arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

التأثيرات الوقائية للوجونين على عديد السكاريد الشحمي الناجم عن الالتهاب وموت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية في الرئة وآلياتها المحتملة

Mar 18, 2022

اتصالtina.xiang@wecistanche.com

الملخص

خلفية: Wogonin (5 ، 7- dihydroxy -8- methoxyflavone) هو مركب طبيعي من مركبات الفلافونويد ثنائي هيدروكسيل مستخرج من جذر Scutellaria baicalensis Georgi. تهدف هذه الورقة إلى دراسة آلية عمل ووغونين في التخفيفاشتعالوموت الخلايا المبرمجفي إصابة الرئة الحادة (علي).

المواد والأساليب: تم استخدام عديدات السكاريد الدهنية (LPS) لإنشاء نموذج في المختبر من ALl. بعد علاج wogonin ، تم قياس قابلية بقاء الخلايا وموت الخلايا المبرمج للخلايا A549 المستحثة بـ LPS ، على التوالي ، بواسطة CCK -8 ، TUNELassays ، وتلوين ثنائي أكريدين البرتقالي / بروميد الإيثيديوم ، بينما محتويات السيتوكينات الالتهابية والاكسدةتم تقدير العلامات بواسطة RT-qPCR ومقايسة ELISA وتحليل اللطخة الغربية والمجموعات التجارية. تم إجراء لطخة غربية أيضًا لتقييم تعبير البروتينات المعنية. بعد ذلك ، تم التحقيق في تأثير wogonin على نزع السيتوين 1 (SIRT1) من مجموعة البروتين عالي الحركة (HMGB1). تم استخدام مثبط SIRT1 EX527 لتقييم التأثيرات التنظيمية لـ wogonin على نزع HMGB1 بوساطة SIRT 1- في خلايا A549 تحت تحفيز LPS.

نتائج: تسبب LPS في حدوث التهاب ، وإجهاد مؤكسد ، وموت الخلايا المبرمج لخلايا A549 ، والتي تم إلغاؤها بواسطة ووغونين. وجد أيضًا أن wogonin روج لـ HMGB1 deacetylation ، مصحوبًا بتعبير SIRT1 المنظم. ومع ذلك ، عكس مثبط SIRT1 EX527 جزئيًا التأثيرات الوقائية للوجونين على الالتهاب والاستماتة للخلايا A549 التي يسببها LPS.

استنتاج: خفف ووغونين من الالتهاب وموت الخلايا المبرمج في خلايا A549 المستحثة بـ LPS بواسطة SIRT 1- بوساطة نزع الأسيتيل HMGB1 ، والذي قد يمثل تحديد آلية جديدة يمارس من خلالها wogonin تأثيرات وقائية على ALI ويقدم أفكارًا لتطبيق wogonin على علاج ALL.

الكلمات الدالة: إصابة الرئة الحادة ، ووغونين ، والتهاب ، و SIRT1 ، و HMGB1 نزع الأسيتيل

4flavonoids anti-inflammatory

انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات

خلفية

تم توثيق إصابة الرئة الحادة (AL) سريريًا كنتيجة للحالات المرضية بما في ذلك الإنتان والالتهاب الرئوي والصدمات والتهاب البنكرياس الحاد [1]. غالبًا ما يظهر في المرضى الذين يتم إدخالهم إلى وحدات العناية المركزة ويظهر معدل وفيات مرتفع [2]. أولئك الذين بقوا على قيد الحياة من ALI عادة ما يواجهون نوعية حياة متدنية [3]. على الرغم من الإنجازات التي تحققت في فهم الفيزيولوجيا المرضية لـ AL ، إلا أن فعالية العلاج للعلاجات الحالية لا تزال محدودة ، والتي لا يمكن أن تلبي توقعات المرضى وعائلاتهم [4]. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تحديد علاجات أو أهداف جديدة لعلاج ALL. Wogonin (5 ، 7- ثنائي هيدروكسي -8- ميثوكسي فلافون) ، الذي يظهر هيكله في الشكل 1 أ ، هو ثنائي هيدروكسيل فلافونويد طبيعي مستخرج من جذر سكوتلاريا بيكالنسيس جورجي [5]. تم الإبلاغ عن خصائصه الهامة المضادة للالتهابات وتطبيقه في علاج الأمراض الالتهابية على نطاق واسع من خلال عدد كبير من الدراسات. على سبيل المثال ، يحتمل أن wogonin يحسن الوذمة الرئوية في الفئران ويحميها من ALI الناجم عن عديد السكاريد الدهني (LPS) عن طريق منع بروتين كيناز p38 المنشط بالميتوجين (MAPK) و c-Jun NH (2) كيناز طرفي (فسفرة الحبر [6) ]. قلل Wogonin أيضًا من ارتشاح العدلات الناجم عن LPS ، وإنتاج السيتوكينات المسببة للالتهابات ، والتعبير عن جزيئات الالتصاق ، و AL المكبوتة التي يسببها LPS في الفئران [7]. وتشير الأدلة الحالية إلى أن الاستجابة الالتهابية و ALI الناجم عن LPS يمكن تخفيفها باعتبارها نتيجة علاج ووغونين عن طريق مسار NF-KB بوساطة مستقبلات البيروكسيسوم المنشط (PPARy). الإنتاج والالتهاب المعتمد على HMGB 1- ، وخفض معدلات الاعتلال المرتبطة بالإنتان وخطر إصابة الرئة [9]. في نموذج ALI المستحث في المختبر وفي الجسم الحي ، أظهر تقرير آخر أن تثبيط HMGB1 من الواضح أن الوسطاء الالتهابيين الآخرين عبر ulinastatin خففوا من مظاهر ALI [10]. وأكدت الدراسات السابقة أن الخلايا الظهارية للرئة البشرية المستحثة بـ LPS (A549) قد تم استخدامها على نطاق واسع كنموذج في المختبر لـ ALI [11-13]. تم اقتراح Sirtuin 1 (SIRT1) ، المستجيب المصب لبروتين كيناز المنشط أحادي الفوسفات (AMPK) ، للعب أدوارًا مهمة في تنظيم إطلاق الأديبونكتين [14]. زادت مكملات Wogonin بشكل ملحوظ من فسفرة AMPK وتعبير SIRT1 ، في حين أن تثبيط AMPK أو SIRT1 قلل من تأثيرات ووغونين على إنتاج أو إطلاق الأديبونيكتين [14]. تم الإبلاغ سابقًا عن أن إزالة HMGB1 المعدلة من HMGB1 تمنع إصابة الكلى الحادة الناتجة عن تعفن الدم [15].

في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى التحقيق في آلية عمل ووغونين في التخفيف مناشتعالوموت الخلايا المبرمجمن الخلايا الظهارية للرئة البشرية التي يسببها LPS ، والتي قد توفر رؤية أكثر شمولاً لعلاج ALI بواسطة wogonin.

Efect of wogonin on the viability of LPS-induced A549 cells. A The chemical structure of wogonin. B The viability of A549 cells exposed to wogonin was determined by a CCK-8 assay. C The viability of LPS-induced A549 cells exposed to wogonin was estimated by a CCK-8 assay. D The LDH activity in LPS-induced A549 cells exposed to wogonin was determined by a LDH assay kit. Data were obtained from three independent experiments (n=3). ***P<0.001 vs. control; #P<0.05, ###P<0.001 vs. LPS; &P<0.05 vs. LPS+5 μM wogonin; @@@P<0.001 vs. LPS+10 μM wogonin

نتائج

آثار ووغونين على حيوية وموت الخلايا المبرمج للخلايا A549 التي يسببها LPS

لمراقبة تأثير wogonin على ALI ، توقعنا أولاً ما إذا كانت صلاحية خلايا A549 العادية يمكن أن تتلف بواسطة wogonin. كما هو مبين في الشكل 1 ب ، لم يتسبب ووغونين في أي ضرر لخلايا A549 دون تلقي أي علاج ، مما يشير إلى سلامة علاج ووغونين في خلايا A549 بتركيزات O ، و 5 ، 10 ، و 20 ميكرومتر. بعد تحفيز LPS لمدة 24 ساعة ، تضررت جدوى خلايا A549 بشكل ملحوظ ، والتي قوبلت بواسطة wogonin بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 1C). علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج اختبار LDH أنه تم تقليل زيادة كبيرة في نشاط LDH في خلايا A549 المعالجة بـ LPS بعد إعطاء جرعات متزايدة من wogonin (الشكل 1D). بعد ذلك ، اختبرنا تأثير wogonin على موت الخلايا المبرمج للخلايا A549 المستحثة بـ LPS. كما هو مبين في الشكل 2 أ ، أظهر تلطيخ TUNEL أن التعرض LPS عزز بشكل كبير موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 مقارنة بمجموعة التحكم ، والتي تم تقليلها بواسطة wogonin بطريقة تعتمد على الجرعة. إلى جانب ذلك ، لوحظ انخفاض التنظيم الظاهر في تعبير Bcl -2 والتنظيم في تعبيرات Bax و Cyto-C و caspase 3 المشقوق في المجموعة المعرضة لـ LPS عند مقارنتها بمجموعة التحكم ، والتي تمت استعادتها بواسطة علاج wogonin (الشكل 1 ب). 2 ب). بشكل ثابت ، تشير نتائج فحوصات مضان AO / EB المزدوجة المعروضة في الشكل 3 إلى أن LPS أدى إلى ارتفاع معدل موت الخلايا المبرمج مقارنة بمجموعة التحكم ، في حين تم تقليل الخلايا الإيجابية لـ EB بشكل ملحوظ بعد إضافة wogonin عند مقارنتها بـ LPS مجموعة. وهكذا ، يستعيد ووغونين الصلاحية ويقلل من موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 التي يسببها LPS.

Efect of wogonin on the apoptosis of LPS-induced A549 cells. A A TUNEL assay was performed to determine apoptosis of LPS-treated A549 cells upon wogonin exposure. B The expression of apoptosis-related proteins in LPS-treated A549 cells upon wogonin exposure was measured by western blot analysis. Magnifcation,×200. All experiments were performed in triplicates (n=3). ***P<0.001 vs. control; ##P<0.01, ###P<0.001 vs. LPS; &P<0.05, &&P<0.01, &&&P<0.001 vs. LPS+5 μM wogonin; @@P<0.01 vs. LPS+10 μM wogonin

Efect of wogonin on the apoptosis of LPS-induced A549 cells. Cell apoptosis was assessed by acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) double fuorescence assays. Results were generated from three independent experiments (n=3). ***P<0.001 vs. control; ###P<0.001 vs. LPS; &&&P<0.001 vs. LPS+5 μM wogonin; @@P<0.01 vs. LPS+10 μM wogonin

آثار ووغونين على الالتهاب والإجهاد التأكسدي لخلايا A549 التي يسببها LPS

لاستكشاف القدرات المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة للوجونين في ALI ، فإناشتعالوالاكسدةمن خلايا A549 المستحثة بـ LPS والتي عولجت بـ wogonin ، على التوالي ، تم اكتشافها. كما هو موضح في الشكل 4A-C ، ارتفعت مستويات الرنا المرسال للسيتوكينات الالتهابية (TNF- و IL -6 و IL -1) المقاسة بواسطة RT-qPCR إلى مستويات عالية بشكل ملحوظ عند تحفيز LPS ، في حين أن wogonin أدى العلاج إلى تقليل تعبيرهم. باستمرار ، أشارت نتائج ELISA إلى أن LPSinduction أدى إلى زيادة ملحوظة في محتويات TNF- و IL -6 و IL -1 مقارنة بالمجموعة غير المعالجة ، والتي انخفضت اعتمادًا على الجرعة بعد علاج wogonin (الشكل . 4D-F). الأهم من ذلك ، أن انزيمات الأكسدة الحلقية -2 (كوكس -2) وعامل الفوسفو-نووي (NF) -KB p65 (p-NF-KB p65) ، وهي علامات مرتبطة بالالتهاب ، تم تنظيمها من قبل LPS بينما منظم بواسطة wogonin (الشكل 4G) بالإضافة إلى ذلك ، أدى LPS إلى انخفاض أنشطة SOD و GSH-Px وزيادة محتويات MDA و ROS ، والتي تم عكسها بواسطة wogonin (الشكل 4H-K). مجتمعة ، يخفف ووغونين من الالتهاب والإجهاد التأكسدي لخلايا A549 التي يسببها LPS.

Efect of wogonin on the infammation and oxidative stress of LPS-induced A549 cells. The mRNA expression levels of A TNF-α, B IL-6 and C IL-1β in LPS-induced A549 cells treated with wogonin were assessed by RT-qPCR. ELISA kits were used to evaluate the concentrations of D TNF-α, E IL-1β and F IL-6 in LPS-induced A549 cells treated with wogonin. G The protein expression levels of infammation-related markers were examined with western blot analysis in LPS-induced A549 cells treated with wogonin. The activities of H SOD, I GSH-Px and the levels of J MDA, K ROS were evaluated by kits. Results were generated from three independent experiments (n=3). ***P<0.001 vs. control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs. LPS; &P<0.05, &&P<0.01, &&&P<0.001 vs. LPS+5 μM wogonin; @@P<0.01, @@@P<0.001 vs. LPS+10 μM wogonin

flavonoids antioxidant

تنظيم wogonin في SIRT 1- بوساطة HMGB1

لتأكيد تكهناتنا بأن wogonin مارس تأثيرات وقائية على إصابة خلية A549 التي يسببها LPS عن طريق نزع السيتلة HMGB1 بوساطة SIRT 1- ، أجرينا لطخة غربية لاكتشاف مستويات البروتين للعوامل المعنية. من الواضح أن LPS قمع التعبير عن SIRT1 وعزز انتقال HMGB1 من النواة إلى السيتوبلازم ، جنبًا إلى جنب مع أستلة HMGB1. ومع ذلك ، تم عكس هذا الاتجاه من خلال تعرض wogonin لخلايا A549 المستحثة بـ LPS (الشكل 5). وبالتالي ، فإن علاج wogonin ينظم SIRT 1- بوساطة نزع السيتلة HMGB1 في خلايا A549 المستحثة بـ LPS.

تنظيم مثبط SIRT1 EX527 على السلوكيات الخلوية لخلايا A549 المستحثة بـ LPS المعالجة بـ wogonin

للتحقق من دور SIRT1 في الآلية الأساسية التي أثر بها wogonin على الالتهاب وموت الخلايا المبرمج للخلايا A549 المستحثة بـ LPS ، استخدمنا EX527 ، وهو مثبط SIRT1 ، لعلاج خلايا A549 المستحثة بـ LPS لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 6 أ ، أدت إضافة EX527 إلى تقليل تعبير SIRT1 ، إلى إعاقة النقل النووي السيتوبلازمي لـ HMGB1 ، وتحفيز نزع الأسيتيل HMGB1 ، مقارنة بمجموعة LPS plus Wogonin. عرض المزيد من فحوصات CCK -8 و LDH أن EX527 أضر بالتأثير التصالحي لـ wogonin على صلاحية خلايا A549 المستحثة بـ LPS (الشكل 6 ب). إلى جانب ذلك ، تم التخفيف جزئيًا من تأثيرات wogonin على تعبير Bcl -2 و Bax و Cyto-C و caspase 3 المشقوق بواسطة EX527 في خلايا A549 المستحثة بـ LPS (الشكل 6C). أخيرًا ، اتجاهات تباين العوامل الالتهابية (TNF- و IL -6 و IL -1) والبروتينات المرتبطة بالالتهاب (Cox -2 و p-NF-kB p65) و أظهرت علامات الإجهاد التأكسدي (SOD و GSH-Px و MDA) في خلايا A549 المستحثة بـ LPS والتي عولجت بشكل مشترك مع wogonin و EX527 أن EX527 أضر بالتأثيرات المثبطة للوجونين على الالتهاب والإجهاد التأكسدي في خلايا A549 المستحثة بـ LPS (الشكل. 7A-K). لذلك ، يعكس مثبط SIRT1 EX527 التأثيرات الوقائية للوجونين على الأنماط الخبيثة لخلايا A549 المستحثة بـ LPS.

Regulation of wogonin on SIRT1-mediated HMGB1 deacetylation in LPS-induced A549 cells following treatment with wogonin. Western blot assay analyzed the expression of proteins involved in SIRT1-mediated HMGB1 deacetylation. All experiments were performed in triplicates (n=3). ***P<0.001 vs. control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs. LPS; &&&P<0.001 vs. LPS+5 μM wogonin; @P<0.05, @@P<0.01 vs. LPS+10 μM wogonin

The regulation of SIRT1 inhibitor EX527 on the apoptosis of LPS-induced A549 cells treated with wogonin. A Western blot analyzed the expression of proteins involved in SIRT1-mediated HMGB1 deacetylation in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527. B The viability LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527 was detected by CCK-8 and LDH assays. C The expression of apoptosis-related proteins in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527 was tested by western blot analysis. Results were generated from three independent experiments (n=3). ***P<0.001 vs. control; ##P<0.01, ###P<0.001 vs. LPS; &P<0.05, &&P<0.01, &&&P<0.001 vs. LPS+wogonin

The regulation of SIRT1 inhibitor EX527 on the infammation and oxidative stress of LPS-induced A549 cells treated with wogonin. The mRNA expression levels of A TNF-α, B IL-6 and C IL-1β were detected by RT-qPCR in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527. ELISA kits were used to evaluate the concentrations of D TNF-α, E IL-1β and F IL-6 in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527. G The expression of infammation-related proteins was examined with western blot analysis in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527. The activities of H SOD, I GSH-Px and the levels of J MDA, K ROS were evaluated by kits in LPS-induced A549 cells treated with wogonin and EX527. Data were obtained from three independent experiments (n=3). ***P<0.001 vs. control; ###P<0.001 vs. LPS; &P<0.05, &&P<0.01, &&&P<0.001 vs. LPS+wogonin

مناقشة

حاليًا ، اعترف العديد من الخبراء بأن ووغونين عامل فعال لعلاج الأمراض الالتهابية. يُقال إن فعاليته في تخفيف الاستجابات الالتهابية تُعزى إلى قمع NF-kB وتفعيل مسارات إشارات العامل النووي ({1}} ذات الصلة بالعامل 2 (Nrf2) [16]. ومن المثير للاهتمام ، أن التقارير السابقة ربطت التأثير المضاد للالتهابات بوساطة تعبير iNOS و Cox -2 أو تنشيط مسارات تأشير أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) / ERK / Nrf2 [5،17]. تمشيا مع النتائج السابقة التي لا تظهر أي تأثير للوجونين على صلاحية الخلايا الغضروفية ، لم نجد فعليًا أي تأثير سام للخلايا مهم لـ wogonin على خلايا A549 الطبيعية ، مما يدعم استكشافنا الإضافي للآلية الأساسية التي من خلالها أثر wogonin في نموذج خلية ALI المختبر [17]. يعد الإجهاد التأكسدي والالتهاب من السمات المميزة الرئيسية في التسبب في الإصابة بـ AL ، وبالتالي اكتشفنا التغييرات في مؤشرات الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات الالتهابية عند علاج wogonin [18]. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تخفيف الالتهاب والإجهاد التأكسدي من خلال التعرض للوجونين في نموذج خلية A549 المعالج بـ LPS ، كما يتضح من الحصار المفروض على إطلاق العامل المؤيد للالتهابات وزيادة إنتاج SOD و GSH-Px ، وكذلك انخفاض إنتاج MDA بعد علاج wogonin يظهر HMGB1 كبروتين محفوظ بدرجة عالية تم تحديده لأول مرة لتعديل الإنتان في نموذج الفئران [19]. تم اعتبار استهداف HMGB1 كخيار علاجي محتمل لعلاج تعفن الدم بسبب حقيقة أن المرضى الذين ظهروا على أنهم استجابات التهابية مطولة أظهروا بشكل متكرر مستويات عالية من HMGB1 [10]. أولت التقارير والمراجعات الأخيرة اهتمامًا كبيرًا بالآثار العلاجية لـ HMGB1 على الأمراض الالتهابية ، ولا تقتصر على تعفن الدم. على سبيل المثال ، تم إثبات سابقًا أن تثبيط HMGB1 بواسطة ulinastatin خفف من إصابة ALI التي يسببها LPS في الفئران [10،20]. بعد إطلاق سراحه من الخلايا الوحيدة / الضامة المنشطة ، عمل HMGB1 كعامل مُحفز للالتهاب عبر المنشطات المختلفة [20]. يمكن أن تؤدي الإشارات الالتهابية مثل LPS إلى الانتقال المرتبط بالأستلة لـ HMGB1 من النواة إلى السيتوبلازم [21]. هنا ، فإن اكتشاف أن انتقال HMGB1 من النواة إلى السيتوبلازم عند تحفيز LPS قد تم التصدي له من خلال علاج ووغونين بشكل غير مباشر أوضح أن التهاب خلايا A549 الناجم عن LPS قد أعاقه ووغونين بقوة.

تم اقتراح أن يلعب SIRT1 دورًا مهمًا في العمليات البيولوجية المختلفة [22]. اعتمادًا على أهداف نزع الأسيتيل ، من المتوقع أن تكون التغييرات في نشاط SIRT1 معنية بالإجهاد التأكسدي والالتهاب [23]. تم التعرف على HMGB1 مؤخرًا كهدف نزع السلاح من SIRT1 [20]. أشارت الأدلة الجوهرية إلى أن 1- نزع الأسيتيل المعدل لـ HMGB1 يخفف الالتهاب ، ويعيد وظائف الكلى ، ويطيل فترة بقاء الفئران المصابة بإصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان [15]. في دراسة تجريبية لإصابات الدماغ الرضحية ، خففت الأحماض الدهنية غير المشبعة أوميغا -3 الالتهاب عن طريق تعديل استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال نزع الأسيتيل المعدل SIRT 1- لمسار HMGB1 / NF-KB [24]. علاوة على ذلك ، منع حمض الأولينوليك نموذج الفئران من النزف تحت العنكبوتية عن طريق نزع السيتلة HMGB1 المعدل بواسطة SIRT 1- [25]. أدى تثبيط NLRP3 / NF-kB بواسطة Aloin عن طريق تنشيط SIRT1 إلى تخفيف ALI الذي يواجه تحدي LPS في الفئران [26]. من خلال تنظيم إشارات SIRT1 / HMGB1 / NF-KB ، حسّن kaempferol إصابة الرئة الناجمة عن نقص التروية - ضخه عن طريق مكافحة الالتهاب والضغط المضاد للأكسدة 27I. باعتباره جزيءًا مهمًا في اتجاه مجرى HMGB1 ، فإن NF-kB هو مسار إشارات رئيسي يشارك في تنظيم الوسطاء الالتهابيين عن طريق تنشيط جينات العامل الالتهابي وإطلاق عدد كبير من العوامل الالتهابية ، بما في ذلك TNF- و IL -6 و TNF -a [28،29] بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ NF-KB أن يشارك أيضًا في عملية الإجهاد التأكسدي من خلال تنظيم إنتاج ROS والتأثير على مستويات SOD و MDA و GSH-Px [30]. لوحظ انخفاض تعبير p-NF-kB p65 بعد إضافة wogonin ، والذي تمت استعادته بواسطة مثبط SIRT1 ، EX527. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن HMGB1 المنفّذ بواسطة wogonin كان مصحوبًا بتعبير SIRT1 المنشط ، مما أدى إلى تكهناتنا بأن wogonin قد يمارس تأثيرات وقائية على التهاب خلايا A549 الناجم عن LPS بواسطة SIRT 1- بوساطة HMGB1. أظهر استخدام EX527 في التجارب التالية أيضًا أن تثبيط SIRTl عكس التأثيرات الوقائية لـ wogonin على التهاب خلايا A549 المستحثة بـ LPS.

cistanche extract powder

استنتاج

في الختام ، أوضحنا أن ووغونين خفف من الالتهاب والإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج لنموذج خلية ALI الناجم عن LPS. يبدو أن آلية العمل هذه ناتجة عن تنظيم SIRT 1- بوساطة نزع السيتلة HMGB1 الذي تم تشغيله بواسطة wogonin. قد تحدد هذه النتائج آلية جديدة يمارس من خلالها wogonin تأثيرات وقائية على ALI وتوفر أساسًا تجريبيًا لتطبيق wogonin في العلاج السريري لـ ALI.

المواد والأساليب

ثقافة الخلية والأدوية

Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>تم شراء 99 في المائة) ، معزولة من Scutellaria baicalensis Georgi ، من Biotic Chemical (تايبيه ، تايوان). تم إذابته في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وتم تخزينه عند -20 درجة مئوية ، وتم تخفيفه بواسطة DMEM. مثبط SIRT1 EX527 （10 ميكرومتر ؛ MedChemExpress، Shanghai، China) تم استخدامه لعلاج الخلايا لمدة 24 ساعة قبل الإعطاء وفقًا للدراسة السابقة [31].

مقايسة مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8)

بعد تحفيز LPS لمدة 24 ساعة وتركيزات مختلفة من التعرض للوجونين لمدة 4 ساعات أخرى ، تم زرع الخلايا في 96- لوحة جيدة وتم إجراء فحص قابلية الخلية للخلية عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كاشف CCK -8 （Dojindo ، كوماموتو ، اليابان） في كل بئر عند 37 درجة لمدة 4 ساعات. تمت مراقبة الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Bio-Rad Laboratories ، Inc.).

مقايسة إطلاق اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH)

تم زرع طاف الخلية الذي تمت معالجته بـ wogonin في 96- ألواح زراعة البئر واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة باستخدام 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، قبل إضافة 100 ميكرولتر من محلول LDH لمجموعة اكتشاف السمية الخلوية (Roche Diagnostics ، فرنسا) لكل منهما بعد 15 دقيقة ، تم تخفيف طاف الخلية ، مع مراقبة قيمة الكثافة البصرية عند 450 نانومتر.

تم إجراء اختبار تلطيخ TUNEL بوساطة ترانسفيراز-ديوكسينوكليوتيديل الطرفية لتقييم موت الخلايا المبرمج لخلايا A549 المستحثة بـ LPS مع أو بدون علاج wogonin بواسطة مجموعة فحص موت الخلايا المبرمج اللوني TUNEL (Beyotime ، شنغهاي ، الصين) بناءً على العملية القواعد الارشادية. بعد غسل محلول الفوسفات الملحي (PBS) مرتين والتثبيت بنسبة 4 بالمائة لامتصاص العرق لمدة 0. 5 ساعات ، 0. 3 بالمائة من بيروكسيد الهيدروجين في برنامج تلفزيوني تم استخدام لاحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. عولجت الخلايا بعد ذلك باستخدام ثنائي أمينوبنزين (DAB) لمدة 10 دقائق وتمت مواجهتها بواسطة الهيماتوكسيلين (سولاربيو ، بكين ، الصين) لمدة 30 ثانية. لوحظت الخلايا الإيجابية الأبوطوزية بواسطة مجهر مضان (شركة أوليمبوس) وتم تأهيل معدل موت الخلايا المبرمج بواسطة برنامج Image-J (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية).

أكريدين برتقال / تلطيخ بروميد إيثيديوم مزدوج

تم إجراء فحوصات مضان مزدوج لبرتقال أكريدين / إيثيديوم (AO / EB) لتقييم تغير موت الخلايا المبرمج. باختصار ، نمت خلايا A549 على أغطية زجاجية في 24- ألواح بئر. تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة 24 ساعة باستخدام وسط خالٍ من المصل ثم تم تحضينها باستخدام LPS وتركيزات مختلفة من wogonin عند 37 درجة مئوية. تم غسل الخلايا باستخدام PBS وتزويدها بمحلول مختلط 5 ميكرولتر AO / EB 100 ميكروغرام / مل من AO و 100 ميكروغرام / مل من EB ممزوجًا في PBS ، علاء الدين ، الصين） في غضون 3 دقائق. لوحظت الخلايا والتقطت صورة بطول موجة إثارة 510 نانومتر تحت مجهر مضان (شركة أوليمبوس).

تحليل لطخة غربية

تم استخراج البروتينات من خلايا A549 باستخدام محلول تحلل RIPA (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين) وتم قياس تركيزات البروتينات بواسطة مجموعة فحص البروتين من حمض البيسينشونينيك (BCA) (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك ، تم إجراء 10 في المائة من الرحلان الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) لفصل 40 ميكروغرام من البروتينات ثم تم نقل البروتينات إلى أغشية بولي فينيل إيدن ثنائي فلوريد (PVDF). تم بعد ذلك سد هذه الأغشية بالحليب الخالي من الدسم ثم تم تحضينها عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة الأولية. بعد ذلك ، تم استخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق مع HRP لاحتضان الأغشية لمدة 1.5 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. أخيرًا ، تم تصور العصابات بواسطة مجموعة توهج كيميائي محسّن (ECL) (Amersham Biosciences ، Buckinghamshire ، UK) ، بينما تمت مراقبة كثافة النطاق باستخدام برنامج Image-J (NIH ، Bethesda ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اعتبار GAPDH كمرجع داخلي.

النسخ العكسي الكمي PCR (RT-gPCR)

تم تحليل خلايا A549 في 1 مل من كاشف TRIzol (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي. بعد جمع إجمالي الحمض النووي الريبي ، تم إجراء النسخ العكسي لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بواسطة مجموعة كاشف PrimeScript RT (Takara Bio ، Inc.) وكانت الشروط كما يلي: 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، و 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، تم استخدام SYBR Premix Ex Taq TM (TaKaRa ، اليابان) للحفظ بدرجة 4 لضبط ظروف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ونظام التفاعل بناءً على اقتراحات الشركة المصنعة. تم استخدام أداة ABI 7500 (AB -4351107 ؛ Applied Biosystems ؛ Thermo Fisher Scientific، Inc.) لـ qPCR. تم استخدام شروط التدوير الحراري التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة لمدة 10 دقائق ؛ تليها 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتلدين عند 60 درجة لمدة دقيقة واحدة ؛ وتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. تم قبول GAPDH كعنصر تحكم تطبيع للتعبير الجيني النسبي. تم إجراء حساب التعبير الجيني النسبي بواسطة طريقة AAct 2-.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم قياس المستويات الخلوية للإنترلوكين -6 (IL -6) و IL -1 وعامل نخر الورم- (TNF-) في طاف الخلية باستخدام IL -6 ELISA Kit و IL -1 ELISA Kit و TNF- ELISA Kit بناءً على اقتراحات الشركة المصنعة (Shanghai Xi Tang Biotechnology ، شنغهاي ، الصين).

الكشف عن الاكسدة

للكشف عن الإجهاد التأكسدي ، تم اكتشاف أنشطة علامات الإجهاد التأكسدي بما في ذلك malondialdehyde (MDA) ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px) ، وديسموتاز الفائق (SOD) باتباع إرشادات الشركة المصنعة (Nanjing Jiancheng Biotechnology المعهد ، الصين).

تحليل احصائي

تم عرض جميع البيانات على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. للمقارنات بين مجموعات متعددة ، تم إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) مع اختبار Tukey اللاحق ، بينما تم إجراء تلك بين مجموعتين بواسطة اختبار الطالب t. ص<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">

cistanche plant

الاختصارات

AL: إصابة الرئة الحادة. LPS: عديدات السكاريد الدهنية. HMGB1: صندوق مجموعة عالي الحركة 1 بروتين ؛ PPARy. مستقبلات غاما المنشط بالبيروكسيسوم ؛ MAPK: بروتين كيناز Mitogen-Activated ؛ JNK: C-Jun NH (2) كيناز نهائي ؛ CLP: ربط الأعور والثقب ؛ DMEM: وسيط النسر المعدل Dulbecco ؛ DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ CCK -8: مجموعة عد الخلايا -8 ؛ LDH: نازعة هيدروجين اللاكتات ؛ TUNEL: وضع العلامات على طرف النيكل بوساطة ترانسفيراز-ديوكسينوكليوتيديل ؛ PBS: محلول ملحي الفوسفات ؛ DAB: ديامينوبنزين ؛ AO / EB: أكريدين برتقال / بروميد إيثيديوم ؛ BCA: حمض بيسينشونينيك ؛ SDS-PAGE: الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد ؛ PVDF: بوليفينيلدين ديفلوريد ؛ ECL: اللمعان الكيميائي المحسن ؛ (كدنا): الحمض النووي التكميلي. ELSA: مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ؛ IL: انترلوكين. TNF-a: عامل نخر الورم- a ؛ MDA: Malondialdehyde ؛ GSH-Px الجلوتاثيون بيروكسيديز ؛ SOD: ديسموتاز الفائق ؛ SD: الانحراف المعياري ؛ ANOVA: تحليل التباين ؛ كوكس -2: انزيمات الأكسدة الحلقية -2 ؛ Nrf2: العامل النووي الكريات الحمر 2- العامل المرتبط 2 ؛ ROS: أنواع الأكسجين التفاعلية.

مراجع

1. Mokra D ، Kosutova P. المؤشرات الحيوية في إصابة الرئة الحادة. Respir Physiol Neurobiol. 2015 ؛ 209: 52-8.

2. Hayes M ، Curley G ، Ansari B ، Laffey JG. مراجعة سريرية: علاجات الخلايا الجذعية لإصابة الرئة الحادة / متلازمة الضائقة التنفسية الحادة - أمل أم دعاية؟ العناية الحرجة. 2012 ؛ 16 (2): 205.

3. Angus DC و Clermont G و Linde-Zwirble WT و Musthafa AA و Dremsizov TT و Lidicker J وآخرون. تكاليف الرعاية الصحية والنتائج طويلة المدى بعد متلازمة الضائقة التنفسية الحادة: تجربة المرحلة الثالثة من استنشاق أكسيد النيتريك. كريت كير ميد. 2006 ؛ 34 (12): 2883-90.

4. Hu JT و Lai J و Zhou W و Chen XF و Zhang C و Pan YP وآخرون. خفف انخفاض حرارة الجسم من إصابة الرئة الحادة التي يسببها LPS في نماذج الفئران من خلال مسار TLR2 / MyD88. اكسب الرئة الدقة. 2018 ؛ 44 (8-9): 397-404.

5. تشي يس ، ليم إتش ، بارك إتش ، كيم إتش بي. آثار ووغونين ، فلافون نباتي من سكوتلاريا جذر ، على التهاب الجلد: التنظيم في الجسم الحي للتعبير الجيني المرتبط بالالتهاب. Biochem فارماكول. 2003 ؛ 66 (7): 1271–127.

6. Wei CY ، Sun HL ، Yang ML ، Yang CP ، Chen LY ، Li YC ، et al. التأثير الوقائي للوجونين على إصابات الرئة الحادة التي يسببها الذيفان الداخلي عن طريق تقليل الفسفرة p38 MAPK و JNK. إنفيرون توكسيكول. 2017 ؛ 32 (2): 397-403.

7. Yeh YC ، Yang CP ، Lee SS ، Horng CT ، Chen HY ، Cho TH ، et al. يتم منع إصابة الرئة الحادة الناجمة عن عديدات السكاريد الدهنية بواسطة ووغونين في الفئران عن طريق تقليل الفسفرة Akt وتنشيط RhoA. J فارماكول 2016 ؛ 68 (2): 257-63.


قد يعجبك ايضا