تنشيط التكميل بوساطة البنتراكسين -3- في نموذج الخنازير للإقفار الكلوي / إصابة إعادة التروية

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

كيارا ديفيلا وآخرون

نبذة مختصرة

البنتراكسينات هي عائلة من جزيئات التعرف على الأنماط المحفوظة تطوريًا ولها أدوار محورية في المناعة والالتهابات الفطرية ، مثل تطهير مسببات الأمراض أثناء الالتهابات البكتيرية والفيروسية. على وجه الخصوص ، ثبت أن البنتراكسين 3 الطويل (PTX3) ينظم العديد من جوانب التهاب الأوعية الدموية والأنسجة أثناء زرع الأعضاء الصلبة.

بحثت دراستنا في دور PTX3 كمحرك محتمل لتفعيل التكميل في نموذج الخنازير لإصابة نقص التروية الكلوية / ضخه (I / R). لقد أظهرنا أن رواسب PTX3 المبكرة الناتجة عن الإصابة I / R عند مستويات الشعيرات الدموية حول الأنبوب والكبيبي. كشف الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر عن ترسبات PTX3 في التوطين المشترك مع CD31 بالإضافة إلى الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط PTX3 مع تسلل الضامة (CD163) ، والخلايا التغصنية (SWC3a) ، والخلايا الليفية العضلية (FSP1). على وجه الخصوص ، أظهرنا تنشيطًا مهمًا لـ PTX 3- بوساطة المسارات الكلاسيكية (C1q بوساطة) والليكتين (بوساطة MBL) للمكملات. ومن المثير للاهتمام ، أن رواسب PTX3 المترجمة مع تنشيط مجمع التكملة الطرفية (C5b -9) على الخلايا البطانية ، مما يشير إلى أن تنشيط تكملة PTX 3- حدث بشكل رئيسي على مستوى الأوعية الكلوية. في الختام ، تشير هذه البيانات إلى أن PTX3 قد يكون هدفًا علاجيًا محتملاً لمنع إصابة I / R التي يسببها التكميلي.

مراسلات ل:جوزيبي كاستيلانو

الكلمات الدالة:إصابة نقص التروية / ضخه ، نظام مكمل ، بنتراكسين 3 ،الكلى، المسار الكلاسيكي

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

المقدمة

تمثل إصابة نقص التروية - ضخه (I / R) السبب الرئيسي للحادةالكلىإصابةبعد الزرع ويتميز بتنشيط كبير للنظام التكميلي [1 ، 2]. في هذا السيناريو ، تلعب الخلايا البطانية (EC) دورًا مهمًا في الإصلاح غير القادر على التكيف بعد I / R ، مما يؤدي إلى تليف مبكر عن طريق الانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة (EndMT) [3]. خلال مرحلة ضخه ، يُنظم التكميل عمليات المناعة والالتهابات ، مما يساهم في الإصابة بأمراض المناعة والالتهابات المختلفة [2-5]. يتم تمثيل المكونات الأساسية الأخرى للذراع الخلطي للجهاز المناعي الفطري بواسطة البنتراكسينات التي يعتقد أنها تلعب دورًا محوريًا في بيولوجيا الأوعية الدموية [6].

البنتراكسينات هي عائلة من البروتينات المتعددة الذوبان [6] والتي يتم تصنيفها إلى عائلات قصيرة وطويلة بناءً على بنيتها [7]. هذه البروتينات المحفوظة تطوريًا هي مؤثرات في المرحلة الحادة ، تعمل كمستشعرات لبدء الالتهاب وتزيد بسرعة في البلازما أثناء العدوى [8]. البنتراكسين 3 الطويل (PTX3) عبارة عن جزيء قابل للذوبان للتعرف على الأنماط وله دور حاسم في الحماية المناعية الفطرية ويمكنه تنشيط النظام التكميلي [9-11].

على وجه الخصوص ، تسبب PTX3 في تنشيط المسار الكلاسيكي ومسار القراءة من خلال الارتباط بـ C1q و MBL و Ficolin -2 وهو قادر على التأثير على المسار البديل عبر CFH [10-12].

على عكس البنتراكسينات الأخرى التي ينتجها الكبد في مجرى الدم (مثل CRP) ، يمكن إطلاق PTX3 بواسطة الخلايا المقيمة داخل موقع الالتهاب ، على سبيل المثال من الخلايا البلعمية وحيدة النواة والخلايا المتغصنة والأرومات الليفية و EC [9] التي تعمل بطريقة paracrine [13]. يتم تخزين PTX3 أيضًا في شكل جاهز في العدلات ، المترجمة في حبيبات معينة ، ويتم إفرازها استجابة للتعرف على الشقوق الميكروبية [14]. في EC ، يتم تحفيز التعبير عن PTX3 بسهولة عن طريق TNF- و IL -1 ، مما يعطي انتقالًا من النمط الظاهري الهادئ والمضاد للالتهابات ، إلى حالة محفزة للتخثر والالتهاب ، وبالتالي ينظم بقوة وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة [7 ، 8 ]. لهذا السبب ، تم وصف مستويات PTX3 على أنهامزمنالكلىمرض، ارتبطت الزيادة في مستويات البروتين في PTX3 بانخفاض GFR ومضاعفات القلب والأوعية الدموية ، ومع ذلك ، لا يزال هناك القليل معروفًا عن دور PTX3 في الإعدادات المبكرة مثل I / R الحاد الناجم عن I / Rالكلىإصابة [15 ، 16].

إن دور PTX3 في أمراض الالتهاب الكلوي ثنائي التكافؤ ، فمن جانب يمكن للبروتين تنشيط المسارات الكلاسيكية والليكتينية التي تعزز الالتهاب الأولي والإصابة [10-12]. على الجانب الآخر ، خفّف المجال الطرفي N لتفعيل التكملة المعدلة PTX3 من تجنيد الكريات البيض الموهن وأعاق التليف الخلالي في الإصابة الكلوية الحادة التي تعزز إصلاح الأنسجة [17-20].

المكمل يلعب دورًا محوريًا في الفيزيولوجيا المرضية للحادة الناجمة عن الإصابة I / Rالكلىإصابة[21 ، 22]. في نموذج الخنازير لإصابة I / R الكلوية ، أظهرنا الدور المحوري لتنشيط نظام التكملة في تحفيز EndMT والتليف المبكر ، مع إشراك كل من المسارات الكلاسيكية والليكتين [23]. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن التثبيط العلاجي لهذه المسارات التكميلية عن طريق المؤتلف C 1- INH (rhC1INH) أدى إلى انخفاض كبير في ترسب المكمل ، مع انخفاض تجنيد الخلايا الالتهابية المتسللة والضرر الخلالي الأنبوبي [23]. تم تأكيد هذه النتائج أيضًا بواسطة Delpech PO et al [24]؛ تم تقييم تعديل هام في الترسيب الكبيبي والأنبوبي C1q و MASP و C4d بعد 30 دقيقة بعد إعادة التروية مما يشير إلى الدور المركزي لـ C 1- INH لمواجهة المسارات الكلاسيكية والليكتين.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في التورط المحتمل لـ PTX3 في التوسط في تنشيط التكميل المبكر في إصابة I / R الكلوية ، والتي تميز المصادر الخلوية المختلفة لـ PTX3.

النتائج

يتم التعبير عن PTX3 بواسطة الخلايا البطانية وخلايا التسلل المناعي في نموذج الخنازير لإصابة I / R

أولاً ، قمنا بالتحقيق في وجود PTX3 في نموذج خنازير لإصابة كلوية دافئة ناجمة عن I / R. لاحظنا رواسب PTX3 محدودة للغاية في الأنسجة الطبيعية (الشكل 1 أ). تسببت إصابة I / R في ترسب منتشر لـ PTX3 بالفعل عند 15 دقيقة بعد ضخه (الشكل 1 ب ، 1 ج) في المنطقة الأنبوبية الخلالي (الشكل 1 هـ) ، في الشعيرات الدموية حول الأنبوب (الشكل 1 د ؛ السهم) ، وفي المستويات الكبيبية (الشكل 1 د). كانت رواسب PTX3 قابلة للاكتشاف بعد ساعة واحدة من ضخه على مستوى الشعيرات الدموية حول الأنبوب (الشكل 1G). في عملنا السابق [23] أظهرنا أن السمات الرئيسية لإصابة I / R هي موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية الأنبوبية وتجنيد الخلايا الالتهابية المتسللة مثل الخلايا الأحادية والخلايا المتغصنة والخلايا الليمفاوية. ومع ذلك ، من خلال التقييم النسيجي الروتيني (الشكل التكميلي 1) ، أوضحنا أن 30 دقيقة من نقص التروية الدافئ متبوعًا بـ 15 دقيقة من التلف الخلالي المبكر للنبيبات الناجم عن ضخه ، والذي يتميز بالاحتقان الشعري الأكبر والفجوة السيتوبلازمية البؤرية لظهارة النبيبات الكلوية ، مقارنةً بالقاعدة القاعدية. حالة.

لمزيد من توصيف التوطين الخلوي لرواسب PTX3 وتقييم تأثيره المحتمل في تعديل الاستجابة الالتهابية والإصابة ، أجرينا التحليل المجهري المزدوج المناعي والمتحد البؤر. تم الكشف عن تعبير البروتين PTX3 في معظم EC عند مستويات الحبيبي (الشكل 2 أ) والكبيبي (الشكل 2 ب) الشعرية ، بعد 15 دقيقة من ضخه.

من المعروف أن إصابة I / R تتميز بتنشيط متزايد للاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية ، بما في ذلك تهريب الخلايا الالتهابية إلى العضو المصاب الذي يؤدي إلى تفاقم الإصابة عبر الخلايا المناعية والجهاز التكميلي [25]. في نموذج الخنازير الخاص بنا ، لاحظنا أيضًا ، بالفعل بعد 15 دقيقة من ضخه ، ارتشاح التهابي كثيف يتكون بشكل كبير من الخلايا الضامة والخلايا المتغصنة في المنطقة الخلالية الأنبوبية. وجدنا أن كل من هذه الخلايا التي تقدم المستضد تميزت بزيادة تعبير PTX3 عند مقارنتها بـ T 0 نظرًا لأننا لاحظنا زيادة في عدد CD163 plus / PTX3 plus (الشكل 2E ، 2F ​​، 2K) و SWC3a plus / PTX3 plus (الشكل 2G ، 2H ، 2L) الخلايا في المستويات الخلالية نبيب في T15.

يمكن أن يساهم تعبير PTX3 في EndMT في إصابة I / R.

في الملاحظات السابقة ، أظهرنا أن إصابة I / R كانت مسؤولة عن EndMT [26 ، 27] ، والتي تتميز باكتساب النمط الظاهري اللحمة المتوسطة بواسطة EC مع فقدان علامات بطانية معينة واكتساب علامات اللحمة المتوسطة ، مثل الخلايا الليفية الخاصة البروتين 1 (FSP -1) والكادرين العصبي (N-cadherin) وأكتين العضلات الملساء ألفا (alpha-SMA). وبالتالي ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان تعبير PTX3 بواسطة EC يمكن أن يؤثر على هذه العملية. كما هو متوقع ، عندما بحثنا في تعبير alpha-SMA ، كعلامات للخلايا الليفية العضلية المنشطة ، لم نجد أي توطين مشترك بين alpha-SMA و PTX3 (الشكل 2C ، 2D). على العكس من ذلك ، لاحظنا زيادة في tubulointerstitial FSP1 plus / PTX3 بالإضافة إلى الخلايا الليفية العضلية طوال فترة المراقبة (الشكل 2K - 2M).

ترتبط رواسب PTX3 بتنشيط النظام التكميلي

أخيرًا ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت رواسب PTX3 مرتبطة بتنشيط التكملة. في الواقع ، كما هو الحال مع المكونات الأخرى لعائلة البنتراكسين ، يمكن لـ PTX3 تنظيم تنشيط المسار التكميلي الكلاسيكي [7]. لتحديد العلاقة بين PTX3 وتنشيط التكملة ، أجرينا تألق مناعي مزدوج التسمية لتقييم تعبير PTX3 والطرف. تكملة معقد ، C5b -9 ، باستخدام جسم مضاد موجه ضد C {8}} neoepitope. لاحظنا توطينًا كبيرًا للودائع PTX3 و C5b -9 (الشكل 3 أ ، 3 ب). تم توطين المركب الطرفي التكميلي على المستوى المحيط بالنبيبات وكذلك داخل الشعيرات الدموية المحيطة بالنبيبات جنبًا إلى جنب مع طبقة الخلايا البطانية ، كما أوضحنا سابقًا [23 ، 28]. نظرًا لأنه يمكن لـ PTX3 تنشيط نظام التكميل من خلال المسارين الكلاسيكيين والليكتين ، فقد قمنا بتقييم ترسب C1q و MBL في الحمة الكلوية. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على ودائع C1q (الشكل 3E ، 3F) و MBL (الشكل 3C ، 3D) بشكل أساسي على المستوى الخلالي والشعري (الشكل 3C من خلال 3F) ، كما هو موضح سابقًا [23] وتم تنسيقه مع رواسب PTX3.

يتداخل مثبط 1- C مع ارتباط PTX3 بالخلايا البطانية

في عملنا السابق [23] أوضحنا أن إدارة مثبط C 1- أدت إلى انخفاض كبير في ترسب المكمل ، مع انخفاض تجنيد تسلل الخلايا الالتهابية والضرر الأنبوبي الخلالي. لذلك ، قمنا بفحص مستوى تعبير PTX3 في الحيوانات المعالجة بـ rhC 1- INH. وجدنا أن ضخ مثبط C 1- قلل من رواسب PTX3 في الشعيرات الدموية حول الأنبوب والمستوى الخلالي بعد 15 دقيقة بعد ضخه (الشكل 4 أ).

علاوة على ذلك ، لدعم الفرضية القائلة بأن تقليل رواسب PTX3 في الحيوانات المعالجة بـ rhC 1- كان مرتبطًا بتثبيط الضرر البطاني ، أجرينا تجارب في المختبر وقمنا بتقييم الارتباط بـ RhC 1- INH و PTX3 على مثقف المفوضية الأوروبية في ظل الظروف العادية أو في وجود الإجهاد الخلوي (الشكل 4 ب). أظهر تحليل FACS أن EC في الظروف العادية لم تربط كلا من rhC 1- INH و PTX3. وفقًا لدراستنا السابقة [26] ، لاحظنا زيادة الارتباط الخلوي لـ rhC 1- INH على H2O 2- محفزًا EC مقارنة بالظروف القاعدية. علاوة على ذلك ، في حالة عدم وجود rhC 1- INH ، يمكن لـ PTX3 ربط EC المنشط. ومن المثير للاهتمام ، أنه عندما تم تحضين H2O 2- تنشيط EC باستخدام PTX3 و rhC 1- INH ، لاحظنا أن C1INH كانت قادرة على حماية EC عند منع ربط PTX3.

نقاش

في هذه الدراسة ، أظهرنا ترسب PTX3 في المرحلة المبكرة من إصابة I / R الكلوية ومساهمتها المحتملة في تطوير EndMT. ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا أن تنشيط التكملة الوسيطة PTX 3- يحدث بشكل رئيسي على مستوى الأوعية الدموية ، بالتشارك مع C1q و MBL ، جزيئات التعرف على المسارات الكلاسيكية والليكتينية لسلسلة التكملة.

تؤدي إصابة I / R إلى استجابة التهابية ملحوظة تتميز بتنشيط المكمل ، والجذور الخالية من الأكسجين ، وإنتاج السيتوكينات المسببة للالتهابات ، مما يؤدي إلى تنشيط البطانة الوعائية والكريات البيض المحيطية [29 ، 30]. أثناء إصابة I / R ، يؤدي تنشيط التكميل إلى ترسيب المكونات المكمل على الغشاء السطحي للمفاصل الأوروبي التالف والمختل وظيفيًا ، مع التوليد المتزامن للسموم المفرطة وتضخيم العملية الالتهابية [31]. أثناء الالتهاب ، يزيد PTX3 بسرعة ويمكن أن يلعب دورًا مركزيًا في تعديل الاستجابة البطانية. في الواقع ، تم الإشارة إلى PTX3 كعلامة بيولوجية محتملة لاختلال وظائف بطانة الأوعية الدموية في العديد من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض المزمنة.الكلىالمرض وتسمم الحمل والعديد من أمراض الأوعية الدموية [7 ، 16 ، 17 ، 32]. أثبتنا أيضًا أن PTX3 متورط في مضاعفات الأوعية الدموية الأخرى مثل فشل الناسور الشرياني الوريدي في مرضى غسيل الكلى [33]. تشير هذه الملاحظات إلى أن PTX3 يمكن أن يكون جسرًا بين الاستجابة الالتهابية والخلل البطاني [34]. تمشيا مع هذه الدراسات ، لاحظنا رواسب PTX3 على مستوى بطاني بالفعل بعد 15 دقيقة بعد ضخه (الشكل 2 أ ، 2 ب). أظهرت نتائجنا أيضًا أنه في المرحلة المبكرة من إصابة I / R ، تم تحديد موقع PTX3 باستخدام علامة الأرومة الليفية العضلية ، FSP -1 (الشكل 2I ، 2J) ولكن ليس باستخدام alpha-SMA ، وهي علامة يتم التعبير عنها بواسطة الأرومة الليفية العضلية المنشطة (الشكل 2C ، 2D). مجتمعة ، يمكن أن تشير هذه البيانات إلى أن الخلل البطاني وعملية EndMT [35] ، التي لوحظت في حيوانات I / R [26] ، حدثت أولاً في EC معبرة عن PTX3.

الارتباط بين PTX3 والخلايا الالتهابية معترف به على نطاق واسع. في هذه الورقة ، ركزنا بشكل خاص على التأثيرات الكامنة لـ PTX3 في التسلل الخلالي للخلايا البيضاء التي تعد مصدرًا رئيسيًا لـ PTX3 [36]. على وجه الخصوص ، وجدنا الضامة والخلايا التغصنية ، بعد 15 دقيقة بعد ضخه ، معبرة عن مستويات أعلى من PTX3 (الشكل 2E حتى 2H). تتوافق هذه البيانات مع مجموعة الأدلة المتزايدة التي تشير إلى دور ذي صلة للمناعة الفطرية في التوسط في الضرر المبكر في إصابة I / R [23]. يؤدي التنشيط المبكر للمكملات في الأنسجة الكلوية بعد إصابة I / R إلى توليد العديد من الوسطاء الالتهابيين الذين يزيدون من تجنيد الخلايا المناعية [21 ، 23 ، 37 ، 38]. حددت الدراسات الحديثة PTX3 كأحد المكونات الرئيسية للشبكة التي تنظم الاستجابة الالتهابية الناتجة عن إصابة I / R [39]. في نماذج تجريبية مختلفة لإصابة I / R ، يمكن لـ PTX3 ممارسة أدوار مزدوجة معاكسة على أنسجة معينة [40 ، 41]. يرتبط الإنتاج المبكر لـ PTX3 بالضرر الكلوي لأنه يحفز التعبير المبكر عن جزيئات الالتصاق البطاني والكيموكينات التي تسرع الاستجابة الالتهابية غير القادرة على التكيف الموضعي.

على العكس من ذلك ، فإن الإنتاج المحلي المطول لـ PTX3 يمنع التهاب الأعضاء المفرط والخلل الوظيفي [41].

PTX3 هو مُشَكِّل سلسلة تكميلية [9 ، 42] ؛ هذا يتفق مع الخصائص متعددة الاتجاهات لـ PTX3 مما يشير إلى الدور المزدوج لـ PTX3 كمعدل أو مكبر للاستجابة المناعية الفطرية [39]. في البداية ، يقوم PTX3 بتنشيط التكملة عن طريق الربط C1q و MBL [43] ؛ ومع ذلك ، يجب أن يقتصر الالتهاب المبكر المتزايد على المنطقة المستهدفة. لذلك ، يمكن أن يقلل PTX3 ، من خلال تجنيد العامل H أو تثبيط تكوين الأوعية ، الاستجابة الالتهابية والتفعيل التكميلي الذي يحافظ على الحمة الكلوية من التلف الالتهابي [43]. على الرغم من أن التنشيط التكميلي في I / R في القوارض موضعي بشكل أساسي على المستوى الأنبوبي [44] ، خلال مرحلة إعادة ضخ الدم ، فإن البطانة هي الهدف الأساسي لمختلف العوامل المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك الوسطاء التكميليون [2]. لقد أوضحنا سابقًا أنه في نموذج الخنازير لإصابة I / R وكذلك في مرضى DGF ، يحدث تنشيط النظام التكميلي في المرحلة المبكرة ، على الشعيرات الدموية المحيطة بالنبيبات ، وداخل النسيج الخلالي ، وعلى البطانة الكبيبية [23]. أظهرت بياناتنا توطينًا مشتركًا واضحًا لودائع C5b -9 على PTX3 بالإضافة إلى EC بعد 15 دقيقة بعد ضخه (الشكل 3 أ ، 3 ب). لذلك ، يبدو أن البطانة الكلوية هي الموقع السائد لـ PTX 3- التنشيط التكميلي بوساطة PTX في المرحلة المبكرة من إصابة I / R في كل من الإعدادات قبل السريرية والسريرية.

تم وصف تفاعل البنتراكسينات مع C1q ودوره في تنشيط المسار التكميلي الكلاسيكي بشكل جيد [45-47]. في سياق الاستجابات المناعية الفطرية ، يمكن لـ PTX3 ربط مكونات تكميلية مختلفة وتعديل تنشيط المتمم [43 ، 48]. ينشط PTX3 تكملة ربط C1q [49]. أظهرت نتائجنا في النموذج الحيواني بوضوح أن PTX3 قد يتوسط في تنشيط المسار الكلاسيكي من خلال التفاعل مع C1q (الشكل 3E ، 3F). علاوة على ذلك ، يعدل PTX3 أيضًا مسار المحاضرة للمكمل ، كما هو موضح في الشكل 3 ج ، ثلاثي الأبعاد. تربط MBL PTX3 عبر مجالها الشبيه بالكولاجين [45] وتقوم مجمعات MBL / PTX3 بتجنيد C1q واستنباط ترسيب C3 و C4 على أسطح الخلايا المستهدفة.

إجمالاً ، تشير هذه النتائج إلى الدور المركزي لـ PTX3 في التوسطالكلىالضرر في إصابة I / R ، والذي يمكن أن يكون له آثار مهمة على العلاجات المكملة الموجهة في إصابة I / R الكلوية.

في دراستنا السابقة [26] ، بحثنا في مشاركة المكمل في التوسط في تنشيط EC باستخدام شكل مؤتلف من C 1- INH ، وهو مثبط قوي للبروتياز في المسارات التكميلية الكلاسيكية والكتينية (C1r ، C1 s ، و MASP2). في نفس النموذج الحيواني ، أظهرنا (الشكل 4 أ) أن التثبيط العلاجي لكلا المسارين بواسطة rhC1INH قلل من رواسب PTX3 في الشعيرات الدموية المحيطة بالنبيبات والمستوى الخلالي بعد 15 دقيقة بعد ضخه. هذه البيانات التي تم تأكيدها من خلال النتائج المختبرية على EC (الشكل 4 ب) ، أدت بنا إلى افتراض أن rhC1INH قد تحمي EC التالف عند حظر ربط PTX3. في الأدبيات ، هناك دليل على ارتباط C 1- INH بجزيئات الالتصاق البطانية ، المعبر عنها في البطانة النشطة ، والتي تسمى سيليكتينز ، على وجه الخصوص P و E-selectins [50 ، 51]. هذا الارتباط على EC يمكن أن يتداخل مع تفاعل الخلايا البيضاء البطانية أثناء الالتهاب ويمثل آلية أخرى مهمة مضادة للالتهابات [50 ، 51]. لذلك ، افترضنا أن rh-C1INH يمكن أن يربط EC المنشط ويتوسط التنظيم المحلي لتنشيط التكملة والعملية الالتهابية. في دراساتنا السابقة ، أظهرنا تورط المكمل في إصابة I / R وأمراض الكلى المناعية الأخرى [38 ، 52-54]. يمكن أن يكون لآليات تنشيط التكملة في هذا النموذج الحيواني آثار مهمة لتفسير البيانات المتوقعة في البيئة البشرية. لتطوير تدخلات علاجية بنجاح تستهدف تنشيط التكملة [36 ، 54] ، من الضروري إثبات صحة بيانات الخنازير بالنسبة لما يحدث في الظروف السريرية. نظرًا لأن هذا البحث يقتصر على الدراسات القائمة على الملاحظة ، فهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتحديد الآليات المترابطة بين PTX3 والمكملات التي قد تسلط الضوء على استراتيجيات علاجية جديدة. من النتائج المذكورة أعلاه ، تدعم بياناتنا الفرضية القائلة بأن PTX3 قد تنظم جوانب متعددة من إصابة I / R بوساطة تكميلية وبالتالي تمثل هدفًا علاجيًا محتملاً.

المواد والأساليب

نموذج إصابة الخنزير الكلوي I / R

تم تطوير النموذج الحيواني للإصابة الكلوية I / R كما هو موصوف سابقًا [23]. بعد موافقة اللجنة الأخلاقية في وزارة الصحة ، خضعت 4- أنثى الخنازير البيضاء الكبيرة البالغة من العمر شهرًا (ن =8 ، ن =4 للمجموعة ، 2 0 كجم) إجراء جراحي تجريبي مفتوح تحت التخدير العام. صامت الحيوانات لمدة 24 ساعة قبل التخدير. تم رصد وتسجيل مخطط كهربية القلب ، ومعدل ضربات القلب ، وتشبع الأكسجين بالهيموغلوبين ، وتكوين الغاز التنفسي ، ومعدل التنفس ، وحجم المد والجزر ، وضغط مجرى الهواء ، وضغط الدم الشرياني الانقباضي ، والضغط الوريدي المركزي تلقائيًا (Ohmeda Modulus CD ؛ DatexOhmeda ، هلسنكي ، فنلندا) . تم عزل الوريد والشريان الكلوي الأيسر وتم وضع حلقة الوعاء الدموي حول الشريان الكلوي بمشبك بزاوية قائمة. تم إجراء خزعة الكلى قبل نقص التروية (T0). بعد ذلك ، تم إحداث المرحلة الإقفارية (30 دقيقة) عن طريق سحب حلقة الوعاء الدموي. ثم تم إجراء خزعات متعددة في 15 و 30 و 60 دقيقة بعد ضخه. تم التضحية بالحيوانات بعد 24 ساعة من العملية الجراحية. تم تجميد جزء من كل عينة خزعة على الفور في درجة حرارة القطع المثلى (Tissuetek ، Pittsburgh ، PA) وتخزينها في النيتروجين السائل. تم تثبيت جزء آخر في الفورمالين المخزن (4 في المائة) لمدة 12 ساعة وتم تضمينه في البارافين باستخدام الإجراءات القياسية.

دراسة مجهرية

تم استخدام العينات الكلوية المضمنة بالبارافين المأخوذة من خزعات الكلى للتلوين النسيجي التقليدي (H&E ، حمض شيف الدوري). تم الحصول على الصور بواسطة جهاز Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies ، Vista ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم آفات Tubule-interstitial and glomerular باستخدام تحليل نوعي من قبل اثنين من المراقبين (CD ، MR) الذين لم يكونوا على دراية بالأصل.

الأجسام المضادة

تعرفت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة على المستضدات التالية: PTX3 (MNB4: مباشر ضد المجال الطرفي PTX3 N ، Exira Life Sciences In. ، Larsen ، سويسرا) ؛ CD163 (الخلايا الوحيدة / الضامة ، الولايات المتحدة البيولوجية ، سوامبسكوت ، ماساتشوستس) ؛ SWC3a (الخلايا المتغصنة ، [55] 74-22-15 A ، BD Biosciences) ؛ FSP1 (بروتين معين من الخلايا الليفية 1 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ؛ أكتين العضلات الملساء ألفا (Santa Cruz Biotechnology Inc. ؛ سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ C1q (R9 / 2 ، AbDSerotec ، كيدلينجتون ، المملكة المتحدة) ؛ MBL (3E7: مباشر ضد مجال التعرف على الكربوهيدرات MBL ، Hycult biotechnology ، Uden ، هولندا) و C9 neoantigen (aE11 ، Hycult biotechnology). تم التحقق من صحة التفاعل التبادلي عن طريق الحضانة المسبقة للأجسام المضادة المحددة ، قبل استخدامها ، مع الببتيدات البشرية المستخدمة في رفعها. ألغى ما قبل الحضانة تلطيخ معين على أنسجة الخنازير.

التألق المناعي للأنسجة والفحص المجهري بالليزر متحد البؤر

تم التحقيق في توصيف وتوطين إشارة PTX3 على الأنسجة المجمدة المدرجة في وسط OCT (Tissue-Tek). تم تحضين الشرائح باستخدام 5٪ من مصل الأرانب لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم حضنت الشرائح لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة بأجسام مضادة محددة. بعد ثلاث غسلات في PBS ، تم تحضين الشرائح بعد ذلك بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة (Alexa Flour 488 and 555 ، Molecular Probes ، Eugene ، OR). تمت مواجهة جميع الأقسام باستخدام TO-PRO -3 (مجسات جزيئية). تم تحضير الضوابط السلبية بأجسام مضادة غير ذات صلة. تم تحليل المقاطع باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر Leica TCS SP2 (لايكا ، ويتزلار ، ألمانيا). تم قياس عدد الخلايا المتسللة في ما لا يقل عن 10 حقول / قسم عالي الطاقة (x630) بواسطة مراقبين مستقلين أعمى عن أصل الشرائح. كانت الأعداد النهائية هي متوسط ​​المقياسين. في أي حال من الأحوال ، كان التباين بين المراقبين أعلى من 20 في المائة.

ثقافة الخلية وتحليل التدفق الخلوي

تم شراء الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC ، EC) من American Type Culture Collection (معايير ATCC-LGC ، سيستو سان جيوفاني ، إيطاليا). نمت EC في الوسائط الموصى بها ، EndoGro (ميرك ميليبور ، دارمشتات ، ألمانيا). تم طلاء EC بكثافة 1 {{1 0} ، 000 خلية / سم 2 وتم تحفيزها بعلاج H2O2 (3 بالمائة ، ساعة واحدة). ثم تم غسل EC القاعدية والمحفزة مرتين باستخدام PBS وتمت إزالتها باستخدام PBS-EDTA 2mM و trypsin 0. 001 ×. ثم تم تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وحضنت على التوالي باستخدام PTX3 (مؤتلف بشري PTX3 ، سيجما ألدريتش ، ميرك ، ألمانيا) (1 ميكروغرام / مل) أو / ومع rhC 1- INH (Ruconest® ، Pharming) (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة 60 دقيقة. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS 1X ، تم تعليق الخلايا في محلول قياس التدفق الخلوي (FACS) (محلول ملحي مخزّن بالفوسفات ، ودرجة الحموضة 7.2 ، وألبومين مصل بقري بنسبة 0.2 بالمائة ، و 0.02 بالمائة من أزيد الصوديوم) وحضنت باستخدام كاشف منع FCR (Miltenyi Biotec) من أجل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحجب ، تم تحضين ECs مع الأرانب المضادة للإنسان C 1- INH (مقدمة من البروفيسور M. العلوم في. ، تخفيف 1/20) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وغسلها باستخدام المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا باستخدام IgG PE المضاد للأرنب الماعز (مجسات جزيئية ، تخفيف 1/100) أو / باستخدام مجسات جزيئية IgG FITC (مجسات جزيئية ، تخفيف 1/100) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وغسلها ثلاث مرات. تم تحليل الخلايا باستخدام FC500 (بيكمان كولتر ، بري ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وبرنامج كالوزا. تم تحديد منطقة الإيجابية باستخدام mAb المطابق للنمط المتماثل ، وفي المجموع ، تم الحصول على 104 حدثًا لكل عينة. أجريت ثلاث تجارب مستقلة.

تحليل احصائي

يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD) وتتم مقارنتها باستخدام تحليل التباين أو اختبار الطالب المقترن ، حسب الاقتضاء. تم اعتبار الاختلافات ذات دلالة إحصائية عندما كانت قيم p أقل من 0. 0 5. تم تحليل البيانات باستخدام حزمة برنامج Statview (الإصدار 5.0) (شركة SAS Inc. ، كاري ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عرض الرسوم البيانية باستخدام برنامج GraphPad Prism 5.

الاختصارات

I / R: نقص التروية / ضخه. EC: الخلايا البطانية. PTX3: بنتراكسين 3 ؛ FSP -1: بروتين خاص بالأرومة الليفية 1 ؛ N-cadherin: كاديرين الخلايا العصبية ؛ alpha-SMA: أكتين عضلي أملس ألفا.

الكاتب الاشتراكات

نسق القرص المضغوط الدراسة ، وشارك في الفحص المجهري المناعي والمتحد البؤر لأقسام الكلى ، وصاغ المخطوطة. شارك AS و RF في تصميم الدراسة ، وساهما في تحليل البيانات ، وأجريا تجارب في المختبر ، ونقحا المخطوطة بشكل نقدي. قام MR و GSN بتحليل الصورة النسيجية المرضية. أجرى LL ، FS ، AMC النموذج الحيواني لإصابة نقص التروية - ضخه وساعد في مراجعة المخطوطة. نفذ كل من GL و PD و MB جميع الإجراءات الجراحية على نموذج الخنزير وساعدوا في مراجعة المخطوطة. قام MRD و P.vdP. و C.vK و FS بمراجعة المخطوطة.

قام كل من PP و ER و GG و GS و LG بمراجعة المخطوطة بشكل نقدي. قدم GC أدوات تحليلية جديدة ، صمم وأشرف على البحث. ساهم كل من CD و AS و RF بالتساوي في هذه الدراسة. ساهم جميع المؤلفين في المقالة ووافقوا على النسخة المقدمة.

شكر وتقدير

نشكر كلوديا كورسي من وحدة الكلى وغسيل الكلى وزرع الكلى ، قسم الطوارئ وزرع الأعضاء ،

جامعة باري للمساعدة التقنية الممتازة.

تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

التمويل

تم دعم هذه الدراسة من قبل جامعة باري "Aldo Moro" ، وزارة الصحة الإيطالية (GR 2016- 02362239 "نهج قائم على النسخ لتحديد العوامل التنبؤية والأهداف العلاجية لوظيفة الكسب غير المشروع المتأخرة فيالكلىمتلقو الزراعة "، Bando di Ricerca Finalizzata 2016 ، حصل القرص المضغوط على منحة دراسية في هذا المشروع) و Fondo Sociale Europeo، Azione I.2" Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori "- AIM -1810057- النشاط 2 الممنوح لـ AS

المراجع

1. Bonventre JV، Yang L. الفيزيولوجيا المرضية الخلوية للإقفار الحادالكلىإصابة. ياء كلين إنفست. 2011 ؛ 121: 4210 - 21.

2. Jang HR ، Rabb H. الاستجابة المناعية الفطرية في حالات نقص التروية الحادةالكلىإصابة. كلين إمونول. 2009 ؛ 130: 41-50.

3. Ricklin D ، Hajishengallis G ، Yang K ، Lambris JD. مكمل: نظام رئيسي لمراقبة المناعة والتوازن. نات إمونول. 2010 ؛ 11: 785 - 97.

4. ثورمان جم ، هولرز VM. الدور المركزي للمسار التكميلي البديل في مرض الإنسان. ياء إمونول. 2006 ؛ 176: 1305-10. PMID: 16424154

5. Franzin R، Stasi A، Fiorentino M، Stallone G، Cantaluppi V، Gesualdo L، Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link between Acuteالكلىالإصابة وأضرار الكسب غير المشروع المزمنة. الجبهة المناعية.

2020 ؛ 11: 734.ميد: 32457738

6. Deban L و Jaillon S و Garlanda C و Bottazzi B و Mantovani A. Pentraxins في المناعة الفطرية: دروس من PTX3. الدقة الأنسجة الخلوية. 2011 ؛ 343: 237–49.PMID: 20683616

7. Cieślik P، Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) في ضوء هيكلها وآلية عملها وآثارها السريرية. المناعة الذاتية. 2012 ؛ 45: 119-28.ميد: 21988562

8. Kunes P ، Holubcova Z ، Kolackova M ، Krejsek J. Pentraxin 3 (PTX 3): مُعدِّل داخلي للاستجابة الالتهابية. التهاب الوسطاء. 2012 ؛ 2012: 920517.PMID: 22577258

9. Garlanda C و Bottazzi B و Bastone A و Mantovani A. Pentraxins عند مفترق الطرق بين المناعة الفطرية والالتهاب وترسب المصفوفة وخصوبة الإناث. Annu Rev Immunol. 2005 ؛ 23: 337–66.115756PMID: 15771574

10. بوتازي ب ، جارلاندا سي ، كوتينا أ ، مولي إف ، جايلون إس ، ديبان إل ، مانتوفاني أ. البنتراكسين الطويل PTX3 كمستقبل للتعرف على النمط الخلطي: التفاعل مع المناعة الخلوية الفطرية. إمونول القس .2009 ؛ 227: 9-18.PMID: 19120471

11. Ma YJ و Doni A و Hummelshøj T و Honoré C و Bastone A و Mantovani A و Thielens NM و Garred P. Synergy between ficolin -2 و pentraxin 3 يعزز التعرف المناعي الفطري والترسب التكميلي. J بيول كيم. 2009 ؛ 284: 28263–75.PMID: 19632990

12. Netti GS و Lucarelli G و Spadaccino F و Castellano G و Gigante M و Divella C و Rocchetti MT و Rascio F و Mancini V و Stallone G و Carrieri G و Gesualdo L و Battaglia M و Ranieri E. PTX3 المكروية وعامل تنبؤي للمرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكلوية الصافية. الشيخوخة (ألباني نيويورك). 2020 ؛ 12: 7585-602.PMID: 32345771

13. سوزا دي جي ، أمارال إف ، فاغونديس سي تي ، كويلو إف إم ، أرانتيس آر إم ، سوزا إل بي ، ماتزوك إم إم ، جارلاندا سي ، مانتوفاني إيه ، دياس إيه إيه ، تيكسيرا إم إم. يعتبر البنتراكسين الطويل PTX3 ضروريًا لالتهاب الأنسجة بعد ذلك

نقص التروية المعوية وضخه في الفئران. أنا J باتول. 2009 ؛ 174: 1309-18. رئيس الوزراء: 19286566

14. Jaillon S، Peri G، Delneste Y، Frémaux I، Doni A، Moalli F، Garlanda C، Romani L، Gascan H، Bellocchio S، Bozza S، Cassatella MA، Jeannin P، Mantovani A. مستقبل التعرف على النمط الخلطي PTX3 يتم تخزينها في حبيبات العدلات وتوضع في مصائد خارج الخلية. J إكسب ميد. 2007 ؛ 204: 793-804 ، PMID: 17389238

15. تونغ إم ، كاريرو جيه ، قريشي إيه آر ، أندرستام ب ، هايمبورجر أو ، باراني بي ، أكسلسون جي ، ألفيستراند أ ، ستينفينكل بي ، ليندهولم بي ، سليمان إم إي. بينتراكسين 3 البلازما في المرضى الذين يعانون من مزمنالكلىالمرض: الارتباط بوظيفة الكلى ، وطاقة البروتين ، والهزال ، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، والوفيات. كلين J آم سوك نيفرول. 2007 ؛ 2: 889-97.PMID: 17702732

16. Witasp A ، Rydén M ، Carrero JJ ، Qureshi AR ، Nordfors L ، Näslund E ، Hammarqvist F ، Arefin S ، Kublickiene K ، Stenvinkel P. بلوس واحد. 2013 ؛ 8: e63493.PMID: 23658833

17. Presta M ، Camozzi M ، Salvatori G ، Rusnati M. دور مستقبل التعرف على الأنماط القابلة للذوبان PTX3 في بيولوجيا الأوعية الدموية. J سيل مول ميد. 2007 ؛ 11: 723 - 38.PMID: 17760835

18. بوتازي ب ، إنفورزاتو أ ، ميسا إم ، بارباغالو إم ، ماجريني إي ، جارلاندا سي ، مانتوفاني أ. البنتراكسين PTX3 و SAP في المناعة الفطرية ، تنظيم الالتهاب وإعادة تشكيل الأنسجة. J هيباتول. 2016 ؛ 64: 1416–27.

19. Xiao Y ، Yang N ، Zhang Q ، Wang Y ، Yang S ، Liu Z. Pentraxin 3 يثبط التليف الخلالي الناجم عن إصابة الكلى الحادة من خلال قمع مسار IL -6 / Stat3. اشتعال. 2014 ؛ 37: 1895 - 901.PMID: 24854162

20. Inforzato A، Reading PC، Barbati E، Bottazzi B، Garlanda C، Mantovani A. الجانب "الحلو" من البنتراكسين الطويل: كيف يؤثر الارتباط بالجليكوزيل على وظائف PTX3 في المناعة والالتهابات الفطرية. الجبهة المناعية. 2013 ؛ 3: 407. بميد: 23316195