 و CTGF بالإضافة إلى أنشطة المروجين لـ AP -1 و SP -1 ، وبالتالي تنظيمSMADومسارات إشارات MAPK ، ومن ثم تمارسمضاد تليفالآثار المترتبة علىالكلىالخلايا.

انقر فوق Cistanche herba لمرض الكلى

1 المقدمة

الكلىيحدث التليف بسبب عوامل مختلفة ، بما في ذلك مرض السكري ، وارتفاع ضغط الدم ، والتهاب كبيبات الكلى ، والمزمن المرتبط بالعمر.الكلىمرض [1-3]. التصلب الكبيبي والنبيبي الخلاليتليفهي السمات المرضية النهائية لالكلىالأمراض [4،5]. يؤدي الإنتاج المفرط وترسب بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) إلى أضرار هيكلية ووظيفية فيالكلى، مما أدى إلى فقدان تدريجي لوظيفتها ، والتي تبلغ ذروتها في المرحلة النهائيةالكلىمرض [5]. الالكلىلها هيكل معقد ينقسم إلى الكبيبات ، والنبيبات الخلوية ، والأوعية الدموية ؛ تحتوي كل حجرة على نوع مختلف من المصفوفة خارج الخلية ويمكن أن تتأثر بهاتليف[6،7]. تحتوي ECM للخلايا الأنبوبية الخلالية على مكونات مختلفة بما في ذلك الكولاجين والجليكوزامينوجليكان والإيلاستين واللامينين والبروتينات السكرية. يمكن للخلايا الأنبوبية القريبة المنشطة أن تنشط الأنبوبي الخلالي [6-10]. يعزز الجليكوجين سينثاز كيناز (GSK3)الكلىتليفعن طريق تنشيط إشارات TGF في الخلايا الأنبوبية والخلايا البينية الأنبوبية القريبة [11]. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى تحديد تأثيرات مثبط GSK3 ،6- السيرة الذاتية، على الخلايا الليفية الأنبوبية والخلالية القريبة من خلال استهداف مثبط منشط البلازمينوجين -1 (PAI -1) وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) ، والتي تلعب دورًا محوريًا في التدريجيالكلىالضرر و tubulointerstitialتليف.

6- السيرة الذاتيةهو مشتق قابل للنفاذ للخلايا من نظير إندروبين ، 6- برو-إندروبين ، المعزول عن الرخويات البحرية وله خصوصية وانتقائية عالية لـ GSK -3 [12،13].6- السيرة الذاتيةهو مثبط تنافسي لـ ATP ويظهر تشابهًا مع مجال ربط ATP لبروتين كيناز المعتمد على السيكلين (CDK) الذي ينظم النشاط المضاد للورم [14-16]. يرتبط نشاط GSK3 غير الطبيعي بالعديد من الأمراض البشرية ، بما في ذلك مرض السكري والالتهابات والأمراض التنكسية العصبية والذهان [17 ، 18]. لقد ثبت في الدراسات السابقة أن مثبطات GSK3 يمكنها إصلاح الأنابيب التالفة وتقليل الاستجابات الالتهابية ، والانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة (EMT) المرتبط بإشارات TGF 1 ، وتراكم الفبرونيكتين في الخلايا الوسيطة الكبيبية المستزرعة [11 ، 19 - 21]. بالإضافة الى،6- السيرة الذاتيةقد تمارس تأثيرات علاجية محتملة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك مرض السكري ، والاضطرابات التنكسية العصبية ، والسرطان من خلال تنظيم الالتهاب ، والإجهاد التأكسدي ، وبقاء الخلايا وكذلك تكاثرها ، وموت الخلايا [22-24]. ومع ذلك ، فإن الآثار العلاجية المحتملة6- السيرة الذاتيةعلىالكلىتليفالمرتبطة بالضرر الخلالي الأنبوبي والأنبوبي القريب لا يزال غير معروف.

PAI -1 ، وهو بروتين سكري متعدد الوظائف فيالكلى، هو مثبط سيرين بروتياز ، الذي يثبط منشط البلازمينوجين urokinase (uPA) ومنشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) الذي يحلل البلازمينوجين إلى بلازمين [25،26]. إن الإفراط في التعبير عن PAI -1 يمنع انحلال الفبرين وتدهور ECM ، مما يزيد من تراكم ECM [27]. بالإضافة إلى ذلك ، تنظم PAI -1 MAPK (كينازات البروتين المنشط بالميتوجين) ،SMAD، و RhoA / ROCK (بروتين كيناز Rho) الذي يشير إلى مسارات في مرض السكري والمزمنالكلىمرض [28-30]. عوامل النسخ ، مثل AP -1 ، SP -1 ،SMAD3/4 ، USF2 (عامل النسخ المنبع 2) ، و CTF / NF (عائلة ربط الحمض النووي الخاص بالموقع

البروتينات) ، يتم تنشيطها أيضًا بواسطة MAPK وSMADتأشير [30،31]. يؤدي التنشيط المشترك لمسارات الإشارة وعوامل النسخ هذه إلى زيادة التعبير عن PAI -1 ويؤدي إلى تراكم ECM. CTGF هو بروتين مرتبط بالهيبارين مرتبط بـ ECM ويتضمن مجالات ، مثل بروتين ربط عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGFBP) ، وتكرار von Willebrand من النوع C (VWC) ، وتكرار النوع 1 من الثرومبوسبوندين (TSR) ، والطرف C المجال (CT) مع شكل عقدة السيستين. من بين هذه المجالات الأربعة ، يتفاعل مجال التصوير المقطعي المحوسب مع عائلة TGF الفائقة ، والفيبرونيكتين ، والبيرليكان [32–34]. وبالتالي ، تزيد CTGF من MAPK ،SMADو PI3K و YAP عن طريق تحفيز TGF ، وتنشط مسارات الإشارة هذه عوامل النسخ ، مثل AP -1 و SP -1 و NF-kB وSMAD2/3. وبالتالي ، يؤدي تنظيم CTGF إلى هجرة الخلايا وتكاثرها والتهابها ، مما يتسبب في تراكم ECM [35-37].

بناءً على نتائج الدراسات السابقة ، توقعنا أن MAPK وSMADالإشارات ، بالإضافة إلى عوامل النسخ AP -1 و SP -1 ، ربما الروابط المشتركة بين PAI -1 وتراكم ECM الناجم عن CTGF بشكل تدريجيالكلىمرض و tubulointerstitialتليف. وهكذا ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان6- السيرة الذاتيةيمكن أن يمنع التدريجي المزمنالكلىالمرض من خلال تنظيم PAI -1 و CTGF.

2. المواد والأساليب

2.1. الأجسام المضادة والكواشف

كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي الأجسام المضادة للأرانب ضد PAI -1 (11907) ، TGF (3711) ، الفسفرةSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454) ، فسفرة ERK (P-ERK) (9101) ، فسفرة P38 (P-P38) (4631) ، JNK فسفرة (P-JNK) (9251) ، فسفرة C-JUN (PC-JUN) (3270) ، C-FOS (PC-FOS) (5348) ، والهيستون H3 (9715) ، وجميعها تم الحصول عليها من تقنية تشوير الخلية. CTGF (sc -365970) ، SP -1 (sc -17824) ،SMADتم الحصول على 6 (sc -25321) من Santa Cruz Biotechnology. الأجسام المضادة للفأر-أكتين (a5316) و (2'Z، 3'E) -6- برومو إنديروبين -3- أوكسيم (6- السيرة الذاتية) (B1686) من Sigma-Aldrich.

2.2. التجارب على الحيوانات

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات باتباع الإرشادات واللوائح ذات الصلة. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة لوائح رعاية الحيوان (ACR) بكلية الطب بجامعة تشونام الوطنية (CNUH IACUC -18010 ، 19 أبريل 2019). أجريت التجارب باستخدام ذكور جرذان سبراغ-داولي (180-200 جم ، سامتاكو ، كوريا) [38]. تم إبقاء الفئران تحت درجة حرارة مضبوطة (21 ± 2 درجة مئوية) في دورة مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة. تم تقسيم الفئران إلى ثلاث مجموعات: مجموعة التحكم (n=6) ، انسداد الحالب أحادي الجانب (UUO ، n=6) ، و UUO مع6- السيرة الذاتيةالعلاج (ن=6).6- السيرة الذاتية({0}. 2 ملغم / كغم / يوم) تم حقنه داخل الصفاق (ip) لمدة 6 أيام. لتطوير نموذج جرذ اعتلال الكلية الانسدادي ، تم إجراء العملية على النحو التالي: تم تحفيز UUO عن طريق ربط الحالب الأيسر لمدة سبعة أيام. تم فتح التجويف البطني ووضع 2–0 رباط حرير في الحالب القريب الأيسر. تلقت المجموعة الضابطة نفس المعاملة لمدة سبعة أيام ، باستثناء الرباط. كان للفئران حرية الوصول إلى علف الفئران القياسي ومياه الصنبور وتم التضحية بها في اليوم السابع بعد العملية. الالكلىتمت إزالتها ومعالجتها بسرعة من أجل الكيمياء المناعية والنشاف الغربي.

2.3 علم الانسجة

الكلىتم إصلاح الأنسجة بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد ، مدمجة في البارافين ، ومقطعة إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. تم إجراء إجراءات تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E) ، وحمض شيف الدوري (PAS) ، وسيريوس الأحمر ، وتلوين ماسون ثلاثي الكروم (MT) لتقييم التشكل النسيجي. تم إجراء تلطيخ H&E و PAS و Sirius باللون الأحمر وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بالنسبة لتلطيخ MT ، بعد إزالة الكافيين بالزيلين ، تمت معالجة المقاطع بمحلول بوين عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وغسلها تحت ماء الصنبور الجاري حتى تصبح الأقسام واضحة. تم تلطيخ المقاطع بعد ذلك بهيماتوكسيلين Weigert (A: B=1: 1) ، متبوعًا بالتلطيخ بمحلول Biebrich Scarlet / Acid Fuchsin لمدة 10 دقائق والغسيل بالماء المقطر. تم تحضين المقاطع بمحلول حمض الفوسفوتنجستيك / حمض الفوسفوموليبديك لمدة 10 دقائق ومعالجتها بمحلول الأنيلين الأزرق لمدة 15 دقيقة. تم تحضين المقاطع لاحقًا باستخدام حمض الأسيتيك لمدة دقيقة واحدة وتجفيفها باستخدام الإيثانول والزيلين. كانت ترسبات الكولاجين والنواة والألياف العضلية ملطخة باللون الأزرق والأسود والأحمر على التوالي. تم إجراء التحليل الكمي للقسم الملون باستخدام برنامج ImageJ.

2.4 تحليل لطخة غربية

تم حصاد الخلايا وغسلها مرتين بمحلول ملحي مبرد بالفوسفات (PBS) ، وأعيد تعليقه في محلول تحلل ، وصوت لفترة وجيزة. يتكون المخزن المؤقت لاستخراج البروتين من 5 0 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، 5 ملي مولار EDTA ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 بالمائة Nonidet P -40 ، 0.1 بالمائة SDS ، كوكتيل مثبط البروتياز (GenDEPOT ، P3100– 001) ، وكوكتيل مثبطات الفوسفاتيز

(GenDEPOT، P32 0 0–001). بعد الطرد المركزي ، تم جمع المواد الطافية التي تحتوي على مستخلصات البروتين وقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين Pierce® BCA (Pierce Biotechnology ، Inc. ، Rockford ، IL ، USA). تم فصل البروتينات على 12 بالمائة من جل الصوديوم دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد ونقلها إلى أغشية النيتروسليلوز. تم حظر البقع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع 5 في المائة من الحليب منزوع الدسم في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 في المائة توين -20 (PBST). ثم تم تحضين اللطخة طوال الليل باستخدام الجسم المضاد الأولي (1 ؛ 2000) عند 4 درجات مئوية ، متبوعًا بحضانة الجسم المضاد الثانوي (1: 2500) ، وأخيراً مع الأجسام المضادة المقترنة ببيروكسيداز الفجل المضادة للأرانب ، كما هو موضح سابقًا [39 ]. تم تصور نطاقات بروتينية محددة باستخدام نظام معزز كيميائي. التحليل الكمي لـ

تم إجراء كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.5 ضربة قاضية سيرنا

لإخراج SP -1 ، تم نقل إصابة SP -1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology، Inc.، sc -29487) والتحكم siRNA (Santa Cruz، sc -37007) لمدة 24 ساعة في HK -2 وخلايا NRK49F عند التقاء 60 بالمائة باستخدام كاشف تعداء Dhar-maFECT 1 (Dharmacon ، T -2001 - 02) بتركيز نهائي قدره 30 نانومتر. تم تحضين الخلايا في وسط خالٍ من المصل لمدة يوم واحد في 37^◦ حاضنة C في جو مرطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، ومعالجة مسبقة بـ 6- BIO لمدة ساعة واحدة ، وتحفيزها باستخدام TGF- لمدة 24 ساعة. تم تحديد كفاءة الضربة القاضية من خلال تحليل اللطخة الغربية.

2.6. تعداء عابر للبلازميد وبناء المراسل

نمت الخلايا حتى تتكدس بنسبة 60-70 في المائة ، وغُسلت بخلايا DMEM-F -12 (خلايا HK -2) أو وسائط DMEM (خلايا NRK49F) ، ثم حضنت لمدة 24 ساعة في الوسط المعني بدون مصل ومضادات حيوية . تم بعد ذلك نقل الخلايا باستخدام بنية C-JUN سالبة سالبة ، بالإضافة إلى مراسل PAI -1 و CTGF و AP -1 و SP -1 الذي يحمل ناقل pGL3 باستخدام كاشف FuGene HD. كان تركيز البلازميد المراسل المستخدم في تعداء عابر 2 ميكروغرام (1 ميكروغرام / ميكرولتر). تمت معالجة الخلايا المنقولة بواسطة المراسل باستخدام 6- BIO لمدة ساعة واحدة واحتضانها بـ 10 نانوغرام / مل TGF لمدة 16 ساعة.

2.7. مقايسة مراسل المروج

تم إنتاج تركيبات مراسل PAI -1 و CTGF بواسطة BIO FACT (Yuseong-gu ، Daejeon ، جمهورية كوريا). تم توفير تركيبات مراسل pGL 3- AP -1 و pGL 3- SP -1 من قِبل الأستاذ يونغ دو يونغ (جامعة تشونام الوطنية). تم التحقيق في تنظيم النسخ لـ PAI -1 ، و CTGF ، و AP -1 ، و SP -1 من خلال ترنسفكأيشن عابر لبنى مراسل pGL3 المروج لوسيفيراز. تم بذر خلايا HK -2 و NRK49F (5 × 10 5) ونمت حتى تم الوصول إلى التقاء 60-70 بالمائة. بعد ذلك ، تم نقل بنى المروج والمتجهات الفارغة pGL 3- إلى الخلايا باستخدام FuGene HD ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تضمين ترميز البلازميد pRL-null Renilla luciferase في جميع العينات لمراقبة كفاءة تعداء العدوى. في 24 ساعة بعد تعداء العدوى ، تم قياس مستويات أنشطة اليراع ورينيلا لوسيفيراز بالتتابع من عينة واحدة باستخدام نظام الفحص Dual-Glo Luciferase (Promega). تم تطبيع نشاط Firefly luciferase إلى نشاط Renilla والكمية النسبية لنشاط luciferase في الخلايا غير المعالجة.

2.8. الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر

فأرالكلىتم إصلاح العينات في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة ، ومضمنة في البارافين ، وتم تقطيعها إلى أقسام بسماكة 3- ميكرومتر.الكلىتم إزالة مادة الكافيين وإعادة ترطيبها وسدها وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضانها بمضادات PAI -1 ومضادة CTGF و anti-PC-JUN و anti-PC-FOS و anti-SP -1 و تم تخفيف الأجسام المضادة لـ AQP1 في منع المخزن المؤقت لمدة 24 ساعة عند

4 ^◦بعد الغسل ، تم تحضين المقاطع بمضاد أرنب من نوع Alexa Fluor 488 (مضان أخضر) (Life Technologies ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، Cy3 (مضان أحمر) ماعز مضاد للفأر ، أو ماعز مضاد للأرانب (Invitrogen) ، أوريغون) لمدة 2 ساعة. تم زرع خلايا HK -2 و NRK49F (3 × 10 5) في غرف الآبار {{1 0} وحضنت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم معالجة الخلايا مسبقًا بـ 5 ميكرومتر 6- BIO لمدة ساعة واحدة ثم تعريضها لـ 10 نانوغرام / مل TGF لمدة 16 ساعة. بعد الغسل باستخدام 1X PBS ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وتم حظرها لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة مع 1X PBS تحتوي على 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم و 0.2 بالمائة تريتون X -100. تم تحضين الخلايا بعد ذلك بأجسام مضادة أحادية النسيلة من الأرانب أو الفئران ضد PAI -1 و CTGF و PC-JUN و PC-FOS و SP -1 (تم تخفيفها بنسبة 1: 200 في المخزن المؤقت للحظر) عند 4 درجات لمدة 24 ح. بعد الغسيل ، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة (Cy3 goat anti-rabbit and anti-mouse antibodies ، Alexa Fluor 488 الماعز المضادة للأرانب والأجسام المضادة للفأر ، مخففة 1: 200) لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، تم تركيب أغطية الأغطية على شرائح صغيرة باستخدام ProLong Gold Antifade Reagent مع DAPI (Life Technologies Corporation). تم تحليل الصور تحت مجهر المسح بالليزر متحد البؤر Leica TCS SP8 (Leica Microsystems ، مانهايم ، ألمانيا).

2.9 تحليل احصائي

تم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SEM. تم إجراء مقارنات متعددة بين المجموعات عن طريق اختبار ANOVA أحادي الاتجاه وفرق Tukey المهم بصدق (HSD) بعد الاختبار المخصص. النتائج مع p <0. 05="" اعتبرت="" ذات="" دلالة="">

3. النتائج

3.1. 6- تخفف BIO التغيرات المورفولوجية والتعبير عن العلامات المرتبطة بالتليف في نموذج الفئران UUO

قمنا بتقييم تأثيرات 6- السيرة الذاتية علىتليففي الالكلىلنموذج الفئران UUO. كما هو مبين في الشكل 1 أ ، زاد نموذج UUO المعروض بشكل ملحوظالكلىالضرر الأنبوبي الخلالي ، والتصلب الكبيبي ، والتسلل الخلالي للخلايا أحادية النواة ، وترسب الكولاجين الخلالي ، وتليفمقارنة بعناصر التحكم ، كما هو محدد بواسطة تلطيخ H&E و PAS و Sirius Red و MT. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز البروتينات المرتبطة بـ EMTالكلىتليفبالإضافة إلى الكولاجين I و -IV اللذين يزيدان من تراكم ECM في UUO مقارنة بعناصر التحكم (الشكل S1A و C). ومع ذلك ، تم تخفيف هذه التغييرات بواسطة العلاج 6- الحيوي. يوضح الشكل 1 ب أنه بعد 7 أيام من الانسداد ، زاد التعبير عن بروتينات PAI -1 ، و CTGF ، و -SMA ، و TGF في كلى فئران نموذج UUO مقارنةً بتلك الموجودة في الضوابط ، وقد تم تخفيف هذه الزيادة بواسطة العلاج باستخدام 6- السيرة الذاتية. التعبير عنليفيزادت العلامات بشكل ملحوظ في UUO مقارنةً بعناصر التحكم ، والتي تم التصدي لها بواسطة6- السيرة الذاتيةالعلاج (الشكل 1 ج). كشف تلطيخ التألق المناعي (الشكل 1 د) عن زيادة تعبير PAI -1 و CTGF (التألق الأحمر) في المنطقة المسدودة.الكلىفي اليوم -7 مقارنة بعناصر التحكم. ومع ذلك ، فإن التعبير عن PAI -1 و CTGF انخفض عند 6- العلاج الحيوي (الشكل 1 د). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن 6- BIO يخفف الضرر البيني الخلالي عن طريق تثبيط تعبير PAI -1 و CTGF.

3.2 6- تخفف BIO من التعبير عن PC-JUN و PC-FOS و SP -1 وتمنع مسارات الإشارات المرتبطة بالتليف في نموذج الفئران UUO

بعد ذلك ، قررنا ما إذا كان6- السيرة الذاتيةيؤثر على مسارات الإشارات المتعلقة بالكلىتليف. أولا ، أكدنا ذلك6- السيرة الذاتية، وهو مثبط معروف لـ GSK3 ، يمنع GSK3 الفسفرة. يوضح الشكل S1A و B تقليل GSK3 بمقدار 6- BIO. يوضح الشكل 2 أ TGF /SMADممر الإشارات. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن التعبير عن الفسفرةSMAD2/3 وSMADزيادة 4 بروتينات في UUOالكلى، والذي تم تخفيفه بواسطة 6- العلاج الحيوي (الشكل 2 أ). لكن،SMAD6 ، الذي يثبط فسفرة SMAD 2 ونشاطSMAD4 [40] ، كانت له نتائج معاكسة. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب إشارات MAPK دورًا رئيسيًا فيالكلىتليف [41،42]. أجرينا تحليل اللطخة الغربية لتحديد ما إذا كان 6- BIO يؤثر على إشارات MAPK. زادت مستويات ERK و JNK و P38 المفسفرة في UUOالكلىمقارنة بمن هم في وضع السيطرةالكلى(الشكل 2 ب). تم تقليل التعبير عن ERK و JNK الفسفوري بشكل كبير من خلال معاملة 6- BIO ، بينما كان الانخفاض في مستوى p38 الفسفوري مهملاً (الشكل 2 ب).SMADتم تنظيم مسارات إشارات MAPK في مجموعة UUO ، والتي تم عكسها بواسطة6- السيرة الذاتيةالعلاج (الشكل 2 ج). تشارك العديد من عوامل النسخ فيالكلىتليفولعب الأدوار الرئيسية في تنظيم التعبير الجيني المصب. يوضح الشكل 2D أنه بعد 7 أيام من الانسداد ، زاد التعبير عن بروتينات PC-JUN و PC-FOS و SP -1 فيالكلىمن الفئران التي لديها UUO مقارنة بتلك الموجودة في الضوابط ، وقد تم تخفيف هذه الزيادة عن طريق 6- العلاج الحيوي. وبالمثل ، فإن تعبير AP -1 و SP -1 ، عوامل النسخ الهامة التي تنظمالكلىالجينات المرتبطة بالتليف بشكل ملحوظالكلىمن الجرذان مع UUO ولكن تم تخفيفه عند العلاج بـ 6- BIO (الشكل 2E). يوضح الشكل 2F تلطيخ التألق المناعي لـ PC-JUN و PC-FOS. و SP -1. تمت زيادة التألق الأحمر لتلوين PC-JUN و PC-FOS و SP -1 بشكل كبير فيالكلى، مقارنةً بعناصر التحكم ، وانخفض بسبب 6- العلاج الحيوي. تؤكد هذه النتائج أن AP -1 و SP -1 عاملان مهمان في النسخالكلىتليف و6- السيرة الذاتيةقد ينقصالكلىالتليف عن طريق التخفيف من نشاط النسخ.

للجزء 2 ، انقر فوقهنا.