اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

Katharina Artinger '، Alexander H. Kirsch' ، Agnes A. Mooslechner '، Daniel J. Cooper23 ، Ida Aringer' ، Max Schuller '، Corinna SchabhüttI' ، Konstantin A. آنا إل إيليرت ، ألكسندر ر. روزنكرانز ، بيتر جيه لين 2 وكاثرين إيلر

يمكن أن يساعد Cistanche في وظائف الكلى بشكل جيد للغاية

"القسم السريري لأمراض الكلى ، قسم الطب الباطني ، جامعة غراتس الطبية ، غراتس ، النمسا ؛ مركز مجلس البحوث الطبية لتنظيم المناعة ، معهد البحوث الطبية الحيوية ، جامعة برمنغهام ، برمنغهام ، المملكة المتحدة ؛ قسم الصحة العالمية والمدارية ، كلية مينزيس للبحوث الصحية وجامعة تشارلز داروين ، داروين ، الإقليم الشمالي ، أستراليا ؛ وحدة العناية المركزة ، قسم الطب الباطني ، جامعة غراتس الطبية ، غراتس النمسا: 'قسم علم المناعة ، كلية الطب ، جامعة جونتيندو ، طوكيو ، اليابان ؛ وشهادة قسم الطب ل ، المركز الطبي - جامعة فرايبورغ ، كلية الطب ، جامعة فرايبورغ ، فرايبورغ ، ألمانيا

يعد التحفيز المشترك شرطًا أساسيًا للنشاط الممرض في الأمراض التي تتوسطها الخلايا التائية وقد ثبت أنه يحقق التسامح في المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء كهدف علاجي. هنا ، قمنا بتقييم تورط أفراد عائلة عامل نخر الورم CD30 و OX40 في مركب مناعي بوساطةالكلى مرض. في التحفيز والتكاثر في المختبر ، أجريت دراسات باستخدام خلايا CD4 plus من النوع البري وفئران CD30 / OX40 مزدوجة الضربة القاضية （CD30OX40. أجريت الدراسات في الجسم الحي عن طريق تحريض التهاب الكلية المصلي السام للكلية في النوع البري ، CD30OX40 ، CD30 '، OX40 درجة ، الفئران المعاد تشكيلها Rag1 ~ و C57Bl / 6J المعالجة بأجسام مضادة CD30L aOX40L. تم تنظيم CD30 و OX40 وروابطهم على الكريات البيض المختلفة في التهاب الكلية المصلي السام للكلية. تم حماية الفئران CD30OX40 ، ولكن ليس CD30 / أو OX40mice من التهاب الكلية المصلي السام للكلية. تم العثور على حماية مماثلة في الفئران Rag1 المحقونة بـ CD4 plus Tcells من CD30OX40'mice مقارنة بالفئران Rag1 التي تم حقنها بخلايا CD4T من الفئران من النوع البري. كانت قادرة تمامًا على

التمايز إلى مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة الوسيطة للمرض ولكنها أظهرت انخفاضًا ملحوظًا في مستويات الانتشار في الجسم الحي وفي المختبر مقارنة بالخلايا من النوع البري. منع الأجسام المضادة ضد CD30L و OX40L من التهاب الكلية المصلي السام للكلية دون التأثير على خلايا المستجيب الشامل أو خلايا الذاكرة التائية. وبالتالي ، تشير نتائجنا إلى تعزيز المرض عبر إشارات CD30 و OX40 بسبب تسهيل تكاثر الخلايا التائية المبالغ فيه وهجرة الخلايا التائية 17 المساعدة في التهاب الكلية المصلي السام للكلية. ومن ثم ، فإن حصار التحفيز المشترك الذي يستهدف مسارات إشارات CD30 و X40 قد يوفر استراتيجية علاجية جديدة في المناعة الذاتية.مرض كلوي.

بيان متعدية

توضح هذه المقالة قابلية تطبيق مسارات إشارات CD30 و OX40 كأهداف علاجية مستقبلية في مرض الكبيبات المناعي بوساطة معقدة باستخدام نموذج الفئران لالتهاب الكلية الكلوي المصلي. يعد الحصار المشترك لمسارات تكلفة CD30 و OX40 وسيلة لتحقيق التسامح المحيطي في المناعة الذاتية عن طريق الحد من الانتشار المفرط الممرض في الأعضاء الليمفاوية الثانوية وانتقال الخلايا التائية المساعدة المسببة للأمراض 17 خلية إلىالكلى. نظرًا لأن خيارات العلاج التقليدية كانت مصحوبة بآثار ضائرة شديدة ، فمن المحتمل أن يؤدي حصار CD30 و OX40 المشترك إلى عدد أقل من الإصابات التي تهدد الحياة مقارنة بالعلاجات التقليدية المثبطة للمناعة.

تعتبر إشارات التكلفة من المتطلبات الأساسية لتنشيط الخلايا التائية والتمايز ووظيفة المستجيب والبقاء على قيد الحياة. تم تحديد حجب التكلفة كاستراتيجية لتحقيق التسامح المناعي. جنبًا إلى جنب مع عائلة Ig الفائقة ، بما في ذلك CD28 و B7 ، فإن "الجزيئات الأكثر تكلفة هي أعضاء في عائلة عامل نخر الورم القديم والتطور (TNF). تعمل أيضًا وظيفيًا بشكل تآزري.تتفاعل العوامل المرتبطة بمستقبلات TNF مع مناطق المستقبلات داخل الخلايا وتعزز بقاء الخلية عبر إشارات عامل nu-dear-KB في كلتا الحالتين.يمكن التعبير عن CD30 و OX40 ، بالإضافة إلى روابطهما CD30L و OX40L ، على T و الخلايا البائية وعلى مجموعة متنوعة من الخلايا العارضة للمستضد.

يلعب CD30 دورًا حاسمًا في الالتهاب في داء السكري المناعي الذاتي ، والتهاب القولون ، والتهاب الدماغ والنخاع. -1 وجد التحقيق في النماذج التجريبية أدوارًا مُمرضة لـ OX40 في التهاب العنبية المناعي الذاتي ، والتهاب المفاصل ، والتهاب الحساسية ، 12-1 في حين أن تقريرًا حديثًا اقترح مسار OX40 / OX40L للحماية من التهاب كبيبات الكلى الهلالي عن طريق تحفيز تكاثر الخلايا التائية التنظيمية. ومع ذلك ، فقد تم ربط كلا الجزيئين بشكل مستقل بالإمراضية لمرض الذئبة الحمامية الجهازية (SLE). CD30 القابل للذوبان هو علامة على نشاط المرض في SLEl6،17 a ويرتبط النمط الفرداني OX40L بزيادة خطر الإصابة بالمرض .8 بالإضافة إلى ذلك ، تعبر الخلايا التائية المساعدة 17 (Th17) عن مستويات متزايدة من OX40 في مرضى الذئبة الحمراء ، و يمكن اكتشاف تعبير OX40 على الكريات البيض حول الأوعية الدموية في التهاب الكلية الذئبي.

ترتبط الخيارات العلاجية الفعالة لعلاج التهاب كبيبات الكلى بزيادة المراضة وارتفاع مخاطر الآثار الضارة 1 ؛ وبالتالي ، فإن العلاج الموجه بشكل أكثر تحديدًا ضروري. النهج المتنامي في استهداف الاستجابات المناعية هو تحريض التسامح.] تشمل الخيارات العلاجية لتحقيق التسامح المحيطي حذف نسيلي ، والجهل ، وتنظيم المناعة ، وأخيرًا ، الطاقة ، والتي ثبت بالفعل أنها استراتيجية قيّمة مثبطة للمناعة عند السامة للخلايا اللمفاوية التائية- تم تقديم بروتينات انصهار البروتينات المرتبطة 4-.

OX40L blockade قيد التقييم السريري حاليًا ؛ ومع ذلك ، فإن الاستهداف المشترك لـ CD30 و OX40 لم يتم التحقيق فيه بشكل شامل حتى الآن. تعتمد المناعة الذاتية المعتمدة على القرص المضغوط 4- بشكل حاسم على التفاعل بين كل من أزواج المستقبلة والرابطية ، كما يتضح من ضرورة الإلغاء المشترك لإشارات CD30 و OX40 لحماية الفئران التي تعاني من نقص في forkhead box P3 (FoxP3) من التطور الفتاك المبكر مرض يصيب جهاز المناعه. التهاب الكلية المصل الكلوي (NTS) هو نموذج مورين من التهاب كبيبات الكلى المركب المناعي الذي ثبت أنه يعتمد بشكل صارم على الخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا التائية 1 (Th1) وخلايا Th17. يحدث عرض المستضد في هذا النموذج بشكل أساسي في الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، ولكن أيضًا محليًا داخلالكلى. وبالتالي ، افترضنا أن تنشيط مسارات تكلفة CD30 و OX40 يفترض أنها تدعم NTS.

طرق الحيوانات

CD30OX407 تم إنشاء الفئران ذات الضربة القاضية المزدوجة التي تعاني من نقص في CD30 و OX40 كما هو موضح سابقًا. تم تربيتها في كل من CD30OX 40- و CD30OX40 plus / littermate ، بالإضافة إلى CD30 ~ و OX40 ~. كما تم توفير الفئران CD30√ من قبل الدكتور تنبيه ، فرايبورغ ، ألمانيا. تم الحصول على الفئران C57BL / 6J من معامل تشارلز ريفر (سولزفيلد ، ألمانيا). تم الحصول على الفئران Ragland B6.Thyl.1 من مختبر جاكسون (بار هاربور ، ME). كانت جميع الفئران على خلفية C57BL / 6J.

نموذج NTS

تم إحداث NTS كما هو موضح سابقًا. باختصار ، تم تحصين الفئران مسبقًا باستخدام 2 مجم / مل من الأرانب lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories ، West Grove ، PA) مذابة في مادة مساعدة غير مكتملة من Freund (Sigma-Aldrich ، St. ديترويت ، ميشيغان) قبل 3 أيام من إعطاء مصل الأرانب المضاد للفأر الكلوي. تم التقييم بعد 4 أو 14 يومًا بعد حقن مصل NTS ، كما هو محدد.

نقل الخلايا في Rag 1- / الفئران

تم حقن الفئران 1- بخلايا 1.5 × 10 درجة CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من طحال إما من الفئران من النوع البري (WT) أو CD30OX 40-- أو خلايا CD90.1 WT ، وكانت خلايا CD90.2 الضربة القاضية نقل بالتبني بنسبة 1: 1. بعد يوم واحد من النقل بالتبني ، تم تحريض NTS وتقييمه بعد 4 أو 14 يومًا. تم عزل خلايا CD4 plus T من الطحال باستخدام مجموعة عزل الخلايا CD4 بالإضافة إلى الماوس (Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا).

منع تجارب الأجسام المضادة

تم علاج الفئران الكلوية C57BL / 6 بأجسام مضادة مانعة ضد الفئران OX4 0 L (استنساخ RM134L) و CD3 0 L (استنساخ RM153) إما معًا أو بمفردها بدءًا من يوم التحصين أو بعد 3 أيام NTS الحث. تم حقن الفئران في IP مع 0.5 ملغ x-OX40L و / أو 0.5 ملغ من الأجسام المضادة أحادية النسيلة a-CD30L أو 1 ملغ من الأجسام المضادة IgG (Sigma-Aldrich) 3 مرات في الأسبوع.

قياس الزلال البولي والكرياتينين والسيتوكين الطافي

تم استخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المزدوج (Abcam ، Cambridge ، MA) لتحديد إفراز الألبومين البولي ، كما ورد سابقًا (نطاق الكشف ، 0. 781-200 نانوغرام / مل). تم تقييم الكرياتينين البولي ضوئيًا باستخدام مجموعة قائمة على حمض البيكريك متاحة تجاريًا (Sigma-Aldrich). تم إجراء الكشف عن السيتوكين في المواد الطافية كما هو موضح في الطرق التكميلية.

تقييم استجابة الجسم المضاد الذاتي

تم تحضين الألواح طوال الليل بـ 100 ميكروغرام / مل من IgG (معامل Jackson ImmunoResearch Laboratories). بعد ذلك ، تم تحضين المصل في تخفيفات مضاعفة متسلسلة للكشف عن تداول الفئران المضادة للأرانب Ig. باستخدام الفجل الماعز المترافق مع بيروكسيداز الماعز المضاد للفأر IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ، تم اكتشاف IgG للفأر المضاد للأرانب.

نيتروجين اليوريا في الدم

نيتروجين اليوريا في الدم

تم الحصول على مستويات (BUN) في مصل الدم باستخدام مجموعة أدوات الكشف اللوني BUN المتاحة تجارياً (Invitrogen).

تقييم التشريح المرضي والمناعة

تقييم دوري ملطخ بحمض شيف (PAS)الكلىتم إجراء المقاطع كما هو موضح سابقًا ، وفي الطرق التكميلية.

تم استخدام 3- تقنية تلطيخ المناعي متعدد الطبقات لتقييم خلايا الأنسجة المتسللة (الطرق التكميلية).

التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر

تم تلوين عينات الأنسجة المجمدة بأجسام مضادة ذات علامات الفلورسنت (طرق تكميلية) وتم تقييمها على meta LSM510 (زايس ، أوبيركوشن ، ألمانيا).

الشكل 1|يتم التعبير عن يجند CD30 و OX40 و CD30 (CD30L) و OX40 (OX40L) بشكل تفاضلي على الكريات البيض الطحالية في التهاب الكلية المصلي السام للكلية (NTS). التعبير عن CD30 و OX40 و CD30L و OX40L على خلايا CD4 بالإضافة إلى T في الفئران السليمة والكلوية C57Bl / 6J بعد 12 ساعة ، 24 ساعة و 72 ساعة و 7 أيام و 14 يومًا من NTS (n =5 الفئران / تم تقييم التعبير عن المستقبلات والروابط ذات الصلة على (أ) CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، (ب) خلايا CD8T ، (ج) الخلايا البائية ، (د) CD11 الخلايا التندريتية ، (هـ) CD11bLv6G بالإضافة إلى العدلات SSChi ، (f） CD11btLy6GCD115 بالإضافة إلى Ly6C بالإضافة إلى وحيدات الكلاسيكية ، و (g) CD11btLy6G-CD115 بالإضافة إلى Ly6C وحيدات غير كلاسيكية. تظهر جميع البيانات نطاقات وسيطة ورباعية. يتم توفير الدلالات الإحصائية مقارنة بالفئران السليمة. * P<><><0.001,><>

التدفق الخلوي

تم إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام 1 × RBC Lysis Buffer Solution (eBioscience) مع عينات الدم قبل الحصول على تعليق أحادي الخلية من الدم والطحال والعقد الليمفاوية باستخدام 70- مصافي خلايا أم. عزل الخلية منالكلىتم إجراؤه باستخدام الطرد المركزي المتدرج كثافة بيركول بعد هضم المفروم ناعماًالكلىفي معهد روزويل بارك التذكاري 1640 متوسط ​​(Thermo Fisher Scientific) مكمل بالكولاجيناز D و DNAse I بدرجة 37 ، كما هو موضح سابقًا.

تم إجراء عمليات تلوين وتقييم التدفق الخلوي كما هو موضح في الطرق التكميلية.

مقايسة تكاثر الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى

تم تحضين خلايا CD4 plus T باستخدام Celltrace Violet (مجموعة تكاثر الخلايا البنفسجي CellTrace ؛ Invitrogen) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة ، وتم زرعها عند 2.5 × 10 / مل للحضانة باستخدام 5 ميكروغرام / مل كونكانافالين-أ (سيغما-ألدريتش) أو 5 ميكروغرام / مل فيتوهيماجلوتينين (سيغما الدريتش). بعد 7 أيام ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم شدة Celltrace البنفسجي في هذه الخلايا.

تحفيز الطحال

تم حصاد الخلايا الطحالية من الفئران الكلوية المعالجة بجسم مضاد للنمط المتماثل أو الأجسام المضادة لـ xCD30LxOX40L بعد 14 يومًا من NTS. تم زرع الخلايا الطحالية بنسبة 2 × 10 بالمائة / مل في آبار الأرانب-IgG المطلية مسبقًا وإعادة تنشيطها لمدة 24 ساعة قبل قياس التدفق الخلوي. تم زرع الخلايا الطحالية من WT كلوي و CD30OX40 ~ الفئران (اليوم 14) عند 2 × 1097 مل وتحفيزها باستخدام xCD3 (5 ميكروغرام / مل) و xCD28 (1 ميكروغرام / مل) (كلاهما من eBioscience) لمدة 3 أيام قبل تقييم طاف ثقافة الخلية .

تجارب استقطاب الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى

تم عزل خلايا CD4 plus CD62L plus T من الطحال باستخدام CD4 plus CD62L بالإضافة إلى مجموعة العزل II (Miltenyi Biotec) وتحفيزها كما هو موضح في الطرق التكميلية.

النسخ العكسي لتفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من العقد الليمفاوية والكلىباستخدام TRI Reagent (Sigma-Aldrich) وبعد ذلك ، تم تصنيع cDNA باستخدام مجموعة النسخ Superscript II (Invitrogen) والبادئات العشوائية (Invitrogen) للنسخ العكسي لـ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بشكل مكرر على نظام CFX96 Real-Time System (BioRad ، Hercules ، CA). الجين TaqMan

الشكل 2|CD30OX 40- الفئران محمية من التهاب الكلية المصلي السام للكلية (NTS). CD30OX 40- / - الفئران ، الفئران المنفردة CD30 ، والفئران المنفردة OX40 ، وكذلك من النوع البري (WT) ، عناصر التحكم (n =5-6 الفئران لكل مجموعة) تعرضت لـ 14 يومًا من NTS ، (أ) تم تقييم بيلة الألبومين و (ب) مستويات نيتروجين اليوريا في الدم (BUN). (م) ممثل دوري حامض شيف (PAS) - ملطخةالكلى، بالإضافة إلى درجات PAS ، (و) درجة الهلال ، (ز) درجة الجلطة داخل الصفيحة ، (ح) تشكيل الزهر الأنبوبي ، و (ط) درجة الإصابة الأنبوبية الحادة. () التسلل الكلوي CD68 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، (ك) العدلات ، () خلايا CD4T ، و (م) CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية متوفرة. تم تقييم إجمالي أعداد وأعداد خلايا CD45 بالإضافة إلى خلايا CD4 T في (n) العقد الليمفاوية و (o) طحال الفئران WT و CD30OX 40- / - بواسطة قياس التدفق الخلوي. (ع) إجمالي عدد كريات الدم البيضاء الكلوية التي تم تقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي و (ز) النسب المئوية لخلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، و CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، و Ly6G بالإضافة إلى العدلات SSChi ، و Ly6C plus monocytes ، و Ly6C monocytes فيالكلىمن الفئران CD30OX40 و W. (ص) تم تقييم lgG الفأر المضاد للأرانب (عدد=10 فئران / مجموعة). (ق) يتم عرض إجمالي عدد CD4 بالإضافة إلى CD28 بالإضافة إلى الخلايا / العقدة الليمفاوية من WT الكلوي (n=7 الفئران) و CD30OX 40- / (n =5 الفئران). التكبير الأصلي × 40 إظهار البيانات (أ ، ب ، ص ، ق) يعني ± SEM ؛ (c، fg) يشار إلى المتوسطات بخط أفقي. البيانات تمثل 4 تجارب مستقلة. يتم توفير الدلالات الإحصائية مقارنة مع الفئران WT. * P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

تم استخدام فحوصات التعبير (النظم البيولوجية التطبيقية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) و SYBR الأخضر (BioRad) (الطرق التكميلية).

تحليل احصائي

تم إجراء جميع التقييمات الإحصائية (الطرق التكميلية) باستخدام GraphPad Prism 6. 0 لنظام التشغيل Macintosh (برنامج GraphPad ، لا جولا ، كاليفورنيا).

بيان الأخلاق

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة للوزارة النمساوية (BMWFW -66. 010 / 0054- WF / V / 3b / 2015).

النتائج

يتغير التعبير عن CD30 و OX40 وروابطهما بمرور الوقت من NTS على خلايا المناعة الفطرية والتكيفية CD30 و OX40 التعبير على الطحال CD4 زائد الخلايا التائية على مدار الوقت من NTS (الشكل لا). تمت زيادة مستويات التعبير CD30L و OX40L بشكل كبير على خلايا CD4 الطحالية بالإضافة إلى الخلايا التائية للفئران الكلوية بعد 7 و 14 يومًا (الشكل لا). على CD4 * CD25Foxp3 بالإضافة إلى الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ، تم العثور على زيادة مماثلة في تعبير CD30 و CD30L و OX40 بمرور الوقت (الشكل التكميلي S1A). تمت زيادة CD30 و OX40 و OX40L بشكل كبير على خلايا Th17 (الشكل التكميلي S1D) بعد 14 يومًا من NTS مقارنة بالفئران السليمة. أيضًا ، تمت زيادة كل من CD30 و OX40 بشكل ملحوظ على خلايا CD8 T بدءًا من 12 ساعة بعد تحريض NTS مقارنة بالفئران السليمة (الشكل 1 ب). أظهرت الخلايا البائية ملف تعريف تعبير مشابهًا لخلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية (الشكل 1 ج). تم تنظيم OX40L بالفعل بعد 12 ساعة من NTS وظل انخفض بعد ذلك على الخلايا المتغصنة (الشكل 1 د). وبالمثل ، كان CD30L و OX40L أسفل CD11b بالإضافة إلى Ly6G بالإضافة إلى SSChineutrophils ، تم تنظيمهما على Ly6G-CD115 plus Ly6Ct و Ly6G-CD115Ly6C monocytes على مدار الوقت من NTS (ساق الشكل). على العدلات ، تميل الخلية التغصنية ووحيدات CD30 و OX40 إلى الزيادة في NTS (الشكل ld-g). تم التعبير عن CD30L بشكل متزايد على الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 2 بعد 12 ساعة من تحريض NTS ، كما تمت زيادة CD30L و OX40L بعد 14 يومًا من NTS (الشكل التكميلي S1B). زادت أعداد الكريات البيض التي تعبر عن CD30 و CD30L و OX40 و OX40L في NTS ، والتي كانت متوافقة مع النتائج على خلايا الطحال (الشكل التكميلي SIE-G).الكلىبعد 7 و 14 يومًا من NTS (الشكل التكميلي S1H). ومع ذلك ، تمت زيادة Cd30l mRNA بعد 7 و 14 يومًا من NTS ، بينما ظل تعبير Ox40 mRNA دون تغيير بعد 14 يومًا من NTS فيالكلى(الشكل التكميلي S1H).

إشارات CD30 و OX40 المتبادلة مطلوبة لتطوير النمط الظاهري NTS

وجدنا انخفاضًا في البول الزلالي و BUN في CD30OX الكلوي 40- / الفئران مقارنةً بعناصر التحكم في WT (الشكل 2 أ و ب) ، بينما بيلة الألبومين في الفئران المضغوطة 30- و OX 40- كانت مماثلة لفئران التحكم WT (الشكل 2 أ). كما لوحظ انخفاض كبير فيالكلىإيجابية PAS ، تكوين الهلال ، درجة الجلطة داخل اللمعة ، تكوين الزهر الأنبوبي ، ودرجة الإصابة الأنبوبية الحادة في CD30OX 40- / الفئران مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2 ج-ط). لم يتم تغيير كل هذه الميزات النسيجية بشكل كبير في الفئران المنفردة بالضربة القاضية مقارنة بعناصر تحكم WT (الشكل 2 ج و fi). وجدنا أعدادًا أقل بكثير من الضامة CD68 في الأطفال من الفئران CD30OX 40-- مقارنةً بعناصر تحكم WT (الشكل 2 ي). كان هناك اتجاه نحو انخفاض أعدادالكلى-تسلل CD68 بالإضافة إلى الضامة في القرص المضغوط 30- و OX 40- / - الفئران بالضربة القاضية المفردة (الشكل 2 ي). تم العثور على العدلات وخلايا CD8 T في أعداد منخفضة بشكل ملحوظ فيالكلىCD30OX 40- مقارنةً بعناصر تحكم WT الكلوية ، وأظهر القرص المضغوط 30-- وكذلك OX 40- عددًا أقل من العدلات وخلايا C8 بالإضافة إلى الخلايا التائية التي تسللت إلى الكلى (الشكل 2 ك و م). تم العثور على خلايا CD4 بالإضافة إلى T بأعداد أقل بكثير في التهاب الكليةالكلىمن CD30OX 40-- (الشكل 2l). كشف قياس التدفق الخلوي للكلى عن نتائج مماثلة لانخفاض أعداد الخلايا المتسللة (الشكل 2p و q). تجدر الإشارة إلى أن الفئران الساذجة المفردة والمزدوجة بالضربة القاضية لم تظهر أي اختلافات في تكوين كريات الدم البيضاء الطحالية مقارنةً بفئران WT الصحية ، عندما تم تقييم الخلايا التائية CD4 plus و CD8 plus ، والعدلات ، والوحيدات (الشكل التكميلي S2). تم تقليل تعبير Icos و Gitr فيالكلىمن الفئران CD30OX الكلوية 40- (الشكل التكميلي S3B). تم تقليل استجابات الخلايا البائية ، كما تم قياسها بواسطة IgG المضاد للفأر ، في الفئران CD30OX 40- مقارنة بعناصر تحكم WT (الشكل 2r).

لا يتم تقليل عدد خلايا CD4 بالإضافة إلى T في العقد الليمفاوية لـ CD30OX 40- / - الفئران

كشف قياس التدفق الخلوي عن عدم وجود فرق في مجموع العقدة الليمفاوية وخلوية الطحال (الشكل 2 ن و س) أو في عدد خلايا CD4 plus. ومن المثير للاهتمام أننا أيضًا لم نكتشف أي اختلافات في Tregs بين الفئران WT و CD30OX 40- (الشكل التكميلي S3). وتجدر الإشارة إلى أن السيتوكينات (TNF-d ، والإنترلوكين -6 ، والإنترفيرون- Y ، والإنترلوكين -17 ، والإنترلوكين -4 ، والإنترلوكين -10) تقاس في طاف للخلايا الطحالية المعزولة من لم تظهر الفئران WT و CD30OX 40- بعد 14 يومًا من NTS أي فرق (البيانات غير معروضة).

تفشل خلايا CD4 plus T التي تعاني من نقص في CD30 و OX40 في تعزيز NTS لدراسة دور تعبير CD30 و OX40 على خلايا CD4 plus في NTS ، تم حقن Rag 1- بخلايا CD4 plus (الشكل التكميلي S4) من طحال أي منهما WT أو CD30OX 40- / في الفئران. كان إجمالي عدد خلايا CD4 بالإضافة إلى الطحال ومعدلات الخلايا الميتة قابلة للمقارنة في اليوم 4 بعد تحريض NTS (الشكل التكميلي S5). على الرغم من أن الفئران Rag1 ~ التي تلقت خلايا CD4 plus من الفئران WT طورت بيلة ألبومين كبيرة و BUN بعد 14 يومًا من NTS ، فإن Rag 1- / الفئران التي أعيد تكوينها باستخدام خلايا CD4 plus من CD30OX40mice (الشكل 3 أ) لم تفعل ذلك. تم تقليل الضرر النسيجي بشكل كبير في الفئران Ragl 1- التي تلقت CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من CD30OX 40-- الفئران عند مقارنتها بخلايا WT ، على النحو الذي تحدده نقاط PAS ، ودرجة الهلال ، ودرجة الجلطة داخل اللمعة ، ودرجة الإصابة الأنبوبية الحادة ، والقوالب الأنبوبية (الشكل 3 ب-ز). تسلل الخلاياالكلىمن الفئران Ragl ، بما في ذلك خلايا CD4 plus ، و CD68 macrophages ، و Ly6G بالإضافة إلى العدلات ، تم أيضًا تقليلها بشكل كبير إذا لم تعبر خلايا CD4 plus المنقولة عن CD30 و OX40 (الشكل 3h-k). .1 و CD30OX 40- تم نقل الفئران التي تعبر عن CD90.2 بشكل متبني إلى Rag 1- / الفئران بنسبة 1: 1. هنا ، انخفضت الأرقام المطلقة لـ CD90.2 التي تعبر عن CD30OX 40-- CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية في الطحال مقارنةً بـ CD90.1 WT CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية (الشكل 4t و u) ، ولكن النسب المئوية لـ Ifn-Y (الشكل 4 أ) و ب) ، و l4 (الشكل 4 د و هـ) ، و Il17 (الشكل 4 ز و ح) كانت الخلايا المنتجة أعلى بشكل ملحوظ في CD90.2 معبرة عن خلايا خروج المغلوب. ومع ذلك ، في الوقت نفسه ، تم العثور على النسب المئوية المنخفضة لخلايا خروج المغلوب CD90.2 تحتوي على النمط الظاهري Th17 في الكلى مقارنة بخلايا CD90.1 WT (الشكل 4i) ، بينما تم العثور على العكس في الخلية المساعدة The و T 2 (Th2) ) خلايا فيالكلى(الشكل 4 ج و و). ومع ذلك ، فإن الأرقام المطلقة لخلايا خروج المغلوب CD90.2 المنقولة فيالكلىكانت أقل بكثير مقارنة بخلايا CD90.1 WT (البيانات غير معروضة).

يعطل عوز CD30 و OX40 هجرة Th17 من الأعضاء اللمفاوية الثانوية إلى الكلى

تمت زيادة مستقبلات CXC الكيميائية (CXCR) 3 (الشكل 4j و k) على خلايا CD90.2 CD30OX 40- / - مقارنة بخلايا CD90.1 WT ، بينما لم يتم الكشف عن اختلافات في تعبير CXCR6 (الشكل 4l و m) . الأهم من ذلك ، وجدنا انخفاضًا كبيرًا في مستقبلات CC chemokine (CCR) 6 على خلايا خروج المغلوب CD90.2 (الشكل 4n و o). في الخطوة التالية ، تم تحفيز الخلايا الساذجة CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية في المختبر في ظل ظروف التمايز Th1 أو Th17 ( الشكل التكميلي S6). لاحظنا وجود اتجاه نحو إمكانات أكبر لـ Th17 (الشكل 5 أ و) والتمايز Th1 (الشكل 5 ج و د) لخلايا CD4 بالإضافة إلى T الساذجة المعزولة من CD30OX 40- / - الفئران مقارنة مع الفئران WT في المختبر. بشكل ملحوظ ، تم العثور على خلايا CD4 plus T التي تعبر عن CD28 في زيادة كبيرة

الشكل 3|Rag 1- / الفئران التي تتلقى CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من CD30OX 40- / محمية من التهاب الكلية المصلي السام للكلية (NTS). Rag 1- / الفئران التي تتلقى خلايا CD4 T من أي من النوع البري (WT) ) أو CD30OX 40- تم تعريض الفئران لـ NTS ومتابعتها لمدة 14 يومًا (ن =6 إلى 7 فئران لكل مجموعة). (أ) تم تقييم مستويات البيلة الألبومينية ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN). ه) دورية تمثيلية حامض شيف (PAS) - ملطخةالكلىبالإضافة إلى (ب) درجات PAS ، (C) درجة الهلال ، (د) درجة الجلطة ، (t) القوالب الأنبوبية ، و (ز) درجة الإصابة الأنبوبية الحادة موضحة. (ح) عدد خلايا CD4T (i) CD68 بالإضافة إلى البلاعم ، و (ي) يتم عرض العدلات Ly6Gt وكذلك الصور التمثيلية (ك). التكبير الأصلي × 40 (PAS ، CD4 ، [تابع] الأرقام في الغدد الليمفاوية من CD30OX الكلوي 40- / الفئران مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2s).

الرجاء النقر هنا للجزء 2