الجزء 1: التأثيرات المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة والترطيب والتكوين المضاد للكورسيتين 3- O - - D-Glucuronide في الخلايا الكيراتينية البشرية وخلايا الورم الميلانيني عن طريق تنشيط مسارات NF-κB و AP -1
Mar 21, 2022
للمزيد من المعلومات الرجاء الاتصالtina.xiang@wecistanche.com
الملخص: كيرسيتين3- O - - D-glucuronide (Q -3- G) ، مركب الجلوكورونيد المتقارن من كيرسيتين ، تم الإبلاغ عن احتوائه علىمضاد التهابخصائص الضامة المحفزة لعديدات السكاريد الدهنية ، بالإضافة إلى الخصائص المضادة للسرطان ومضادات الأكسدة. على عكس الكيرسيتين ، الذي تم وصفه على نطاق واسع بأنه يمتلك مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية بما في ذلك التأثيرات الوقائية للجلد ، لا يزال يتعين توضيح الفوائد والآليات الدوائية لـ Q -3- G في الجلد. ركزت هذه الدراسة على توصيف الخصائص الواقية للبشرة ، بما في ذلك الخصائص المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة ، لـ Q -3- ضد الإجهاد التأكسدي المستحث بـ UVB أو H2O 2- ، وتأثيرات الترطيب ، والتولد المضادالأنشطة باستخدام الخلايا الكيراتينية البشرية (HaCaT) وخلايا الورم الميلانيني (B16F10). Q -3- خفف G التعبير عن الجين المؤيد للالتهابات والسيتوكين مثل انزيمات الأكسدة الحلقية -2 (COX -2) وعامل نخر الورم (TNF) - في HO ، أو UVB- الخلايا المشعة HaCaT. لقد أظهرنا أيضًا أن O -3- Gexhibits لها تأثير مضاد للأكسدة باستخدام مقايسات مسح الجذور الحرة وقياس التدفق الخلوي وزيادة التعبير عن العامل النووي 2- المرتبط بالعامل 2 (Nrf2). Q -3- قلل G من إنتاج الميلانين في خلايا B16F10 التي يسببها الهرمون المنشط للخلايا الصباغية (-MSH). تم فحص تأثيرات وآليات الترطيب لـ Q -3- G من خلال تقييم الجينات المرتبطة بعامل الترطيب ، مثل transglutaminase -1 (TGM -1) و filaggrin (FLG) و hyaluronic acid synthase (HAS) -1. بالإضافة إلى ذلك ، زاد Q -3- G فسفرة c-Jun و Jun N-terminal kinase (JNK) وبروتين كيناز منشط Mitogen (MAPK) كيناز 4 (MKK4) و TAK1 ، يشارك في MAPKs / AP -1 مسار وفسفرة IkB و IkB kinase (IKK) - و Akt و Src ، المتضمنة في مسار NF-kB. مجتمعة ، لقد أوضحنا أن Q -3- G يمارس خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة ومرطبة ومضادة للتكوين في الخلايا الكيراتينية البشرية وخلايا الورم الميلانيني من خلال مسارات NF-kB و AP -1.
الكلمات الدالة: كيرسيتين 3- O - - D-glucuronide ؛ حماية من الأشعة فوق البنفسجية ؛ ترطيب. التولد المضاد. AP -1 ، NF- كيلو بايت
1 المقدمة
يوفر الجلد ، وهو أكبر عضو في الجسم ، حاجزًا يلعب دورًا رئيسيًا في حماية الجسم من البيئة الخارجية والعوامل الضارة مثل الأشعة فوق البنفسجية والميكروبات المعدية والمواد الكيميائية الضارة. ينظم هذا الحاجز أيضًا توازن الكهارل في الجسم ودرجة الحرارة ويمنع فقدان الرطوبة [1،2]. يتكون جلد الإنسان من ثلاث طبقات: البشرة والأدمة مع الزوائد والأنسجة تحت الجلد [3]. تلعب طبقة البشرة دورًا مهمًا في الحفاظ على درجة حرارة الجسم.
الخلايا الكيراتينية ، المكون الوفير في البشرة ، تتفاعل بإحكام مع أخرى من خلال الديسموسومات والوصلات الضيقة التي تسمح بحاجز فيزيائي كيميائي فعال [4]. على الرغم من أن الجلد يعمل كحاجز وقائي ، إلا أن الأشعة فوق البنفسجية لها تأثير كبير على معظم الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية ، الطبقة الخارجية من الجلد. يمكن أن تتسبب الأشعة فوق البنفسجية في شيخوخة الجلد وتلف الجلد والتجاعيد وفرط التصبغ ، والذي يعتبر أحد أكثر عوامل الخطر رقابًا [5]. يتكون ضوء الأشعة فوق البنفسجية من ثلاثة نطاقات للأطوال الموجية: UVA (320-400 نانومتر) ، UVB (280-320 نانومتر) و UVC (200-280 نانومتر). Be-side بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) ، الذي يُعرف عنه أنه يساهم في الإجهاد التأكسدي ، يمكن أن يؤدي UVB إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من خلال تنشيط الإنزيمات المولدة لـ ROS [6]. تم وصف التراكم غير المنضبط لـ ROS في الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية بأنه يتسبب في تعديلات مؤكسدة للدهون والبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الأخرى داخل الخلايا والتي تؤدي لاحقًا إلى أنواع مختلفة من تلف الجلد والعمليات المرتبطة بالشيخوخة مثل موت الخلايا والإجهاد التأكسدي ، والالتهاب [7،8]. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن استجابة الإجهاد التأكسدي تؤثر على تلف المكونات الخلوية المختلفة [9]. يمكن أن تؤدي خلايا الجلد التالفة أيضًا إلى استجابات التهابية ، مما يؤدي إلى تلف الجلد المزمن [10]. أحد أنواع الأشعة فوق البنفسجية B أو H2O 2- الذي يتسبب في تلف الجلد من خلال العمليات البيولوجية هو التعبير عن الجينات الالتهابية مثل انزيمات الأكسدة الحلقية -2 (COX -2) والسيتوكينات المسببة للالتهابات [11]. لذلك ، فإن تطوير تأثيرات واقية للجلد أكثر أمانًا وقوة وفعالية أمر ضروري للوقاية من الأمراض المرتبطة بالأشعة فوق البنفسجية أو H2O2 التي تتسبب في تلف الجلد.
يلعب ترطيب الجلد أيضًا دورًا مهمًا في الحفاظ على وظيفته الطبيعية. على وجه الخصوص ، فإن الطبقة القرنية (SC) لها تأثير وقائي ضد فقدان الماء [12]. يساهم المحتوى المائي للطبقة القرنية في تقشر الجلد والنضج السليم ، في حين أن عدم كفاية الماء في SC يعزز التراكم والخلل الوظيفي للخلايا القرنية [12 ، 13]. في المراحل النهائية من تمايز الخلايا الكيراتينية ، يختفي غشاء البلازما والعضيات الخلوية ، ثم يحفز تدفق الكالسيوم ترانسجلوتاميناز (TGM) للتشابك مع البروتينات الأخرى. يؤدي نقص أو فقدان TGM -1 إلى تشابك معيب لمغلف الخلية. السماك اللاميلي هو مثال على مرض ناجم عن فقدان TGM -1. علاوة على ذلك ، تلعب filaggrin (FLG) ، مصفوفة الكيراتين المتكونة ، دورًا في تكوين SC حيث أنها تعمل كسقالة لربط البروتينات المغلفة المتقرنة والدهون [14] عن طريق تحفيز تفاعلات الارتباط المتصالب g-glutamyl lysine ، و ATGMs ، والغشاء - الإنزيمات المصاحبة ، التي تضفي النزاهة على الطوائف المنبوذة [15]. بالإضافة إلى ذلك ، حمض الهيالورونيك (HA) هو نوع من عامل الترطيب الطبيعي (NMF) يشارك في الاحتفاظ بالرطوبة في الجلد ويعرض مظهرًا مميزًا في شيخوخة الجلد الذاتية ، وهو عامل توصيل الدواء ، وهو مكون مهم في المصفوفة خارج الخلية [16 ، 17]. يلعب HA دورًا في زيادة رطوبة الجلد من خلال تنظيم جينات سينثاز حمض الهيالورونيك (HAS) ؛ إلى جانب ذلك ، يمكن لحمض الريتينويك (فيتامين أ) تنظيم HA بشكل فعال في البشرة [17]. TGM -1 و FLG و HAS -12 ، 3 هي جينات مرتبطة بإنتاج NMF [18]. علاوة على ذلك ، فإن تنشيط عوامل النسخ مثل البروتين المنشط -1 (AP -1) والعامل النووي (NF) -kB تشارك في إنتاج المواد المسببة للالتهابات التي تعمل على تحسين حاجز البشرة وترطيبها من خلال مسارات AP -1 و NF-kB [19]. تتضمن إنزيمات الإشارات الأولية في مسار AP -1 كينازات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPKs) مثل c-Jun N-terminal kinase (JNK) ، كيناز خارج الخلية منظم بالإشارة (ERK) ، و p38 ، بينما Src ، تنتمي Akt و IkB -kinase (IKKo /) و KBO (IkBa) إلى مسار NF-KB [20. ينتج الجلد أيضًا مادة الميلانين في طبقة البشرة ، خاصة في الخلايا الصباغية - المصدر الرئيسي للميلانين - التي تساهم في تحديد لون البشرة وتكوين الميلانين [21]. يمكن أن يؤدي تشعيع UVB وهرمون تحفيز الخلايا الصباغية (o-MSH) إلى تحفيز إفراز الميلانين ، وبالتالي تحفيز تكون الميلانين [22. أثناء تكون الميلانيني ، ينشط -MSH بروتين كيناز A (PKA) ، وعامل النسخ المرتبط بالبروتين المصغر (MITF) ، وربط عنصر استجابة cAMP (CREB) [23]. تعتبر إحدى وظائف الميلانين هي الوقاية من تلف الجلد بواسطة الأشعة فوق البنفسجية ، بما في ذلك أشعة الشمس. ومع ذلك ، فإن الإفراط في إنتاج الميلانين أو عدم وجود محتوى الميلانين الناجم عن الشيخوخة ، وهرمون تحفيز الخلايا الصباغية ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية يعزز النمش ، والكلف ، ونباتات الشيخوخة ، وغيرها من اضطرابات فرط / نقص التصبغ التي يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على المظهر والجلد الصحة [24]. وبالتالي ، فإن التحكم في تكون الميلانين مطلوب أيضًا للحفاظ على المظهر الصحي والتجميل لجسم الإنسان.
كيرسيتينهو نوع سائد من الفلافونويد من نوع الفلافونول موجود في الخضار والفواكه والمشروبات والنباتات الطبية [25]. وبالتالي ، تمت دراسة كيرسيتين على نطاق واسع لامتلاك فوائد دوائية بما في ذلك مضادات الالتهاب ومضادات تصلب الشرايين ،مضادات الأكسدة، ومضاد للسرطان ، وخصائص واقية للبشرة ، ويرتبط بتكوين الميلانين [24 ، 26-29]. ومع ذلك ، فقد أثبتت العديد من الأعمال التي تستخدم طرقًا حساسة وموثوقة أن مادة الكيرسيتين لم يتم اكتشافها في البلازما [30-33] وبالكاد توجد في الدماغ [34،35]. يتم امتصاص الكيرسيتين ، الذي يظهر بشكل عام في صورة غليكوزيد ، جيدًا ويتم تحلله في الغالب واستقلابه في الأمعاء الدقيقة والقولون والكبد والكلى إلى نواتج أيضية مترافقة [3 0 ، 36-38]. يتم الكشف عن المستقلبات المترافقة مثل الجلوكورونيد أو الكبريتات (ميثيل أو غير ميثيل ، على التوالي) ، بدلاً من كيرسيتين أجليكون أو جليكوسيداته ، في الدورة الدموية. 3 / -methyl-quercetin -3- glucuronide و quercetin -3- glucuronide و quercetin -3 '- تم التعرف على الكبريتات كمستقلبات البلازما الرئيسية بعد 1.5 ساعة من استهلاك البصل المقلي [30، 32]. تتشكل مستقلبات كيرسيتين هذه في الأمعاء الدقيقة والكبد عن طريق إنزيمات التحول الأحيائي بما في ذلك UDP-glucuronyltransferases نتيجة لعملية التمثيل الغذائي في المرحلة الثانية [29،39،40]. تم الإبلاغ أيضًا عن أن المستقلبات المترافقة من الكيرسيتين تتراكم في البلازما البشرية في نطاق تركيز من 10- 'إلى 10- درجة M بعد التناول الدوري للبصل مع وجبات الطعام لمدة أسبوع واحد [41]. يكون عمر النصف لمستقلبات الكيرسيتين مرتفعًا جدًا ، عند حوالي 11 إلى 28 ساعة [29]. نظرًا لأن هذه المركبات قد لوحظت باعتبارها الأشكال الرئيسية لمستقلبات كيرسيتين المقترنة ، فإن الدراسات التي تركز على النشاط البيولوجي للفلافونول باستخدام هذه المستقلبات المترافقة ستكون ضرورية ، مما دفعنا إلى دراسة النشاط البيولوجي لأحد نواتج كيرسيتين المقترنة. يعد كيرسيتين 3- O - - D-glucuronide (Q -3- G) (الشكل 1) أحد أكثر نواتج الجلوكورونيد وفرة الموجودة بشكل رئيسي في البلازما والأنسجة بما في ذلك الكبد والكلى والدماغ [31،35،40،42،43] ، والتي قد تولد أنشطة مماثلة أو أقوى أو أضعف مقارنة بالمركبات الرئيسية في نماذج مختلفة. Q -3- يتم نقل G إلى الأنسجة المستهدفة عبر البلازما لممارسة نشاطها البيولوجي [39]. وقد ثبت أيضًا أن O -3- G هو مستقلب فعال في بلازما الجرذان بعد تناول الكيرسيتين عن طريق الفم [43]. في دراسات أخرى ، وجد أن المستقلب الذي يحتوي على Q {{44} G يتراكم في الشريان الأورطي بعد تناول الطعام الغني بالكيرسيتين وتم تحديده كمبدأ نشط تم اكتشافه في دم الإنسان يتراوح من 0. {{48} } ميكرومتر 【44】. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على Q -3- G في النبيذ [45] وفي النباتات الطبية مثل Hypericum hirsutum و Nelumbo nucifera و Oenothera biennis والفاصوليا الخضراء [46-49]. Q -3- G تم وصفه بأنه مكون مضاد للالتهابات في ظل ظروف تحفيز LPS وأظهر خصائص مضادة للأكسدة في بلازما الدم [50-52]. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التاريخ الطويل للتطبيق والدراسة الواسعة للكيرسيتين ، لا يزال يتعين استكشاف دراسة Q -3- G. لذلك ، تم اختيار Q -3- G كممثل لمستقلبات كيرسيتين كعامل نشط في الجسم الحي من كيرسيتين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دور Q -3- G في تأثيرات حماية الجلد لم يتم توضيحه بشكل كامل حتى الآن. في هذه الدراسة ، باستخدام تقييمات مختلفة في المختبر ، بحثنا في التأثيرات الوقائية للجلد لـ Q -3- G ضد UVBor H2O 2- الذي يسبب الإجهاد التأكسدي والالتهاب ، وترطيب الجلد في HaCaT (خط خلايا الكيراتين البشرية) الخلايا ، ونشاط التولد المضاد في خلايا B16F10 (خط خلية سرطان الجلد من الفئران).
2. النتيجة
2.1. التأثيرات المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة لـ Q -3- G ضد UVB أو H2O 2- خلايا HaCaT المحفزة
يمكن أن تتلف أنسجة الجلد بسبب الأشعة فوق البنفسجية. تنشط الأشعة فوق البنفسجية العديد من العوامل الضارة ، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج والالتهاب وشيخوخة الجلد. من أجل تحديد أنشطة الحماية من الأشعة فوق البنفسجية لـ Q -3- G ، قمنا مبدئيًا بتقييم ما إذا كان Q -3- G له أي تأثيرات على قابلية بقاء الخلايا الكيراتينية البشرية. باستخدام مقايسة 3- (4-5- Dimethylthiazol -2- yl) -2 ، 5- diphenyl -243 tetrazolium bromide (MTT) ، قمنا بفحص التأثيرات السامة للخلايا من O -3- G في خلايا هاكا. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، لم يكن هناك تداخل كبير في قابلية الخلية للحياة بتركيز 2. 5-20 uM بواسطة Q -3- G ، مما يشير إلى أن O -3- G لم يُظهر سمية خلوية تصل إلى 20 ميكرومتر ولم تؤذي الخلايا الكيراتينية ، الطبقة السطحية لخلايا الجلد. بعد ذلك ، قمنا بتقييم التأثيرات الواقية للجلد لـ Q -3- G في خلايا HaCaT المعرضة للأشعة فوق البنفسجية B. بعد تشعيع UVB عند 30 مللي جول / سم 2 ، قام Q -3- G بحماية خلايا HaCaT بشكل كبير من موت الخلايا الناجم عن UVB بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 2 ب). بالاتفاق مع مقايسة MTT ، باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر لالتقاط مورفولوجيا خلايا HaCaT ، فإن Q -3- G محمي ضد موت الخلايا بسبب خلايا HaCaT المشععة بالأشعة فوق البنفسجية حتى تركيز 10 ميكرومتر （الشكل 2 ج） . كان عدد خلايا HaCaT تحت كل حالة 482 للمجموعة غير المعالجة ، و 91 لمجموعة UVB 30 مللي جول / سم ، و 276 لمجموعة UVB 30 مللي جول / سم 2 زائد 5 ميكرومتر O -3- G ، و 320 لمجموعة UVB 30 مللي جول / سم 2 بالإضافة إلى 10 ميكرومتر Q -3- مجموعة G (الشكل 2 د). أكدت هذه النتائج أن Q -3- G يثبط تلف HaCaT الناجم عن UVB وينقذ تأثير حماية الجلد من إشعاع UVB.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
إن حدوث وتفاقم الالتهاب في الجسم ينشط أحيانًا الضامة ويطلق بعض السيتوكينات. الالتهاب هو السمة المميزة للإجهاد التأكسدي. لقد درسنا التأثير المضاد للالتهابات لـ Q -3- G ضد الالتهاب الناجم عن UVB أو HO 2-. من المعروف أن UVB يمكن أن يعزز تلف الحمض النووي والالتهابات في خلايا الجلد 【10】. قمنا بتشعيع خلايا HaCaT باستخدام UVB 30mJ / cm² واحتضان خلايا HaCaT بـ H2O2 (500 ميكرومتر). استخدمنا اختبار PCR في الوقت الحقيقي للتحقق من تعبير mRNA للإنزيم الالتهابي COX -2 والسيتوكين TNF- المؤيد للالتهابات. كما هو موضح في النتائج في الشكل 2 هـ ، و ، فإن تركيز 10 ميكرومتر من O -3- G منع بشكل كبير تعبير mRNA لـ COX -2 و TNF-. وبالتالي ، قام Q -3- G بقمع الاستجابات الالتهابية التي تحدث في خلايا HaCaT بعد التعرض لإشعاع UVB أو H2O2.
استخدمنا 2،2'-azinobis - (3- ethylbenzothiazoline -6- حمض السلفونيك) (ABTS) و 2 ، 2- مقايسات إزالة جذرية ثنائية الفينيل (DPPH) —- أنظمة نموذجية مستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في أنشطة الكسح في المختبر للمركبات الطبيعية - لتقييم خاصية مضادات الأكسدة لـ Q -3- G بتركيزات مختلفة. عولجت خلايا HaCaT بـ Q -3- G بطريقة تعتمد على التركيز بدءًا من 2. 5-40 ميكرومتر في وجود DPPH ، وأظهرت النتيجة نشاط تنظيف كبير في أكثر من 2.5 ميكرومتر (الشكل 2 جم) . أظهر اختبار ABTS أيضًا بشكل كبير تأثيرات Q -3- G على تنظيف الجذور الحرة في الأساليب المعتمدة على التركيز بقيمة IC50 تبلغ 1.75 ميكرومتر （الشكل 2 ح）. أظهر حمض الأسكوربيك （AA ، كعنصر تحكم إيجابي ، أكبر تأثيرات مضادات الأكسدة في كل من مقايسات DPPH و ABTS. تم الإبلاغ عن العامل 2 (Nrf2) للعامل النووي ، وهو أحد الجينات المعتمدة على عنصر الاستجابة المضادة للأكسدة (ARE) ، لتنظيم الإنزيمات المؤكسدة الواقية وركائزها المحبة للأكسدة ، وبالتالي تعزيز الإنزيمات المضادة للأكسدة لإزالة الضرر والإصلاح أنظمة [53]. بعد ذلك ، قمنا بفحص مستوى التعبير عن Nrf2 في خلايا HaCaT المشعة بالأشعة فوق البنفسجية. من خلال تعزيز النتائج المذكورة أعلاه ، عزز O -3- G بشكل ملحوظ مستوى التعبير عن Nrf2 عند تشعيع UVB مقارنةً بالتحكم بطريقة تعتمد على التركيز ، حتى 10 أمتار (الشكل 2i) ، مما يعني أن Q -3- يقدم G تأثيرًا مضادًا للأكسدة كيميائيًا وبيولوجيًا مع خاصية إزالة الجذور الحرة ويزيد من التأثير الوقائي لإشارات ARE المعتمدة على Nrf 2- ، على التوالي. علاوة على ذلك ، أجرينا أيضًا قياس التدفق الخلوي ROS باستخدام ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ديهيدروفلوريسين (DCFDA) في حالة الأشعة فوق البنفسجية. من المعروف على نطاق واسع أن مضادات الأكسدة تقوم بقمع الضغوطات الخلوية عن طريق تثبيط إنتاج ROS [54]. أظهرت النتيجة أن العلاج بـ Q -3- G بتركيزات 5 و 10 ميكرومتر قلل من مستوى ROS المستحث بالأشعة فوق البنفسجية الشكل 2j）. مجتمعة ، تدل هذه البيانات على أن Q -3- خصائص واقية للجلد مثل التأثيرات المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة ضد H2O أو الإجهاد التأكسدي والالتهاب الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية في خلايا HaCaT.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2 تأثير التولد المضاد في B16F10 وتأثير الترطيب في خلايا HaCaT لـ Q -3- G
لفحص تأثيرات O -3- G على تكوين الميلانين ، تمت معالجة خلايا الورم الميلانيني بـ -MSH لمدة 48 ساعة لإفراز الميلانين في خلايا B16F10. من خلال استخدام فحوصات MTT ، أكدنا أولاً أن Q -3- G ليس لديه سمية خلوية في خلايا B16F10 بتركيزات تصل إلى 20 ميكرومتر لمدة 48 ساعة (الشكل 3 أ). أظهرت هذه النتيجة ، للتقييمات التالية ، أن تأثيرات O -3- G في B16F10 لم تكن بسبب موت الخلية. بعد ذلك ، قمنا بتقييم B16F10 باستخدام Q -3- Gand -MSH لمدة 48 ساعة لتحديد تأثيرات Q -3- G على تكوين الميلانين. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، ثبط Q -3- G بشكل كبير إفراز الميلانين. كما أن عنصر التحكم الإيجابي أربوتين يقلل بشكل كبير من إفراز الميلانين.
الجزيء المرتبط برطوبة الجلد هو حمض الهيالورونيك (HA). كما ذكرنا سابقًا ، HA ، الموزع في جميع أنحاء البشرة والأدمة ، هو NMF الذي يعزز ترطيب البشرة [55]. استخدمنا اختبار PCR (RT-PCR) للنسخ العكسي لفحص مستوى النسخ لـ HAS -1 بعد 12 ساعة بتركيز Q -3- G يصل إلى 30 ميكرومتر. يعزز HAS تراكم HA متوسط الحجم داخل الخلايا الكيراتينية [12]. كما هو موضح في الشكل 3 ج ، تمت زيادة تعبير HAS -1 عن طريق العلاج بـ Q -3- G حتى 10 ميكرومتر. بالإضافة إلى عامل الترطيب ، قمنا أيضًا بفحص تعبير FLG و TGM {{ 13}}. استخدمنا الريتينول كمجموعة تحكم إيجابية. زادت مستويات النسخ لـ FLG و TGM -1 بشكل ملحوظ بعد العلاج بـ Q -3- G بتركيزات تصل إلى 10 ميكرومتر (الشكل ثلاثي الأبعاد). تشير هذه النتائج إلى أن Q -3- G له نشاط ترطيب للبشرة في خلايا HaCaT. علاوة على ذلك ، باستخدام SB203580 (مثبط p38) و SP600125 (مثبط JNK) و UO126 (مثبط ERK) و Bay 11-7082 (مثبط NF-kB) ، قمنا بفحص تورط مسارات إشارات MAPK و NF-kB في الترطيب عامل Q -3- خلايا HaCaT المعالجة بـ G. استنادًا إلى التعبير الجيني المستحث بـ O -3- ، تم تقليل كل من مستويات TGM -1 و FLG عن طريق العلاج باستخدام SP600125 ، وهو مثبط JNK (الشكل 3 هـ) ، مما يشير إلى أن JNK مطلوب لزيادة التعبير من TGM -1 و FLG من حيث تأثير ترطيب الجلد لـ O -3- G. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل تعبير FLG أيضًا بواسطة Bay 11-7082 ، وهو مثبط لـ IKK و IkB ، مما يشير إلى أن الآلية الصيدلانية لـ Q -3- G يمكن أن تنتمي أيضًا إلى مسار إشارات NF-kB.
2.3.مسارات الترطيب المرتبطة بالإشارة لـ Q -3- G عبر تنشيط AP -1 و NF-kB
استنادًا إلى نتائج mRNA السابقة ، افترضنا أن مشاركة AP -1 وإشارات NF-kB في تأثير الماء لـ Q -3- G يمكن أن تحدث أيضًا في مستويات البروتين. باستخدام اختبار لطخة غربية ، قمنا بفحص فسفرة جزيئات المنبع لـ AP -1 و NF-kB. أولاً ، في مسار AP -1 ، تمت زيادة فسفرة c-Jun بعد احتضان خلايا HaCaT بـ Q -3- G لمدة 24 ساعة (الشكل 4 أ). تمت زيادة مستوى p-INK أيضًا بعد العلاج بـ Q -3- G بتركيزات 2.5،5 و 10 ميكرومتر. ظل الشكل الإجمالي لـ JNK دون تغيير (الشكل 4 ب). لقد فحصنا أيضًا فسفرة MKK4 و TAK -1 ، وهما المنظمان الأوليان لـ JNK. كما هو مبين في الشكل 3 ج ، بعد معالجة خلايا HaCaT بـ O -3- G ، تم أيضًا تنظيم مستويات البروتين في p-MKK4 و p-TAK1.
بالإضافة إلى إشارات NF-kB ، زاد Q -3- G الفسفرة في p50 و p65 ، وهي وحدة فرعية من NF-kB (الشكل 4 ج). علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم تنشيط IKK و IkBa ، والتي تمت زيادتها أيضًا بمقدار Q -3- G حتى 10 uM مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 4 د). في النهاية ، قررنا تنشيط جزيئات المنبع المشاركة في مسار إشارات NF-kB. تم تحسين فسفرة Src و Akt (Ser473) بواسطة علاج O -3- G (الشكل 4 هـ). بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن تأثيرات حماية الجلد لـ Q -3- G تستهدف تنشيط TAK1 و Src عن طريق زيادة مستوى البروتين ، وبالتالي تنظيم نشاط AP -1 و NF-kB ، على التوالي.
2.4.Effects Q -3- G على التنشيط النسخي لـ AP -1 و NF-kB
لقد درسنا السمية الخلوية للخلية Q -3- G في خلايا HEK293T في خط خلايا الكلى الجنينية البشرية عن طريق مقايسة MTT (الشكل 4f). لم تتأثر جدوى خلايا HEK293T بشكل كبير بعد العلاج بـ Q -3- G （2. 5-20 ميكرومتر） مقارنة بالخلايا غير المعالجة.
لقد استخدمنا مقايسة لوسيفيراز لتحديد ما إذا كان Q -3- G يمكنه تعديل مقايسات مروج NF-kB و AP -1. لقد أكدنا أن O -3- زاد نشاط لوسيفيراز بوساطة AP -1- (الشكل 4 ز) ونشاط لوسيفيراز بوساطة NF-kB (الشكل 4 ح) بطريقة تعتمد على التركيز. تؤكد هذه النتائج أن تنشيط AP -1 وتنشيط NF-KB هما هدفان دوائيان مهمان لـ Q -3- G.
انقر فوق الارتباط للحصول على مزيد من المعلومات:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html
