دراسة بروتينية كمية تكشف مسار الفيبرينوجين في مرض الكبد المتعدد الكيسات Ⅱ

3. النتائج

3.1. الكلى والكبد لا يتبعان نفس الآليات الكيسية

أظهرت الدراسات السابقة أن التعطيل المبكر لجين Pkd1 (قبل p12) يؤدي إلى تطور سريع لمرض متعدد الكيسات (نافذة كيسية)، في حين أن التعطيل بعد p14 يؤدي إلى تكوين كيس متأخر بعد 4-5 أشهر، مع نمط ظاهري خفيف (نافذة غير كيسية). [19]. باستخدام نفس النموذج المتعامد لـ ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19]، قمنا بالتحقق مما إذا كانت نافذة التطور الكلوي هذه تتوافق في الوقت المناسب مع نافذة مماثلة لتطور الكبد. لإجراء مقارنة مباشرة مع دراساتنا السابقة [37]، تم حث الفئران باستخدام عقار تاموكسيفين لتعطيل جين Pkd1 في أيام ما بعد الولادة 14 (ص14) و12 (ص12) وتم التضحية بها في عمر 30 يومًا (ص30). ومن المثير للاهتمام، أننا لاحظنا النمط الظاهري الكيسي في كلتا النقطتين الزمنيتين مع درجة مختلفة من المرض (معتدل وشديد)، مما يشير إلى أن الكلى والكبد لهما نوافذ نمو كيسية مستقلة (الشكل 1 أ)، و/أو توقيتات مختلفة محتملة وتطور المرض. . لم يتم العثور على فروق بين الذكور والإناث في سن الذبح هذا بين نافذتي التعطيل (تم استخدام=6 لكل مجموعة من المسوخات). قدمت الحيوانات المتحولة p14 نمطًا ظاهريًا أكثر اعتدالًا من المجموعة المتحولة p12 مع قيم أقل للمؤشر الكيسي وعدد الخراجات ووظيفة الكبد وفقًا لقيمة مصل ALP (الشكل 1 ب – د). هذه هي الدراسة الأولى التي تُظهر نوافذ/آليات تطورية مختلفة لنقص Pkd1 في الكبد والكلى. ويجب تحديد هذه الاختلافات الجزيئية في الدراسات المستقبلية.

الشكل 1. توصيف النمط الظاهري للكبد الكيسي في اليوم 3 0 من المرحلتين p12 وp14. يؤدي حذف Pkd1 عند p12 إلى تكوين المثانة الأكثر خطورة. ( أ ) صور عيانية ومجهرية تمثيلية للهيماتوكسيلين - يوزين ملطخة من كبد Pkd1cond / cond؛ Tam-Cre mouse Wild Type (WT، Pkd1cond / cond؛ Tam-Cre−) و Mutant (KO، Pkd1cond / cond؛ Tam-Cre + ) مع حذف الجين Pkd1 الناجم عن عقار تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 14 (مجموعة P14) و 12 (مجموعة P12). تم التضحية بجميع الفئران عند p3 0. شريط المقياس، 2 مم (اللوحة العلوية) 100 ميكرومتر (اللوحة السفلية). يمثل n عدد العينات لكل مجموعة، ويعني Bd القناة الصفراوية. ( ب ، ج ) مؤشر الكيس الكبدي وعدد الخراجات من الأنماط الظاهرية المختلفة. ( د ، هـ ) قيم ALP و ALT في مصل الدم. تمثل الأشرطة الوسائل ± SEM في جميع الحالات. تم اعتبار p <0.05 بواسطة اختبار الطالب (ثنائي الذيل) نتيجة مهمة. ns لا يمثل أهمية. * ع < 0.05، ** ع < 0.01، *** ف < 0.001.

انقر لcistancheherba لأمراض الكلى

3.2. التحليل البروتيني Shotgun وSWATH-MS في PLD

كما هو مشار إليه في الشكل 2، أجرينا تحليل البروتين التفاضلي في كلتا المرحلتين الكيسيتين (p12 - مرض الكيسي الوخيم- وp14 - مرض الكيسي الخفيف-) من المسوخ (KO) مقارنة بالحيوانات من النوع البري (WT)، من أجل تحديد و توصيف الآليات الجزيئية ذات الصلة التي تخضع لتكوين المثانة في الكبد وتطور المرض.

الشكل 2. مخطط سير العمل المصور. استخدمنا نموذج الفئران ADPKD (Pkd1cond/cond؛ الفئران Tam-Cre) حيث تم إحداث التعطيل الوراثي لـ Pkd1 عن طريق إعطاء عقار تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 10 (ص 10) وp11 (تطور سريع للمرض) أو p15 وp16 (تأخر تطور المرض). ) وفقًا للمفتاح التنموي لتكوين المثانة الكلوي، مع تحديد مجموعتي الدراسة المسمى p12 وp14 على التوالي [19]. بالنسبة لكلتا المجموعتين، استخدمنا عددًا يساوي أو أكبر من ستة أفراد من النوع البري (WT) والمتحول (KO) في كل حالة، وتم التضحية بجميع الحيوانات عند p30. قمنا بدراسة البروتين التفاضلي للكبد WT وKO في كل من شدة مرض كيس الكبد (الشكل 1)، وذلك باستخدام كل من تحليل SWATH-MS البروتيني الكمي وتحليل DDA-MS المعتمد على بيانات البندقية. من البروتينات مع تغير كبير في الوفرة، استخدمنا المعلوماتية الحيوية الشكل 2. مخطط سير العمل المصور. استخدمنا نموذج الفئران ADPKD (Pkd1cond/cond؛ الفئران Tam-Cre) حيث تم إحداث التعطيل الوراثي لـ Pkd1 عن طريق إعطاء عقار تاموكسيفين في يوم ما بعد الولادة 10 (ص 10) وp11 (تطور سريع للمرض) أو p15 وp16 (تأخر تطور المرض). ) وفقًا للمفتاح التنموي لتكوين المثانة الكلوي، مع تحديد مجموعتي الدراسة المسمى p12 وp14 على التوالي [19]. بالنسبة لكلتا المجموعتين، استخدمنا عددًا يساوي أو أكبر من ستة أفراد من النوع البري (WT) والمتحول (KO) في كل حالة، وتم التضحية بجميع الحيوانات عند p30. درسنا البروتين التفاضلي للكبد WT و KO في كل من شدة مرض كيس الكبد (الشكل 1) ، وذلك باستخدام كل من البروتين الكمي SWATH-MS وتحليل DDA-MS المعتمد على بيانات البندقية. ومن بين البروتينات التي شهدت تغيرًا كبيرًا في وفرتها، استخدمنا أدوات المعلوماتية الحيوية لاكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة والمسارات المرتبطة بالمرض. أخيرًا، قمنا بالتحقق من صحة هذه الأهداف باستخدام أولًا في السيليكو (تحليل DDA مقابل SWATH) وأخيرًا في استراتيجيات الجسم الحي، بالإضافة إلى RT-qPCR والنشاف الغربي والكيمياء المناعية. p يعني يوم ما بعد الولادة

نمط التعبير البروتيني في تكوين المثانة الكبدي أولاً، أجرينا تحليل قياس الطيف الكتلي البروتيني عن طريق الاستحواذ المعتمد على بيانات البندقية DDA-MS أو DDA. يسمح هذا التحليل بتوصيف البروتين من عينات كاملة وفردية، مما يوفر وجود/غياب البروتينات ذات الحساسية العالية ولكن دون توفير القياس الكمي لها. لقد أخذنا في الاعتبار حصريًا جميع البروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في أكثر من خمس عينات مستقلة من إجمالي ست عينات، للمراحل p14 وp12 من النوع البري والأفراد المتحولين، على التوالي (الشكل S1). في p14 ، تم تحديد 1 بروتينات حصرية لـ WT (أو خاضعة للتنظيم للمرض) و 7 بروتينات حصرية (مُنظَّمة) لـ MUT ، بينما في p12 ، تمت ملاحظة ثمانية بروتينات حصرية لـ WT وستة بروتينات حصرية لـ MUT (الشكل S1).

بعد ذلك، استخدمنا طريقة سمحت لنا بتحديد كمية البروتينات المعبر عنها تفاضليًا. أجرينا تحليلًا بروتينيًا كميًا لـ SWATH-MS على نفس العينات التي استخدمناها في DDA، وحصلنا على حوالي 1500 بروتين لكل عينة وأكثر من 2000 بروتين في كل مجموعة دراسة. أولاً، أجرينا تطبيع إجمالي المساحة (TAS) لتقييم أن عيناتنا اتبعت نمط التوزيع الطبيعي، كما هو موضح في الشكلين S2 وS3. بعد ذلك، قمنا بدراسة البروتين مع وجود اختلافات كبيرة بين المجموعتين Wild Type وMutant. يوضح الجدول 1 البروتينات مع تغير كبير في الوفرة مع زيادة مضاعفة (منضبطة) أو نقصان (منضبطة لأسفل)، وقيمة p معدلة كبيرة (وفقًا لاختبار الطالب البارامترى) في WT مقابل عينات MUT في p14 وp12. في المجموع، أظهرت ستة بروتينات اختلافات كبيرة في وفرة البروتين بين مجموعتي WT p14 وMUT-p14 (خمسة بروتينات منظمة وبروتينات واحدة خاضعة للتنظيم). بين WT-p12 وMUT-p12، أظهر 26 بروتينًا (20 بروتينًا منظمًا و6 بروتينات خاضعة للتنظيم) اختلافات كبيرة (الشكل 3 أ والجدول 1). بيانياً، يمكن ملاحظة هذه الاختلافات من خلال مخططات البركان، والتي تم إنشاؤها عن طريق رسم تغييرات السجل (2) لجميع البروتينات المحددة مقابل قيمة −log(10) الخاصة بها (الشكل 3 ب). يمكن تصور اختلافات كبيرة بين مستويات وفرة البروتين في الخريطة الحرارية مع القيم الفردية وفقا لمناطق المكتبة الطيفية، ومستوى التجميع في تحليل خريطة الحرارة العنقودية (الشكلان 3 ج وS4). تساعدنا هذه المجموعات التي اكتشفها تحليل SWATH-MS على تحديد تلك العينات المنفصلة نوعيًا، والتي سيتم أخذها في الاعتبار عند التحليل الكمي (الشكل S5). تم إجراء تحليل إحصائي متعدد المتغيرات غير خاضع للرقابة باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) لمقارنة البيانات بين العينات (الشكل S6). أظهرت بيانات خريطة الحرارة وPCA إمكانية التكاثر بين ثلاث نسخ من العينة حيث أن النسخ الثلاثة تتجمع بشكل وثيق في كلا التحليلين. يمكننا أن نلاحظ في كل من PCA وفي تحليل مجموعة الخريطة الحرارية (الشكلان S5 وS6) كيف لم يتم تجميع بعض العينات بشكل صحيح، متداخلة بين المجموعتين. ومع ذلك، يمكننا أن نرى الميل إلى فصل البيانات في مجموعات Wild Type وMutant. يمكن تبرير انخفاض عدد البروتينات ذات الاختلافات الكبيرة في p14 مقابل p12 باختلاف درجة الخطورة (الشكل 2)، مما يشير إلى أن عدد البروتينات والمسارات يزداد بناءً على شدة النمط الظاهري الكيسي وحالته المرضية.

3.3. التجميع وإثراء المسار وتحليل تفاعل البروتين والبروتين للتعبير الجيني في PLD

لإنشاء الوظيفة المتعلقة بالبروتينات المعبر عنها تفاضليًا والتي تم تحديدها بواسطة تحليل SWATH-MS، استخدمنا العديد من أدوات المعلومات الحيوية وأشكال التحليلات. تم إجراء تحليلات ومصطلحات ومسارات علم الجينات (GO) باستخدام FunRich [39,40] وString [41] وReactome [42]. تم فرز البروتينات في تحليل إثراء الجينات FunRich. فيما يتعلق بالعملية البيولوجية، كانت مجموعة البروتينات الأكثر إثراءً لمجموعة p14 (الكيسية الخفيفة) مرتبطة بنقل الأحماض الدهنية والتخليق الحيوي للبروستاجلاندين، وبالنسبة لمجموعة p12 (الكيسية الشديدة) مع نشاط الفيبرينوجين/الفبرين، والتصاق الخلية/المصفوفة والتمثيل الغذائي. عملية (الشكل 4A، اللوحة العلوية). كان ANXA2 ومجمع الفيبرينوجين هما المكونان الخلويان الأكثر إثراء في مجموعتي p14 وp12، على التوالي. علاوة على ذلك، كانت المساحة خارج الخلية هي المكون الخلوي الذي يحتوي على أعلى نسبة من البروتينات في كلا المجموعتين (الشكل 4 أ، اللوحة السفلية). وبالمثل، تم إنشاء نفس التحليل باستخدام تحليل السلسلة، وتحديد العمليات الأيضية المختلفة باعتبارها العملية البيولوجية الرئيسية، والفضاء خارج الخلية باعتباره مكون الخلية الأكثر إثراء؛ بما يتوافق مع نتائج GO (الشكل S7a). أخيرًا، كررنا التحليل باستخدام منصة Reactome، ووجدنا أن التمثيل الغذائي والجهاز المناعي كانا أكثر المسارات إثراءً (الشكل S7b).

تم أيضًا إجراء تحليل البروتين - البروتين أو التحليل العنقودي بناءً على تحليل السلسلة من أجل التحقيق في تفاعلات البروتين - البروتين المحتملة (التفاعلات مع الأدلة التجريبية). تم تحديد العديد من تفاعلات البروتين في مجموعات مختلفة (الشكل S8)، لكن مجموعة واحدة عند p14 وأخرى عند p12 كانت الأكثر صلة بناءً على عدد التفاعلات بين البروتينات ومستوى التعبير (الشكل 4 ب). تحتوي المجموعة p14- على بروتين Annexin A2 (ANXA2_P07356) المرتبط بالعديد من الوظائف الخلوية، مثل انحلال الفيبرين، وحركة الخلية (في الخلايا الظهارية)، وهو بروتين مرتبط بالأكتين تفاعلات الهيكل الخلوي ومصفوفة الخلية [43]، والتفاعل مع اثنين من البروتينات الأخرى المشاركة في نقل الدهون داخل الخلايا (FABP1_P12710 وFABP5_Q05816). ومن المثير للاهتمام، أنه تم تحديد مجموعة أخرى ذات صلة من البروتينات في المجموعة 12- مع تفاعل بروتين-بروتين قوي جدًا بين العديد من الفيبرينوجينات (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22) }}E9PV24 وFIBGG_Q8VCM7). تشارك الفيبرينوجينات في نمو خلايا الكبد، وهي تتوسط في انتشار الصفائح الدموية والكولاجين الخلالي والآفات الليفية [44]. علاوة على ذلك، تم العثور على بروتينات إضافية تتفاعل مع الفيبرينوجينات (الشكل S8)، مثل مكون الأميلويد p في المصل (SAMP_P12246)، أو الهيموبكسين (HEMO_Q91X72) أو أوكسيديز حمض الهيدروكسي 2 (HAOX{ {37}}س9NYQ2). تمشيا مع نتائج السلسلة، كانت مجمعات ANXA2 والفيبرينوجين أيضا المكونات الخلوية الأكثر إثراء التي حددها تحليل FunRich (الشكل 4A). ومن المثير للاهتمام، عند مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل DDA وSWATH، أكدنا أن العديد من البروتينات التي تم تحديدها بواسطة SWATH تم تحديدها أيضًا من خلال تحليل DDA، بما في ذلك العديد من البروتينات المرتبطة ببروتينات الفيبرينوجين المعقدة (SAMP/Apcs وS10A9/S100a9؛ الجدول S3).

3.4. التحقق من صحة تحليل SWATH-MS يكشف عن مجمع الفيبرينوجين كآلية جزيئية جديدة مرتبطة بـ PLD

بناءً على هذه البيانات، اخترنا من تحليل SWATH-MS (الشكل S9) البروتينات المتغيرة المرتبطة بمركب الفيبرينوجين في المرحلتين p12 وp14 للتحقق من صحتها في الجسم الحي باستخدام RT-qPCR والنشاف الغربي والكيمياء المناعية، لإثبات تأكيدها قدر الإمكان. أهداف المرض. تم التحقق من صحة ثمانية من أصل 1 0 من هذه البروتينات المحددة على مستوى مرنا بواسطة RT-qPCR (الشكل 5)؛ واحد تم تنظيمه في المرحلة 14- (ANXA2_P07356) وفي المجموعة p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222، S10A9_P31725، FIBB_Q8K0E8، HEMO_Q91X72، FIBA_E9PV24 وFIBG_Q8VCM7)، وواحد لأسفل- ينظم في المجموعة p12 (HAOX 2_Q9NYQ2). ومن المثير للاهتمام، أن التعبير الجيني للبروتينين مع مسافة أكبر أو تفاعلات أقل مع مجموعة الفيبرينوجين (ILK وS10A9) كانا الوحيدين اللذين لم يتم التحقق من صحتهما (الشكل 5 ج).

تم تأكيد التنظيم الإضافي لمركب الفيبرينوجين (بروتينات ANXA2 وSAMP وFIBB وFIBA وFIBG وHAOX2) من خلال تحليل النشاف الغربي (WB) (الشكل 6). بشكل عام، كان التعبير الجيني وWB متسقين للغاية مع البيانات البروتينية SWATH-MS. أخيرًا، أجرينا أيضًا التحقق من صحة الكيمياء المناعية لمجمع الفيبرينوجين في عينات الكبد المتحولة ومتعددة الكيسات (الشكل 7). تم تنظيم تلطيخ الفيبرينوجين بقوة في الخلايا الظهارية المبطنة للكيس وتوسعات القناة الصفراوية (الشكل 7 أ). تكشف هذه النتائج، لأول مرة، عن مجمع الفيبرينوجين كمسار محتمل يتعلق بتكوين المثانة الكبدي وكهدف علاجي محتمل في المستقبل لـ PLD.

الشكل 5. التحقق من صحة أهداف PLD المحتملة بواسطة RT-qPCR. التعبير الجيني للأهداف المحددة من 8 إلى 1 0 المرتبطة ببيانات SWATH-MS. RT-qPCRs للملحق المستهدف p14 المحدد والمُنظم A2 (Anxa2) ( أ ) ؛ يستهدف p12 المنظم مكون الأميلويد p، والمصل (Apcs، SAMP gene)، الشبيه بالفيبرينوجين 1 (Fgl1)، سلسلة بيتا الفيبرينوجين (Fgb)، الهيموبكسين (Hpx)، سلسلة ألفا الفيبرينوجين (Fga)، سلسلة غاما الفيبرينوجين (Fgg) (ب) كيناز مرتبط بالإنتغرين (Ilk) وS10{{30}} بروتين ربط الكالسيوم A9 (S100a9) (ج)؛ ويستهدف p12 الخاضع للتنظيم أوكسيديز حمض الهيدروكسي 2 (Hao2) ( د ). تم استخدام n=6 لكل مجموعة بروتين. تم استخدام Gapdh كجينة للتدبير المنزلي. تمثل الأشرطة الوسائل ± SEM. تم استخدام اختبار الطالب ذو الذيل المزدوج واعتبرت قيمة p <0.05 ذات أهمية. ns: غير مهم (p أكبر من أو يساوي 0.05)، * p < 0.05، ** p < 0.01، *** p < 0.001.

الشكل 7. يتم تنظيم مجمع الفيبرينوجين في الظهارة الكيسية. ( أ، ب ) صور تمثيلية للكيمياء المناعية للفبرينوجين في القناة الصفراوية (اللوحة العلوية) وحمة الكبد (اللوحة السفلية) (أ) وتقديرها الكمي (ب). تم استخدام n=6 لكل مجموعة. أظهر تحليل الكيمياء المناعية زيادة في تنظيم الفيبرينوجين من خلال الظهارة الكيسية. العينات تتوافق مع مجموعة P12. تمثل أشرطة النطاق 100 ميكرومتر. Bd يعني القناة الصفراوية. تمثل الأشرطة الوسائل ± SEM. تم استخدام اختبار الطالب ذو الذيل المزدوج واعتبرت قيمة p <0.05 ذات أهمية. *** ع <0.001.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى