تحليل البروتين والقدرات المضادة للفيروسات ومضادات السرطان ومضادات الأكسدة في المختبر من المستخلصات المائية لعدسات العدس والفطر الصالح للأكل

لمزيد من التفاصيل ، يرجى الاتصالtina.xiang@wecistanche.com

الملخص: في هذه الدراسة ، قمنا بفحص المستخلصات المائية للفطر الصالح للأكل Pleurotus ostreatus (فطر المحار) و Lentinula edodes (فطر شيتاكي). تم إجراء تحليل البروتين باستخدام LC-Triple TOF-MS وأظهر التعبير عن 753 بروتينًا بواسطة Pleurotus ostreatus و 432 بروتينًا بواسطة Lentinula edodes. الببتيدات النشطة بيولوجيا: تم تحديد مثبط تفكك الناتج المحلي الإجمالي للربب ، ديسموتاز الفائق ، اختزال ثيوردوكسين ، بروتيناز السيرين ، والليكتين ، في كلا الفطر. تضمنت المقتطفات أيضًا مركبات واعدة نشطة بيولوجيًا بما في ذلك الفينولات ،مركبات الفلافونويدوالفيتامينات والأحماض الأمينية. أظهرت المقتطفات واعدةالأنشطة المضادة للفيروسات، بمؤشر انتقائي (SI) 4.5 لـ Pleurotus ostreatus ضد الفيروس الغدي (Ad7) ، ونشاط طفيف لعدسات Lentinula ضد الهربس البسيط II (HSV -2). لم تكن المقتطفات سامة للخلايا للخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي الطبيعي (PBMCs). على العكس من ذلك ، فقد أظهروا سمية خلوية معتدلة ضد سلالات الخلايا السرطانية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم نشاط مضادات الأكسدة باستخدام DPPHالكسح جذري، ABTS الراديكالية الكسح الكاتيون ، ومقايسات ORAC. أظهر المستخلصان إمكانيةأنشطة مضادات الأكسدة، مع أقصى نشاط لوحظ لـ Pleurotus ostreatus (IC50 ug / mL) =39 .46 ± 1.27 لـ DPPH ؛ 11.22 ± 1.81 لـ ABTS ؛ و 21.40 ± 2.20 لفحوصات ORAC. تشجع هذه الدراسة على استخدام هذه الفطريات في الطب في ضوء انخفاض سمية الخلايا على PBMCs العادية مقابل قدراتها المضادة للفيروسات والأورام ومضادات الأكسدة.

الكلمات الدالة: فطر العفن الأبيض. بلوروتوس ostreatus. لينتينولا اودود شيتاكي. مضادات الأكسدة. مضاد للورم. مضاد فيروسات

1 المقدمة

تمتلك الفطر آفاقًا كبيرة في الطب وإنتاج المواد الغذائية. بالإضافة إلى احتوائه على خصائص حسية جيدة وقيم غذائية عالية ، تم الإبلاغ عن أن العديد من أنواع الفطر تحتوي على عدد لا يحصى من الأنشطة الدوائية [1-3]. من بين أنواع الفطر المزروعة على نطاق واسع Lentinula edodes (فطر شيتاكي) و Pleurotus ostreatus (فطر المحار). يأتي شيتاكي في المرتبة الثانية بعد Agaricus bisporus باعتباره أكثر أنواع الفطر الصالح للأكل استهلاكًا في جميع أنحاء العالم [4]. هذا الفطر له تأثيرات واعدة كمضاد للبكتيريا ، ومضاد للفطريات ، ومضاد للفيروسات ، وقائي للكبد ، ومضاد لفرط سكر الدم ، وتأثيرات مناعية [5-7]. وهو غني بالجزيئات النشطة بيولوجيًا ، وأكثرها دراسة "لينتينان" ، وهو عديد السكاريد الذي له تأثير ضد البكتيريا والفيروسات والأورام ، بالإضافة إلى مادة "اللنتينان" التي تساعد في السيطرة على دسليبيدميا وارتفاع السكر في الدم [8]. Pleurotus ostreatus ، النوع الأكثر شيوعًا من جنس Pleurotus [9] ، والمعروف أيضًا باسم فطر المحار ، هو محلل للأخشاب ولديه مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية [10]. بالمقارنة مع الفطر العلاجي الآخر ، أصبح فطر المحار أكثر شيوعًا كمحفز للصحة [11]. إن وجود عدد كبير من المكونات الغذائية مثل الليكتين والسكريات والفيتامينات والمعادن في فطر المحار يجعلها قادرة على امتلاك مضادات محتملة للسرطان ،مضادات الأكسدة، خصائص مضادة لمرض السكر ، مضادات الميكروبات ، ومضادة لفرط كوليسترول الدم [12،13]. بالمقارنة مع أنواع الفطر الأخرى الصالحة للأكل ، فإن فطر المحار وشيتاكي له فترة نمو قصيرة ويمكن حصاده على مدار العام 14. ونتيجة لسهولة زراعته واختباره ، وقيمته الغذائية العالية ، وفوائده الطبية الواعدة ، فإن هذا الفطر يتمتع بإمكانيات هائلة في الصناعات الغذائية والدوائية [4،15]. في الواقع ، يمكن أن تكون الفطريات القاعدية المرتفعة بمثابة وجبات غذائية متعددة الوظائف واعدة.

تم العثور على العديد من المركبات النشطة بيولوجيًا ، بما في ذلك السكريات والبروتينات النشطة من الناحية الفسيولوجية والأحماض الدهنية غير المشبعة والفينولات (الأحماض الفينولية والبوليفينول) والفلافونويدات والتربينويد والبروتينات السكرية والبوليكيتيدات والمنشطات والقلويدات في هذين الفطر [16 ، 17]. تعمل هذه المركبات بشكل منفرد أو تآزري لإحداث التأثيرات الدوائية الواسعة لهذه الفطريات. تم الإبلاغ عن أن فطر الشيتاكي والمحار لهما أنشطة مضادة للبكتيريا والفيروسات وخافضة للضغط ومضادة للأكسدة [1،18،19]. سيو وآخرون. [20] لخص آليات النشاط المضاد للفيروسات للجزيئات الحيوية للفطر ، مشيرًا إلى أن الحد من العدوى الفيروسية يتم بشكل أساسي من خلال التدخل في امتصاص الفيروس في الخلايا المضيفة ، وتكاثره ، وتخليق البروتين والإنزيم ، بالإضافة إلى تحفيز مضيف الاستجابة المناعية [21]. مضادات الأكسدة هي جزيئات مهمة في مواجهة أنواع الأكسجين التفاعلية التي تسبب العديد من المشاكل الصحية. منذ أن تم رفع العديد من العلامات الحمراء ضد استخدام مضادات الأكسدة الاصطناعية ، أصبحت دراسة مضادات الأكسدة الطبيعية إلزامية [22]. كان التأثير المضاد للأورام لمنتجات غرفة الهريسة مرتبطًا بالجزيئات الحيوية بما في ذلك الجلوكان والإرغوستيرول والبروتيوغليكان والأحماض الأمينية (الأرجينين والجلوتامين) [23]. قد تتضمن الآلية المفترضة الكامنة وراء هذا التأثير تحفيز الخلايا اللمفاوية التائية ، وقمع الأوعية الدموية الجديدة ، وتحريض موت الخلايا السرطانية ، بالإضافة إلى تحفيز الاستجابة المناعية ضد الخلايا السرطانية [24 ، 25].

أثبتت البروتيوميات نفسها كواحدة من الأدوات القيمة في الأبحاث الحيوية ، وخاصة البحوث الزراعية [26]. Lindequist وآخرون. [27] كانت المجموعة الأولى التي سلطت الضوء على أهمية استخدام البروتينات في أبحاث الفطر الصالح للأكل. وشددوا على الحاجة إلى استخدام "omics" لدراسة الجزيئات النشطة بيولوجيا الفطرية. نادرا ما تستخدم البروتيوميات في أبحاث الفطر الصالح للأكل مقابل الفطريات المسببة للأمراض [28]. وبناءً على ذلك ، كانت أهداف هذه الدراسة هي تحليل البروتينات في الفطر الصالح للأكل ، Pleurotus ostreatus و Lentinula edodes ، والتحقق من إمكاناتهما.مضاد فيروسات، ومضادات الأورام ، ومضادات الأكسدة.

2. النتائج

2.1.Proteom1e تحليل

تم إجراء تحليل البروتين باستخدام تحليل LC-Triple TOF-MS بمعدل اكتشاف خاطئ (FDR)<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. مجموع المركبات النشطة بيولوجيا إجمالي المحتويات

في تقييم المحتويات الإجمالية ، شمل ذلك تقييم إجمالي الكربوهيدرات والبروتينات والفينولات والفلافونويد. يحتوي مستخلص P. ostreatus على ثلاثة أضعاف عدد الكربوهيدرات ومضاعفة عدد البروتينات الموجودة في مستخلص L.edodes ؛ ومع ذلك ، تم اكتشاف المزيد من مركبات الفلافونويد في مستخلص L.edodes مقارنة بمستخلص P. ostreatus (الجدول 1).

2.3 جزيئات الفينول والفلافونويد

يحتوي كلا مستخلصي الفطر على مادة الكاتيكين (تم اكتشافها في وقت الاحتفاظ 26.48 دقيقة). شملت P.ostreatus بالإضافة إلى ذلك kaempferol و apigenin (تم اكتشافهما في أوقات الاحتفاظ 59.13 دقيقة و 59.56 دقيقة ، على التوالي) ، بينما احتوت L.edodes أيضًا على كيرسيتين (وقت الاحتفاظ=56. 86 دقيقة ؛ الجدول 2 ؛ الشكل S1).

2.4 الفيتامينات

تم تحديد محتويات الفيتامينات القابلة للذوبان في الماء وكذلك الدهون القابلة للذوبان عبر HPLC (الجدول 3 والشكلان S2 و S3). كلا الفطر غني بفيتامين C ، مع كميات ملحوظة من الفيتامينات B3 و B6 و D. لم يكن هناك فرق كبير بين كلا الفطر في كميات الفيتامينات التي يمتلكها. من ناحية أخرى ، لم يتم اكتشاف الفيتامينات B1 و B2 و B9 و A و E في كلا الفطر.

2.5 تحليل الأحماض الأمينية

تم استخدام محلل الأحماض الأمينية Sykam لتحليل الأحماض الأمينية. كان إجمالي محتوى الأحماض الأمينية 5.14 و 4.35 في P.ostreatus و L.edodes على التوالي ، كما هو موضح في الجدول 4 ، والفطران غنيان بحمض الجلوتاميك. بينما تم الكشف عن البرولين بتركيز كبير (0. 57 جم / 100 جم بروتين) في مستخلص P. ostreatus ، لم يتم اكتشافه في مستخلص L.edodes. تم اكتشاف الهيستدين وحمض الأسبارتيك في أي من الفطر.

2.6. الأنشطة البيولوجية

2.6.1 نشاط مضاد للفيروسات

تم تقييم النشاط المضاد للفيروسات ضد فيروسين: الفيروس الغدي والهربس البسيط -2. كما هو مبين في الجدول 5 ، أظهر مستخلص P.ostreatus نشاطًا فعالًا مضادًا للفيروسات ضد الفيروسات الغدية ، مع مؤشر انتقائية يصل إلى 4.5. كما تم تسجيل تأثيرات واعدة مضادة للفيروسات لمستخلص P. ostreatus ضد الهربس البسيط II ومستخلص L.edodes ضد كلا الفيروسين. يمثل الشكلان S4 و S5 منحنيات الاستجابة للجرعة.

2.6.2. النشاط السام للخلايا ضد PBMCs البشري الطبيعي

تم تسجيل الحد الأدنى من السمية الخلوية （IC50 ميكروغرام / مل ؛ 66.41 ± 3.7 و 82.81 ± 2.72 ، لـ P.ostreatus و L. edodes ، على التوالي) ضد PBMCs البشري الطبيعي.

ضد خطوط الخلايا السرطانية

تم استخدام خطوط خلايا سرطانية متنوعة في هذا الاختبار بما في ذلك سرطان البروستاتا (DU -145 و PC3) ؛ سرطان الخلايا الكبدية (HepG2) ؛ سرطان القولون والمستقيم (كولو -205) ؛ سرطان الأعور (LS -513) ؛ سرطان عنق الرحم (هيلا) ؛ وسرطان الثدي (MDA-MB -231 و MCF -7). تم استخدام Doxorubicin كعنصر تحكم إيجابي (تسبب في انخفاض القابلية للحياة إلى 53 بالمائة في HepG2 ؛ 44 بالمائة في MDA-MB -231 ؛ 39 بالمائة في PC3 ؛ 35 بالمائة في DU -145 ؛ 29 بالمائة في MCF -7: 25 بالمائة في LS -513 ، و 23 بالمائة في هيلا ، و 19 بالمائة في خلايا كولو -205). توضح النتائج في الشكل 2 أن مستخلصات Ledodes و P. ostreatus قللت من صلاحية خطوط الخلايا السرطانية المختبرة لـ LS -513 و HepG2 و DU -145 والكمبيوتر الشخصي -3 بنحو 20 نسبه مئويه .

ضد اللوكيميا وخطوط الخلايا الليمفاوية

تم اختبار مستخلصات الفطر من P.ostreatus و L.edodes للتحقق من السمية الخلوية ضد سرطان الدم (CCR-CEM و NB -4 و THP -1) وسرطان الغدد الليمفاوية (U937). كان Doxorubicin هو المعيار الإيجابي ، مما تسبب في انخفاض قابلية الخلية للحياة إلى 29 بالمائة و 25.5 بالمائة و 20.3 بالمائة و 19.1 بالمائة في خلايا U937 و NB4 و CCRF-CEM و THIP1 على التوالي. قلل مستخلص L.edodes من صلاحية خلايا THP1 إلى 66.02 بالمائة ، بينما قلل مستخلص P.ostreatus من صلاحية خلايا CCRF-CEM إلى 70.64 بالمائة (الشكل 3).

2.6.3. النشاط المضاد للأكسدة

تمت دراسة نتائج التأثير المضاد للأكسدة من خلال طرق التقييم الثلاثة ، وهي DPPHالكسح جذري، وكسح الكاتيون الجذري ABTS ، ومقايسات ORAC ، بالمقارنة مع معيار مضادات الأكسدة ، Trolox ، موضحة في الجدول 6 والشكل S6a ، b. أظهرت النتائج أن مستخلص P. ostreatus يمتلك قدرة مضادات أكسدة أكثر فعالية من مستخلص L.edodes ، كما يتضح من مقايسات مضادات الأكسدة الثلاثة المستخدمة. يوضح الشكل 4 تسوس إشارة الفلورسين الناجم عن المقتطفات في مقايسة ORAC.

3. مناقشة

أثارت فطريات العفن الأبيض اهتمام المجتمع العلمي نظرًا لخصائصها الطبية ، والتي تشمل تعديل الجهاز المناعي ، ونشاط خافض لسكر الدم ومضادات التخثر ، وخصائص مضادة لارتفاع ضغط الدم ، ومضادة للالتهابات ، ومضادة للميكروبات ، ومضادة للأورام ، فضلاً عن القدرة على خفض مستويات الكوليسترول في الدم [ 24 ، 36-38]. يعتبر نوعان من الفطريات ذات العفن الأبيض P. ostreatus و L.edodes من أكثر أنواع الفطر الصالح للأكل استهلاكًا في العديد من البلدان [39]. ينتج هذان الفطران عددًا كبيرًا من البروتينات النشطة بيولوجيًا ، ويعد تحليل البروتين حاليًا الأداة الأكثر فاعلية لتحديد خصائص البروتين [40]. في الدراسة الحالية ، أظهر تحليل البروتين تعبيرًا عن البروتينات النشطة بيولوجيًا بما في ذلك مثبط تفكك راب الناتج المحلي الإجمالي ، واختزال ثيوردوكسين ، وبروتينات السيرين ، وديسموتاز الفائق ، والليكتين في فطر الاختبارين. ينظم مثبط تفكك راب الناتج المحلي الإجمالي (Rab GDI) وظيفة Rab GTPases التي تلعب دورًا محوريًا في تهريب الأغشية في الخلايا السرطانية. وبناءً على ذلك ، فإن استخدام Rab GDI هو استراتيجية واعدة لمكافحة السرطان [29].

يساهم بروتين سيرين فيمضاد فيروساتنشاط الفطر الصالح للأكل [30،31]. علاوة على ذلك ، ياب وآخرون. (2018) أبلغ عن سمية خلوية انتقائية قوية لبروتينات السيرين في مواجهة خط خلية سرطان غدي للثدي البشري (MCF7) واقترح أن الآلية تنطوي على التأثير التعاوني لكل من آليات موت الخلايا الداخلية والخارجية ، بالإضافة إلى تحفيز كاسباس {{ 4}} و -9 وتثبيط Bcl -2 [41].

تناولمضادات الأكسدةهي استراتيجية وقائية ميمونة ضد الفسيولوجيا المرضية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) [22]. تظهر نتائجنا تعبيرًا عن إنزيمات نظام الدفاع المضاد للأكسدة بواسطة Pleurotus ostreatus و Lentinula edodes. تتضمن هذه الإنزيمات ديسموتاز الفائق ، الكاتلاز ، والجلوتاثيون بيروكسيديز ، والتي توازن إنتاج ROS [32]. يبدأ ديسموتاز الفائق عن طريق تحويل الأكسيد الفائق إلى بيروكسيد الهيدروجين ، والذي بدوره يتحول بواسطة الكاتلاز والجلوتاثيون بيروكسيديز إلى ماء [33].

تم الكشف عن تعبير الليكتين أيضًا في عيش الغراب. أبلغ العديد من الباحثين عن الملامح البيولوجية المتنوعة بشكل ملحوظ للليكتين مع مجموعة واسعة من الأنشطة التي تشمل الروابط النشطة المضادة للالتهابات ومضادات الاكتئاب ومضادات الحمل والتوسع الوعائي [34،35،42]. الليكتينات عبارة عن بروتينات مرتبطة بالكربوهيدرات مع مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية بما في ذلك تثبيط نمو الورم في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق الارتباط الانتقائي بأغشية الخلايا السرطانية أو مستقبلاتها ، مما يؤدي إلى تنشيط كينازات البروتين ، أو تعديل الاستجابات المناعية من خلال إنتاج الإنترلوكين [43]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن لكتينات الفطر أيضًا دور في إثارة مسارات مختلفة لموت الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والنخر ، و / أو الالتهام الذاتي [42].

تظهر بياناتنا التعبير عن كل من انحلال العظم و pleurotolysin في Pleurotus ostreatus. هذه عبارة عن بروتينات مكونة للمسام ذات أنشطة انتقائية للغاية مضادة للسرطان [44،45]. Ostreolysin هو بروتين حل خلوي بقدرة 15 كيلو دالتون مع القدرة على نفاذية كريات الدم الحمراء والخلايا الأخرى بتركيزات شبه ميكرومولار. يعمل من خلال آلية تناضحية غروانية ويحث على تكوين مسام غشاء واسعة|46،47I. نمري وآخرون أنتج pleurotolysin المؤتلف مع نشاط مضاد للأورام قوي ضد خلايا ورم القولون البشري والفأر [48].

في L.edodes ، تم التعبير عن البروتين المحتوي على فالوسين ودبوس المزلاج. تم الإبلاغ سابقًا عن وجود بروتين يحتوي على Valosinمضادات الأكسدةالخصائص التي يمكن أن تساعد في المتلازمات العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب الجانبي والخرف [49-51]. Latcripin هو عامل محتمل مضاد للسرطان [50]. حقق Riaz Ud Din et al. (2020) في الآلية المضادة للسرطان لمزلاج دبوس ضد خطوط خلايا سرطان الثدي. أبلغوا عن قدرته على إحداث موت الخلايا وكذلك الالتهام الذاتي ، بالإضافة إلى تأثيره التثبيطي على الهجرة والغزو [52].

تم تحديد كمية مجموعة من المركبات النشطة بيولوجيًا في مستخلصات P.ostreatus و L.edodes. تم اكتشاف TPN's من 19.37 ± 0. 39 و 24.14 ± 1. 0 1 مجم / جم من خلاصة P.ostreatus و L.edodes ، على التوالي ، تم اكتشافها في الدراسة الحالية. هذه القيم أعلى من تلك التي سجلها رحيمة وزملاؤها ، الذين استخدموا اختبارات الأمونيوم وشينودا لتقدير محتوى الفلافونويد الكلي في P. ostreatus على أنه 6.67 مجم / جم من المستخلص [53]. بالإضافة إلى ذلك ، نتائجنا أعلى من تلك التي وجدها Montibus وآخرون ، الذين قيموا TPC في مستخلصات L edodes باستخدام طريقة Folin-Ciocalteu ووجدوا 0. 8-1. 5٪ وزن جاف (DW) في القبعات و 0. 8-1. 1٪ dw في الشرائط [54].

تم الكشف عن الكاتشين في مستخلصات P. ostreatus و L.edodes. الكاتشين هو مستقلب الفينول الثانوي للنبات ، وله خصائص قوية لكسح الجذور الحرة [55]. تم العثور على مستخلص L.edodes يحتوي على كيرسيتين الفلافونويد. يتم التوسط في التأثير المضاد للأكسدة من الكيرسيتين عن طريق تنظيم مستويات الجلوتاثيون وزيادة إنتاج إنزيمات مضادات الأكسدة بما في ذلك الجلوتاثيون ترانسفيراز و Aldo-keto reductase [56]. بالإضافة إلى ذلك ، ورد أن كيرسيتين له نشاط مضاد للأورام من خلال مقاطعة دورة الخلية وتعزيز موت الخلايا المبرمج [57،58]. لي وآخرون. ذكرت أن كيرسيتين يسبب توقف الخلايا في خطوط الخلايا السرطانية PC3 و Du145 و U937 [59]. تكشف نتائجنا أيضًا أنه تم العثور على kaempferol و apigenin في P.ostreatus. لقد ثبت أن Kaempferol و apigenin لهما أنشطة مضادة للأكسدة ومضادة للتكاثر [60-62]. تم العثور على حمض الجلوتاميك ليكون أكثر الأحماض الأمينية وفرة في كلا مستخلصات الفطر. على نفس المنوال ، قام Chirinang وزملاؤه بتحليل محتوى الأحماض الأمينية في P. ostreatus و P. major-caju ووجدوا أن محتوى حمض الجلوتاميك كان الأعلى ، يليه حمض الأسبارتيك ثم الأرجينين [63].

أظهرت المتصورة البروتستريتوس و L. edodes نشاطًا واعدًا مضادًا للفيروسات ضد الفيروس الغدي وفيروس الهربس البسيط الثاني ، حيث وصل مؤشر SI إلى 4.5 لمستخلص P. ostreatus ضد الفيروس الغدي. تم استخدام SI لتقييم فعالية وسلامة المستخلصات حيث أنه يقدر النافذة بين الأنشطة السامة للخلايا والأنشطة المضادة للفيروسات. كلما ارتفع SI ، كان المركب أكثر أمانًا وكفاءة [64،65]. تم عرض البيانات ذات الصلة مؤخرًا بواسطة Urbancikova et al. ، حيث قللت المكملات المستندة إلى Pleuran (غير قابلة للذوبان -1 ، 3/1 ، 6- D-glucan معزولة من P. ostreatus) بشكل كبير مدة فيروس الهربس البسيط - أنا أعراض ، مع انخفاض شدة أعراض الجهاز التنفسي ، في المرضى المصابين بفيروس الهربس البسيط - I - إيجابي من مجموعة الدواء الوهمي ، دون آثار جانبية كبيرة ، واقترح الجنبي للاستخدام المستقبلي المحتمل في علاج فيروس الهربس البسيط الحاد- I [66].

يرجع التأثير المضاد للفيروسات للفطر في الغالب إلى التدخل في امتصاص الفيروس ، والتكاثر ، ونشاط الإنزيم ، والببتيدات العاملة بالإضافة إلى تقوية الجهاز المناعي للمضيف [67]. اقترح Seo and Choi (2021) أن -جلوكان الموجود في جزء عديد السكاريد من P.ostreatus و L.edodes قد يكون مسؤولاً عن تأثيره المضاد للهربس من خلال تأثيرات ما قبل العلاج وبعده [20]. قد يكون التأثير المضاد لفيروس نقص المناعة البشرية للمستخلصات المائية من P. ostreatus و L.edodes ناتجًا عن تثبيط إنزيم المنتسخة العكسية بواسطة البروتين الشبيه باليوبيكويتين واللبتين على التوالي [68،69].

تم إثبات أن المستخلصات المائية من عيش الغراب لدينا تمنع بقاء خطوط الخلايا السرطانية المختبرة بحوالي 20 بالمائة. لقد رأينا أيضًا تأثيرات مماثلة ضد سلالات خلايا سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية ، مع انخفاض في قابليتها للحياة إلى 66 بالمائة مع مستخلص L.edodes ضد خلايا THP1Lukemia ، وإلى 70.6 بالمائة مع مستخلص P.ostreatus ضد خلايا سرطان الدم CCRF-CEM. تم الإبلاغ سابقًا عن أن مستخلصات الجسد الفطري المائي وجسم الفاكهة من L.edodes تمارس إجراءات مضادة للتكاثر والاستماتة على خلايا سرطان الثدي MCF -7 [70]. كان جزء أسيتات الإيثيل وجلوكان من L.edodes مسؤولاً في الغالب عن هذه الإجراءات [71،72]. في نفس السياق ، كان مستخلص P. ostreatus قادرًا على إظهار نشاط مضاد للتكاثر تجاه خلايا MCF -7 و MDA-MB -231 سرطان الثدي الغدي [73] ، و 6- الجلوكانات المرتبطة عزز المستخلص السمية الخلوية القاتلة الطبيعية ضد خلايا سرطان الثدي والرئة [74]. في الآونة الأخيرة ، ياكوبوفيتش وآخرون. وجد أن مستحضرات الفطر الطبية المكونة من 6 و 10 عيش الغراب بما في ذلك L.edodes و P. ostreatus أظهرت تأثيرات كبيرة مضادة للتكاثر ومحفزة للاستماتة على سلالات الخلايا السرطانية في القولون والمستقيم (HCT -116، SW620) [75]. على العكس من ذلك ، لاحظ المؤلفون أن التأثير على خط الخلايا الليفية البشرية (WI -38) كان تكاثريًا ، مما يوضح خصوصية مستحضرات الفطر هذه تجاه خطوط الخلايا السرطانية. وبالمثل ، اكتشفنا الحد الأدنى من السمية الخلوية التي تفرزها فطرنا ضد PBMCs البشري الطبيعي. تشير هذه النتيجة أيضًا إلى الاستخدام الآمن للفطر.

تُعزى السمية الخلوية للفطر إلى مجموعة واسعة من الجزيئات بما في ذلك x و -glucans والبروتينات والبروتينات السكرية والأحماض الدهنية ومضادات النوكليوزيدات والتيربينويدات والمركبات الفينولية [76]. عبد الله وآخرون (2012) اقترح أن مستخلصات الفطر تمنع تكاثر خلايا سرطان الثدي عن طريق تثبيط نشاط الأروماتاز ​​[77]. إمام وآخرون. (2021) عزل حامض اللاكتيك الإندولي من ليدود الذي منع انقسام خلايا سرطان الرئة [78]. يوكاوا وآخرون (2012) اقترح أن التأثير الاستماتي المباشر لـ L edodes mycelia على خلايا HepG2 يتم من خلال تنشيط مسارات مستقبلات الموت -3 و -8 [79]. درس Wu et al. (2011) التأثير السام للخلايا لمستخلص بروتين P. ostreatus على خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري (SW480) وسرطان الدم أحادي الخلية البشري ، THP -1 (الخلايا) ، وأبلغ عن إنتاج ROS ، والإرهاق الجلوتاثيون ، وتغيير إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتفكك الحمض النووي قليل النوى ، مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا SW480 [80].

بما أن مضادات الأكسدة لا تعمل من خلال آلية واحدة ، فإن تقييم قدرة مضادات الأكسدة يتم عادة من خلال أكثر من طريقة واحدة [81]. في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاث طرق للتقييم ، وهي فحوصات DPPH و ABTS و ORAC. تم تقييم آلية مضادات الأكسدة SET (نقل الإلكترون الفردي) من خلال مقايسة DPPH ، بينما تم استخدام مقايسات ABTS و ORAC لتفاعلات HAT (نقل ذرة الهيدروجين) [81]. يوفر اختبار ORAC تقديرات أكثر دقة لأنه يجمع بين وقت التثبيط ودرجة التثبيط في مصطلح واحد [82]. بينما يتم استخدام مقايسة الفوسفوموليبدات بشكل شائع للتعبير عن إجمالي سعة مضادات الأكسدة (TAC) ، يتم استخدام جميع الطرق الثلاثة

في هذه المخطوطة تم الإبلاغ عنها لتقييم TAC. وصف Munteanu و Apetrei (2021) ، في مراجعتهما للطرق المستخدمة في تحديد نشاط مضادات الأكسدة ، مقايسة الكسح الجذري ABTS بأنها "طريقة بسيطة ومريحة تستخدم لقياس السعة الكلية لمضادات الأكسدة (TAC)" [83]. في دراستهم المقارنة ، Csepregi et al. (2016) مقارنة بين أربع طرق مستخدمة لتقييم TAC ، والتي كانت سعة مضادات الأكسدة المكافئة لـ Trolox (TEAC) ، وإمكانية تقليل مضادات الأكسدة الحديديك (FRAP) ، و 2 ، 2- diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) مقايسة الكسح الجذري ، وتفاعلية كاشف Folin-Ciocalteu (FCR) [84]. في عام 2013 ، قدم Ou وآخرون ORAC كطريقة جديدة لتقييم TAC [85] ، وفي نفس السياق ، Rubio et al. (2016 ) صنفت مقايسة ORAC على أنها من بين الطرق المباشرة لتحديد TAC ، جنبًا إلى جنب مع TEAC [86]. تظهر نتائج فحوصات ABTS و ORAC أن مستخلصات P. ostreatus و L.edode تتمتع بقدرات مضادة للأكسدة أعلى من تلك الموجودة في مضادات الأكسدة القياسية ، Trolox.

قد يعزى التأثير المضاد للأكسدة للفطر إلى وجود العديد من المكونات النشطة بيولوجيًا بما في ذلكمركبات الفلافونويد، الفينولات ، الببتيدات النشطة بيولوجيًا ، وفيتامين ج [87]. جابر وآخرون مقارنة ABTS ، DPPH ، قوة مضادات الأكسدة الحديديك (FRAP) ، و ORAC لتقييم قدرة مضادات الأكسدة في مستخلصات الجوافة وأبلغت عن وجود علاقة إيجابية بين القوى المضادة للأكسدة ، على النحو الذي تحدده الطرق الأربعة ، ومحتوى فيتامين C و TPN. من ناحية أخرى ، سجلوا ارتباطًا سلبيًا مع محتوى الكاروتين [88]. DPPH (1 ، 1- Diphenyl -2- picryl-hydrazyl) هو جذر حر ثابت يحتوي على إلكترون تكافؤ غير مزدوج في ذرة واحدة من جسر النيتروجين ؛ وبالتالي ، فإن تنظيف جذور DPPH هو أساس مقايسة مضادات الأكسدة DPPH الشائعة [89]. تفقد الكاتيون الجذري 2،2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- sulfonate) (ABTS) لونه الأزرق عندما يتم تقليله بواسطة أحد مضادات الأكسدة ، ويمكن قياس تغير اللون بطريقة قياس الطيف الضوئي [90]. يقيس اختبار ORAC التدهور التأكسدي لمسبار التألق بواسطة الجذور الحرة التي تنقطع بواسطة المادة المضادة للأكسدة. وفقًا لذلك ، كلما زادت قدرة مضادات الأكسدة ، قل الوقت اللازم لإخماد التألق [91]. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن المستخلصات المختبرة أظهرت تأثيرات واعدة مضادة للأكسدة عند اختبارها من خلال الطرق المذكورة أعلاه ، يمكن الاستنتاج أنها تعمل من خلالإزالة الجذور الحرة. ومع ذلك ، فإن الفطر الذي تم اختباره يحتوي على محتويات إجمالية كبيرة من الفلافونويد ، وبما أنه تم ربط الفلافونويد بتفعيل عامل النسخ Nrf2 (2017) ، يمكن إضافة هذا كآلية مفترضة [92].

4. المواد والطرق

4.1.إعداد أنواع الفطر والتربية الفرعية

تم الحصول على عيش الغراب P. ostreatus و L.edodes الذي تم تحديده سابقًا ، كبيض و / أو أجسام ثمرية ، من مجموعة الاستزراع في مركز البحوث الزراعية ، القاهرة ، مصر [93،94]. تم استخدام الشفرات الجراحية لتقطيع الثمار معقمًا من أجل الزراعة الفرعية من أجسام فطر عيش الغراب. تم حصاد الفطريات الداخلية باستخدام إبر معقمة وزُرعت في صفائح معقمة من البطاطس Dextrose Agar (PDA) (ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا) 95]. لزراعة البويضات الفطرية ، تم استخدام ملقط معقم لقطف البذور ونقلها معقمًا إلى أطباق PDA المعقمة ، والتي تم تحضينها عند 28 درجة لمدة 7 أيام ، وتم غسل أجسام الثمار لكل سلالة على حدة. تُترك كل عزلة (500 جم) لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة الغرفة لتجف في الهواء ، ويتم طحنها يدويًا في مطحنة المطبخ ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في منطقة جيدة التهوية للاستخدام المستقبلي.

4.2 استخراج مائي من Pleurotus Ostreatus و Lentinus Edodes

تم طحن كل فاكهة مجففة من كل عزلة إلى مسحوق سعة 500 جرام باستخدام خلاط منزلي ، ثم نقعها ثلاث مرات في 7 لتر من الماء المقطر عند درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أيام ، فوق الصوتية (منظف بالموجات فوق الصوتية ، إنجلترا ، المملكة المتحدة) ، ثم ترشيحها. تكررت عملية النقع والترشيح حتى نفاد السائل. تم استخدام الإيثانول لتخزين المحصول. بعد تبخر الإيثانول عند 45 درجة ، تم تجفيف إجمالي 500 مل من كل عزلة للحصول على ما يقرب من 20 جم من المتبقي الجاف من كل مستخلص [96].

4.3 التحليل البروتيني

تم إجراء التحليل البروتيني في وحدة البروتينات والأيض في مستشفى سرطان الأطفال في مصر 57357 (CCHE) ، القاهرة ، مصر. حوالي 6 0 0 uL من 8 مليون يوريا في 5 0 0 ملي تريس (pH8.5) و 6 0 uL كامل البروتياز (Roche ، مانهايم ، ألمانيا) إلى كل عينة ، ثم تم اهتزاز العينات بقوة وطردها عند 1 0 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. تم جمع المواد الطافية ، وتم حقن الكسور 1 ميكروغرام / 10 ميكرولتر） باستخدام نظام NanoLC. تم إقران نظام TOF الثلاثي لقياس الطيف الكتلي (Sciex TripleTOF 5600 plus ، AB SCIEX ، Concord) بالكروماتوجرافيا السائلة (LC) (3 um ، ChromXP C18 CL ، 120 A ، 150 × 0.3 مم) ، ويتألف من جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي Eksigent nanoLC400 المرفق بـ مضخة Ekspert nanoLC425 ، بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 55 دقيقة ، لكل عينة [97]. تم إجراء تحليل البيانات بواسطة ProteinPilot (الإصدار 5.0.1.0،4895) وخوارزمية Paragon (الإصدار 5.0.1.0 ، 4874). تمت محاذاة تسلسل البروتين مع التسلسلات في Swiss-Prot وقاعدة بيانات TrEMBL (Pleurotus sp. تحتوي على 14792 مدخلًا لـ P. ostreatus ، و Lentinula sp. تحتوي على 12603 مدخلات لـ L.edodes) [98]. تم توضيح البروتينات التي تم التعرف عليها بشكل شائع بين أنواع الفطر باستخدام برنامج Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull ، إنجلترا ، المملكة المتحدة).

4.4. توصيف المركبات النشطة بيولوجيا

كما ورد سابقًا ، تم تحديد إجمالي محتوى الكربوهيدرات القابل للذوبان باستخدام تقنية حمض الكبريتيك الفينول [100]. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD) ، وأجريت التجارب في ثلاث نسخ.

تم تحديد إجمالي محتوى الفينول (TPC) وإجمالي محتوى الفلافونويد (TFC) كما ورد بواسطة Ryan et al. [101]. تم تحضير العينات بتركيز 20 مجم / مل في الماء. تم تحضير حمض الغال (1 مجم / مل من محلول المخزون) في الميثانول. تم تحضير روتين (1 مجم / مل من محلول المخزون) في الميثانول. تم سحب عينات وعينات حمض الغال في آبار الصفيحة في ستة مكررات وقياسها عند 630 نانومتر. تم قياس كل من معايير وعينات روتين العشرة في ستة مكررات عند 420 نانومتر.

تم إجراء تحليل HPLC لمجموع الفينولات والفلافونيدات وفقًا لطريقة سينغ وآخرون. [1 0 2]. تم إذابة كل عينة و 0 محلول قياسي مختلف في ميثانول وترشيحها باستخدام 0.22 أم حقنة مرشحات ، ثم تم حقن 100 ميكرولتر من كل عينة و 10 ميكرولتر من كل معيار باستخدام عمود HPLC ، Waters 2690 Alliance HPLC نظام مزود بكاشف Waters 996 photodiode. العمود C18 Inertsil ODS3: 4.6 × 250 مم ، 5 أم ؛ الطور المتحرك: المخزن المؤقت (0.1 بالمائة حمض الفوسفوريك في الماء) ؛ كان أسلوب شطف الميثانول متدرجًا بمعدل تدفق قدره 1 مل / دقيقة بطول موجي يبلغ 280 نانومتر.

لتحليل الفيتامينات القابلة للذوبان في الماء ، مستخلصات الفطر المختبرة (5 0 مجم / مل) ، المعايير المرجعية (1 0 مجم في 1 0 مل 0.05 م من هيدروكسيد الصوديوم) لكل من الفيتامينات السبعة القابلة للذوبان في الماء (ثيامين حمض الهيدروكلوريك ، وحمض الأسكوربيك ، والريبوفلافين ، وحمض النيكوتينيك ، والنيكوتيناميد ، وبيريدوكسين حمض الهيدروكلوريك وحمض الفوليك) [103] والفيتامينات التي تذوب في الدهون ، والمحاليل (50 مجم / مل) من مستخلصات الفطر الثلاثة و تم تحضير محلول قياسي في الميثانول لثلاثة فيتامينات دهنية: E و D3 و A عند 806.2 و 114 و 400 وحدة دولية / مل على التوالي. تم بعد ذلك تخفيف المحاليل إلى 100 ميكروغرام / مل ، وتصفيتها باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر ، وتم حقن 100 ميكرولتر في عمود HPLC ، نظام Waters 2690 Alliance HPLC (Milford ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية) المجهز بكاشف صفيف ثنائي ضوئي Waters 996. العمود Inertsil ODS 3∶4.6 × 250 مم ، 5 ميكرومتر ؛ الطور المتحرك: محلول منظم (0.85 جم ملح حمض الهكسان سلفونيك في 1000 مل من الماء وتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 3 باستخدام حمض الفوسفوريك) ؛ كان شطف الميثانول متدرجًا بمعدل تدفق قدره 1 مل / دقيقة بطول موجة 210 نانومتر [104].

4.5 تحليل البروتين والأحماض الأمينية

تم تقييم تركيبة الأحماض الأمينية لمستخلصات الفطر باستخدام محلل الأحماض الأمينية Sykam (Sykam GmbH ، ألمانيا) المجهز بنظام توصيل مذيب ، S 21 0 0 (مضخة رباعية ذات نطاق تدفق {{ 24}}. 0 1 إلى 10. 00 مل / دقيقة وأقصى ضغط يصل إلى 400 بار) ، جهاز أخذ العينات التلقائي ، S5200 ، وحدة تفاعل الأحماض الأمينية ، S4300 (مع مرشح مزدوج مدمج مقياس الضوء عند 570 نانومتر) ، ومنظم كاشف مبرد ، S4130. يخلط جرام واحد من كل مستخلص عيش الغراب مع 5 مل من الهكسان ويترك لينقع لمدة 24 ساعة ، ثم يرشح الخليط باستخدام Whatman no. 1 ورق ترشيح. تم وضع المتبقي في أنبوب اختبار يحتوي على 10 مل من حمض الهيدروكلوريك وحضنته في فرن عند 110 درجة لمدة 24 ساعة. بعد فترة الحضانة ، تم إجراء الترشيح باستخدام Whatman no. 1 ورق ترشيح ، متبوعًا بالتبخير في مبخر دوار. تمت إذابة المتبقي تمامًا في 2 مل من محلول التخفيف (تجفيف ثلاثي سيترات الصوديوم 0.06 م ، حمض الستريك 0.03 م ، فينول 0.02 م ، ثيوديغليكول 1.4 بالمائة ، HCL 32 بالمائة) ، مخفف 1000- أضعاف في نفس المخزن المؤقت ثم تحميلها على عمود مرشح الأمونيا (LCA، K04 / Na، 4.6 × 100 مم، Sykam GmbH، Erasing، ألمانيا) مجهز بمحلل الأحماض الأمينية الأوتوماتيكي (Sykam) [105].

4.6 مزارع الخلايا

تمت المحافظة على خلايا سرطان عنق الرحم (هيلا) وسرطان الدم الوحيدي الحاد (Thpl) وسرطان القولون والمستقيم (كولو -205) وسرطان الأعور (LS -513) في وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) (لونزا ، كولونيا ، ألمانيا) مع 100 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 100 وحدة / مل من البنسلين و 10 في المائة من مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة. خطوط الخلايا الأخرى: اللوكيميا البشرية (CCRF-CEM) ؛ ابيضاض الدم النخاعي الحاد (ملحوظة -4) ؛ سرطان الغدد الليمفاوية البشرية (U937) ؛ سرطان البروستاتا (DU -145 و PC3) ؛ سرطان الخلايا الكبدية (HepG2) ؛ سرطان الثدي الغدي (MCF -7 و MDA-MB -231) ؛ فيرو. وخلايا Hep -2 ، تمت زراعتها بشكل فرعي في Dulbecco's Eagle Medium (DMEM ؛ Invitrogen ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم إجراء الحضانة عند 37 درجة في جو رطب مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تم الحصول على خطوط الخلايا من شركة Nawah Scientific Inc. (المقطم ، القاهرة ، مصر) ، بينما تم شراء خلايا الدم المحيطية الأولية أحادية النواة (PBMCs) وخلايا البشر العاديين (ATCC PCS -800-011 TM) من Viscera ، القاهرة ، مصر. تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة البحث الأخلاقي بكلية الصيدلة جامعة عين شمس (اعتماد رقم 294).

4.7 النشاط المضاد للفيروسات

نشاط مضاد للفيروساتتم اختباره ضد الفيروس الغدي من النوع 7 (Ad7) وفيروس الهربس البسيط من النوع الثاني (HSV -2) (نواة العلمية ، المقطم ، مصر). تم تقييم النشاط المضاد للفيروسات كما هو موضح سابقًا [106]. تم زرع خلايا Vero و Hep -2 في 96- لوحة مزرعة بكثافة 2 × 10 * خلايا / قبل الإصابة بيوم واحد. تمت إزالة وسط زراعة الخلية (القسم 4.6) في اليوم التالي ، وتم استخدام محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) لغسل الخلايا. تم تحديد قابلية العدوى للفيروس الغدي البشري وفيروس الهربس البسيط من النوع الثاني باستخدام طريقة sulforhodamine B (SRB) ، والتي ترصد تأثيرات اعتلال الخلايا (CPE) وحساب النسبة المئوية لجدوى الخلية [107]. تم حساب النشاط المضاد للفيروسات بناءً على قدرة مستخلصات الفطر على تثبيط إنزيم CPE الفيروسي ، حيث تم تحديد التركيز السام للخلايا بنسبة 50 بالمائة (CC5o) والتركيز المثبط بنسبة 50 بالمائة (IC50) باستخدام برنامج GraphPad PRISM (برنامج Graph-Pad ، سان دييغو) ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب مؤشر الانتقائية (SD) كما ذكر دوجان وآخرون. [108] وفقًا للمعادلة (1) مؤشر الانتقائية (SI)=CC50 / IC50

4.8 السمية الخلوية ضد PBMCs باستخدام اختبار MTT

تم تقييم السمية الخلوية باستخدام مقايسة MTT 【109】. قسامات （100 ميكرولتر） من المعلقات الخلوية (كثافة الخلية 1. 2-1. تم ​​طلاء 8 × 10 * خلايا / بئر) في 96- ألواح جيدة ، تمت إضافة وسط كامل وحضنت الخلايا لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بالتخفيف المتسلسل لمستخلصات الفطر لمدة 48 ساعة. تمت إضافة محلول MTT (5 مجم / مل) في برنامج تلفزيوني إلى الآبار واحتضانها لمدة 4 ساعات ، وتمت قراءة الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. تم استخدام الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية ، وكانت الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين (Sigma-Aldrich ، Darmstadt ، ألمانيا) بمثابة عنصر تحكم إيجابي.

4.9.Eoaluation of Cytotoxic Activity UIsing SRB ضد خطوط الخلايا السرطانية

السمية الخلوية ضد سرطان البروستاتا (DU {0} و PC3) ؛ سرطان الخلايا الكبدية (HepG2) ؛ سرطان القولون والمستقيم (كولو -205) ؛ سرطان الأعور (LS -513) ؛ سرطان عنق الرحم (هيلا) ؛ والسرطان الغدي للثدي (MDA-MB -231 و MCF -7) تم تقييم خطوط الخلايا باستخدام مقايسة لونية السلفوروودامين ب (SRB) [110]. تم تحضين معلقات الخلية في وسط كامل (4.6) في لوحات بئر 96- لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت إضافة تركيزات مختلفة (0 إلى 100 ميكروغرام / مل في وسط كامل من مستخلصات الفطر واحتضانها لمدة 72 ساعة.استخدمت الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية ، وكانت الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين بمثابة تحكم إيجابي.

4.10 جدوى اللوكيميا وخطوط الخلايا الليمفاوية UIsing WST -1 الفحص

تم تحديد السمية الخلوية ضد ابيضاض الدم البشري (CCRF-CEM) ، وابيضاض الدم النخاعي الحاد (NB4) ، وسرطان الدم الوحيدي الحاد (THP1) ، وسرطان الغدد الليمفاوية البشري (U937) عن طريق مقايسة ملح تترازوليوم (WST -1) القابل للذوبان في الماء باستخدام Abcamkit ( ab1559 0 2 WST -1 كاشف انتشار الخلايا ، المملكة المتحدة). تم تحضين المعلقات الخلوية لمدة 24 ساعة ثم تمت معالجتها بتركيزات مختلفة (0 إلى 100 ميكروغرام / مل في وسط كامل) من مستخلصات الفطر لمدة 48 ساعة. عولجت الخلايا بعد ذلك بكاشف 10 ميكرولتر WST -1 لمدة ساعة واحدة ، وتمت قراءة A450 باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية [111]. تم استخدام الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية ، وكانت الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين (Sigma-Aldrich ، ألمانيا) بمثابة عنصر تحكم إيجابي.

4.11 نشاط مضاد للأكسدة

4.11.1.DPPH نشاط الكسح الجذري

تم إجراء اختبار الكسح الجذري DPPH وفقًا لطريقة Lu et al. [112]. تم قياس الانخفاض الناتج في لون DPPH عند 540 نانومتر.النشاط المضاد للأكسدةتم التعبير عنها كنسبة التثبيط بالإشارة إلى منحنى المعايرة (R 2=0. 9903). يتم تمثيل البيانات كوسائل ± SD وفقًا للمعادلة (2) :( نسبة نشاط مضادات الأكسدة=[(abs-blank-abs-sample) / abs-blank] × 100)

(2) حيث تشير عينة القيمة المطلقة وعينة القيمة المطلقة إلى امتصاص الفراغ والعينة ، على التوالي. تم تقدير تركيز العينة المطلوب لتثبيط نصف الجذور الحرة (IC50).

4.11.2.ABTS (2،2'-Azinobis - (3- ethylbenzthiazolin -6- حمض السلفونيك)) نشاط الكسح الراديكالي للكاتيون

تم إجراء الفحص كما هو موضح سابقًا 【113】. تم خلط مستخلصات الفطر （1 0 ميكرولتر من 0 إلى 100 ميكروغرام / مل من المحاليل） مع 190 ميكرولتر من ABTS Sigma-Aldrich Germany المحضرة حديثًا) في 96- أطباق جيدة وحضنت في الظلام في درجة حرارة الغرفة من أجل 2 ح. تم اختبار كل عينة في أربع مكررات ، وتم قياس الامتصاصية عند 734 نانومتر. تم التعبير عن نشاط مضادات الأكسدة كنسبة مئوية من التثبيط (المعادلة (1)) بالإشارة إلى منحنى المعايرة (R 2=0. 9948).

4.11.3. فحص قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC)

تم إجراء التحليل على النحو المحدد مسبقًا [62] ، مع تعديلات طفيفة. باختصار ، تم تحضين 12.5 ميكرولتر من مستخلصات الفطر ، في ثلاث نسخ ، مع 75 ميكرولتر من الفلوريسين (10 نانومتر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. تم إجراء قياس الإسفار (485 EX ، 520 EM ، nm） لثلاث دورات دورة زمنية =90 ثانية. بعد ذلك ، 12.5 ميكرولتر من محلول 240 مم طازجًا من 2،2'-Azobis 2- تمت إضافة ثنائي هيدروكلوريد الأدينوبروبان (AAPH) (Ab-cam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) إلى كل بئر على الفور واستمر قياس التألق لمدة 2.5 ساعة (85 دورة ، كل 90 ثانية). يقيس الفحص فقدان الفلورة الفلورية بمرور الوقت نتيجة لذلك من تكوين جذور البيروكسيل عن طريق تحلل AAPH. ترولوكس (6- هيدروكسي -2 ، 5،7 ، 8- رباعي ميثيل كرومان -2- حمض الكربوكسيل) ، فيتامين إي قابل للذوبان في الماء تمثيلي ، يعمل كعنصر تحكم إيجابي يمنع تسوس الفلورسين بطريقة تعتمد على الجرعة. تم التعبير عن نشاط مضادات الأكسدة كنسبة مئوية من التثبيط (المعادلة (1) بالإشارة إلى منحنى المعايرة (R 2= 0. 9957).

4.12. التحليل الإحصائي

تم إجراء فحوصات كيميائية ثلاثية ، وتم التعبير عن النتائج على أنها انحرافات معيارية متوسطة. تم إجراء التحليلات الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه.

تم تقييم أهمية الاختلافات بين الوسائل من خلال اختبار المقارنات المتعددة Tukey-Kramer. القيمة الاحتمالية التي تكون أقل من أو تساوي 0. 05 تعتبر ذات دلالة إحصائية. تم تحديد التقييم الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad PRISM (برنامج Graph-Pad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

5. الاستنتاجات

يحتوي عيش الغراب P. ostreatus و L.edodes على مجموعة واسعة من المركبات النشطة بيولوجيًا. أظهر تحليل البروتين التعبير عن العديد من الجزيئات النشطة بيولوجيًا مع العديد من الأنشطة البيولوجية. المقتطفات المائية من الفطر واعدةمضاد فيروساتالأنشطة ضد الفيروس الغدي من النوع 7 وفيروس الهربس البسيط من النوع الثاني. تم الكشف عن CPEs ضد خطوط الخلايا السرطانية ولكن ليس ضد PBMCs البشري الطبيعي. تشجع الدراسة الحالية على استخدام هذه الفطريات للأغراض الدوائية في ضوء انخفاض سمية الخلايا على PBMCs العادية ، بالإضافة إلى قدراتها المضادة للفيروسات والأورام ومضادات الأكسدة.

مراجع

1. بيرتيلي ، MBD ؛ أوليفيرا فيلهو ، OBQ ؛ فريتاس ، JDS ؛ بيرتولوتشي ، مرحاض ؛ سيلفا ، GR ؛ Gazim، ZC ؛ ليفيرو ، الجيش الملكي ؛ لوفاتو ، ECW ؛ فالي ، شبيبة ؛ ليندي ، جورجيا ؛ وآخرون. Lentinus crinitus basidiocarp stipe and pileus: التركيب الكيميائي ، السمية الخلوية والنشاط المضاد للأكسدة. يورو. الدقة الغذائية. تكنول. 2021 ، 247 ، 1355-1366. [CrossRef]

2. Ragupathi، V .؛ ستيفن أ. أريفولي ، د. Kumaresan ، S. النشاط المضاد للبكتيريا ، في إمكانات مضادات الأكسدة في المختبر وتوصيف GC-MS للمستخلص الميثانولي من Gymnopilus Junius ، فطر بري من جنوب غرب غاتس ، الهند. يورو. J. بيوميد. 2018 ، 5 ، 650-657.

3 - أتيلا ، ف. عويد ، مينيسوتا ؛ شريعتي ، الفوائد الغذائية والطبية لـ Agaricus bisporus: مراجعة. J. ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. علوم الغذاء. 2017 ، 7 ، 281-286. [CrossRef]

4 - غايتان - هيرنانديز ، ر. Cortés، GMN تحسين محصول الفطر الصالح للأكل والطبية Lentinula edodes على قش القمح باستخدام تفرخ مكمل. براز. J. ميكروبيول. 2014 ، 45 ، 467-474. [CrossRef] [PubMed]

5. سمانية ، أ. ديلي موناش ، ف. سمانيا ، إي. جيل ، م. Benchetrit ، L. Cruz، F. نشاط مضاد للبكتيريا لمادة ينتجها فطر Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. ياء إثنوفارماكول. 1995 ، 45 ، 177-181. [CrossRef]

6 - إيشيكاوا ، ناغورني كاراباخ ؛ كاسويا ، مليون متر مكعب ؛ فانيتي ، MCD النشاط المضاد للبكتيريا لدود Lentinula تنمو في وسط سائل. براز. J. ميكروبيول. 2001 ، 32 ، 206-210. [CrossRef]

7. Hwang، H.-J .؛ كيم ، سو ؛ ليم ، جي إم. جو ، جيه إتش. كيم ، H.-O. ؛ كيم ، إتش. م. يون ، ج. تأثير نقص السكر في الدم للسكريات الخارجية الخام التي تنتجها الفطر الطبي Phellinus baumii في الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها الستربتوزوتوسين. علوم الحياة. 2005 ، 76 ، 3069-3080. [CrossRef] [PubMed]

8. هيرست ، ر. نيلسون ، د. ماكولوم ، ج. ميلار ، كولومبيا البريطانية ؛ مايدا ، واي. صائغ ، CE ؛ روني ، بي جيه ؛ لوفري ، أ. راو ، ياء ؛ مور ، جي إي فحص للخصائص المضادة للبكتيريا والفطريات لمكونات فطر شيتاكي (Lentinula edodes) و Oyster (Pleurotus ostreatus). مديح. هناك. كلين. الممارسة. 2009 ، 15 ، 5-7. [CrossRef]

9. Zervakis، G.؛ فيليبوسيس ، أ. يوانيدو ، إس. حركية نمو Diamantopoulou و P. Mycelium وظروف درجة الحرارة المثلى لزراعة أنواع الفطر الصالح للأكل على ركائز lignocellulosic. فوليا ميكروبيول. 2001 ، 46 ، 231-234. [CrossRef]

10. سانشيز ، C. زراعة الجنبة ostreatus والفطر الصالح للأكل. تطبيق ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية. 2009 ، 85 ، 1321-1337. [CrossRef]