يمنع التدريب البدني تكوين التليف في الكلى من مرض الزهايمر الذي يؤثر على مسارات إشارات TGFB

edmund.chen@wecistanche.com

المقدمة 

مرض الزهايمر (AD) هو الشكل الأكثر شيوعًا للخرف ، لكن مظهره الجهازي لم يُناقش إلا في العقود الماضية. على الرغم من بذل جهود كبيرة لتطوير الأدوية والعلاجات المعدلة للمرض ، إلا أنه لا توجد إجراءات علاجية متاحة حتى الآن [1-3]. يعتبر تكوين لويحات الأميلويد والوظيفة غير الطبيعية لسلائف بروتين الأميلويد (APP) من العلامات الأولى للمرض ليس فقط في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ولكن أيضًا في المحيط [4]. تدعم الأدلة القاطعة الدور المحوري للأميلويد- B (AB) في التسبب في مرض الزهايمر [5] ، مشيرًا إلى أن تقليل إزالة البروتين AB هو أحد العمليات الرئيسية في آلية المرض. في مرض الزهايمر ، يصاب العديد من الأعضاء المحيطية مثل الخصية [5] والبنكرياس [6] والكلى[7] ، وتسليط الضوء على تطور مرض جهازي معقد مع أهداف متعددة [8]. لقد ثبت أنالكلىيشارك في إزالة AB [9]. علاوة على ذلك ، يرتفع تركيز AB في الدم بشكل ملحوظ في الحالات المزمنةمرض كلوي (كد) مرضى [10 ، 11]. كما تم إثبات تراكم AB فيالكلى[12] ، مما يؤدي إلى اضطراب في الترشيح. يتم تنظيم الترشيح المناسب جزئيًا عن طريق تحويل عامل النمو B (TGFB) ، وهو سيتوكين رئيسي في التسبب فيكلويالالتهاب والتليف [13] ، ويُعرف أيضًا بأنه عامل مهم في التسبب في مرض الزهايمر [14]. في AD ، تلعب إشارات TGFB دورًا في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والحماية العصبية بوساطة الخلايا النجمية [15]. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر التعبير المتغير لـ TGFB أيضًا على الالتهاب في الجهاز العصبي المركزي والأنسجة المحيطية [13 ، 16].

سيحسن القسطرة من أمراض الكلى / الكلى

يحتوي TGFB على ثلاثة أشكال إسوية: TGFB1 و TGFB2 و TGFB3 [17]. يشارك TGFB1 في العديد من العمليات مثل نمو الجنين ، والتحكم في نمو الخلايا وتمايزها ، وتشكيل الأنسجة التليفية والندبية ، ونمو الورم ، والاستجابة المناعية [18]. وهو سيتوكين مهم في تكوين التليف في أعضاء مختلفة مثل الكبد والكلى[19]. يشكل TGFB1 ثنائيات ، والتي ترتبط أولاً بمستقبل TGFB من النوع الثاني (TGFRII) ، ثم تقوم بتنشيط مستقبل TGFB من النوع الأول (TGFRI) Ser / Thr kinase ، مما يؤدي إلى تكوين معقد للإشارات داخل الخلايا لعوامل نسخ Smad. في مسار إشارات TGFB المتعارف عليه ، تتم فسفرة عوامل النسخ Smad2 / 3 ، وبعد التشكيل المعقد باستخدام Smad4 ، تنتقل إلى النواة [20]. يمكن أن تتأثر العديد من الجينات بتنشيط TGFB1 لأنه يحفز التعبير عن الكولاجين المختلفة ، ويتحكم في تكاثر الخلايا ، ويؤثر على موت الخلايا المبرمج [20] وينظم تعبير البروتين المعدني للمصفوفة (MMP) [21]. يبدأ مسار إشارات TGFB غير المتعارف عليه تنشيط MAPKes عن طريق الفسفرة والتي بدورها يمكن أن تحفز المزيد من تعبير TGFB [22]. تم تحديد كينازات JNK و p38 كأهداف TGFB فيكلويتليف وينظم موت الخلايا المبرمج [23].

ثبت أن النشاط البدني له آثار مفيدة على المرضى من البشر. يمكن أن تنظم التمارين وتؤجل ظهور مرض الزهايمر [24 ، 25] كما تم الإبلاغ عن تقليل المؤشرات الحيوية لمرض الزهايمر مثل تاو وأب في البلازما [25]. تم العثور على النشاط البدني للحد من الإصابة بمرض الزهايمر ، والعبء المرضي العصبي المرتبط بمرض الزهايمر ، والتدهور المعرفي [26]. على الرغم من نشر العديد من الدراسات حول فوائد النشاط البدني في تكوين مرض الزهايمر [27] ، لم تتم مناقشة الآليات داخل الخلايا المتضمنة في هذه الآثار الإيجابية بالتفصيل. هناك عدد قليل من النماذج الحيوانية حيث تم اختبار الفئران المعدلة وراثيًا مع زيادة التعبير تاو و AB أثناء ممارسة الرياضة البدنية. في هذه النماذج ، ثبت أن النشاط البدني المرتفع كان قادرًا على تأجيل ظهور ميلادي [28 ، 29]. علاوة على ذلك ، تم إثبات أن التدريب طويل الأمد لهذه الفئران كان له آثار إيجابية على اختلال وظائف الأعضاء الطرفية في مرض الزهايمر. غير النشاط البدني الحديث المتبادل PACAP-BMP في ADالكلىعن طريق تطبيع تعبير الكولاجين من النوع الرابع وألف تراكم [30]. علاوة على ذلك ، تم نشر تحليل مفصل للوظيفة الوقائية للتدريب على تعبير Sox9 في خصية AD [31]. يؤثر التدريب النشط أيضًا على إشارات TGFB لأنه يقمعكلويالتهاب وتليف لاحق [32]. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر TGFB وإشاراتها مهمة لإعادة تشكيل عظام البالغين التي تتعرض للاضطرابالكلىتليف [33]. بعد ذلك ، كانت فرضيتنا الرئيسية هي أن التدريب البدني طويل الأمد له تأثير نظامي على إشارات TGFB التي يمكن أن تنظمالكلىإنتاج المصفوفة في ميلادي. قد تؤدي التغييرات في مسارات الإشارات هذه إلى انخفاض الكلىالتليف وتطبيع إزالة م. لذلك ، كان هدفنا هو توضيح العلاقة بين إشارات TGFB والتأثيرات المفيدة للتدريب البدني علىالكلىفيبروسيس في م. في تجاربنا ، نقدم دليلًا على أن التدريب طويل الأمد له تأثيرات مباشرة على إشارات TGFB فيالكلىمن الفئران ميلادي. علاوة على ذلك ، نظهر أن زيادة التمارين البدنية تنخفضالكلىتليف عبر تطبيع إشارات TGFB الكنسي وغير المتعارف عليه.

الكلمات الدالة:مرض الزهايمر ، التليف ، النشاط البدني ، الصماد ، أمراض الكلى. كلوي

سيحسن الكستانش الكلى / الكلى

المواد والطرق

حيوانتم استخدام ذكور الفئران المعدلة وراثيا (ن=5) (B6C 3- Tg (APPswe، PSEN1dE9) 85Dbo / J) لمتابعة تأثير AD. نوع بري عمره ثلاثة أشهر (WT) (بدون تعديل جيني ولا تدريب) (ن=5) ، فئران ألزهايمر المعدلة وراثيًا (AD) (ن=5) ، ومدربة AD (TAD) (ن=5) تم الاحتفاظ بالفئران تحت دورات مظلمة / فاتحة من 12/12 ساعة مع الطعام والماء بالشهرة الإعلانية. تم تطبيق جهاز الجري المتقطع على التمرين والمجموعة المشتركة. في السابق ، كانت جميع الحيوانات التي تمارس التمارين معتادة على جهاز المشي الذي يعمل بمحرك (كولومبوس إنست. ، كولومبوس أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية) وسرعة الجري لمدة أسبوعين. تم إجراء التدريب أربع مرات في الأسبوع لمدة 60 دقيقة. استغرقت كل جلسة تدريب 10 دورات ، كل دورة تتكون من 4 دقائق من الكثافة العالية ودقيقتين من الجري منخفض الكثافة. كانت سرعة الجري منخفضة الكثافة دائمة أثناء التجربة مما يعني سرعة 10 م / دقيقة. بينما بدأت سرعة الجري عالية الكثافة عند 16 م / دقيقة وتم رفعها كل أسبوع ثالث بمعدل 1 م / دقيقة حتى الوصول إلى 20 م / دقيقة. تم أيضًا اعتياد مجموعة التحكم والتغذية على جهاز المشي وبقيت هناك لمدة 5 دقائق / يوم على جهاز الجري الدائم [28]. بدأت التجارب مع حيوانات عمرها 3- شهر وانتهت في عمر 10 أشهر. تم إجراء الدراسة وفقًا للإرشادات الأخلاقية (رقم الإذن الأخلاقي لهذه الدراسة: PEI / 001 / 2105-6 / 2014 ، جامعة سيميلويس ، المجر). تم استخدام مجموعة Phire Animal Tissue Direct PCR في التنميط الجيني للحيوانات (Thermo Fischer Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

علم التشكل المجهري الخفيفبعد الانتهاء من جميع الاختبارات المعرفية ، تم تخدير {0} فئران عمرها شهر بالحقن داخل الصفاق من الكيتامين (ريختر ، التركيز: 100 مجم / مل) / زيلازين (Produlab Pharma ، التركيز: 20 مجم / مل) كوكتيل بجرعة 0.1 مل / 10 جم من وزن الجسم ومروى بطريق القلب مع محلول ملحي مثلج مملح بالهيبارين [28] والكلىأزيلت. تم غسل عينات الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتثبيتها في خليط 4: 1 من الإيثانول المطلق و 40 في المائة من الفورمالديهايد ، ثم تم دمجها في البارافين. بالنسبة لتلوين ماسون ثلاثي الألوان (Sigma-Aldrich ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم عمل أقسام متسلسلة وتم تصور الأنسجة الليفية. تم تنفيذ بروتوكول التلوين وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام كاميرا DP74 (شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) على مجهر أوليمبوس Bx53 (شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) لأخذ الصور المجهرية.

المناعيةتم تنفيذه علىالكلىعينات الأنسجة من الفئران WT ، AD ، وفئران TAD لتصور توطين Smad2 ، PCNA (مستضد الخلية النووية المتكاثرة) ، ونوع الكولاجين الأول (العقيد الأول) [30].الكلىتم إصلاحه في خليط 4: 1 من الإيثانول المطلق و 4 0 بالمائة من الفورمالديهايد وغسلها في 70 بالمائة من الإيثانول. بعد إجراء تضمين المقاطع التسلسلية ، تبع إزالة الكافيين الشطف في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم حظر مواقع الربط غير المحددة باستخدام 1 في المائة من ألبومين مصل الأبقار المذاب في PBS (Amresco LLC ، Solon ، OH ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين المقاطع باستخدام polyclonal Smad2 (Sigma-Aldrich ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتخفيف 1: 500 ، PCNA (تشوير الخلية ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتخفيف 1: 800 أو العقيد الأول (Sigma-Aldrich ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتخفيف 1: 500 عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تم تصور الأجسام المضادة الأولية مع إضافة الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 555 المضاد للأرانب (Life Technologies Corporation ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم استخدامه بتخفيف 1: 1000. تم تركيب العينات في وسط تركيب Vectashield (Vector Laboratories ، Peterborough ، إنجلترا) يحتوي على DAPI (4 ، 6- Diamidino -2- phenylindole dihydrochloride) لتلوين الحمض النووي النووي. تم استخدام مضاد الأرانب Alexa Fluor 555 بدون الأجسام المضادة الأولية للتحكم السلبي. تم التقاط الصور المجهرية باستخدام كاميرا DP74 (شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) على مجهر أوليمبوس Bx53 (شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) لتصور العقيد الأول. تم الحصول على الصور باستخدام برنامج cellSense Entry 1.5 (أوليمبوس ، شينجوكو ، طوكيو ، اليابان ) مع إعدادات الكاميرا الثابتة للسماح بمقارنة شدة إشارة الفلورسنت FL. لاكتشاف Smad2 و PCNA ، تم استخدام مجهر أوليمبوس FV3000 متحد البؤر (شركة أوليمبوس طوكيو ، اليابان) لتطبيق هدف الغمر بالزيت 60 × (NA: 1.42). للإثارة ، تم استخدام خطوط ليزر من 543 نانومتر. كان متوسط ​​وقت البكسل 4Bs. تم تسجيل سلسلة صور Z بسمك بصري 1 متر في وضع المسح المتسلسل. تمت إضافة صور Alexa555 و DAPI باستخدام برنامج Adobe Photoshop الإصدار 10.0. تمت زيادة تباين الصور بالتساوي دون تغيير الإعدادات الثابتة.

تحليل RT-PCRالكلىمن WT (n=5) ، AD (n=5) ، و TAD (n=5) تم تأريضها ميكانيكيًا وتم حلها في Tri zol (Applied Biosystems ، Foster City ، CA ، USA ) ، بعد 30 دقيقة من الحضانة عند 4 درجات مئوية وتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي [30]. تم حصاد RNA في ماء خالٍ من RNase وتخزينه في -70 درجة مئوية. تم استخدام مجموعة RT عالية السعة للنسخ العكسي (Applied Biosystems ، Foster City ، CA ، USA). للحصول على تسلسل أزواج التمهيدي المطبقة وتفاصيل تفاعلات البوليميراز المتسلسلة ، انظر الجدول 1. تم إجراء عمليات التضخيم في جهاز تدوير حراري (Labnet MultiGene ™ 96- بئر التدرج الحراري Cycler ؛ Labnet International ، Edison ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) مثل يلي: 95 درجة مئوية ، دقيقتان ، متبوعة بـ 35 دورة (تمسخ ، 94 درجة مئوية ، 30 ثانية ، تلدين لمدة 45 ثانية عند درجات حرارة مثالية كما هو موضح في الجدول 1 ؛ التمديد ، 72 درجة مئوية ، 90 ثانية) ثم 72 درجة مئوية و

7 دقائق وقد استخدم الأكتين باعتبارها الرقابة الداخلية. تم تحليل منتجات PCR باستخدام هلام agarose بنسبة 1.2 بالمائة يحتوي على بروميد الإيثيديوم وتم توثيقه باستخدام نظام FluorchemE geldocumetary (ProteinSimple ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد الكثافة الضوئية لإشارات منتج PCR باستخدام برنامج ImageJ 1.40 جم المجاني. قبل قياسات الكثافة الضوئية ، أجرينا معايرات فردية على كل صورة مجهرية. ثم قمنا بزيادة تكبير الصور للوصول إلى حجم البكسل الفردي وبواسطة الطريقة اليدوية تم تدوير الممرات بدقة وقياس الكثافة المتكاملة للمنطقة. تم قياس البيكسلات في 5 تجارب مستقلة بواسطة 3 مشغلين مستقلين. تمت مقارنة الإشارات أولاً مع الأكتين WT لإجراء مقارنة أفضل لاختلافات التعبير في الفئران AD و TAD. تُظهر الأرقام الموجودة أسفل الممرات التحليل الإحصائي للتجارب حيث تم تطبيع كل تجربة منفصلة (5 على الأقل) لإشارة أكتين الخاصة بها ثم تم حساب الفروق الإحصائية.

تحليل لطخة غربية

الكلىمن وزن WT (ن {0}}) ، AD (ن=5) ، وفئران TAD (ن=5) تم غسلها في محلول ملحي فيزيولوجي N وتم تخزينها في -7 {{1 0}} ◦ ج. تم طحن العينات ميكانيكيًا في النيتروجين السائل وتم جمعها في 100 مل من التجانس RIPA (فحص ترسيب المناعي الراديوي) - عازل (150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ؛ 1.0 بالمائة NP40 ، 0.5 بالمائة ديوكسيكولات الصوديوم ؛ 50 ملي تريس ، درجة الحموضة 8.0) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (أبروتينين (أبروتينين) 10 جم / مل) ، 5 ملي بنزاميدين ، Leupeptin (10 ميكروغرام / مل) ، مثبط التربسين (10 جم / مل) ، 1 ملي PMSF ، 5 ملي EDTA ، 1 مم EGTA ، 8 ملي NaFluoride ، 1 ملي مولار Na-orthovanadate). تم صوت الكريات بواسطة انفجار نابض لمدة 30 ثانية عند 40 أ (ColeParmer ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير محللات الخلايا الكلية لتحليلات البقع الغربية [30]. تم فصل 20 جم بروتين في 7.5 بالمائة SDS – polyacrylamide gels للكشف عن TGF -1 ، TGF R1 ، TGF-R2 ، Smad2 ، Smad3 ، ERK1 / 2 ، P-ERK1 / 2 ، p38 ، P-p38 ،

JNK و PP2A و PP2B و p21 و PCNA و Cleaved caspase3 و MMP9 ونوع الكولاجين الأول (Col. I) والأكتين. تم استخدام مجموعة الكشف عن PhosphoSer / Thr (Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لاكتشاف مستوى الفسفرة في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية Ser / Thr. تم مسح البروتينات إلى أغشية النيتروسليلوز وتعريضها للأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية في التخفيف كما هو مذكور في الجدول 2. وأعقب الحضانة بغسل PBST لمدة 30 دقيقة ثم تمت تغطية الأغشية بـ IgG المترافق مع الأجسام المضادة الثانوية IgG في 1 : 1500 (مختبرات Bio-Rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو IgG المضاد للفأر في 1: 1500 (مختبرات Bio-Rad ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). للكشف عن اللمعان الكيميائي المحسن (Advansta Inc. ، مينلو بارك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم استخدامه وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وقد استخدم الأكتين باعتبارها الرقابة الداخلية. تم التقاط الإشارات بكاميرا مبردة على نظام وثائقي جل (Fluorchem E ، ProteinSimple ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس الكثافة الضوئية للإشارات باستخدام برنامج ImageJ 1.40g المجاني. قبل قياسات الكثافة الضوئية ، أجرينا معايرات فردية على كل صورة مجهرية. ثم قمنا بزيادة تكبير الصور للوصول إلى حجم البكسل الفردي وبواسطة الطريقة اليدوية تم تدوير الممرات بدقة وقياس الكثافة المتكاملة للمنطقة. تم قياس البيكسلات في 5 تجارب مستقلة بواسطة 3 مشغلين مستقلين. تمت مقارنة الإشارات أولاً مع الأكتين WT من أجل مقارنة أفضل لاختلافات التعبير في AD و TAD. تُظهر الأرقام الموجودة أسفل الممرات التحليل الإحصائي للتجارب حيث تم تطبيع كل تجربة منفصلة (5 على الأقل) لإشارة أكتين الخاصة بها ثم تم حساب الفروق الإحصائية.

تحليل احصائيجميع البيانات تمثل ما لا يقل عن خمس تجارب مستقلة. لجميع الأشكال ، تم اختيار عينات من نفس حيوانات WT و AD و TAD مع تحكمها الداخلي من أجل مقارنة أفضل. تم استخدام صورة توضيحية واحدة فقط من نفس المجموعة الحيوانية في كل شخصية. تم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Tukey's HSD اللاحق. تم تعيين عتبة الفروق ذات الدلالة الإحصائية مقارنة بعينات التحكم عند ∗ p <0. 0="" 5="" ولعينات="" ad="" #p=""><0.05. ∗="" يشير="" إلى="" الاختلافات="" wt="" مقارنة="" مع="" ad="" و="" tad="" ،="" #="" يشير="" إلى="" الاختلافات="" ad="" مقارنة="" بـ="">

النتائج

أدى النشاط البدني إلى تطبيع مسار إشارات TGF الكنسي في كليتي الفئران المصابة بمرض الزهايمرتم فحص التعبير عن عناصر مسار الإشارات الكنسي TGFB بالتفصيل. لم يظهر تعبير البروتين و mRNA لـ TGFB1 أي فرق كبير عندماالكلىتمت مقارنة الفئران WT و AD ولكن تم العثور على زيادة التعبير في عينات TAD (الشكل 1 أ ، ب). انخفض التعبير عن TGFRI في AD ولكن النشاط البدني جعله طبيعيًا (الشكل 1 أ ، ب) ، بينما ارتفع التعبير عن TGFBRII فيالكلىمن الفئران ميلادي ولكنه يتضاءل بعد النشاط البدني (الشكل 1 أ ، ب). تمشيا مع هذه الملاحظات ، زاد تعبير Smad2 في عينات AD وتم تطبيعه بعد الجسديالنشاط (الشكل 1 أ ، ب). على العكس من ذلك ، أظهر تعبير Smad3 انخفاضًا معتدلًا فيالكلىمن الفئران AD التي تم تعويضها في عينات TAD (الشكل 1 أ ، ب). شوهد ارتفاع الإشارات الإيجابية لـ Smad2 في النظام الأنبوبي للقشرة ولكن ليس فيكلويالكريات في الفئران ميلادي. تم تقليل هذا الارتفاع في الأنابيب من الحيوانات TAD (الشكل 1C).

تم تعديل مسارات الإشارات غير المتعارف عليها في كليتي فئران الزهايمر بعد النشاط البدنيتشكل MAPK-es ، مثل ERK و p38 و JNK ، جزءًا مهمًا من إشارات TGF غير المتعارف عليها [22]. لم يتم تغيير تعبير mRNA لـ ERK فيالكلىمن الفئران AD ولكنها أظهرت انخفاضًا في عينات TAD (الشكل 2 أ). لم يكن التعبير البروتيني عن هذا الكيناز مرتبطًا بتعبير الرنا المرسال وتم اكتشاف انخفاض قوي فيالكلىالفئران مع تطبيع معتدل بعد زيادة النشاط البدني (الشكل 2 ب). تم رفع الشكل النشط الفسفوري بشكل مثير للاهتمام في عينات AD وأظهر انخفاضًا مشابهًا فيالكلىالفئران TAD (الشكل 2 ب). لم يتم تغيير تعبير mRNA لـ p38 بشكل كبير في أي عينات (الشكل 2 أ). زاد التعبير البروتيني لـ p38 بقوة فيالكلىالفئران التي تم تعويضها جزئيًا بالنشاط البدني (الشكل 2 ب). ومن المثير للاهتمام أن شكل الفسفرة الأكثر نشاطًا أظهر انخفاضًا في عينات AD

تم تطبيعه في حيوانات TAD (الشكل 2 ب). تم تقليل تعبير mRNA لـ JNK في عينات AD و TAD (الشكل 2A). تم الكشف عن التعبير البروتيني عن 2 من الأشكال الإسوية لـ JNK عن طريق تحليل اللطخة الغربية. تم الكشف عن الوظائف غير الزائدة عن الحاجة لـ JNK1 و JNK2 [34] وتم الكشف عن انخفاض كبير قدره 57 كيلو دالتون في الشكل الإسوي و 46 كيلو دالتون في الشكل الإسوي في عينات AD (الشكل 2 ب). أظهرت الأشكال الإسوية 57 كيلو دالتون و 46 كيلو دالتون ارتفاعًا بعد النشاط البدني فيالكلىالفئران TAD (الشكل 2 ب).

تعبير متغير عن فسفاتازات Ser / Thr وفسفرة البروتين المعدل في ميلاديتم إظهار تعبير ووظيفة فوسفاتيز البروتين النوعي Ser / Thr في AD [35 ، 36]. اكتشفنا زيادة في التعبير عن PP2B فيالكلىمن الفئران ميلادي ، ولكن تم تقليله من خلال النشاط البدني (الشكل 2 أ ، ب). على العكس من ذلك ، ظهر التعبير عن الفوسفاتاز الخلوي الرئيسي الآخر من نوع Ser / Thr ، PP2A ، مع انخفاض قوي فيالكلىمن الفئران ميلادي (الشكل 2 أ ، ب). في عينات TAD ، زاد تعبير mRNA والبروتين للوحدة الحفزية PP2A (الشكل 2 أ ، ب). أظهر التحقيق في فسفرة البروتين على بقايا Ser / Thr إشارة قوية عند 55 كيلو دالتون فيالكلىمن الفئران AD ، تمثل الوزن الجزيئي لـ tau (الشكل 2C). ظهر شريط مرتفع آخر عند 10 كيلو دالتون وهو ما يتوافق مع الوزن الجزيئي للطرف C المشقوق لـ APP (الشكل 2C). تم تقليل الفسفرة لكل من هذه البروتينات عند ممارسة الرياضة (الشكل 2 ج).

أثرت إشارات TGF على دورة الخلية وموت الخلايا المبرمجكما تم رصد علامات تكاثر الخلايا p21 ومستويات التعبير PCNA. من المعروف أن تنشيط TGFB يحفز التعبير عن p21 [37]. علاوة على ذلك ، يؤدي تنشيط TGFB1 إلى تغيير تكاثر الخلايا [38]. لذلك ، تم التحقيق في تكاثر مستضد الخلية النووية (PCNA). تم رفع مستوى البروتين p21 بشكل ملحوظ في AD ولكن انخفض في عينات TAD (الشكل 3 أ ، ب). استجاب PCNA بشكل مختلف: تسبب AD في انخفاض في تعبير البروتين ، بينما زاد بروتين PCNA عند ممارسة الرياضة (الشكل 3 أ ، ب). تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد الخلايا الإيجابية للـ PCNA ونتج عن ذلك انخفاض في النشاط المناعي في الخلايا الأنبوبية في كلى الفئران المصابة بمرض الزهايمر. ومن المثير للاهتمام أنه تم عرض إيجابية PCNA طبيعية في الخلايا الأنبوبية في الفئران TAD. لم يتم الكشف عن خلايا إيجابية PCNA فيكلويالجسيمات (الشكل 3 ج). نظرًا لأن إشارات TGF1 يمكن أن تؤثر على موت الخلايا المبرمج [39] ، فقد تم فحص الشكل النشط لـ proapoptotic caspase3. على الرغم من اكتشاف تعبير بسيط عن mRNA لـ caspase3 في عينات WT ، لم يتم عرض capase3 المشقوق النشط. على العكس من ذلك ، ظهر مرنا قوي و caspase3 مشقوق في عينات AD ، بينما أدى النشاط البدني المتزايد إلى تقليل التعبير عن البروتين proapoptotic (الشكل 3 أ ، ب).

تم تقليل تنظيم التليف الكلوي من خلال النشاط البدنيتشير النتائج السابقة إلى وجود تليف محتمل في كلى حيوانات الزهايمر. أولاً ، تم فحص تعبير MMP9 ، والذي يمكن تنظيمه عن طريق تنشيط TGFB1 ، [21]. تم التعبير عن mRNA لـ MMP9 في جميع العينات ، لكنه أظهر زيادة ملحوظة فقط في كليتي فئران TAD. كان التعبير البروتيني لمصفوفة البروتين المعدني عند حد الكشف في عينات WT لكنه أظهر ارتفاعًا كبيرًا في حيوانات الزهايمر. من المثير للدهشة أن التمارين البدنية النشطة زادت بشكل كبير من تعبير MMP9 (الشكل 4 أ ، ب). المكون الآخر للعمليات الليفية هو زيادة ترسب الكولاجين من النوع الأول فيالكلى[40]. في عينات WT ، تم اكتشاف انخفاض mRNA وتعبير البروتين لنوع الكولاجين الأول ولكن ظهرت زيادة قوية في حيوانات الزهايمر. أدت الحركة الجسدية النشطة إلى تطبيع كل من مرنا وتعبير البروتين لنوع الكولاجين الأول (الشكل 4 أ ، ب). عادة ما يحيط النوع الأول من الكولاجين بالأنابيب ويتم توطينه أيضًا في الخلالي. مع التلوين المرضي الروتيني لثلاثي ألوان ماسون ، يمثل اللون الأزرق وجود أي نوع من الكولاجين الذي كان مرئيًا حول الأنابيب ،كلويالكريات ، وكمية صغيرة في الخلالي في الكلى WT. في عينات الزهايمر ، كان هناك تراكم قوي مرئي في الخلالي وفي بعض الأنابيب. بعد النشاط البدني ، انخفضت كمية الكولاجين ولم يتم الكشف عن أي تراكم في النسيج الخلالي (الشكل 4 ج). تم إجراء كيمياء مناعية من النوع الأول للكولاجين لتحديد الكولاجين المتراكم. في WTالكلى، على غرار تلطيخ ماسون ، ظهرت إشارات حول الأنابيب ،كلويكانت الجسيمات وإشارة الخلالية الضعيفة مرئية أيضًا. في عينات من الفئران ميلادي ، ظهرت إيجابية مناعية قوية في الخلالي وحول النظام الأنبوبي. والمثير للدهشة أن الانخفاض كان مرئيًا في النسيج الخلالي ، ولكن ظهرت إشارة مهمة في الجزء القمي من الخلايا الظهارية الأنبوبية في حيوانات TAD (الشكل 4 د).

سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى

نقاش

على الرغم من أن عملية تكوين الزهايمر تتم مناقشتها على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي ، إلا أنه لم يتم التحقيق بالتفصيل في التعديلات والأمراض المحيطية المصاحبة المحتملة. كانت فرضيتنا الرئيسية هي ذلكالكلىالتليف هو عملية محتملة تؤثر على مظاهر الزهايمر وتراكم أ. من ناحية أخرى ، فإن التدريب البدني طويل الأمد له تأثير إيجابي على مرض الزهايمر الذي قد يكون له علاقة بمسار إشارات TGFB للتغيير النظامي. لقد ثبت أن الأعضاء المحيطية متورطة في التسبب في مرض الزهايمر ، كما تم اكتشاف نشاط إنزيم استقلابي متغير في مرضى الزهايمر [41] كما ظهر تراكم في البنكرياس [42] وفيالكلى[30]. هذا المرض الجهازي الذي يصيب الأعضاء المختلفة يجعل التشخيص المبكر للإصابة بمرض الزهايمر وإمكانية الشفاء منه أمرًا صعبًا. يتم تنظيم إزالة الزهايمر من الجهاز العصبي المركزي جزئيًا بواسطة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكن يمكن إزالة جزء منها بعد المرور عبر الحاجز الدموي الدماغي في المحيط [43]. يعتبر هذا التطهير المحيطي أحد الأهداف المحتملة للأدوية لتقليل تركيز الزهايمر في البلازما [44]. يمثل إفراز الجزيئات الصغيرة بواسطة الأنابيب القريبة من الكلى وظيفة استتباب حيوية وقد تشارك في إفراز السموم أو البروتينات في البول [45]. لقد ثبت أن الزهايمر يتم إفرازه في البول ويمكن أن يكون علامة تشخيصية للخرف [46] ؛ بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي ضعف الكلى لدى كبار السن إلى زيادة خطر الإصابة بالخرف [47] ، ووجد أن مستويات الزهايمر في الدم كانت أعلى بشكل ملحوظ في مرضى الكلى المزمن [10]. تشير هذه البيانات إلى وظيفة محتملة لـالكلىفي إزالة م في المحيط. ثبت أن التمارين البدنية لها تأثيرات إيجابية على وظائف الكلى لأنها تحافظ على الشكل الكبيبي السليم والإفراز الأنبوبي المحمي [48]. لقد ثبت أن زيادة النشاط البدني يقلل من إشارات TGFB في الكلى ويمكن أن تكون التمارين البدنية استراتيجية جيدة لمضادات التليف [32]. إجمالاً ، قد يكون لتنشيط TGF اتصال مباشر بالإشارات المتعلقة بالنشاط البدني والتي قد تحافظ على تخليص AD في المحيط. لذلك ، قمنا بفحص مسار إشارات TGFB في WT و AD وفئران AD المدربة على المدى الطويل.

في الدراسة الحالية ، تم إثبات أن تعبير TGFFRII قد زاد في كليتي الفئران المصابة بمرض الزهايمر وتم تطبيعه جزئيًا في عينات TAD. يشير TGFBRII المرتفع إلى تنشيط محسن لمسار إشارات TGFB في AD [49]. أظهر انخفاض تعبير TGF RI أن روابط TGF مع تقارب أعلى لـ TGFBRII وتشكيل homodimer من المحتمل في AD [50]. على غرار هذه النتائج ، تم عرض تشكيل TGFFRII homodimer في الضامة فيكلويتليف [51]. من ناحية أخرى ، تعادل التدريب طويل الأمد التعبير عن مستقبلات TGFB مما يشير إلى تكوين معقد لمستقبلات مغايرة يمكن تثبيته عن طريق تعبير TGFB1 المرتفع [50]. علاوة على ذلك ، تم تغيير تعبير Smad2 و Smad3 بشكل مثير للجدل في ميلادي. يُعرف Smad2 بأنه يتم تنشيطه بشكل كلاسيكي بواسطة مستقبلات TGF ويتم نقله إلى النواة بينما يتمتع Smad3 بوظيفة مميزة [52]. لقد تم نشر أن التنظيم الخافض لـ Smad3 يؤثر على التليف [53]. يشير التعبير الطبيعي لعوامل نسخ Smad في عينات TAD

أن النشاط البدني أعاد توازن إشارات TGFB وقلل من التنشيط الكيميائي المرضي. عائلة البروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) التي تحتوي على p38MAPK و JNK و ERK لها تفاعل مع إشارات TGF [54]. تم إظهار التعبير المرتفع لـ p38 في الخلايا الظهارية الأنبوبية التي تسبب تليف الكلى ويمكن أن يكون انسدادها هدفًا جيدًا لعلاج التليف [55]. في الفئران AD ، تم الكشف عن زيادة تعبير البروتين p38 مما يدعم تكوين الفيفيبروز. على العكس من ذلك ، تم تقليل الفسفرة p38 في الكلى AD مما يشير إلى تنشيط يعتمد على مرحلة التليف لـ p38 MAPK [56]. من ناحية أخرى ، أدى النشاط البدني المرتفع إلى تطبيع جزئي لكل من الشكل p38 والشكل الفسفوري الموجود في الكلى مما يشير إلى وظيفة موازنة للتدريب في تكوين التليف بوساطة p 38-. على غرار p38 كيناز ، يمكن أن يمنع تثبيط JNK تكوين التليف [57]. تنشيط JNK له وظائف مختلفة في أجزاء مختلفة من الكلى ، مثل الترشيح الكبيبي والعمليات التليفية الخلالية [58]. يشير مستخلص البروتين في تجاربنا المشتقة من محلول الكلى الكلي إلى أنه أثناء تطور مرض الزهايمر ، من المحتمل أن يكون لـ JNK وظيفة مميزة في الأجزاء الأنبوبية والكبيبية مع تنشيط النمط النظري الخاص بالخلية في الكلى المصابة بمرض الزهايمر. تم الإبلاغ عن تنشيط MMP المستحث بواسطة TGFB1 اعتمادًا على وظيفة p38 [59] ، بينما أدى تثبيط نشاط ERK إلى تقليل التليف الخلالي [60]. تدعم هذه البيانات بقوة الوظائف المميزة لأفراد عائلة MAPK في التسبب في تليف الكلى في مرض الزهايمر. اكتشفنا تعبيرًا منخفضًا من ERK في كليتي الفئران المصابة بمرض الزهايمر ، بينما ارتفعت كمية شكله النشط الفسفوري بشكل ملحوظ. في المجموعة التجريبية من الفئران التي تشارك في تدريب بدني طويل الأمد ، اكتشفنا تعبير ERK الطبيعي وتعبير phospho-ERK وتأثير مفيد علىوظيفة الكلى.تدعم هذه الملاحظات مساهمة ERK في التحول الليفي للكلى في مرض الزهايمر وتُظهر تأثيرًا إيجابيًا واضحًا بشكل مدهش للتدريب البدني على مورفولوجيا الكلى ووظيفة فئران الزهايمر. في الآونة الأخيرة ، أثبت مختبرنا تورط ERK في النقل الميكانيكي لخلايا الغضاريف النامية [61].

تحدث الفسفرة TGFBRII و Smad و JNK و p38 و ERK على بقايا Ser [62] والتي تقترح التنشيط المحتمل لفوسفاتيز Ser / Thr. تم إثبات عدم تنظيم PP2B في AD [35 ، 63]. من ناحية أخرى ، لا ينظم PP2B بشكل كبير فسفرة تاو في الدماغ ، على الرغم من أنه قادر على نزع الفسفرة في العديد من مواقع الفسفرة [35]. إن الفوسفاتاز الخلوي الرئيسي الآخر ، PP2A ، يزيل الفوسفوريلات البروتينات على بقايا Ser ويقل نشاطه في AD وهو قادر على تنظيم فسفرة تاو مع تقارب أعلى من PP2B [64]. تم إثبات انخفاض PP2A ، ولكن تم إظهار زيادة تعبير PP2B في كليتي الفئران AD ، على غرار الجهاز العصبي المركزي. زيادة الفسفرة على مخلفات Ser ، نتيجة لانخفاض تعبير PP2A ، يمكن أن تحفز فرط فسفرة بروتين تاو أو APP كما كان متوقعا في الكلى من الفئران ميلادي. يمكن تنظيم عملية إزالة الفسفرة لـ JNK و p38 بشكل مباشر بواسطة PP2B [65] ، وبالتالي ، فإن انخفاض تنشيط هذه الكينازات في AD يمكن أن يكون نتيجة لارتفاع تعبير PP2B. من ناحية أخرى ، يمكن أن يحدث نزع الفسفرة ERK كيناز بشكل رئيسي من خلال تنشيط PP2A [66] ، وبالتالي يمكن أن يؤدي تقليل التعبير عن PP2A إلى زيادة فسفرة ERK في ميلادي. عمل التدريب طويل المدى لفئران AD على تطبيع تعبير PP2B و PP2A والذي بدا بدوره أنه يحول مستوى الفسفرة Ser / Thr لأنزيمات MAPK أقرب إلى المستوى الطبيعي. مارس الحمل الميكانيكي تأثيرًا متوازنًا على الفسفرة العكسية من خلال مشاركة PP2B و PP2A في تمييز الخلايا الغضروفية أيضًا [61].

تنشيط مسار إشارات TGFB غير الكنسي ينظم تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج. على غرار النتائج التي توصلنا إليها ، تم عرض الخلايا الإيجابية للـ p21 في الجهاز الأنبوبي للكلية [67] ، كما أظهرنا زيادة تعبيرها في مرض الزهايمر. يشير هذا الارتفاع إلى توقف دورة الخلية في AD بوساطة تنشيط MAPK ، بينما يتفاعل p21 مع PCNA ويمنع الخلايا في المرحلة S من دورة الخلية [68]. اكتشفنا تنشيط p21 وما يترتب على ذلك من انخفاض قوي في PCNA في النظام الأنبوبي لفئران AD. على غرار النتائج السابقة التي توصلنا إليها ، أدى النشاط البدني المعزز إلى تطبيع دورة الخلية في خلايا النظام الأنبوبي. من ناحية أخرى ، فإن p21 له صلة أيضًا بتنشيط caspase و JNK ، بينما يؤدي ERK أيضًا إلى حدوث انشقاق caspase3 [69 ، 70]. تم التعرف على تنشيط Caspase3 ليلعب دورًا مهمًا في التسبب في مرض الزهايمر عن طريق الاضطرابات السينوبتيكية الناتجة عن الانقسام ABPP والتراكم A بوساطة الكاسبيز [71]. في كلى الفئران المصابة بمرض الزهايمر ، اكتشفنا تعبيرات كاسباس 3 عالية المشقوق تشير إلى ارتفاع موت الخلايا المبرمج وفقدان وظيفة الخلايا الأنبوبية والكبيبية. يمكن أن تعزز هذه العمليات تراكم الزهايمر في خلالي الكلى كما أوضحنا سابقًا [30].

سيحسن القسطرة من التهاب الكلى / التهاب الجلد

لقد ثبت أن الإشارات الوسيطة TGFB تزيد من تعبير الكولاجين وتراكمه في النسيج الخلالي [40]. وفقًا لهذه النتائج في كليتي الفئران المصابة بمرض الزهايمر ، أظهرنا ارتفاعًا ملحوظًا في تعبير الكولاجين من النوع الأول المتراكم في النسيج الخلالي. تشير هذه البيانات بقوة إلى أن إشارات TGFB المتغيرة وغير الكنسية في AD تلعب دورًا حاسمًا في التليف الكلوي [18 ، 72]. على العكس من ذلك ، قلل التدريب طويل المدى من توطين الكولاجين الخلالي من النوع الأول جزئيًا على الأقل من خلال إعادة موازنة إشارات TGFB. يمكن أن يؤدي التليف المخفف إلى إزالة الزهايمر وتقليلهكلويالتراكم كما أوضحنا سابقًا [30]. تم دعم هذه الفرضية من خلال النتائج التي توصلنا إليها ، حيث أدى التدريب البدني إلى تراكم النوع الأول من الكولاجين في الخلايا الظهارية الأنبوبية ، والذي ظهر في كليتي فئران TAD مما يدل على عملية تدهور الكولاجين. يمكن تنشيط MMP9 عن طريق إشارات TGFB في الكلى [73] وينتج عن ذلك تحلل ألياف المصفوفة. على الرغم من أن MMPs لها أدوار مثبطة وتحفيزية في التليف ، إلا أن MMP9 يعتبر عامل بروتيبوتيك بوساطة تنشيط TGFB [74]. على العكس من ذلك ، فقد ثبت أن MMP9 يمكن أن يلعب دورًا تنظيميًا في تحلل الكولاجين من النوع الأول في الكلى [75]. في كليتي الفئران المصابة بمرض الزهايمر ، أظهرنا تعبيرًا مرتفعًا عن MMP9 يشير إلى وظيفته في العملية الليفية التي يتحكم فيها تسلسل إشارات TGFB. من ناحية أخرى ، تم قياس الارتفاع الإضافي بعد تدريب طويل الأمد والذي يمكن أن يكون سبب الانخفاض القوي في التعبير والمظهر الأنبوبي لنوع الكولاجين الأول. في التحفيز الميكانيكي ، أظهر مختبرنا أن تعبير MMP9 كان مرتفعًا في الثقافات الغضروفية الأولية [76] ، وقد تم نشر نتائج مماثلة في تكوين النسيج الندبي حيث زاد الضغط الميكانيكي من التعبير عن MMP9 [77]. في إصابة الكلى الحادة ، يكون لارتفاع MMP9 وظيفة مضادة للاستماتة ويحمي الجزء S3 من الأنابيب القريبة [78]. علاوة على ذلك ، تم أيضًا اكتشاف مسار إشارات TGFB المُنشَّط بإجهاد القص وتشكيل التليف المتقطع في الرئتين [79]. علاوة على ذلك ، تسبب الإجهاد الميكانيكي في الخلايا الظهارية في الرئة في إعادة تشكيل ECM عن طريق تنشيط MMP9 وتغيير تعبير الكولاجين [80]. لذلك ، يمكننا أن نستنتج أن زيادة النشاط البدني يؤدي إلى إعادة تشكيل إنتاج المصفوفة من خلال تعديل إشارات TGFB ليس فقط محليًا ولكن أيضًا بشكل منهجي أيضًا. تتمثل حدود عملنا في أن الفئران المعدلة وراثيًا قد يكون لها تكوين أسرع لمرض الزهايمر ولا يتم التحقيق في وظائف الكلى بالتفصيل. يجب إجراء مزيد من التحقيق في أن إنتاج المصفوفة المستحث بـ TGFB فقط هو الذي يتم تغييره في الكلى الليفية لفئران الزهايمر أو تنظيم توازن الصوديوم والبوتاسيوم ، كما أن إزالة الزهايمر تشارك أيضًا في التدريب طويل المدى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا متابعة تراكم الكولاجين من النوع الأول في البول لتحسين هذا التدريب البدني طويل الأمد في مرض الزهايمر الذي يؤدي إلى الحد من تليف الكلى. من ناحية أخرى ، أثبتنا في الجسم الحي أن التدريب البدني طويل الأمد له تأثير نظامي على إشارات TGFB الكنسية وغير القانونية. أظهرنا في الجسم الحي أن التدريب البدني يقلل من تكوين التليف الكلوي في مرض الزهايمر الذي له تأثير إيجابي على مظهر من مظاهر المرض. في الختام ، تشير بياناتنا إلى أن تنشيط مسارات إشارات TGFB يلعب دورًا مسببًا في التحول الليفي لكلي الفئران عند الإصابة بمرض الزهايمر. كنهج بسيط للغاية لتحقيق تغييرات إيجابية في هذه الحالة ، نوصي بالتدريب البدني طويل المدى ، حيث كان قادرًا على تطبيع التعبير والفسفرة لأعضاء مسارات إشارات TGFB الكنسي وغير الكنسي وأدى إلى تحسين التليف الكلوي. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي التمارين البدنية التي تثبط التليف الكيسي إلى إعادة التوازن إلى وظائف الكلى ويمكن أن تؤدي إلى إزالة مرتفعة لمرض الزهايمر الجهازي في مرض الزهايمر.