الجزء 1: Cistanoside من Cistanche Herba يخفف الضرر التناسلي الذكري الناجم عن نقص الأكسجة عن طريق قمع الإجهاد التأكسدي
Mar 26, 2022
اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791
Fengqi Yan1 * ، Xiaoliang Dou1 * ، Guangfeng Zhu1 * ، Mingyuan Xia1 ، Yahui Liu3 ، Xiaozi Liu3 ، Guojun Wu2 ، HeWang1 ، Bo Zhang1 ، Qiuju Shao4 ، Yong Wang1
الملخص:تشير الدلائل المتزايدة إلى أن نقص الأكسجة هو سبب لعقم الذكور ، وقد يكون نقص الأكسجة مرتبطًا بالإجهاد التأكسدي (OS). Cistanoside (Cis) هو مركب جليكوسيد فينيليثانويد يمكن استخلاصه من CistanchesHerba وله وظائف بيولوجية مختلفة. هدفت هذه الدراسة إلى التحقيق في الآثار الوقائية لرابطات الدول المستقلة على الضرر الإنجابي الناجم عن نقص الأكسجة واستكشاف الآليات الأساسية المحددة. تم إنشاء نماذج تجريبية لنقص الأكسجة في الخلايا والحيوانات ، وتم تقييم التأثيرات الوقائية لأنواع فرعية مختلفة من رابطة الدول المستقلة على الجهاز التناسلي الذكري في المختبر وفي الجسم الحي. أشارت النتائج إلى أن نقص الأكسجة قلل بشكل كبير من قابلية خلايا GC {{0} من خلال توقف دورة الخلية وتفعيل موت الخلايا المبرمج ، والتي ارتبطت بزيادة نظام التشغيل. علاوة على ذلك ، أظهرت رابطة الدول المستقلة تأثيرات قوية مضادة للأكسدة في كل من المختبر والحي ، واستعادة أنشطة إنزيم مضادات الأكسدة بشكل كبير وتقليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) مع زيادة قابلية بقاء الخلية وتقليل التبطين. الأهم من ذلك ، أن الأنواع الفرعية لـ Cis (Cis-A و Cis-B و Cis-C و Cis-H) التي تمت دراستها هنا أظهرت جميعها تأثيرات معينة مضادة للأكسدة ، من بينها تأثيرات Cis-B كانت الأكثر أهمية. توضح هذه الدراسة أن رابطة الدول المستقلة تخفف بشكل ملحوظ الآثار الضارة لنظام التشغيل الناجم عن نقص الأكسجة من خلال التأثير على أنشطة إنزيم مضادات الأكسدة في الخصيتين وخلايا GC -1.
الكلمات المفتاحية: السيستانوزيد ، نقص الأكسجة ، عقم الذكور ، الإجهاد التأكسدي ، الحماية الإنجابية
مصنع cistanche الطازجة
مقدمة
حاليًا ، يعاني حوالي 48.5 مليون (15 بالمائة) من الأزواج في سن الإنجاب في جميع أنحاء العالم من العقم [1] ، من بينهم 40-50 في المائة من الحالات التي تُعزى إلى عقم الذكور [2] ، وهي حالة مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالبيئة ونمط الحياة عوامل. تشير الأدلة إلى أن حساسية الثدييات لانخفاض ضغط الأكسجين هي عامل مسبب لبعض أشكال العقم عند الذكور [3]. كما هو موضح في الدراسات السابقة ، تضعف عملية تكوين الحيوانات المنوية وتنخفض عند التعرض لنقص الأكسجة الناقص الضغط [4-7].
لاستكشاف الآلية الأساسية ، أظهرت الدراسات أن التعرض لنقص الأكسجة الناقص الضغط يزيد من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) [8 ، 9]. يلعب ROS دورًا مهمًا في الجهاز التناسلي للذكور. في المستويات المنخفضة ، هم مطلوبون لتكاثر الحيوانات المنوية ، تفاعل أكروسوم ، واندماج البويضات والحيوانات المنوية [10]. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الإفراط في استخدام أنواع الأكسجين التفاعلية إلى إحداث تلف في الحمض النووي للحيوانات المنوية / الميتوكوندريا وتلف بيروكسيد غشاء البلازما ، والذي يعد من العوامل المسببة الرئيسية لزيادة خطر الإصابة بالعقم عند الذكور [11 ، 12]. وبالتالي ، فإن تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية الناجم عن نقص الأكسجة قد يكون أحد أسباب العقم عند الذكور.
Cistanches Herba ، نبات طبي طفيلي معمر ، منتشر على نطاق واسع في المناطق القاحلة [13] ويستخدم على نطاق واسع نظرًا لأنشطته الدوائية [14-17]. من بين جميع المحتويات الفعالة لـ Cistanches Herba ، تم اعتبار PhGs كعنصر نشط رئيسي. حتى الآن ، تم عزل 34 PhGs من نباتات Cistanches [13]. حظي Cistanoside (Cis) ، وهو عامل PhG نشط معزول من Cistanches Herba ، باهتمام لما له من تأثيرات مضادة للأكسدة.
بالنظر إلى التأثيرات المضادة للأكسدة لـ Cis ودور ROS في عقم الذكور الناجم عن نقص الأكسجة ، يعتبر Cis مرشحًا محتملًا للأدوية لعلاج عقم الذكور الناجم عن نقص الأكسجة. ومع ذلك ، فقد تناولت تقارير قليلة التأثيرات المضادة للأكسدة لرابطة الدول المستقلة المستخرجة من Cistanches Herba في علاج عقم الذكور الناجم عن نقص الأكسجة أو مسارات الإشارات المعنية. في هذه الدراسة ، تم بناء نماذج تجريبية لنقص الأكسجة في المختبر وفي الجسم الحي وتم تقييم مكونات التأثيرات لمختلف Ciswere.
يحتوي Cistanche على ملفتأثير الإنتاج التناسلي.
المواد والأساليب
ثقافة الخلية والكاشف
تم شراء خط خلية الحيوانات المنوية للفأر GC -1 spg (GC -1) من American TypeCulture Collection (ATCC) وتم تربيته في DMEM (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنينية ، و 1 بالمائة L- الجلوتامين (100 ملم) ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة في حاضنة مرطبة مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. تم شراء Cis (Cis-A، B، C، H) من شركة تشنغدو جيليبو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (الصين).
فحص جدوى الخلية
تم اختبار صلاحية الخلية بواسطة اختبار مجموعة عد الخلايا {0}} (CCK -8). باختصار ، تم زرع خلايا GC -1 في أطباق البئر 96- عند 1.5 × 1 0 3 لكل بئر وتم تربيتها عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة (20 في المائة ، 15 في المائة ، 10 في المائة ، 5 في المائة) من الأكسجين أو تركيزات مختلفة (2 ميكرومتر ، 0.2 ميكرومتر ، 0.02 ميكرومتر) من رابطة الدول المستقلة (Cis-A ، Cis-B ، Cis-C ، Cis-H) للوقت المطلوب. بعد ذلك ، تم إهمال المادة الطافية ، وتم اكتشاف قابليات الخلية باستخدام مجموعة CCK -8 (DojindoJapan). تم قياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (BioRad USA). أخيرًا ، تم حساب قابليات الخلية وفقًا للصيغة التالية:
صلاحية الخلية=(مجموعة OD التجريبية - مجموعة ODblank) / (مجموعة ODcontrol - مجموعة ODblank) × 100 بالمائة.
تحليل لطخة غربية
تم تجانس الخلايا أو الأنسجة المحصودة في عازلة inRIPA لاستخراج البروتينات (RIPA Beyotimeالصين؛ كوكتيل روش سويسرا). تم جمع المواد الطافية ، وتم اختبار تركيز البروتينات بطريقة BCA (بايوتيم). تم فصل ما يقرب من 40 ميكروغرام من البروتينات المستخرجة من كل عينة بواسطة SDS-PAGE ونقلها كهربائيًا على غشاء مرشح النيتروسليلوز (NC) (BeyotimeChina). تم حظر أغشية مرشح NC باستخدام 5 في المائة من الحليب الخالي من الدسم لمدة 1.5 ساعة واحتضانها بأجسام مضادة محددة (anti-PARP 1: 1000 ، anti-Caspase -3 1: 1000 ، anti-Bcl -2 1: 1000 ، anti-Bax1: 1000 ، anti-GAPDH 1: 1000 ؛ تم شراء جميع الأجسام المضادة من Cell Signaling Technology ، الولايات المتحدة الأمريكية) طوال الليل عند 4 درجات. بعد ذلك ، تم تحضين جميع أغشية NC مع الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الفجل الحار لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة وتم تصويرها باستخدام نظام التصوير (Tannon ، الصين).
مكملات مسحوق استخراج cistanche
كشف دورة الخلية
تم إجراء فحص التدفق الخلوي (FCM) لتحليل دورة الخلية. تم معالجة الخلايا تحت ظروف مختلفة لمدة 72 ساعة وحصادها. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام PBS ، وتثبيتها في 75 بالمائة من الإيثانول ، وتلطيخها بالبروبيديوميوديد (PI). لكل عينة ، تم جمع 1 × 104 خلية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (FACSCalibur ، BD Biosciences). بعد ذلك ، تم حساب نسبة خلايا الطور G1 / S / G2 ومؤشر الانتشار [الطور (S زائد G2) / الطور (G1 زائد S زائد G2) × 100 بالمائة].
تلطيخ كي -67
تم استنبات الخلايا في طبق متحد البؤر وعولجت بنقص الأكسجة أو أنواع فرعية مختلفة من رابطة الدول المستقلة لمدة 72 ساعة. بعد تثبيت جميع الخلايا التي تحتوي على 4 في المائة من بارافورمالدهيد ، تم تحضينها بمضاد للجسم -67 المضاد لـ Ki (1: 2 0 0 ، تقنية تشوير الخلايا). بعد ذلك ، تم تحضين جميع الخلايا باستخدام الجسم المضاد IgG المترافق المضاد للأرنب CY -3- (1: 200 ، Boster ، الصين) ومحلول DAPI (1.0 ميكروغرام / مل ، Beyotime). لوحظ الإسفار باستخدام مجهر متحد البؤر Fluoview FV1000 (أوليمبوس ، اليابان).
كشف ROS
تم تقديم FCM لقياس مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام DCFH-DA. تم زرع الخلايا المعلقة في 6- أطباق جيدة وتعريضها لمعاملة مختلفة. بعد 72 ساعة من العلاج ، تم تعليق الخلايا في DMEM الخالي من المصل مع 10 ميكرومتر DCFH-DA (Beyotime). تم تحديد محتويات ROS عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية على نظام Beckman Coulter Flow CytometrySystem بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 525 نانومتر [18].
تحديد بيروكسيد الدهون (LPO)
تم إجراء فحص المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) للكشف عن LPO. تم إجراء جميع خطوات التشغيل وفقًا للتعليمات (Sigma USA). تم حساب التركيزات باستخدام معامل الانقراض المولي 1.56 × 105 / (م · سم) ، والذي تم الحصول عليه باستخدام malondialdehyde كمعيار. يتم التعبير عن النتائج في صورة nmol من مكافئات MDA / ملغ من البروتين.
تحديد نشاط الانزيم
تم اختبار أنشطة الإنزيم باستخدام مجموعات الفحص بما في ذلك اختزال الجلوتاثيون (GR) والجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx) وديسموتاز الفائق (SOD). تم تنفيذ جميع خطوات التشغيل وفقًا للتعليمات المقدمة (معهد نان جينغ جيان تشينغ للهندسة الحيوية في الصين).
الحيوانات والبروتوكول التجريبي
تم الحصول على ذكر فئران Wistar البالغة (180-220 جم ، 8 ث) من مركز الحيوانات التابع للجامعة الطبية العسكرية الرابعة ، شيان ، الصين. تم الحصول على إذن لاستخدام الحيوانات من لجنة الأخلاقيات بالجامعة (الرقم المرجعي) : 20190506). تم إجراء التجربة الحيوانية وفقًا لإرشادات الجامعة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر.
سمح لجميع الفئران بالتكيف لمدة أسبوع تقريبًا قبل بدء التجربة. بعد التأقلم ، تم توزيع الفئران عشوائياً إلى 6 مجموعات مع 5 حيوانات في كل مجموعة. تم تربية الفئران في المجموعة الضابطة تحت الضغط الطبيعي (PO2: 20٪ ؛ ضغط الهواء: 101.3 كيلو باسكال) ، بينما تمت تربية الفئران في النموذج ومجموعات Cistreated في غرفة أكسجين منخفضة الضغط (ضغط داخلي 61.6 كيلو باسكال ، أي ما يعادل ارتفاع 4000 متر فوق مستوى سطح البحر ؛ PO2: 14.55 بالمائة) لمحاكاة بيئة منخفضة الأكسجين على ارتفاعات عالية. كان لجميع الفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء في أقفاص بلاستيكية عند 22 ± 2 درجة وظروف الرطوبة مع 12- دورة إضاءة / مظلمة تلقائية. ظلت الفئران في النموذج والمجموعات المعالجة في رابطة الدول المستقلة تحت ظروف منخفضة الضغط ولكن تم نقلها في ظروف ضغط طن كل 96 ساعة ، وفي ذلك الوقت تم توفير الطعام والماء لهم وتنظيف الأقفاص. كانت مدة الانتقال من الضغط الخفيف إلى الضغط الخفيف حوالي 2 ساعة. عولجت جميع المجموعات العلاجية بالـ CIS المقابل (8 مجم / كجم / يوم) عن طريق gavagag عن طريق الفم لمدة 8 أسابيع ، بينما عولجت الجرذان الضابطة والنموذج بكمية متساوية من الماء.
بعد 8 أسابيع ، تم التضحية بالفئران تحت التخدير. تم فصل الخصيتين والبربخ والحويصلات المنوية ووزنها ، وتم حساب المؤشر العضوي وفقًا للصيغة التالية: (وزن العضو / وزن الحيوان) × 100 بالمائة. بعد ذلك ، تم جمع الحيوانات المنوية في البربخ ، وتم اختبار حركتها ونشاط الإنزيم الأكروسوميني. وبالمثل ، تم جمع أنسجة الخصية للدراسات النسيجية و ROS و LPO وكشف نشاط إنزيم مضادات الأكسدة.
تقييم معدل الحيوانات المنوية الحية
تم شق البربخ بالمقص الجراحي ، وتم تحضير تعليق الحيوانات المنوية في محلول ملحي عادي. لتقييم معدل الحيوانات المنوية الحية ، تم خلط 5 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية بعناية مع حجم متساوٍ من يوزين - يستين. ثم تم عد الحيوانات المنوية تحت المجهر. تم تقييم معدلات الحيوانات المنوية الحية عن طريق حساب كل من الحيوانات المنوية الملطخة (الميتة) وغير الملوثة (الحيوانات المنوية الحية).
مسحوق Cistanche tubulosaيزيد منمعدلات الحيوانات المنوية الحية.
لمزيد من المعلومات، يرجى الضغط هنا.
تحديد نشاط إنزيم الحيوانات المنوية
تم استخدام مقايسة نشاط إنزيم الحيوانات المنوية لتقييم نشاط إنزيم الحيوانات المنوية [19]. تم حساب النتائج في كل مجموعة باستخدام الصيغة التالية: نشاط إنزيم Acrosome (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank group) / (247.5 × 10) × 106.
تحليل احصائي
يتم التعبير عن جميع البيانات الكمية على أنها متوسط ± SD وتم تحليلها باستخدام برنامج SPSS 22. 0. تم استخدام اختبار t للطالب المستقل لمقارنة البيانات بين مجموعتين. * ص< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">