إصابة Podocyte من خلال التفاعل بين Tlr8 و Ligand MiR الذاتية -21 في الكلى المسدودة وكليتها الجانبية

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

عدم القدرة على الانتصاب المتعلقة بالكلى

بينما ينتشر مرض الكلى المزمن عند البالغين ، فقد تم الإبلاغ عن اعتلال الكلية الانسدادي (ON) في كل من المرضى الصغار والكبار. في ON ، تم التحقيق على نطاق واسع في الآفات tubulointerstitial (TILs) ، ولكن تم إهمال الآفات الكبيبية (GLs) إلى حد كبير. هنا ، نعرض آلية جديدة يقوم عليها تطوير GL في ON في الفئران الصغيرة والكبيرة. تتطور TILs في وقت أبكر من GLs بسبب تسلل الخلايا الالتهابية في tubulointerstitium ، لكن GLs تتطور بعد تنشيط مستقبل Toll-like 8 (Tlr8) على الرغم من عدم وجود الخلايا الالتهابية التي تتسلل إلى الكبيبة. تتزاوج بروتينات TLR8 و interleukin 1 beta (IL1b) مع تقليل علامات وظيفة podocyte (PFMs) ، مما يشير إلى تنشيط إشارات TLR8 في خلايا podocytes المصابة. علاوة على ذلك ، كانت مستويات الكبيبات والمصل لـ miR -21 ، وهو يجند داخلي المنشأ لـ Tlr8 ، أعلى في نموذج الماوس ON منه في عنصر التحكم الوهمي. يرتبط التعبير الكبيبي لـ Tlr8 بشكل إيجابي مع miR -21 والسيتوكينات في اتجاه التيار Il1b و Il6 ويرتبط سلبًا بـ PFMs (Nphs1 و Synpo). نظهر أيضًا تلازم بروتينات TLR8 و IL1b مع تقليل PFMs في كل من الانسداد وجانبيةالكلىالفئران الصغيرة والكبيرة. علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج الدراسة في المختبر تعبيرًا أعلى عن Tlr8 والسيتوكينات في اتجاه مجرى الدم في الكبيبات من الانسداد.الكلىاتباع العلاج بتقليد miR - 21 مما هو عليه في مجموعة التحكم. في الختام ، قد يعمل الإفراط في التعبير عن Tlr8 كآلية معقولة تكمن وراء تطور GL في ON من خلال إصابة podocyte.

الكلمات الرئيسية: مرض الكلى المزمن ،اعتلال الكلية الانسدادي ، خلية البودوسيت ، TLR8 ، انسداد الكلية الجانبية

المقدمة

مرض الكلى المزمن (كد)، مصدر قلق رئيسي للصحة العامة ، منتشر في 8 في المائة - 13 في المائة من عامة السكان (1). وهو شائع عند كبار السن بسبب شيخوخة المجتمع. يعتبر اعتلال الكلية الانسدادي (ON) ذا أهمية كبيرة للأطباء ، حيث تم الإبلاغ عنه في المرضى من مختلف الفئات العمرية. ON قابل للعلاج والعكس ، على عكس CKDs الأخرى (2 ، 3). في الأطفال ، يحدث في واحد من 15 0 0 شابًا ، ويصل معدل انتشاره إلى 1٪ -5٪ في البلدان المتقدمة (4 ، 5). في البالغين ، يتراوح انتشار التهاب العصب البصري من 5 في 1000 إلى 5 في 10000 فرد. بالإضافة إلى ذلك ، يبلغ معدل انتشار التهاب العصب البصري المزمن من جانب واحد حوالي 0.5 في المائة ، بينما يبلغ انتشار التهاب العصب البصري المزمن الأحادي الجانب والمزمن حوالي 0.1 في المائة (4-7).

يمكن أن يؤدي التهاب العصب البصري إلى إصابة الكلى الحادة أو مرض الكلى المزمن ، والذي ينطوي على انخفاض تدريجي في وظائف الكلى وتغييرات في الهياكل الكلوية تستمر لأكثر من 3 أشهر (8 ، 9). انسداد الحالب أحادي الجانب (UUO) هو استراتيجية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة التهاب العصب البصري المزمن. يتميز ON في كلية UUO بالتضخم ، موه الكلية ، تجنيد الخلايا الالتهابية في المنطقة الخلالية ، موت الخلايا الأنبوبية من نقص الأكسجة ، وترسب الكولاجين في tubulointerstitium ، متبوعًا بتطور tubulointerstitial fifibrosis (TF) (10).

TF هو سمة مهمة لمرض الكلى في نهاية المرحلة ومحدد رئيسي للإصابة الكلوية التقدمية (11). تم فحص TF على نطاق واسع في نماذج ON ، ولكن البيانات المتعلقة بإصابة الكبيبات ، وخاصة تشوهات حاجز الدم والبول (BUB) ، نادرة (8 ، 9 ، 12). علاوة على ذلك ، حققت الدراسات في آفات الأنبوب الخلالي (TILs) في الكلية الجانبية في ON أحادي الجانب ، ولكن تم إهمال الآفات الكبيبية (GLs) إلى حد كبير (12). كشفت العديد من التقارير عن تورط الشعيرات الدموية حول الأنبوب في تطور TILs في ON التجريبية (13 ، 14). ومع ذلك ، استنزاف الكبيبات والشعيرات الدموية الكبيبية في الأجزاء الأنبوبية من النيفرون والشعيرات الدموية حول الأنبوب ، على التوالي. لذلك ، نقترح أن التهاب كبيبات الكلى قد يؤثر أيضًا على tubulointerstitium. سلطت دراساتنا السابقة الضوء على مساهمة إصابة الخلايا الجوهرية الكبيبية ، بشكل رئيسي الخلايا البودوسية ، في GL وتطور TIL اللاحق في نموذج فأر لأمراض المناعة الذاتية بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات شبيهة بالمستقبلات (TLRs) (15-18).

البطانة الشعرية الكبيبية وخلايا القدم هي حراس بوابات مهمون يتألفون من BUBs. بين هاتين الظاهرتين ، تتعرض الخلايا البودوسية باستمرار لإشارات الخطر ، بما في ذلك روابط TLR مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (PAMPs) ، نظرًا لتوطينها الفريد في الكبيبات (15). لذلك ، يُعتقد أن التفاعل بين المستقبلات TLRs في خلايا podocytes وروابطها الداخلية المنشأ يساهم في إصابة خلايا podocyte في ظروف غير معدية. في هذه الدراسة ، ركزنا على تطور GL في كل من الكلى المسدودة والجانبية للفئران الصغيرة والكبيرة ، حيث يوجد التهاب العصب البصري بشكل متكرر في كل من الشباب وكبار السن. لقد أوضحنا أن GL تم تطويره في ON بسبب إصابة خلية البودوسيت من خلال الإفراط في التعبير عن Tlr8 في خلايا podocytes من كل من الكلى المسدودة والجانبية للفئران الصغيرة والكبيرة.

المواد والأساليب

البيان الأخلاقي والإسكان التجريبي للحيوانات تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم حيوانات المختبر من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في كلية الطب البيطري ، جامعة هوكايدو (رقم الموافقة 16- 0124). اتبع المؤلفون الدليل المعتمد لرعاية واستخدام حيوانات المختبر بجامعة هوكايدو ، كلية الطب البيطري (تمت الموافقة عليه من قبل الرابطة الدولية لتقييم واعتماد رعاية حيوانات المختبر الدولية). تم شراء فئران C57BL / 6N عمرها ستة أسابيع من Japan SLC Inc. (هاماماتسو ، اليابان) وتم الحفاظ عليها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في بيئة مظلمة 1: 1. تم تزويد الحيوانات التجريبية بالطعام الشهي ومياه الشرب.

التصميم التجريبي استخدمنا كلاً من الفئران الصغيرة (9 أسابيع) والكبيرة (12 شهرًا). تعرضت الفئران من كل فئة عمرية (ن=4) إما لعملية زائفة (مجموعة تحكم) أو وحدة UUO (2 و 7 و 11 و 21 يومًا) لإنشاء كلية على النموذج ، كما هو موضح في دراستنا السابقة (13).

تم تخدير فئران تحضير العينة بعمق بمزيج من عوامل التخدير كما هو موصوف سابقًا (16) والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. تم جمع عينات الدم من الشريان الفخذي لتحليل علامات المصل. تم جمع كل من UUO والكلى الجانبية وتقطيعها إلى شرائح رقيقة. تم إصلاح شرائح الكلى بنسبة 10 في المائة من الفورمالين المحايد (NBF) ، و 4 في المائة من بارافورمالدهيد (PFA) ، و 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد (GTA) لدراسات التشريح المرضي والكيميائي المناعي والإلكترون على التوالي.

تم قطع كتل البارافين الثابتة NBF والكيمياء المناعية والتألق المناعي بسمك 2 مم وملطخة بحمض شيف-هيماتوكسيلين الدوري (PAS-H) لفحص التشريح الكلوي. تم إجراء الكشف المناعي للعلامات الخلوية كما تم الإبلاغ عنه سابقًا (16) للخلايا B (B220) ، والخلايا التائية (CD3) ، والبطانة الشعرية (CD31) ، و IL1b ، والضامة (Iba1) ، و podocytes (podocin و synaptodin) ، و TLR8. يتم سرد شروط تلطيخ في الجدول 1.

تم تحويل مسار قياس النسيج PAS-H وأقسام الكلى المحصنة بالمناعة إلى شرائح افتراضية باستخدام Nano Zoomer 2. 0 RS (Hamamatsu Photonics Co.، Ltd .؛ Hamamatsu ، اليابان). تم حساب الخلايا الإيجابية من 20 كبيبة تم اختيارها عشوائيًا أو 20 بؤرة من tubulointerstitium بتكبير 400x باستخدام برنامج NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co.، Ltd.). تم أيضًا التقاط صور 20 من الكبيبات من أقسام ملطخة بـ PAS-H بمعدل 400x من كل فأر باستخدام مجهر مضان الكل في واحد BZ-X710 (Keyence ، أوساكا ، اليابان). تم قياس مساحة الكبيبة وحجمها من الصور الملتقطة باستخدام محلل BZ-X (Keyence).

تم عزل عزل الكبيبات لاستخراج الحمض النووي الريبي وزراعة الكبيبات من الكليتين المشغلة بالشام و UUO كما هو موصوف سابقًا (16). باختصار ، تم تخدير الفئران بعمق وإرواءها من خلال البطين الأيسر مع 40 مل من محلول الملح المتوازن لهانك (HBSS) الذي يحتوي على Dynabeads (8 × 107 ؛ تقنيات الحياة ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استئصال الكلية

ومقطعة إلى قطع صغيرة. ثم تم هضم الخلايا باستخدام كولاجيناز A (1 مجم / مل ؛ روش ، بازل ، سويسرا) و deoxyribonuclease I (100 U / ml ؛ تقنيات الحياة) في HBSS عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة. تم ضغط المعلق المحتوي على الأنسجة المهضومة برفق من خلال مصفاة خلية 100- مم (BD Falcon ، Franklin Lakes ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام مدقة مسطحة. تم الطرد المركزي لتعليق الخلية الناتج عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وتم إعادة تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من HBSS. تم جمع الكبيبات المحتوية على Dynabeads باستخدام مُكثِّف الجسيمات المغناطيسية (Life Technologies) واستخدامها لعزل الحمض النووي الريبي.

النسخ العكسي و PCR في الوقت الحقيقيتم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الكبيبات باستخدام مجموعة RNeasy (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا). تم تصنيع (كدنا) من إجمالي الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ العكسي باستخدام إنزيم النسخ العكسي ReverTra Ace (تويوبو ، أوساكا ، اليابان) وبادئات dT العشوائية (Promega). تم استخدام cDNA في PCR في الوقت الفعلي مع مزيج Brilliant III SYBR Green QPCR الرئيسي و Mx3000P (Agilent Technologies ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيع التعبير الجيني الكبيبي لتعبير Actb. يتم عرض أزواج التمهيدي المستخدمة في الجدول 2.

النسخ العكسي و PCR القائم على TaqManتم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك microRNA (ميرنا) في الكبيبات المعزولة ، باستخدام مجموعة miRNeasy (Qiagen). تم استخدام بادئات RT ذات الحلقة الجذعية الخاصة بـ miRNA ، ونسخة عكسية ، ومخزن النسخ العكسي ، و dNTPs ، ومثبط RNase لعكس نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (Applied Biosystems ، Foster City ، CA ، USA). تم إجراء PCR في الوقت الفعلي باستخدام cDNA الناتج باستخدام بادئات TaqMan المحددة من miR -21- والتحقيقات المحددة (النظم البيولوجية التطبيقية) ، و TaqMan Universal PCR Master Mix (النظم البيولوجية التطبيقية) ، و Mx3000P (تقنيات Agilent).

المعالجة المخبرية للكبيبات المنعزلة مع المحاكاةتم عزل الكبيبات من وحدة UUO و UUO التي تعمل بطريقة الصورالكلىبعد 11 يومًا من الانسداد. تم توزيع وسط Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI -1640) (Fujifilm Wako ، اليابان) يحتوي على 300 من الكبيبات في كل بئر من 96- لوحة استنبات الآبار (TPP ، Trasadingen ، سويسرا) و تعامل مع PBS ، والتحكم السلبي ، وتقليد miR -21 (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer ، Daejeon ، كوريا الجنوبية) عند 1 pmol / L لمدة 4 ساعات عند 37 درجة في 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تم قياس التعبير عن Tlr8 والسيتوكينات في اتجاه مجرى النهر كما هو موضح في القسم السابق.

المسح المجهري الإلكترونيلإجراء الفحص المجهري الإلكتروني الروتيني (SEM) ، صغيرالكلى شرائحتم إصلاحها بنسبة 2.5 في المائة من GTA لمدة 4 ساعات وثابتة لاحقًا باستخدام 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة ، تليها المعالجة بحمض التانيك بنسبة 1 في المائة لمدة ساعة واحدة. تم بعد ذلك تثبيت العينات باستخدام 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة ومعالجتها بـ 0 .5 في المائة و 1 في المائة من حمض التانيك لمدة 10 دقائق و 1 ساعة على التوالي.الكلىشرائحتم تجفيفها بدرجات متصاعدة من الكحول ، وتم نقلها إلى 3- ميثيل بيوتيل أسيتات ، وتم تجفيفها أخيرًا باستخدام مجفف النقاط الحرجة HCP -2 (هيتاشي ، طوكيو ، اليابان). تم تعريض العينات لطلاء الأيونات ثم فحصها تحت مجهر إلكتروني مسح -4100 بجهد متسارع يبلغ 12 كيلو فولت.

تحليل احصائييتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​الخطأ المعياري ± (حد ذاتها). تم تحليل النتائج إحصائيًا باستخدام اختبار Mann-Whitney U اللامعلمي (P <0. 0="" 5).="" تم="" استخدام="" اختبار="" kruskal-wallis="" لمقارنة="" ثلاث="" مجموعات="" سكانية="" أو="" أكثر="" ،="" وتم="" إجراء="" مقارنات="" متعددة="" باستخدام="" طريقة="" scheffe="" بمجرد="" ملاحظة="" اختلافات="" كبيرة="" (p=""><0. 05).="" تم="" تحليل="" الارتباط="" بين="" المعلمتين="" باستخدام="" اختبار="" معامل="" ارتباط="" الرتبة="" لسبيرمان="" (p=""><>

النتائج

TILs و GLs في الكلى المسدودة في الفئران الصغيرةقمنا أولاً بفحص TILs و GLs في كليتي UUO و UUO للفئران الصغيرة المعرضة للانسداد لفترات زمنية مختلفة. في حين أظهرت الكلى التي تعمل بطريقة الصورية أنبوبة انتيرستيتيوم طبيعية (الشكل 1 أ) ، أظهرت الكلى المسدودة بعد يومين من UUO TILs وتميزت بتوسع الأنابيب ؛ تحتوي بعض الأنابيب أيضًا على قوالب بولية. زادت هذه الآفات مع تقدم الانسداد (الشكل 1 أ). لوحظ GLs ، وتصلب الكبيبات بشكل رئيسي ، في المرحلة المتأخرة في 21 يومًا بعد UUO وتميزت بترسب مواد دورية موجبة للحمض شيف (PAS). كان التركيب الكبيبي طبيعيًا في كل من الكليتين الوهمية والأولى UUO (2 و 7 و 11 يومًا) (الشكل 1 ب). تميل عدد الخلايا الكبيبية إلى الزيادة حتى اليوم -11 بعد الانسداد وتميل إلى الانخفاض في اليوم -21 في الكلى UUO (الشكل 1C). تميل التراكم الكبيبي المسراق إلى الزيادة من 7 أيام بعد الانسداد (الشكل 1 د).

كان غائبًا في وسط الكبيبات في الكلى UUO في 21 يومًا بعد الانسداد (الشكل 1F). كشف تفاعل البلمرة المتسلسل عن انخفاض كبير في PFMs (Nphs1 و Synpo) في الكلى UUO بعد 21 يومًا من الانسداد (الشكل 1G). علاوة على ذلك ، كشف تحليل SEM عن عمليات قدم طبيعية (PFPs) في الكلى التي يتم تشغيلها بطريقة وهمية ؛ ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن إضعاف PFP والهياكل الشبيهة بالدقيقة في الكلى UUO بعد 21 يومًا من الانسداد (الشكل 1H). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى حدوث إصابة في خلية البودوسيت في الكلى المسدودة بعد 21 يومًا من الانسداد.

الخلايا المناعية المتسللة غائبة في الكلى المسدودة لقد أظهرنا سابقًا أن إصابة الخلايا القرنية ترتبط باختراق الخلايا المناعية في الكبيبة (13 ، 16 ، 18). لذلك ، قمنا بفحص تسلل الخلايا B و T بالإضافة إلى البلاعم في TILs و GLs من الكلى التي تعمل بنظام الشام و UUO (الشكل 2). لوحظ تسلل العديد من الخلايا B و T و macrophages في TILs في الكلى UUO في جميع الأيام التي أعقبت الانسداد ، لكنها كانت شبه غائبة أو قليلة في الكبيبات في كل من الكلى الزائفة والكلى UUO (الأشكال 2A-E). كان عدد الخلايا B و T و macrophages قليلًا جدًا في الكبيبات (لم تظهر البيانات) ولكنها كانت أعلى بشكل ملحوظ في

tubulointerstitium للكلى النهارية 2- و 7- و 11- و 21- مقارنةً بالكلى الزائفة (الشكل 2F). لذلك ، قد يساهم ارتشاح الخلايا المناعية في تطوير TILs في الكلى المسدودة. ومع ذلك ، قد تكون هناك عوامل أخرى مرتبطة بتطوير GL.

التعبير عن أعضاء مختلفين من عائلة TLR والسيتوكينات المصبّة في الكليتين المشغولة بالشام والمعوقة لدى الفئران الصغيرة كشفت الدراسات السابقة عن تعبير أعلى لمستقبلات TLRs مختلفة في خلايا بودوسيت للكلى المريضة (15 ، 16 ، 19 ، 20). ومن المثير للاهتمام ، كشفت بياناتنا عن تعبير أعلى بشكل ملحوظ عن Tlr8 و Tlr9 في الكبيبات المعزولة من مجموعة اليوم UUO 21- مقارنة بكبيبات المجموعة الوهمية (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، قمنا بفحص التعبير عن السيتوكينات النهائية لأفراد عائلة TLR في الكبيبات من مجموعات اليوم الشام و UUO 21- ووجدنا زيادة كبيرة في التنظيم في التعبير عن الجينات التي تشفر كلاً من إنترلوكين 1 بيتا (Il1b) وإنترلوكين 6 (Il6) في مجموعة UUO مقارنة بمجموعة الشام (الشكل 3 ب).

TLR8 Co-Localized مع PFM نظرًا لأن التعبير عن Tlr8 و Tlr9 كان مرتفعًا في الكبيبات المعزولة من الكلى المسدودة ، قمنا بفحص توطينها عن طريق تلطيخ التألق المناعي. لم يتم الكشف عن بروتين TLR8 في الكلى التي تعمل بطريقة الشام (الشكل 4 أ) ولكن تم تحديد موقعه مع سينابتوبودين PFM في كلية UUO (الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، فشلنا في الكشف عن تعبير بروتين TLR9 في الكلى إما من الفئران التي تعمل بطريقة الشام أو UUO (البيانات غير معروضة).

إنتاج IL1b من Podocytes في الكلى المسدودة للفئران الصغيرة كما هو موضح في الشكل 3B ، كان التعبير عن Il1b الكبيبي (سيتوكين في اتجاه مجرى النهر لعائلة TLR) أعلى بشكل ملحوظ في كلية UUO في 21 يومًا من ذلك في الكلى الزائفة. لذلك ، قمنا بفحص مصدر IL1b في الكبيبات في الكلى UUO عن طريق تلطيخ التألق المناعي. لم يتم اكتشاف تعبير بروتين IL1b في كبيبات الكلى الزائفة ولكن لوحظ في الكبيبات في الكلى UUO (الأشكال 4C ، D). علاوة على ذلك ، يتم تحديد موقع IL1b مع podocin PFM (الشكل 4D).

في UUOالكلىفي 21 يومًا من ذلك في الوهمالكلى.لذلك ، قمنا بفحص مصدر IL1b في الكبيبات في الكلى UUO عن طريق تلطيخ التألق المناعي. لم يتم الكشف عن تعبير بروتين IL1b في الكبيبات الزائفةالكلىولكن لوحظ في الكبيبات في UUOالكلى(الأشكال 4 ج ، د). علاوة على ذلك ، يتم تحديد موقع IL1b مع podocin PFM (الشكل 4D).

زيادة مستوى Ligand الداخلي المزعوم Tlr8 في ON Model Mice وقد أظهرت دراسة سابقة أن miR -21 بمثابة رابط لـ TLR8 (21). لذلك ، قمنا بمقارنة كل من المستويات الكبيبية والمصلية لـ miR -21 بين مجموعتي اليوم الصورتين و UUO 21-. ومن المثير للاهتمام ، أن مجموعة اليوم UUO 21- أظهرت مستويات أعلى بشكل ملحوظ من miR الكبيبي -21 من تلك الموجودة في المجموعة الصورية (P <0. 05)="" ،="" ومع="" ذلك="" ،="" فإن="" الميل="" المتزايد="" للمصل="" mir="" {="" {10}}="" لوحظ="" في="" المجموعة="" الأولى="" من="" الثانية="" (p="0." 06)="" (الشكل="">

ارتباط تعبير Tlr8 مع Ligand miR -21 و PFMs في المعوقالكلىكما هو مبين في الجدول 3 ، لاحظنا وجود علاقة إيجابية كبيرة بين التعبير الكبيبي لـ Tlr8 mRNA و ligand الداخلي (miR -21) بالإضافة إلى السيتوكينات في اتجاه التيار Il1b و Il6. من ناحية أخرى ، كان هناك ارتباط سلبي واضح بين Tlr8 mRNA و PFMs Nphs1 و Synpo.

التحفيز المختبري للكبيبات باستخدام miR {0}} ينشط التقليد التعبير عن Tlr8 وسيتوكيناته في اتجاه المصب تميل تعبير Tlr8 إلى الزيادة (P=0. 0 6) ولكن كانت السيتوكينات المصب (Ifng و Il1b) تزداد بشكل ملحوظ (P <0.05 و 0.01) في الكبيبات في الفئران الزائفة التالية

العلاج بتقليد miR -21 مقارنةً بتلك الموجودة في الكبيبات في الفئران المعالجة ببرنامج تلفزيوني ومحاكاة التحكم السلبية (الشكل 5 أ). ومع ذلك ، لم يلاحظ أي ارتباط كبير بين التعبير عن Tlr8 والسيتوكينات المصب في الكبيبات من الفئران الزائفة بعد العلاج بالمقلدات (الجدول 4). كان التعبير عن Tlr8 والسيتوكينات المصب أعلى بشكل ملحوظ في الكبيبات في UUOالكلى، بعد العلاج بتقليد miR -21 من تلك الموجودة في الكبيبات في UUOالكلىتعامل مع برنامج تلفزيوني وتقليد التحكم السلبي (الشكل 5 ب). تم الكشف عن ارتباط كبير بين التعبير عن Tlr8 والسيتوكينات في اتجاه مجرى النهر في الكبيبات في الكلى UUO بعد العلاج بالمقلدات ، مما يدل على التنشيط العالي لـ Tlr 8- مسار العامل النووي kappa B (NF-kB) و إفراز السيتوكينات المنشطة للالتهابات في الكلى المسدودة (الجدول 4).

توطين TLR8 وإصابة بودوسيت في الكلى الجانبية للفئران الصغيرةأظهرت الكلى التي تعمل بطريقة الشام الكبيبات الطبيعية ، في حين أن الكلى الجانبية لديها تضخم كبيبي ، وزيادة عدد الخلايا الكبيبية ، وتوسع الشعيرات الدموية الكبيبية (الشكل 6 أ). كانت الكبيبات من الكلى التي تعمل بطريقة الشام إيجابية للتعبير عن سينابتوبودين وتفتقر إلى تعبير TLR8 (الشكل 6 ب). من ناحية أخرى ، فقدت الكلى الجانبية تعبير سينابتوبودين في وسط الكبيبات لكنها أظهرت تعبير TLR8 على طول المعدل الكبيبي (الشكل 6 ج). علاوة على ذلك ، تمت ترجمة بروتين TLR8 مع سينابتودين (الشكل 6C). أظهرت الكلى التي تعمل بنظام الشام تعبيرًا طبيعيًا عن بودوسين ولكن لا يوجد تعبير عن IL1b في الكبيبات (الشكل 6 د). ومع ذلك ، فقدت الكبيبات داخل الكلى الجانبية تعبير بودوسين في المركز ولكن كان لها تعبير IL1b على طول المعدل الكبيبي (الشكل 6E). علاوة على ذلك ، تم تنسيق بروتين IL1b مع بودوسين (الشكل 6E). كشف تحليل SEM عن PFPs طبيعية في كليتي الفأر التي يتم تشغيلها بطريقة وهمية ، ولكن كانت PFP وهياكل شبيهة بالدقيقة مرئية في الكلى الجانبية (الشكل 6F).

توطين TLR8 وإصابة بودوسيت في الكلى المسدودة والجانبية للفئران المسنةأظهرت الكلى التي تعمل بنظام الشام تعبيرًا طبيعيًا عن سينابتودين لكنها لم تكشف عن تلطيخ لبروتين TLR8 داخل الكبيبات (الشكل 7 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن كلا من الكُلى الجانبية ووحدة UUO أظهرت فقدانًا لتعبير سينابتوبودين في مركز الكبيبات لكنها حافظت على تعبير TLR8 على طول الشبكية الكبيبية (الشكلان 7 ب ، ج). تم تجميع بروتين TLR8 مع سينابتودين في الكلى الجانبية و UUO (الشكلان 7 ب ، ج). أظهرت الكلى التي تعمل بنظام الشام بالمثل تعبير بودوسين طبيعي ولكن لم يكن لديها تعبير IL1b في الكبيبات (الشكل 7 د). من ناحية أخرى ، فقدت كل من الكلى الجانبية ووحدة UUO تعبير البودوسين في مركز الكبيبات لكنها أظهرت تعبير IL1b على طول الشبكية الكبيبية (الأشكال 7E ، F). تم العثور على تلطيخ إيجابي مع podocin في الكبيبات الجانبية والكلى UUO (الأشكال 7E ، F). كشف فحص SEM عن PFPs طبيعية في كلى الفأر التي يتم تشغيلها بطريقة وهمية ، وإمحاء PFP ، والهياكل الشبيهة بالدقة الدقيقة في كل من الكلى الجانبية و UUO للفئران القديمة (الشكل 7G).

نقاشعلى

انتشار المرض شائع عند الرضع وكذلك بين الأفراد المسنين (4-7). ومن ثم ، أخضعنا الفئران الصغيرة والكبيرة إلى UUO لتقليد حالة ON للأفراد من مختلف الفئات العمرية وفحصنا TILs و GLs. في الكلى المسدودة ، كان تطور TILs واضحًا في مرحلة سابقة من الانسداد (يومين) ؛ ومع ذلك ، لوحظ تطور GLs جنبا إلى جنب مع إصابة podocyte في مرحلة لاحقة. أظهرت الكلية الجانبية GLs وإصابة في خلية podocyte في نفس الوقت. تشير هذه الملاحظة إلى أن إصابة خلية البودوسيت تحدث في كل من الكلى المسدودة والجانبية ، على الرغم من أن الإهانة الأولية قد تختلف. سلطت دراساتنا السابقة الضوء على العلاقة بين إصابة الخلايا القرنية وتسلل الخلايا المناعية في الكبيبة (13 ، 16 ، 18). ومع ذلك ، لم يلاحظ تسلل الخلايا المناعية إلى الكبيبات في الكلى الزائفة أو المسدودة في هذه الدراسة. لذلك ، أخذنا في الاعتبار تورط عوامل أخرى في إصابة خلية البودوسيت في الكلى المسدودة. افترضنا أن إشارات الخطر (DAMPs أو PAMPs) ، إما من منشأ الدورة الدموية أو ناشئة عن ظهارة أنبوبية تالفة ، قد تساهم في إصابة خلية البودوسيت في ON ، بسبب موقعها الفريد في الكبيبة. الأهم من ذلك ، لقد ثبت أن التفاعل بين DAMPs و TLRs يلعب دورًا مهمًا في التسبب في الأمراض غير المعدية (15). يتم التعبير عن أعضاء مختلفة من عائلة TLR على غشاء بلازما الخلية أو الحويصلات داخل الخلايا (22) ويتم وصفها بأنها مستشعرات مناعية فطرية تتعرف بكفاءة على DAMPs أو PAMPs. عند التنشيط عن طريق DAMPs أو PAMPs المقابلة ، عززت TLRs التعبير عن السيتوكينات النهائية من خلال مسار NF-kB واستحثت نظام الدفاع المضيف (22). علاوة على ذلك ، تنقل DAMPs وجود إصابة الأنسجة إلى الخلايا المناعية أو الخلايا الذاتية المحلية ، وبالتالي تؤدي إلى تفاقم تلف الأنسجة (23-26). الأهم من ذلك ، أن جميع TLRs تنشط مسار NF-kB الذي يتحكم في التعبير عن مجموعة من جينات السيتوكين الالتهابية (27). بالإضافة إلى ذلك ، فإن تنشيط TLRs يشير إلى مساراتها النهائية لتنشيط NF-kB ، وهو المسؤول عن الالتهاب والمرتبط بإحداث الأنسجة التالفة (28). Shichita et al. كشفت التفاعلات المرضية بين الترابطات الداخلية و TLR2 أو TLR4 ، والتي تساهم في إصابة الدماغ الدماغية (25). أظهرت الدراسات السابقة أيضًا قدرة أفراد عائلة TLR على تحفيز TILs في الكلى (TLR2 ، 4 ، 5 ، 7 ، 11) و GLs (TLR1-6 ، 8 ، 9) (17 ، 29 - 33) ). في هذه الدراسة ، وجدنا إصابة في الكريات البيض في الكلى المسدودة والجانبية ووضحنا

أدوار مختلف أعضاء عائلة TLR التي قد تساهم في إصابة خلية البودوسيت (15 ، 16 ، 19 ، 20). كما افترضنا ، كان التعبير الكبيبي لـ Tlr8 و Tlr9 أعلى في الكبيبات المعزولة من كلية UUO مقارنة مع الفئران التي تم تشغيلها بطريقة وهمية. علاوة على ذلك ، كان التعبير الكبيبي للسيتوكينات الالتهابية المتعلقة بمسار NF-kB ، بما في ذلك Il1b و Il6 ، أعلى في كلية UUO في 21 يومًا بعد الانسداد. لذلك ، خلصنا إلى أن مسار NF-kB بوساطة TLR يلعب دورًا مهمًا في التسبب في GL في الكلى المسدودة. على عكس الأعضاء الآخرين في عائلة TLR ، يتم اكتشاف TLR8 و TLR9 في الجسيمات الداخلية للخلايا. يتعرف TLR8 على RNAs وحيد الشريطة و RNAs قصير مزدوج الشريطة من الكائنات الحية الدقيقة وينشط إنتاج العديد من السيتوكينات NF-kB بوساطة (22). من ناحية أخرى ، يتعرف TLR9 على الحمض النووي مزدوج الشريطة وينشط مسار NF-kB لإنتاج السيتوكينات في اتجاه التيار (16 ، 34). في هذه الدراسة ، اكتشفنا فقط تكوّن بروتين TLR8 جنبًا إلى جنب مع سينابتوبودين PFM في الكبيبات. أظهرت دراساتنا السابقة أيضًا أن كلا من TLR8 و TLR9 يتحدان مع PFMs وينشطان إنتاج السيتوكين الالتهابي بوساطة NF-kB للحث على إصابة خلية البودوسيت (15 ، 16). علاوة على ذلك ، أظهرت دراسات أخرى العلاقة المرضية بين المسارات التي تتم بوساطة TLR وإصابة الخلايا البودوسية في المختبر (34 ، 35). باناس وآخرون كشف تفاعل TLR4 في الخلايا البودوسية مع جهاز المناعة أثناء تطور GL (35). وبالتالي ، قد تساهم الخلايا البودوسية في المراقبة المناعية من خلال المسارات التي تتوسطها المستقبلة TLR. في هذه الدراسة ، أظهرنا كلاً من التعبير الجيني TLR8 وتوطين البروتين في الخلايا البودوسية للكلية المسدودة وكذلك التعبير الأعلى عن السيتوكينات المصب في الكبيبة. لذلك ، نستنتج أن المسارات التي تتم بوساطة TLR 8- تساهم في تطور GL من خلال إصابة خلية البودوسيت في الكلى المسدودة.

أظهرت دراسة سابقة أن miR -21 ، وهو رابطة داخلية المنشأ لـ TLR8 ، يمكن أن تصل إلى TLR8 وترتبط به في الجسيمات الداخلية الخلوية ، حيث يمكنها تحفيز تنشيط TLR 8- بوساطة مسار NFkB وإفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات (21). في هذه الدراسة ، وجدنا مستويات أعلى بشكل ملحوظ من miR الكبيبي -21 بالإضافة إلى مستويات مرتفعة من المصل miR -21 في كلية UUO مقارنة بتلك الموجودة في الضوابط الصورية وأظهرنا ارتباطها بالتعبير الكبيبي لـ Tlr8 . ومن المثير للاهتمام ، أن الكبيبات المأخوذة من كلى UUO التي عولجت بتقليد miR -21 أظهرت تعبيرًا أعلى عن Tlr8 والسيتوكينات في اتجاه مجرى النهر مقارنةً بتلك الموجودة في الكبيبات المأخوذة من الفئران الوهمية التي عولجت بتقليد miR -21 ، مما يشير إلى زيادة توافر miR الداخلي. -21 من الأنسجة التالفة في الكلى المسدودة وتنشيط الإفراط في التعبير عن Tlr8 في الكلى UUO مقارنةً بتلك الزائفة. معًا ، نستنتج أن حجمًا أكبر من miR -21 في الكلى المسدودة يصل إلى الجسيمات الداخلية في الخلايا الجسدية ويحث على تنشيط Tlr 8- بوساطة مسار NF-kB وإفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات. هذه السيتوكينات ، بدورها ، تشارك في تطوير GL من خلال إصابة podocyte.

IL1b هي واحدة من السيتوكينات المصب الهامة لمسار NF-kB ، والتي تنتجها بشكل أساسي الخلايا البودوسية في الكبيبة في ظل ظروف المرض. أظهرت الدراسات السابقة أن IL1b يحث على إصابة الخلايا البودوسية عن طريق تقليل PFMs (36 ، 37). في هذه الدراسة ، أظهرنا تعبيرًا كبيبيًا أعلى لـ Il1b وتوحيده مع PFMs ، مما أظهر انخفاضًا في التعبير. علاوة على ذلك ، يرتبط التعبير الكبيبي لـ Il1b بـ Tlr8 ويميل إلى الارتباط مع تعبير PFMs (Nphs1 و Synpo). لذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن العوامل في اتجاه مجرى Tlr8 ، بما في ذلك Il1b و Il6 ، قد تتسبب في إصابة خلايا podocyte في الكلى المسدودة عن طريق تقليل تعبير PFM.

أظهرت الكلى الجانبية للفئران الصغيرة أيضًا GLs وفقدان PFMs. تم تأكيد هذه النتيجة عن طريق SEM ، والتي كشفت عن إصابة في الكلى الجانبية. وجدنا أيضًا مستويات أعلى من المصل miR -21 في نموذج الماوس ON. علاوة على ذلك ، يتم توطين بروتين IL1b مع PFM. تشير هذه النتائج إلى أن المصل miR -21 يتفاعل مع TLR8 في الخلايا البودوسية للكلية الجانبية وينشط إنتاج السيتوكينات في اتجاه مجرى النهر ، والتي بدورها تقلل من وظيفة الخلايا البودوسية وإصابة الخلايا البودوسية. كما لوحظت إصابة بودوسيت في الكلى المسدودة والجانبية للفئران المسنة عبر آلية مشابهة لتلك التي لوحظت في الفئران الصغيرة.

في الختام (الشكل 8) ، يرتفع تعبير miR -21 الكبيبي بعد انسداد الحالب أحادي الجانب ، حيث يتفاعل مع TLR8 في خلايا podocytes ويحث على إنتاج السيتوكينات المصب (Il1b و Il6) مما يشير إلى تنشيط مسار NF-kB. تعمل المستويات الأعلى من السيتوكينات على تقليل PFMs ، مما يؤدي إلى إصابة خلايا podocyte والتطور اللاحق لـ GLs. تعمل المستويات المرتفعة من المصل miR -21 على تنشيط TLR8 في الخلايا البودوسية للكلية الجانبية وتحفز GLs من خلال إصابة خلايا podocyte. لذلك ، تُظهر هذه الدراسة بوضوح تطور GL في الكلى المسدودة والجانبية من خلال إصابة خلية البودوسيت بعد زيادة إفراز Tlr8.