التثبيط الموضعي المستمر للثرومبين يحافظ على الهندسة المعمارية الدقيقة للكلية ووظائفها بعد ظهور إصابات الكلى الحادة

الاتصال: أودري هوaudrey.hu@wecistanche.com

إيان فارغاس وآخرون

الملخص

إصابة الكلى الحادتظل إدارة (AKI) داعمة بشكل أساسي حيث لم تنجح أي عوامل علاجية محددة موجهة إلى مسارات الإشارات الفردية في التجارب السريرية. هنا ، أبلغنا أن تثبيط التخثر الناتج عن الثرومبين والإشارات الالتهابية باستخدام الجسيمات النانوية الكربونية الفلورية المشبعة المستهدفة بالثرومبين (PFC NP) يحمي الأوعية الدموية الكلوية وينظم على نطاق واسع العمليات الالتهابية المتنوعة التي تسبب إصابة نقص التروية الكلوية. تم تعقيد كل PFC NP مع حوالي 13،650 نسخة من مثبط الثرومبين المباشر ، PPACK (برولين-فينيل ألانين-أرجينين-كلورو ميثيل-كيتون). أظهرت الفئران التي عولجت بعد ظهور AKI مع PPACK PFC NP VCAM غير منظم -1 و ICAM -1 و PGD2 prostanoid و M-CSF و IL -6 وتسلل الخلايا البدينة. تم الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الدقيقة والأغشية السفلية الأنبوبية ومكونات حدود الفرشاة بشكل أفضل. تم تقليل عدم ضخه كما يتضح من خلال انخفاض محاصرة خلايا الدم الحمراء والحديد غير الهيم.الكلىتحسنت الوظيفة والنخر الأنبوبي في 24 ساعة مقابل مجموعة التحكم غير المعالجة ، مما يشير إلى فائدة تثبيط مزدوج للتخثر والالتهاب بواسطة PPACK PFC NP.

الكلمات الدالة: إصابة الكلى الحاد؛ تجلط الدم. اشتعال؛ جسيمات الكربون المشبع بالفلور ؛ تلف السفينة

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

إصابة الكلى الحاد(AKI) هي مشكلة سريرية متكررة لدى الصغار والكبار على حد سواء مع حدوث زيادة ومعدل وفيات مرتفع بشكل غير مقبول لم يتحسن بشكل كبير منذ عقود. الالكلىكنتيجة لعدد من الإهانات بما في ذلك انخفاض ضغط الدم ، والإنتان ، والسموم ، وما إلى ذلك. 3 AKI يستحضر مجموعة معقدة من العوامل الجزيئية الفيزيولوجية المرضية وإشارات الأحداث في عملية المرض التي تتطور بمرور الوقت على مراحل. لا توجد علاجات لـ AKI حتى الآن ، على الرغم من الحاجة الطبية الملحة .7 في الواقع ، بعد سنوات من الجهود البحثية قبل السريرية والسريرية ، تظل العلاجات الحالية داعمة بشكل أساسي.

نحن هنا نفترض أن التدخلات العلاجية القائمة على الجسيمات النانوية التي تستهدف الثرومبين والتي يمكن أن تحافظ على سلامة الأوعية الدموية الدقيقة ووظيفة الحاجز وتقليل الإشارات الالتهابية في نفس الوقت ستفيد نتائج AKI. الثرومبين هو جزيء رئيسي لتصلب الشرايين والتئام الجروح يقود العديد من الجزيئات الالتهابية الأخرى التي تشارك في تنشيط البطانة بعد إصابة مثل NF-B و 8 NADPH أوكسيديز ،⁹

وغيرها من خلال المستقبلات التي تنشط بالبروتياز (PAR -1) على البطانة والضامة. 10،11 جميع أنواع الخلايا فيالكلىتغييرات نمط التعبير الجيني من ذوي الخبرة ، والتي تشمل زيادة التعبير عن علامات الإصابة والجينات التنموية كما هو موضح بواسطة Rudman-Melnick et al في دراسة تسلسل خلية مفردة الدورة الزمنية حول نقص التروية من جانب واحد - ضخهالكلىإصابة 12 علاوة على ذلك ، حددت دراسة على القوارض لتسلسل الحمض النووي الريبي لنواة واحدة في إصابة الكلى بنقص التروية - إعادة التروية الثنائية 13 مجموعة خلايا نبيبية دانية محددة تزيد من التعبير عن الجينات المسببة للالتهاب والتليف بعد إصابة نقص التروية الدافئة - إعادة التروية. تشير هذه النتائج إلى أن الالتهاب يجب أن يمثل هدفًا علاجيًا مفيدًا. على الرغم من أن تكوين الجلطات الصلبة داخل الأوعية الدموية يبدو غير شائع في القصور الكلوي الحاد ، فقد افترضنا أيضًا أن التخفيف من نشاط محفز تخثر الأوعية الدموية الدقيقة عن طريق مضادات الجسيمات النانوية القوية المضادة للثرومبين 14-17 قد يحسن تدفق الدم ، ويقلل "عدم الانسياب" ، ويقلل من الإشارات الالتهابية للحفاظ عليها. وظيفة الكلى.

تشمل القضايا الحرجة التي تمنع استخدام مثبطات الثرومبين المباشرة للوقاية من إصابة نقص التروية الكلوية - ضخه (IRI) آثارها الجانبية السامة المحتملة وخطر النزيف الجهازي. فيما يتعلق بتجلط الدم ، لم تكن العلاجات التقليدية المضادة للتخثر ناجحة بشكل خاص على الرغم من أن الثرومبومودولين القابل للذوبان قد يمارس إجراءات حماية كلوية ، 18،19 كما قد ينشط البروتين C ، 20،21 ومضاد الثرومبين III ، 22 وإن كان ذلك مع مضاعفات محتملة للنزيف المفرط .21 علاوة على ذلك ، كل من الوارفارين و ارتبط دابيجاتران بالسمية الكلوية.^23,24ومع ذلك ، فإن حقيقة أن هذه الأساليب المضادة للتخثر لم تنجح بعد سريريًا لا تقلل من القيمة المحتملة للثرومبين كهدف ، نظرًا لوظائفه المزدوجة في كل من التخثر والالتهاب. على الرغم من عدم وجود دراسة سريرية بشأن علاج VEGF لـ AKI ، فقد أظهرت دراسة قبل السريرية أن VEGF هو وسيط مهم في الحماية الكلوية أثناء AKI ، مما يدعم أيضًا الآلية العلاجية الافتراضية المقترحة لدينا للحفاظ على الأوعية الكلوية في حماية وظائف الكلى أثناء AKI.

لقد قمنا بتطوير منصة مستقرة ومتوافقة حيوياً وغير سامة للكلية من الجسيمات النانوية المشبعة بالفلور (PFC NP) التي تمنع نشاط بروتياز الثرومبين دون التسبب في أهبة النزيف. لب وقشرة خارجية ذات خافض للتوتر السطحي فسفوليبيد ويتراوح قطرها بين ~ 160-250 نانومتر. في دراسات AKI الأولية الأخيرة ، قمنا بإعطاء مضاد الثرومبين PFC NP كعلاج مسبق لتأكيد أن الثرومبين هو هدف قيم لتسريع استعادة وظائف الكلى جزئيًا عن طريق الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية الدقيقة وتقليل عدم ضخه في IRI عند إعطائه قبل إعادة ضخ نقص التروية. الإصابة .16 يحمي PFC NPS المضاد للثرومبين أيضًا الطعوم الكلوية من IRI ويظهر انخفاضًا ملحوظًا في النسبة المئوية للنخر الأنبوبي المتني المرتبط بزيادة طول عمر الكلى بعد الزرع .27 ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت هذه الجسيمات النانوية المضادة للتجلط لا تزال فعالة بعد ظهور القصور الكلوي الحاد ، والذي يمثل مجموعة مختلفة تمامًا من المرضى.

وفقًا لذلك ، في العمل الحالي ، سعينا إلى توسيع استخدام هذا النهج ليشمل AKI الراسخ بعد IRI لتوضيح إمكاناته للترجمة السريرية. لإثبات المفهوم ، نحن نستخدم PPACK (Phe [D] -Pro-Arg-chloromethyl ketone) باعتباره جزء مضاد الثرومبين للاقتران بـ PFC NP ، والذي أظهرناه يمنع إشارات الثرومبين وتجلط الأوعية الدموية الدقيقة في نماذج تصلب الشرايين وإصابة الكلى الحادة ( AKI) .14-17 PPACK نفسها هي مثبط معروف للثرومبين المباشر وغير القابل للانعكاس ، وهو شكل حر يتم تفريغه بسرعة كبيرة بواسطة الكلى ليكون ذا قيمة كعامل علاجي. علاج PPACK PFC NP الذي يحد من أحداث الإشارات الالتهابية في كل من الكلى والجهاز ، ويحافظ على البنية الدقيقة الكلوية ، ويخفف من تلف الأوعية الدموية. تشير هذه البيانات إلى أن هذا النهج العلاجي القائم على الجسيمات النانوية لأمراض القصور الكلوي الحاد المستمر يمكن أن يمهد الطريق للتطوير السريري لعامل مضاد للثرومبين الذي يمارس تأثيرات متعددة الموجه محليًا ويمكن إعطاؤه بأمان في المراحل المبكرة من القصور الكلوي الحاد.

طُرق

صياغة الجسيمات النانوية

تمت صياغة الجسيمات النانوية الكربونية المشبعة بالفلور كما تم وصفه سابقًا .14 باختصار ، خليط دهني مكون من 98.5 مول بالمائة من البيض L - - فوسفاتيديل كولين و 1.5 مول بالمائة من 1 ، 2- distearoyl snglycero - 3- phosphoethanolamine-N- [ تم تحضير الكربوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الصوديوم) (Avanti Polar Lipids ، Alabaster ، AL) في كلوروفورم: ميثانول (3: 1) ، قبل التجفيف لتشكيل طبقة دهنية تحت التفريغ. تم بعد ذلك دمج الفيلم الدهني (2 بالمائة (وزن / حجم)) مع PFOB (20 بالمائة (المجلد / المجلد)) (Exfluor Research Corp.) (الجلسرين 1.7 بالمائة (بالوزن / المجلد)) (Sigma ، St. ) ، ومياه MilliQ ، قبل استحلابها (Microfluidics Inc) على الجليد لمدة 4 دقائق عند 20 ، 000 رطل لكل بوصة مربعة. لتفعيل الجسيمات النانوية مع اقتران PPACK ، استخدمنا طريقة اقتران أمين-كربوكسيل. تم خلط الجسيمات النانوية (1 مل) أولاً مع 2 ملغ من EDCI 1- [3- (ديميثيلامينو) بروبيل] -3- إيثيل كاربوديميد ميثيودر (سيجما ، سانت لويس ، ميزوري) لمدة ساعة واحدة ، قبل إضافة 12.5 مجم PPACK (BACHEM ، Torrance ، CA) على درجة حرارة غرفة الهزاز المداري طوال الليل. تم إجراء غسيل الكلى بوزن جزيئي مقطوع 3000-5000 جم / مول (Fisher Scientific ، Waltham ، MA) لإزالة EDCI الزائدة و PPACK. تم تضمين طريقة صياغة مفصلة في المواد التكميلية.

نموذج إصابة الكلى الحادة

خضعت الفئران البالغة C57BL / 6 (ن=22) للإقفار الكلوي الدافئ الثنائي - ضخه للحث على إصابة الكلى الحادة. تم تخدير الحيوانات بالكيتامين (85 مجم / كجم) وزيلازين (13 مجم / كجم) كوكتيل قبل الخضوع لعملية شق البطن لإنتاج 17 دقيقة من نقص التروية الدافئ. تم إدخال شق بطني في خط الوسط لكشف كل من الشريان الكلوي والوريد. تم إحداث نقص التروية الكلوية بواسطة مشابك انسداد على كل من الشريان والوريد لتقييد تدفق الدم إلى الكلى. تم تأكيد التوقف الناجح لتدفق الدم في الكلى بصريًا عن طريق تغيير لون الكلى من اللون الوردي إلى اللون الأرجواني الداكن. تم الحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران عند 37 درجة باستخدام نظام تدفئة الحيوانات الصغيرة. تم تحرير المشابك بعد 17 دقيقة للسماح باستعادة تدفق الدم في الكلى ، وهو ما تم تأكيده من خلال تغيير لون الكلى إلى اللون الوردي. تم بعد ذلك إغلاق الجرح الجراحي في طبقات وتم مراقبة الحيوانات وإعادتها إلى القفص بعد تحريكها بحرية. بعد ضخه لمدة ساعتين ، جرعة واحدة من PPACK

تم إعطاء PFC NP ({0}. 5 مل / كجم PFC NP ؛ 0.05 مجم / كجم PPACK) أو عادي (تحكم) PFC NP عن طريق الحقن في الوريد الذيل. منذ أن أظهرت دراستنا السابقة أن جرعة وقائية واحدة من PPACK PFC NP أظهرت تأثيرات وقائية كلوية ، 16 طبقنا هنا علاجًا بجرعة واحدة بعد بداية AKI لتقييم تأثيره الوقائي الكلوي. تمت الموافقة على الإجراءات والبروتوكولات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة جنوب فلوريدا.

جمع الأنسجة وحفظها بعد 24 ساعة من إعطاء الجسيمات النانوية ، الموت الرحيم للفئران ، واستخراج الكلى للتحليل. قبل إزالة الكلى للتقييمات النسيجية والجزيئية ، تم جمع الدم من خلال ثقب في القلب لتحليل المصل ، ثم تم تروية كل فأر بشكل منتظم بمحلول ملحي عادي (Cat #: 23-535435 ، Fisher Scientific ، Waltham ، MA) حتى المتبقي تم طرد الدم من الكلى. لجمع المصل ، تم تخثر الدم الكامل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، قبل أن يتم طرده عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. تم تخزين المصل الذي تم جمعه عند درجة 80- قبل تقييمات نيتروجين اليوريا في الدم والسيتوكين. بالنسبة للتحليل النسيجي ، تم تثبيت الكلى المستأصلة في 10 في المائة من الفورمالين ، قبل معالجة الأنسجة ، والتضمين في البارافين ، والتقطيع. بالنسبة إلى تقييمات eicosanoids ، تم تشريح الكلى المستأصلة لفصل القشرة والنخاع ، قبل تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة -80 درجة للتحليل.

علم الانسجة

تم تضمين أساليب تلطيخ الأنسجة وتحليل البيانات التفصيلية في المواد التكميلية. تم إزالة الكافيين من الشرائح وترطيبها قبل تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين ، وتلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) (Cat #: ab150680 ، Abcam ، Cambridge ، MA) ، Prussian Blue Iron Staining ، Immunohistochemical Staining لتصور CD31 ، VCAM -1 ، و ICAM -1 ، وتلطيخ الخلايا البدينة - الحمضات (Cat #: 150665 ، Abcam ، Cambridge ، MA). يتم عرض بيانات تلطيخ التحكم في نمط IgG من Rabbit في الشكلين التكميليين 2 و 3 لإثبات خصوصية نتائج التلوين الكيميائي المناعي. تم الحصول على جميع الصور المجهرية في نفس إعدادات الطاقة ومعلمات الرقمنة. تم إجراء التقييمات المجهرية باستخدام مجهر أوليمبوس ذو المجال الساطع المزود بكاميرا رقمية DP27 لتسجيل صور المقاطع المرضية عند تكبير 20 × أو 40 ×. تم إجراء تحليل بيانات مزدوج التعمية على جميع الصور.

نيتروجين اليوريا في الدم (BUN)

تم إجراء قياسات BUN باستخدام مجموعة الكشف اللوني لنيتروجين اليوريا (BUN) (Cat #: K 024- H5 ، Arbor Assays ، Ann Arbor ، MI) باتباع توجيهات الشركة المصنعة.

تحضير وتحليل إيكوزانويد

تم استخراج Eicosanoids باستخدام عملية استخراج معدلة وتحليلها بواسطة UPLC ESI-MS / MS كما هو موضح سابقًا. 28 تم تضمين الطرق التفصيلية المستخدمة لهذه الدراسة في المواد التكميلية.

تقييم مصل السيتوكينات

تم شراء مجموعة السيتوكين المخصصة من R&D Systems (Minneapolis ، MN) وتم تقييمها باستخدام Luminex 200 (Northbrook ، IL) باتباع إرشادات دليل المستخدم.

إحصائيات

يتم التعبير عن النتائج على أنها تعني ± خطأ معياري للمتوسط ​​(SEM). تم تلخيص التحليل الإحصائي لكل تجربة في الجدول التكميلي 1. تم استخدام اختبار t على الوجهين أو ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Scheffe. تم إجراء تحليلات الارتباط لأزواج مختارة من المقاييس لحساب قيمة ص بيرسون. تم تعيين الدلالة الإحصائية للاختلافات في P <0.>

نتائج

يحسن علاج PPACK PFC NP وظائف الكلى بعد ظهورهاإصابة الكلى الحاد.

أشار الفحص المجهري للمظهر العام للكلى بعد 24 ساعة من علاج مضاد الثرومبين بعد ضخه (PPACK) PFC NP إلى تحسن الضرر في AKI الثابت (الشكل 1 ، AB). كانت الإصابة في 24 ساعة تقع في الغالب عند التقاطع القشري النخاعي للكلية وتضررت الأنابيب القريبة بشكل تفضيلي. كان نمط الإصابة هو نمط نخر النوع التخثرى. كان هناك تسلل التهابي طفيف في 24- نقطة زمنية. كشف التحديد الكمي للضرر الأنبوبي في أقسام H & E الملطخة (الشكل 1 ، C) أن الفئران المعالجة بـ PPACK PFC NP أظهرت انخفاضًا إجماليًا بنسبة 33.95 في المائة في النخر الأنبوبي الحاد (ATN) مقابل الفئران المعالجة NP (24.44 ± 1.76 في المائة مقابل 37. 16}} ± 4.96 بالمائة على التوالي ؛ P=0. 035). يوضح الشكل 1 ، D أن الفئران التي تتلقى العلاج أظهرت انخفاضًا بنسبة 44.03 بالمائة في BUN بمقدار 24 ساعة (110.96 ± 6.21 مجم / ديسيلتر مقابل 62.10 ± 8.71 مجم / ديسيلتر للتحكم NP مقابل PPACK PFC NP ؛ P=0. 0002) . تعكس هذه النتائج المفيدة المبكرة الحماية التي لاحظناها سابقًا مع أنظمة المعالجة المسبقة ضد الثرومبين في 24 ساعة ، مما يشير إلى أن الثرومبين يستمر في لعب دور حاسم في تطور القصور الكلوي الحاد بعد الإهانة الإقفارية الأولية.

يوضح الشكل 2 الاستجابات الإقليمية للغشاء القاعدي وهياكل حدود الفرشاة للعلاج المضاد للثرومبين بناءً على التقدير شبه الكمي لتلطيخ PAS. يوضح الشكل 2 ، AC أن المعالجة عززت النسبة المئوية للكبيبات ذات الأغشية القاعدية السليمة من 51.43 بالمائة ± 2.61 بالمائة إلى 70. 00 بالمائة ± 3.09 بالمائة (P=0. 00033). يوضح الشكل 2 ، DF الضرر الأكثر عمقًا الذي تعرضت له حدود الفرشاة الأنبوبية حيث احتفظت أقلية فقط بحدود الفرشاة السليمة تمامًا في 24 ساعة. ومع ذلك ، أدى العلاج إلى تحسين تكامل حدود الفرشاة بنسبة 50.79 بالمائة (P {{20}. 015). خفض العلاج المدى الكلي لمجموعات البروتين بنسبة 54.09 بالمائة (P=0. 032) (الشكل 2 ، GI) ، والذي قد يُتوقع منه منع الازدحام الأنبوبي للحفاظ على وظيفة الكلى.

حافظ علاج PPACK PFC NP على سلامة الأوعية الدموية بعد ظهور IRI

لتحديد إمكانات PPACK PFC NP لحماية عناصر الأوعية الدموية ، كانت أقسام الكلى ملطخة لـ CD31.

يوضح الشكل 3 الانتشار الأكبر لتلطيخ CD31 في 24 ساعة في القشرة المخية ولب الفئران المعالجة بـ PPACK NP مقابل التحكم NP (الشكل 3 ، A و D مقابل B و E). في المناطق القشرية ، شكّل تلطيخ CD31 4.28٪ ± 0. 62٪ من المعالجة مقابل 1.75٪ ± 0. 34٪ للحيوانات الضابطة (P=0. 0 {{ 25}} 18) ، أو زيادة نسبية 144.57 بالمائة (الشكل 3 ، ج). في مناطق النخاع ، يتكون تلطيخ CD31 من 3.24 بالمائة ± 0.38 بالمائة للمعالجة PPACK NP مقابل 1.91 بالمائة ± 0.29 بالمائة للحيوانات المعالجة NP (P=0. 0073) ، أو زيادة نسبية 88.81 بالمائة (الشكل 3 ، F) . أظهر التقييم المجهري لسلامة الأوعية الدموية عدم وجود نخر شرياني ملموس في 24- ساعة زمنية.

اختلف ظهور خلايا الدم الحمراء (RBC) في الصور المجهرية بين PPACK NP والفئران المعالجة بـ NP في 24 ساعة (الشكل 4). نظرًا لأن الفئران تم ترطيبها بشكل منهجي لغسل الدم في مناطق كلوية قابلة للامتصاص ، فإن وجود كرات الدم الحمراء يشير إما إلى التجميع داخل قنوات الأوعية الدموية الدقيقة المروية بشكل سيئ أو التسرب الخلالي ، أو ربما كلاهما. في الكبيبات (الشكل 4 ، AB) ، لوحظت كرات الدم الحمراء داخل خصلات الأوعية الدموية ولكن نادرًا ما كانت في كبسولة بومان في 24 ساعة. خفض العلاج انتشار كرات الدم الحمراء الكبيبية بنسبة 40.78 بالمائة (P=0 .007) (الشكل 3 ، ج). في النخاع (الشكل 4 ، DE) ، لم يكن من الممكن تعيين موقع محدد لكرات الدم الحمراء بناءً على بقع H&E ، لكن العلاج قلل انتشار كرات الدم الحمراء الإجمالية بنسبة 34.92 بالمائة (P=0. 049) (الشكل 4 ، F) .

لمزيد من تحديد عواقب ترسب كرات الدم الحمراء والمحاصرة ، تم إجراء تلطيخ بالحديد غير الهيم باستخدام Prussian Blue. كانت بقع الحديد إيجابية في كل من الهياكل الخلوية الكبيبية والأنبوبية. قلل العلاج من انتشار الحديد في كل من القشرة (انخفاض بنسبة 44.23٪ ؛ P=0. 022) (الشكل 5 ، AC) والنخاع (انخفاض بنسبة 50.50٪ ؛ P=0. 006) (الشكل 5 ، DF ) في 24 ساعة ، بما يتفق مع تأثير العلاج المضاد للثرومبين على محاصرة كرات الدم الحمراء.

قلل علاج PPACK PFC NP الالتهاب الموضعي والجهازي بعد ظهور AKI

لتوضيح دور الثرومبين في الحفاظ على تنشيط البطانة والالتهاب الموضعي في الكلى ، حددنا كلاً من ICAM -1 و VCAM -1. لم يتغير تعبير VCAM -1 في القشرة عن طريق معالجة PPACK (الشكل 6 ، AC). ومع ذلك ، فإن تعبير VCAM - 1 في النخاع تم تقليله إلى حد كبير بنسبة 65.25 بالمائة (P=0. 011) بعد العلاج (الشكل 6 ، DF). لوحظ التعبير المحسن عن ICAM البطاني -1 في كل من القشرة المخية والنخاع في الفئران المعالجة بالـ NP (الشكل 7 و B و E). تم تقليل تنظيم ICAM -1 من خلال العلاج بنسبة 36.89 بالمائة (P=0. 0083) في القشرة (الشكل 7 ، AC) وبنسبة 31.17 بالمائة (P=0. 030) في النخاع (الشكل 7 ، DF).

لتحديد دور الثرومبين في تنظيم الدهون النشطة بيولوجيًا الالتهابية في التطور المبكر لـ AKI ، أجرينا فحوصات الدهون على الأنسجة المستخرجة بشكل منفصل من القشرة والنخاع في 24 ساعة. يسرد الجدولان التكميليان 2 و 3 المقايسات الجزيئية المحددة ومنطقة الكلى وأنواع الموضوعات (AKI المعالج أو AKI غير المعالج أو العادي بدون AKI). يسرد الجدول التكميلي 4 متوسط ​​النسبة المئوية للتغير من خط الأساس الطبيعي الصحي لكل دهون في القشرة والنخاع. بشكل عام ، أظهرت كل من المناطق القشرية والنخية تعبيرًا منحرفًا عن جميع الدهون النشطة بيولوجيًا تقريبًا التي تم تقييمها مقارنة بالكلى الطبيعية (الجدولان التكميليان 2 و 3) ، وتميل جميع الدهون المؤشرة تقريبًا إلى التحول نحو المستويات الطبيعية بعد العلاج بمضادات الثرومبين. كمقياس مبسط للالتهاب الإقليمي (الجدول التكميلي 4) ، كان متوسط ​​التغير في النسبة المئوية لجميع الدهون 65.13 في المائة و 38.60 في المائة للقشرة و 136.42 في المائة و 90.76 في المائة للنخاع في مجموعات التحكم NP و PPACK NP على التوالي ، مما يشير إلى أن الالتهاب في تجاوز النخاع ذلك للقشرة وفقًا لفحوصات الدهون.

على الرغم من أن الاتجاهات كانت واضحة بعد العلاج لجميع أنواع الدهون تقريبًا ، إلا أن معظمها لم يلبِ دلالة إحصائية. ومع ذلك ، كان من الملحوظ في هذه الاختبارات الاستجابة المهمة لـ PDG2 ، والتي انخفضت بنسبة 47.62 في المائة في القشرة (الشكل 8 ، أ) (P=0. 012) و 50.21 في المائة في النخاع (الشكل 8 ، ب) ( P=0. 0249) ، على التوالي. بناءً على هذه الملاحظة ، قمنا بتحديد مدى انتشار تسلل الخلايا البدينة ، والتي تعد مصدرًا بارزًا معروفًا لـ PGD2 الالتهابي. يشير الشكل 8 ، CE إلى أن العلاج بمضادات الثرومبين قلل من محتوى الخلايا البدينة في قسم الكلى بالكامل بنسبة 54.27 بالمائة (P=0. 002) في 24 ساعة. يتوافق هذا مع التخفيضات الملحوظة في VCAM -1 و ICAM -1 (الشكلان 6 و 7) كخلايا سارية نشطة تعبر عن LFA -1 (مستضد 1 مرتبط بوظيفة الخلايا الليمفاوية) و VLA (متأخر جدًا) المستضد) تربط جزيئات الالتصاق الخاصة بالأنسجة للانتقال إلى الأنسجة الملتهبة. 29،30 علاوة على ذلك ، تم تقليل تنظيم الكيموكينات / السيتوكينات المرتبطة بالخلايا البدينة مثل M-CSF و IL -6 بشكل متزامن بواسطة الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين. بعد علاج PPACK NP ، تم تخفيض مصل M-CSF و IL -6 بنسبة 36.60 بالمائة (P=0. 0448) و 27.44 بالمائة (P=0. 0454) ، على التوالي ، بالمقارنة مع مجموعة التحكم غير المعالجة (الشكل 8 ، F).

ظهرت العديد من الارتباطات المثيرة للاهتمام من مجموعة البيانات المتعلقة بتسلل الخلايا البدينة ، وتلف الأوعية الدموية ، ووظيفة الكلى للمجموعات المجمعة الإجمالية للحيوانات المعالجة وغير المعالجة في كل من مناطق القشرة والنخاع. علاقة غير مباشرة تتعلق بين BUN و CD31 (ص=0. 75 ، P=0. 000009) ، مما يشير إلى أن تفاقم الفشل الكلوي كان مرتبطًا بمزيد من الاختراق الوعائي (الشكل التكميلي 1 ، أ). توجد علاقة مباشرة بين أرقام الخلايا البدينة و BUN (ص=0. 71، P=0. 004) ، مما يشير إلى تناقص تدريجي

من وظائف الكلى بالاشتراك مع تسلل الخلايا البدينة (الشكل التكميلي 1 ، ب). لوحظ وجود علاقة غير مباشرة بين أرقام الخلايا البدينة و CD31 (ص=0. 59 ، P=0. 002) ، مما يشير إلى أن تلف الأوعية الدموية يزداد سوءًا مع زيادة تسلل الخلايا البدينة (الشكل التكميلي 1 ، C). أخيرًا ، لوحظ وجود علاقة مباشرة بين رقم الخلية البدينة وتعبير ICAM العالمي -1 (ص=0. 54 ، P=0. 008) ، بما يتفق مع توقع أن جزيئات الالتصاق الوعائي المنتظمة ستؤدي إلى تعزيز توجيه الخلايا البدينة إلى الأنسجة المصابة (الشكل التكميلي 1 ، د). علاقة مباشرة أقرب تتعلق بتعبير VCAM النخاعي وعدد الخلايا البدينة (r=0. 69، P=0. 009 ؛ البيانات غير معروضة).

مناقشة

على الرغم من عقود من الجهود في البحث عن إدارة فعالة لإصابة الكلى الحاد, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 شقوق مضادة للثرومبين في مواقع تجلط الأوعية الدموية الدقيقة وتفعيل PAR -1 (وصف إضافي في المواد التكميلية) ، وهي استراتيجية تضخيم لا يمكن تحقيقها من خلال قياس العناصر المتكافئ بنسبة 1: 1 للعوامل الحرة التقليدية التي تثبط الثرومبين ، بما في ذلك PPACK.

تُظهر مجموعة البيانات الحالية أن إصابة نقص التروية الكلوية - ضخه لا تكتمل بعد ساعتين من إعادة ضخ الدم ، ولا يزال الثرومبين هدفًا عالي القيمة في الأنسجة التالفة بعد ضخه. تدعم الجهود السابقة من قبل شركاء Molitoris وغيرهم الجهود المستمرة لتصميم طرق آمنة لتثبيط الثرومبين بشكل مباشر في AKI.^18,31–33من خلال عملنا السابق في المعالجة المسبقة لـ AKI باستخدام PPACK PFC NP ، نعلم أن الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين توفر مراقبة مستدامة ضد الثرومبين المنشط محليًا الذي يحافظ على سلامة الأوعية الدموية ، ويخفف بشكل ملحوظ من ظاهرة عدم إعادة التدفق بنسبة 50٪ تقريبًا ، ويعكس بسرعة ضعف الكلى بنسبة 24 ساعة 16 بالاقتران مع البيانات الحالية ، من الواضح أن الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين تستمر في الوصول إلى أنسجة كلوية تالفة ولكنها قابلة للحياة بعد فترة طويلة من إعادة التروية لمنع تلف الأوعية الدموية والأنبوب الإضافي. تتفق التقارير السابقة التي تفيد بأن الفئران القاضية PAR -1 تعاني من انخفاض الإصابة بنقص التروية الكلوية وضخه ، تتوافق أيضًا مع استراتيجيتنا للتثبيط الدوائي القوي والمستمر لتفعيل PAR -1 في القصور الكلوي الحاد عن طريق تثبيط الثرومبين.³⁴

حماية الهياكل الوعائية الكلوية (الشكل 3) ، وحد الفرشاة ، والغشاء القاعدي (الشكل 2) التي يوفرها مضاد الثرومبين PFC NP ، بالتنسيق مع بياناتنا السابقة التي توضح أن العلاج المضاد للثرومبين يؤدي إلى تحسن بمقدار 2 × في التروية في المناطق القشرية النخاعية في يؤكد مرض القصور الكلوي الحاد ، 16 على فائدة طارئة لتحسين اعتلال الأوعية الدقيقة الكلوي. على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للأضرار التي لحقت بالشعيرات الدموية والأوردة المحيطة بالنبيبات لم يتم توضيحها بالكامل في هذه النقاط الزمنية المبكرة بعد إعادة التروية ، إلا أنه تم وصف نفاذية الأوعية المحسنة وتنشيط كاسباس البطانة الاستباقية -3 ، بالإضافة إلى تضاؤل ​​الإشارة بالنسبة لـ CD31 (PECAM) ، 35 الذي ينظم سلامة الوصلة البطانية. 36 يتم تنظيم تخليق CD31 والتعبير عند تقاطعات الخلية بواسطة السيتوكينات الالتهابية التي يتم التعبير عنها بواسطة الخلايا البدينة المنشطة (TNF- و IFN-) ، مما يعزز نفاذية الأوعية الدموية.^37,38علاوة على ذلك ، فإن تحريض عامل الأنسجة بواسطة الثرومبين من خلال تنشيط PAR -1 يتم تنظيمه بواسطة CD31 ، وتظهر الفئران المطلقة CD31 زيادة في موت الخلايا المبرمج البطاني والظهاري الأنبوبي ، وزيادة ترسب الفيبرين ، وتعبير عامل الأنسجة.³⁹وفقًا لذلك ، قد تكون قدرة PPACK PFC NP على الحفاظ على تعبير CD31 أمرًا حيويًا للحد من التنشيط المستمر لسلسلة التخثر والحفاظ على سلامة البطانة.

توجد علاقة موضعية بين الالتهاب والتخثر في مرحلة تمديد القصور الكلوي الحاد الذي يحد من نضح الشعيرات الدموية النخاعية الخارجية مما يتسبب في نقص التروية الإقليمية / نقص الأكسجة لفترة طويلة ، مما يضعف بعد ذلك إصلاح وتجديد الخلايا الأنبوبية .4 انخفاض مستمر في عدد الأوعية الدقيقة في الشريط الداخلي من النخاع الخارجي في AKI يشير إلى استمرار تلف الأوعية وإيقاف إشارات VEGF.^40–42علاوة على ذلك ، هناك أدلة وفيرة على أن خلخلة الأوعية الدموية يؤدي إلى نقص الأكسجة المزمن مما يؤدي إلى تليف نبيبي خلالي تدريجي.⁴³في نموذج إقفار الفئران الحاد / الإصابة ، تكون الأنابيب القريبة حساسة بشكل خاص لنقص الأكسجة الذي يظهر عن طريق تقشير الخلايا الأنبوبية وحتى التفكك الكلي ، مما ينتج عنه وفيات مفرطة. فشل كلوي مزمن.⁴⁶

تؤكد بياناتنا أيضًا أن تلف الأوعية الدموية يعزز محاصرة كرات الدم الحمراء وترسب غير الهيم (الشكلان 4 و 5) مما قد يؤدي إلى تفاقم مرض الكلى المزمن ،⁴⁷ولكنه قابل للعلاج بمضادات الثرومبين. مصدر الحديد في الأنسجة في كل من الخلايا الكبيبية والأنبوبية (الشكل 5) نشأ بلا شك من انهيار كرات الدم الحمراء في تلك المناطق نتيجة النزيف و / أو تجلط الأوعية الدموية الدقيقة ، بما يتوافق مع صورة تسوية الأوعية الدموية التي يتم تخفيفها عن طريق العلاج المضاد للثرومبين. وفقًا لذلك ، قد تمثل الأساليب التي تحافظ على سلامة الأوعية الدموية خطوة أولى حاسمة نحو الحفاظ على خطوط الإمداد للركائز الغذائية التي تسهل الشفاء السريع للهياكل الأنبوبية التالفة.

ومن المثير للاهتمام ، أن PPACK PFC NP يبدو أنه يوفر حماية مبكرة لهياكل الأوعية الدموية ويخفف من علامات الالتهاب المختلفة (الشكلان 6 و 7 ؛ الجداول التكميلية 2-4) في كل من القشرة المخية والنخاع. في الدراسات التجريبية التقليدية لـ AKI ، يُفترض أن القشرة أكثر مقاومة للضرر من النخاع بسبب انخفاض الطلب الأيضي ، ومع ذلك يبدو التنشيط البطاني والالتهاب الفيزيولوجي المرضي منتشرين كما يتضح من فحوصاتنا الدهنية والكيميائية النسيجية. علاوة على ذلك ، فإن الترسب الواسع للحديد غير الهيم كنتيجة ثانوية لانهيار كرات الدم الحمراء المحبوسة في كل من القشرة والنخاع - وتخفيفها عن طريق الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين - يتوافق مع نمط عام من الالتهاب والضرر حتى لو كانت القشرة الدماغية قد أثبتت أكثر من ذلك. تأثر بشكل عابر وخفيف من النخاع على مدار المرض.

تشير الاستجابة المبكرة المفاجئة لتسلل الخلايا البدينة في غضون 24 ساعة (الشكل 8) إلى دور مهم للخلايا الالتهابية بخلاف اللاعبين التقليديين مثل العدلات والضامة. تعتبر الخلايا البدينة عادة وسطاء للاستجابات التحسسية ، ولكن هناك مجموعة من المؤلفات المتعلقة بآثارها الفيزيولوجية المرضية في الإصابة الكلوية الحادة والمزمنة.^48–52 على الرغم من أن العدلات هي المستجيب المبكر لإصابة الأنسجة ، فإن البلاعم لا تدخل الصورة حتى وقت لاحق في عملية الالتهاب ، مما يشير إلى أن الخلايا البدينة تلعب دورًا مهمًا في المرحلة المبكرة من AKI. في الواقع ، أظهر Danelli et al أن تحلل الخلايا البدينة يحدث في وقت مبكر من AKI وأن استنفاد الخلايا البدينة في وقت تحريض AKI ولكن ليس بعد 48 ساعة يمنح تأثيرًا مفيدًا طويل المدى على وظائف الكلى والضمور والتليف.⁵³توصل تونغ وآخرون إلى استنتاجات مماثلة في إجراءات الخلايا البدينة المستقرة بالكرومولين التي تم إجراؤها قبل إعادة ضخ الدم .54 أظهر سمرز أن الفئران التي تعاني من نقص الخلايا البدينة (KitW-sh / W-sh) تعاني من إصابات نقص تروية أقل من الأنواع البرية وأن ذلك وضعوا مستويات منخفضة من الكريات البيض الكيميائية الجاذبة.⁵⁵

تعبر الخلايا البدينة عن مستقبلات تنشط بالبروتياز تعبر الخلايا البدينة عن مستقبلات تنشط بالبروتياز (PARs) التي يمكن تنشيطها بواسطة الثرومبين لإزالة الحبيبات وتفريغ مجموعة من الكيموكينات مسبقة التشكيل والسيتوكينات والدهون النشطة بيولوجيًا .56-58 يتسبب الثرومبين أيضًا في التصاق الخلايا البدينة بالمصفوفة البروتينات (على سبيل المثال ، فيبرونيكتين) وتعبير إنترلوكين (على سبيل المثال ، IL -6) من خلال تفاعلات PAR - 1.⁵⁹بعد تثبيط الثرومبين ، لاحظنا انخفاضًا في مستويات PGD2 التي تتوافق مع الاستنفاد النسبي للخلايا البدينة لأن PGD2 هو مادة إيكوزانويد أساسية نشطة بيولوجيًا تفرزها الخلايا البدينة في تفاعلات الحساسية .60 علاوة على ذلك ، تقليل تنظيم ICAM -1 و يتوافق VCAM -1 بعد العلاج بالجسيمات النانوية المضادة للثرومبين مع انخفاض تسلل الخلايا البدينة حيث يعبرون عن LFA -1 و VLA ويستخدمون جزيئات الالتصاق لاكتساب دخول الأنسجة.^29,30

لم يتم وصف الدور الممرض المحدد لـ PGD2 نفسه في تطور IRI الكلوي حتى الآن على حد علمنا ، ولكنه يعمل كمؤشر حيوي واضح لتنشيط الخلايا البدينة.⁵²في الالتهاب الرئوي ، ثبت أن PDG2 يعزز التعبير الخلوي الالتهابي البلاعم من خلال مستقبلاته (DP1 و DP2) ، والتي تنشط بعد ذلك تدفق العدلات. 61 ملاحظتنا لزيادة M-CSF و IL -6 (الشكل 8) في AKI التي يتم تنظيمها بواسطة PPACK PFC NP عبر قمع الخلايا البدينة ستكون متسقة مع هذه الآلية المفترضة. ومع ذلك ، نظرًا لأنه من المعروف أن الخلايا البدينة تطلق مجموعة من العوامل التي من المحتمل أن تكون ضارة بوظيفة الكلى ، 51،52 قد يكون أي عدد من المحددات المسؤولة موضوعًا للدراسة المستقبلية للتحكم عن طريق تثبيط الثرومبين أو العوامل الأخرى المستهدفة جزيئيًا. وفقًا لذلك ، يمكن أن تكون التدخلات التي تؤخر جذب الخلايا البدينة المبكرة وإزالة الحبيبات حماية عالية لسلامة الأوعية الدموية ووظيفة الكلى كما يتضح من تثبيط الثرومبين المحلي في البيانات الحالية.

محددات

لم يتم تصميم هذه الدراسات لتوضيح الفوائد المستمرة لتثبيط الثرومبين حيث يركز نموذج AKI على الحماية المبكرة ضد IRI والآليات ذات الصلة. إن ما إذا كانت الفوائد طويلة المدى لجرعة واحدة من الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين قد تحد من التقدم إلى مرض الكلى المزمن هو خارج نطاق هذا التقرير وسيتطلب نموذجًا وفرضية تجريبية مختلفة. علاوة على ذلك ، فإن النافذة الزمنية للفرصة لتحقيق الانتعاش الوظيفي عن طريق تثبيط الثرومبين في مرحلة تمديد AKI لم يتم تناولها هنا ولكنها موضوع اهتمام للدراسات المستقبلية. إلى أي مدى تكون الآثار المفيدة الرئيسية لتثبيط الثرومبين المحلي في AKI بسبب قمع تنشيط الخلايا البدينة لا تزال تخمينية ولكنها ستكون قابلة للاختبار في دراسات آلية مفصلة لاحقة. ومع ذلك ، على الرغم من أن الارتباطات الخطية الهامة بين أرقام الخلايا البدينة ، CD31 ، و BUN لا تحدد بالضرورة السبب والنتيجة ، فإن توافقها يدعم علاقة قوية بين الخلايا البدينة وتلف الأوعية الدموية في المراحل المبكرة من الكلى IRI. أخيرًا ، يعد استخدام PPACK باعتباره الجزء المضاد للثرومبين مجرد مثال واحد لمكون علاجي قابل للاقتران يمكن توصيله بأمان ومحليًا على بنية نانوية لإخضاع إشارات الثرومبين.

1. Benoit SW، Devarajan P. إصابات الكلى الحادة: العلاجات الدوائية الناشئة في التجارب السريرية الحالية. بيدياتر نيفرول 2018 ؛ 33: 779-87.

2. Chen H، Busse LW. علاجات جديدة لإصابات الكلى الحادة. Kidney Int Rep 2017 ؛ 2: 785-99.

3. Bonventre JV، Yang L. الفيزيولوجيا المرضية الخلوية لإصابة الكلى الحادة الإقفارية. J Clin Invest 2011 ؛ 121: 4210-21.

4. شرف الدين أ. م. موليتوريس. الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الكلى الحادة الإقفارية. نات ريف نفرول 2011 ؛ 7: 189-200.

5. Bonventre JV. الفيزيولوجيا المرضية للـ AKI: الإصابة والإصلاح الطبيعي وغير الطبيعي. مساهمة نفرول 2010 ؛ 165: 9-17.

6. Zuk A ، Palevsky PM ، Fried L ، Harrell Jr FE ، Khan S ، McKay DB ، et al. التغلب على الحواجز الانتقالية في إصابة الكلى الحادة: تقرير من ورشة عمل NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018 ؛ 13: 1113-23.

7. Zuk A، Bonventre JV. التطورات الحديثة في إصابة الكلى الحادة وعواقبها وتأثيرها على أمراض الكلى المزمنة. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019 ؛ 28: 397-405.

8. الرحمن أ ، فضل ف. حجب NF-kappaB: قضية ملتهبة. بروك آم ثوراك سوك 2011 ؛ 8: 497-503.

9. Jagadeesha DK، Takapoo M، Banfi B، Bhalla RC، Miller Jr FJ. إن معاملات Nox1 لمستقبلات عامل نمو البشرة تعزز تساقط N-cadherin وهجرة خلايا العضلات الملساء. كارديوفاسك ريس 2012 ؛ 93: 406-13.

10. Lopez ML ، Bruges G ، Crespo G ، Salazar V ، Deglesne PA ، Schneider H ، et al. يؤدي الثرومبين بشكل انتقائي إلى نسخ الجينات في الخلايا الوحيدة البشرية المشاركة في الالتهاب والتئام الجروح. ثرومب هايموست 2014 ؛ 112: 992-1001.

11. Borissoff JI ، Spronk HM ، Heeneman S ، Ten Cate H. هل الثرومبين لاعب رئيسي في متاهة "التخثر والتصلب العصيدي"؟ كارديوفاسك ريس 2009 ؛ 82: 392-403.

12. رودمان-ميلنيك الخامس ، آدم إم ، بوتر إيه ، تشوكشي إس إم ، ما كيو ، دريك كا ، وآخرون. يكشف التنميط أحادي الخلية لـ AKI في نموذج الفئران عن تواقيع نسخية جديدة ، ونمط ظاهري احترافي ، وتداخل ظهاري إلى انسجة. مجلة الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى: JASN 2020 ؛ 31: 2793-814.

13. Kirita Y، Wu H، Uchimura K، Wilson PC، Humphreys BD. يكشف التنميط الخلوي لإصابة الكلى الحادة في الماوس عن استجابات خلوية محفوظة للإصابة. Proc Natl Acad Sci USA 2020 ؛ 117: 15874-83.

14. Myerson J ، He L ، Lanza G ، Tollefsen D ، Wickline S. توفر الجسيمات النانوية الكربونية البيرفلوروكربونية المثبطة للثرومبين إستراتيجية جديدة للعلاج والتصوير بالرنين المغناطيسي للتخثر الحاد. مجلة التخثر والإرقاء: JTH 2011 ؛ 9: 1292-300.

15. Myerson JW ، He L ، Allen JS ، Williams T ، Lanza G ، Tollefsen D ، et al. تشكل الجسيمات النانوية المثبطة للثرومبين بسرعة أسطحًا متعددة الاستخدامات ومضادة للتجلط يمكن اكتشافها. تقنية النانو 2014 ؛ 25: 395101.

16. Chen J ، Vemuri C ، Palekar RU ، Gaut JP ، Goette M ، Hu L ، et al. تعمل الجسيمات النانوية المضادة للثرومبين على تحسين ضخ الكلى وتحمي وظائف الكلى بعد الإصابة بنقص التروية وضخه. آم J Physiol Renal Physiol 2015 ؛ 308: F 765-73