دور الميلانوجين المعتمد على المصل / PDGF لمستوى دقيقة من Kinase PAK1 المنشأ للأورام في خلايا الورم الميلانيني الذي تم إثباته بواسطة فحص كيناز عالي الحساسية

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

ملخص:لقد أوضحنا سابقًا أن كيناز الورم PAK4 ، الذي يعبر عن كل من الأورام الميلانينية والخلايا الصباغية الطبيعية بمستوى عالٍ جدًا ، ضروري بالنسبة لهم.تكون الميلانين. في هذه الدراسة ، باستخدام مقايسة كيناز "Macaroni-Western" شديدة الحساسية (IP-ATP-Glo) ، قمنا بفحص إمكانات الميلانين في كيناز مسرطنة أخرى PAK1 ، والتي تعبر خلايا الورم الميلانيني (B16F10) فقط عند مستوى دقيق جدًا. بعد عدوى خلايا الورم الميلانيني باستخدام PAK 1- shRNA لإسكات الجين PAK1 ومحتوى الميلانين ،التيروزينازالنشاط ، ونشاط كيناز PAK1 تمت مقارنته بين النوع البري والمعدلات. وجدنا أن (1) يتم تنشيط PAK1 بشكل كبير بواسطة الهرمونات الميلانينية مثل IBMX (3- isobutyl -1- methyl xanthine) و -MSH (هرمون تحفيز الخلايا الصباغية) ، (ii) إسكات جين PAK1 الداخلي في تقلل خلايا الورم الميلانيني من خلال مادة shRNA الخاصة بـ PAK 1- محتوى الميلانين والتيروزينازالنشاط في وجود كل من المصل والهرمونات الميلانينية إلى المستوى القاعدي ، (3) النوع البري المضاف خارجيًا PAK1 في خلايا الورم الميلانيني يعزز مستوى الميلانين المحفز MSH بعدة طيات دون التأثير على القاعدة ، و (4) - نادراً ما يحدث تكوين الميلان الناجم عن MSH / IBMX في غياب أي مصل أو PAK1 ، مما يشير بوضوح إلى أن PAK1 ضروري بشكل أساسي للمصل و MSH / IBMX المعتمدتكون الميلانين، ولكن ليس القاعدية ، في خلايا الورم الميلانيني. قد توفر نتائج هذه الدراسة الأساس العلمي الأول لشرح سبب فائدة مجموعة متنوعة من حاصرات PAK العشبية 1- مثل CAPE (حمض الكافيين إستر الفينيثيل) والكركمين وشيكونين في مستحضرات التجميلتفتيح البشرة.

الكلمات الدالة:PAK1 ،تكون الميلانين، الأورام الميلانينية ،التيروزيناز، MITF ،تفتيح البشرة، مصل

منتجات العناية بالبشرة تبييض cistanche

مقدمة

يتم التحكم في لون الشعر وقزحية العين والجلد بواسطة عائلة من أصباغ تسمى الميلانين. مصدر الميلانين داخل الخلايا هو التيروزين ويتم تحويله إلى الميلانين من خلال سلسلة من الأكسدة الأنزيمية (الهيدروكسيل) التي تتضمنالتيروزيناز، TRP (البروتين المرتبط بالتيروزيناز) 1 ، و TRP2. يتطلب التعبير عن ترميز الجينات لهذه الإنزيمات الميلانينية عاملين على الأقل من عوامل النسخ السرطانية / الميلانينية (MTFs): بيتا كاتينين و MITF (عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم). غالبية المركبات العشبية فيتفتيح البشرةمستحضرات التجميل إما تثبط مباشرة هذه الإنزيمات الميلانينية أو تقلل من تنظيم MTFs. تنتمي نظائر التيروزين مثل حمض الكوجيك إلى الفئة الأولى (التيروزينازمثبطات) ، بينما تنتمي غالبية البقايا مثل CAPE (إستر فينيثيل حمض الكافيين) والكركمين والشيكونين إلى الفئة الثانية (منظمات MTF) (1،2). ومن المثير للاهتمام أن العديد من منظمات MTF بما في ذلك CAPE و curcumin و shikonin و cucurbitacin معروفة بأنها تمنع الكيناز المسرطنة / الشيخوخة PAK1 (RAC / CDC 42- كيناز المنشط 1) (3-5). وبالتالي ، فمن المرجح أن يكون PAK1 متورطًا في تنشيط عوامل النسخ الميلانينية / الورمية في خلايا الشعر أو قزحية العين أو الخلايا الصباغية للجلد. في الواقع ، يعتبر بيتا كاتينين على الأقل من بين الركائز المباشرة لـ PAK1 (6). PAK1 فسفوريلات بيتا كاتينين في Ser 675 للتنشيط ، مما يؤدي إلى تحول خبيث. علاوة على ذلك ، فإن بيتا كاتينين ضروري لتفعيل MITF ، مما يؤدي إلىتكون الميلانينأو / وتكوين الخلايا الصباغية (7).

ومن المثير للاهتمام ، أنه تم الكشف مؤخرًا عن أن الجين PAK1 الضرب في حد ذاته في الفئران المصطبغة يفشل في إنتاج أي فئران ألبينو (Hong He et al. ، ملاحظة غير منشورة) ، مما يشير بوضوح إلى أن تكوين الميلانين الأساسي على الأقل في كل من خلايا الشعر والعين قزحية العين مستقلة عن PAK1 ، على الرغم من مساهمة PAK1 في الجلدتكون الميلانينلا يزال يتعين توضيحه.

لقد أظهرنا سابقًا أن كيناز الورم PAK4 (كيناز 4 المعتمد على CDC 42- يتم التعبير عنه بشكل كبير في كل من الورم الميلانيني وخطوط الخلايا الصباغية الطبيعية ، وهو مسؤول عن تكوين الميلانين ، مما يؤدي إلى تنشيط CREB / beta-catenin-MIFT-التيروزينازpathway ، في حين أن PAK2 (RAC / CDC 42- تنشيط كيناز 2) ، وهو عضو آخر شديد التعبير من عائلة PAK ، لا يلعب أي دور في تكوين الميلانين (8).

في هذه الدراسة ، نقدم أول دليل كيميائي حيوي لدور معين للكيناز المسرطنة الأخرى يسمى PAK1 في الجلدتكون الميلانين، على الرغم من حقيقة أن مستوى تعبيره ضئيل: إسكات الجين PAK1 الناجم عن shRNA في الخلايا الصباغية (B16F10) المشتق من سرطان الجلد في الفأر قلل بشكل كبير من -MSH / IBMX-inducibleتكون الميلانينإلى المستوى الأساسي ، في حين أن الإفراط في التعبير عن جين PAK1 عزز تكوين الميلانين الذي يحفزه MSH دون التأثير على القاعدة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن تكوين الميلانين القابل للتحفيز -MSH / IBM يتطلب عامل مصل يكون على الأرجح PDGF (عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية). في الوسط الخالي من المصل ، القاعدية فقطتكون الميلانينيحدث.

cistancheتقليل نشاط التيروزيناز

2. المواد والأساليب

2.1. المواد

تم شراء خلايا سرطان الجلد B16F10 من American Type Culture Collection (Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء PAK 1- بلازميدات SureSilencing ، تعداء جذابة ، وطقم endofree® plasmid maxi من Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا 91355 ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على الأجسام المضادة الأولية PAK 1- ، والأجسام المضادة الثانوية المهدئة بيولوجيًا ، وكاشف SIGNERFIER TM ECL من تقنية تشوير الخلايا (Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء كاشف Kinase Glo و ATP (ATP _ مجموعة Glo kinase) من Promega (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء خلايا Lipofectamine و JM109 المختصة من Invitrogen and Life Technology. تم شراء AG1295 و AG1478 من Calbiochem (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء جميع المواد الكيميائية الأخرى بما في ذلك PDGF-bb البشري من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.2. إسكات الجين PAK1 في الخلايا الصباغية للفأر (B16F10) عن طريق تعداء مستقر باستخدام shRNA الخاص بالماوس 1-

2.2.1. زراعة الخلايا

تمت زراعة خلايا سرطان الجلد B16F10 في DMEM المضاف إليها 10 في المائة من FBS المنشط بالحرارة و 1 في المائة من البنسلين / الستربتومايسين (10 ، 000 U / مل و 100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

2.2.2. تعداء مستقر مع PAK الماوس 1- shRNA محددة

تم إجراء تعداء ShRNA لخط خلية B16F10 بشكل أساسي من خلال نفس الإجراء الموضح سابقًا (9) ، ولكن باستخدام shRNAs الخاصة بالماوس PAK 1- (# KM04553 ، Qiagen). تم استخدام النسخ الأربعة المميزة التالية من shRNAs للترنس: استنساخ 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT) ، استنساخ 2 (CATCAAGTGACAATTCT) ، استنساخ 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) ، واستنساخ 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGTROL) بالإضافة إلى عنصر تحكم سلبي. . ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، تبين أن الاستنساخ 1 و 2 أكثر فعالية من المستنسخات 3 و 4 لإسكات جين PAK1 للماوس في خط الخلايا الصباغية (البيانات غير معروضة). تم اختيار المواد المعدية المستقرة في وجود G418 (1 مجم / مل) الذي يقتل أكثر من 99 في المائة من الخلايا غير المنقولة.

2.2.3. تحليل اللطخة الغربية لمستوى البروتين PAK1 والمقايسة في المختبر لنشاط كيناز لـ PAK1 في المتحولين

2.2.3.1. تحليل لطخة غربية

من أجل تحديد المستوى المنخفض للغاية لـ PAK1 في كل من خط خلية التحكم (WT) و PAK 1- transfectants (مقاومة 418- G) ، من خلال تقليل مستويات "الضوضاء غير المحددة" ، أجرينا الاختبار الغربي تحليل البقعة باستخدام جسم مضاد متعدد الأضلاع للأرنب ضد PAK1 (# 2062 ، تقنية تشوير الخلية) باعتباره الجسم المضاد الأساسي. باختصار ، تم بذر كل استنساخ بتركيز 2 × 105 خلية / بئر في صفيحة 6 آبار ، تمت زراعتها مسبقًا لمدة 48 ساعة ، وتم غليان محلولات الخلية في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت SDS-PAGE لمدة 5 دقائق. تم استخدام ثمانية ميكرولتر (تحتوي على 15 ميكروغرام من البروتين الكلي) من كل مادة طافية لكل فتحة في SDS-PAGE. تم مسح النيتروسليلوز باستخدام مضاد PAK1 IgG (1: 1 ، 000 كجسم مضاد أولي) ، وكأجسام مضادة ثانوية ، IgG المضاد للأرانب المرتبط بـ HRP ومضاد البيوتين IgG (# 7074 ، # 7075 ، Cell Signaling) لاكتشاف كل من نطاقي PAK1 و -actin اللذين تم تصويرهما في النهاية باستخدام نظام ECL من Amersham. كانت فحوصات اللطخة الغربية ممثلة لثلاث تجارب مستقلة.

2.2.3.2. مقايسة كيناز "Macaroni-Western" (IP- ATP _ Glo) لـ PAK1 في خلايا الورم الميلانيني

تم قياس نشاط كيناز PAK1 في الخلايا الصباغية WT و shRNA (SHs) من خلال تعديل جوهري (5) لطريقة عمرها عقد (والتي صاغناها "Macaroni-Western") طورتها مجموعة إيطالية (1 {{39) }}). باختصار ، تم زرع خطوط خلايا سرطان الجلد B16F10 (WT أو SHs ، 2 × 105 خلية / مل) مسبقًا على لوحة بئر 6- لمدة 24 ساعة. ثم عولجت الخلايا بـ 100 نانومتر -MSH أو 100 ميكرومتر IBMX لمدة 48 ساعة. تم تعطيل الخلايا بواسطة محلول تحلل يحتوي على 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris HCl 7.5 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 في المائة Triton-X. بالنسبة للترسيب المناعي (IP) لـ PAK1 ، تم تحضين محللات الخلية التي تم تطهيرها باستخدام مضاد PAK1 IgG (تخفيف 1:50) وحبات البروتين A-agarose لمدة 1-2 ساعة في الغرفة الباردة مع الاهتزاز المستمر بواسطة خلاط دوار (نيسين ، سوجينامي كو ، طوكيو ، اليابان). تم تحضين IP الناتج (PAK1) من كل محللة باستخدام مجموعة مقايسة ATP Glo kinase (Promega) في وجود ATP و MBP (بروتين المايلين الأساسي) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة ، وتم قياس مستوى ATP المتبقي بواسطة ATP- المعتمد على تفاعل Luciferin-Luciferase الذي يولد في النهاية التلألؤ (10). تم طرد المعلق النهائي بالطرد المركزي ، وتم نقل المادة الطافية إلى لوحة بئر 96- للقراءة. تم تسجيل اللمعان بواسطة قارئ الصفيحة المختبرية MTP -880 (Corona ، Hitachinaka-ku ، Ibaraki ، اليابان) بزمن تكامل يبلغ 0.5 ثانية لكل بئر.

2.3 قياس محتوى الميلانين ونشاط التيروزيناز في المواد المعدية

2.3.1. قياس محتوى الميلانين

تم تحديد محتوى الميلانين كما هو موضح سابقًا (11). باختصار ، تم طلاء خلايا B16F10 (من النوع البري أو 1- انتقالات shRNA محددة) بكثافة 2 × 104 خلية / بئر في لوحة بئر 24-. بعد 24 ساعة من الثقافة ، تمت إضافة 100 ميكرومتر من أيزوبوتيل -1- ميثيل زانثين (IBMX) أو 100 نانومتر-MSH واحتضانها لمدة 72 ساعة إضافية عند 37 درجة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول الفوسفات ، ثم تم تحللها بـ 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم و 10 في المائة DMSO وحضنت عند 80 درجة لمدة ساعة واحدة ، لإذابة الميلانين ، وتم قياس محتوى الميلانين عند 490 نانومتر. لمقارنة محتوى الميلانين في الخلايا البرية والخلايا المنقولة ، تم اعتبار الكمية الإجمالية للميلانين التي تنتجها الخلايا الصباغية من النوع البري كعنصر تحكم (100 في المائة) ، وتم حساب تلك التي بواسطة المتحولات وفقًا لذلك.

2.3.2. فحص نشاط التيروزيناز داخل الخلايا

تيروزينازتم تحديد النشاط كما هو موضح سابقًا (12) ، مع تعديل طفيف. تم طلاء خلايا B16F10 (من النوع البري أو transfectants) بكثافة 2 × 104 خلية / بئر ، وبعد 24 ساعة من الثقافة ، تمت إضافة 100 ميكرومتر IBMX أو 100 نانومتر - MSH واحتضانها لمدة 72 ساعة إضافية عند 37 درجة. . تم بعد ذلك غسل الخلايا بمحلول فوسفات بارد مثلج ومحلول مع محلول فوسفات (درجة الحموضة 6.8) يحتوي على 1 بالمائة Triton-X (500 ميكرولتر / بئر). تم تجميد الألواح عند درجة حرارة -80 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد الذوبان ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من 1 بالمائة L-DOPA إلى كل بئر. بعد الحضانة عند 37 درجة لمدة ساعتين ، تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر.

2.4 قياس محتوى الميلانين في النوع البري و PAK 1- الإفراط في التعبير عن الخلايا الصباغية بعد علاج MSH

باستخدام ناقل Myc (2 ميكروغرام) ، تم نقل الخلايا الصباغية (B16F10) بشكل عابر إما من النوع البري (WT) PAK1 أو ما يسمى بـ "المنشط بشكل أساسي" (CA) PAK1 الذي يحمل طفرة T423E. بعد 3 أيام من الثقافة ، تم حصاد كل استنساخ منقوص لإجراء مزيد من التجارب. تم قياس تأثير PAK 1- الإفراط في التعبير على محتوى الميلانين من خلال نفس الإجراءات الموصوفة سابقًا (8). باختصار ، تم تحضين الخلايا الصباغية ، سواء من النوع البري أو PAK 1- المفرط التي تعبر إما عن النوع البري PAK1 أو متحولة CA الخاصة بها ، مع 100 نانومتر - MSH لمدة 3 أيام. تم تحليل الخلايا بمحلول يحتوي على 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم و 20 في المائة DMSO لإذابة الميلانين ، وتم تحديد محتواه عند 405 نانومتر.

2.5 تكون الميلانين في وسط خالٍ من المصل

تم طلاء خلايا B16F10 (من النوع البري أو 1- انتقالات shRNA محددة) بكثافة 2 × 104 خلايا / بئر في 24- لوحة بئر في وجود 10 بالمائة من FBS. بعد 24 ساعة من الحضانة ، يتم استبدال وسط الاستزراع بوسيط خالٍ من المصل ، ويتم تربيته لمدة 72 ساعة إضافية مع أو بدون 100 ميكرومتر IBMX أو 100 نانومتر -MSH لقياس محتوى الميلانين.

2.6. تأثير مثبطات مستقبلات PDGF / EGF على تكوين الميلانين المعتمد على المصل

تم زرع خلايا 2 × 104 B16F10 في كل بئر لمدة 24 ساعة في وسط يحتوي على 10 بالمائة من FBS ، ثم تم تربيتها لمدة 72 ساعة إضافية في الوسط الطازج الذي يحتوي على 100 نانومتر-MSH وما يلي: (1) لا يوجد مصل ، (2) 10 بالمائة FBS وحده ، (3) 10 بالمائة FBS بالإضافة إلى 2 ميكرومتر AG1295 (مثبط مستقبلات PDGF) ، و (4) 10 بالمائة FBS بالإضافة إلى 400 نانومتر AG1478 (مثبط مستقبلات EGF) ، لقياس محتوى الميلانين.

2.7. تحليل احصائي

يتم التعبير عن البيانات على أنها قيم متوسطة مع أخطائها المعيارية. تم إجراء المقارنات الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Duncan متعدد المدى. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام SAS (الإصدار 9.2 ؛ SAS Institute ، Cary ، NC ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و p أقل من أو يساوي 0. 05 اعتبرت هامة.

الجينسنغ maca cistanche

3. النتائج

3.1. تفعيل PAK1 في خط خلايا الورم الميلانيني (B16F10) بواسطة الهرمونات الميلانينية

غالبًا ما يتم استخدام اثنين من الهرمونات الميلانينية ، -MSH (هرمون منشط للخلايا الصباغية) و IBMX (3- إيزوبوتيل -1- ميثيل زانثين) لتحفيزتكون الميلانينفي الخلايا الصباغية مثل خط خلايا سرطان الجلد B16F10. وبالتالي ، قمنا أولاً بفحص ما إذا كانت هذه الهرمونات يمكنها تنشيط PAK1 في خط الخلية هذا ، على الرغم من أن مستوى البروتين في PAK1 منخفض للغاية ، مقارنةً بمستوى PAK2 و PAK4 (8). لمراقبة التغيرات في نشاط كيناز PAK1 في الخلايا ، قمنا مؤخرًا بتطوير اختبار كيناز عالي الحساسية / محدد يسمى بروتوكول فحص كيناز "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) من خلال الجمع بين الترسيب المناعي (IP) لـ PAK1 من الخلية lysates ومجموعة ATP من Promega _ Glo kinase (5). باستخدام اختبار كيناز هذا ، وجدنا أن كلا من -MSH (100 نانومتر) و IBMX (100 ميكرومتر) ينشطان PAK1 في خلايا الورم الميلانيني ، مع كون -MSH أكثر فعالية من IBMX (انظر الشكل 1). ومع ذلك ، يجب أن نذكر القراء بأن تنشيط الطية لـ PAK1 الموضح هنا واضح فقط ، لأنه خلال هذا الاختبار الذي يستغرق وقتًا طويلاً ، يتم إجراء اختبار IP و kinase (أكثر من 3 ساعات في المجموع) بدون هذه الهرمونات الميلانينية ، سيتم تطبيع PAK1 تدريجيًا خلال زمن. بمعنى آخر ، لا يمكننا تجميد حالة كيناز بالضبط لـ PAK1 في نهاية ثقافة الخلية التي تمت معالجتها بهذه المحفزات ، ولا يعد تنشيط الطية سوى انعكاس أقل تقديرًا لتنشيط PAK1 الذي يحدث أثناء ثقافة الخلية بواسطة هذه المحاكيات.

3.2 إسكات الجين PAK1 بواسطة shRNAs في خط خلايا الورم الميلانيني في الفئران

من أجل مزيد من التحقيق في الكيمياء الحيوية إذا كان PAK1 يساهم فيتكون الميلانينفي خلايا الجلد (الخلايا الصباغية) ، نقلنا بثبات خط خلايا سرطان الجلد B16F10 باستخدام shRNA الخاص بالماوس 1- لإسكات جين PAK1 بشكل انتقائي.

3.2.1. إسكات الجين PAK1 في الخلايا الصباغية

اقترح تحليل اللطخة الغربية الأولية أنه في نسختين متميزتين من PAK {0}} المستنسخة (SH1 و 2) انخفضت مستويات بروتين PAK1 بشكل كبير (بحوالي 75 بالمائة) ، لكن معدل نمو خط خلايا الورم الميلانيني في حد ذاته لم يكن كذلك تتأثر بشكل كبير بإسكات PAK1 (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، كان التحديد الكمي الدقيق لمستويات بروتين PAK1 عن طريق مسح هذه البقعة الغربية أمرًا صعبًا إلى حد ما ، ويرجع ذلك أساسًا إلى ضوضاء الخلفية العالية حول نطاق PAK1 في محاولة لتصور مستويات التعبير المنخفضة للغاية. بدلاً من ذلك ، باستخدام مقايسة كيناز "Macaroni-Western" (5،10) ، تحققنا من أن نشاط كيناز لـ PAK1 في كل من SH1 و 2 مستنسخات فقط حوالي 25-30 بالمائة من ذلك في خلايا التحكم (WT) ( انظر الشكل 2 أ).

3.2.2. انخفاض في تكون الميلانين عن طريق إسكات الجين PAK1

كان سؤالنا الحرج التالي هو ما إذا كان مثل هذا الانخفاض في نشاط كيناز لـ PAK1 يؤثرتكون الميلانين. وهكذا ، تمت مقارنة محتوى الميلانين في هذه الحيوانات المستنسخة (SH1 و 2) مع خلايا الورم الميلانيني من النوع البري (WT) ، بعد معالجة كل هذه الخلايا بمحفز الميلانيني -MSH ، لمدة 72 ساعة. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، يتم تقليل محتوى الميلانين في الخلايا الصباغية الناقصة PAK 1- (SH1 و 2) بحوالي 50 بالمائة (51-55 بالمائة) ، ليصل إلى المستوى الأساسي في WT بدون هرمون الميلانوجين. لمعرفة ما إذا كان هذا الانخفاض في محتوى الميلانين مرتبطًا بقمع نشاط التيروزيناز ، قمنا بقياسالتيروزينازالنشاط في الخلايا الناقصة PAK 1- (استنساخ SH1 و 2) ، مقارنةً بخلايا WT. كما هو موضح في الشكل 2C ، فإن نشاط التيروزيناز في الخلايا الناقصة PAK 1- يبلغ حوالي 45 بالمائة فقط (33-58 بالمائة) من ذلك في WT ، ويصل مرة أخرى إلى المستوى الأساسي (غير المحفز) ، مما يشير بوضوح أن PAK1 ضروري لإنتاج الميلانين الناجم عن MSH بواسطةالتيروزينازفي الخلايا الصباغية. علاوة على ذلك ، بطريقة مشابهة جدًا ، تم أيضًا تقليل تكوين الميلان الناجم عن IBMX عن طريق إسكات الجين PAK1 في خط خلايا سرطان الجلد (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، مع الأخذ في الاعتبار العاملين التاليين ، فمن المرجح أن نصف فقط منتكون الميلانينفي الخلايا الصباغية يعتمد على PAK 1- ، والباقي ("الأساسي" إلى حد كبير) يعتمد على PAK 4-: (1) PAK4 ضروري أيضًا لتكوين الميلانين الناجم عن MSH في الخلايا الصباغية (8) ، و (2) يبدو أن حوالي 25 في المائة من جين PAK1 لا يزال معبرًا عنه في هذه المواد المنقولة للعدوى (SH1 و 2). ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح ما إذا كان PAK1 مسؤولاً عن الهرمون المحفز أم القاعديتكون الميلانين.

علاوة على ذلك ، أكدنا أن PAK1 الداخلي المنشأ يتم تنشيطه بشكل كبير بواسطة محرضات الميلانين مثل IBMX و -MSH في خط خلايا الورم الميلانيني هذا (انظر الشكل 1) ، ولكن دون أي تغيير كبير في الفسفرة الذاتية في Thr 423 كما تم الحكم عليه من قبل anti-pPAK1 الجسم المضاد (البيانات غير معروضة).

3.3 زيادة في تكوين الميلانين الذي يحفزه MSH عن طريق الإفراط في التعبير عن PAK1

من خلال الإفراط في التعبير عن جين PAK1 من النوع البري (WT) في الخلايا الصباغية (خط خلية B16F10) عن طريق ترنسفكأيشن ، كشفنا أن جين PAK1 المضاف خارجيًا يعزز مستوى الميلانين المستحث بـ MSH بعدة طيات (انظر يسار الشكل 3 ، قارن الممران 2 و 4) ، في حين أنه بالكاد يؤثر على مستوى الميلانين "الأساسي" المستقل في حد ذاته (قارن الممرات 1 و 3 في اللوحة اليسرى من الشكل 3) ، مما يشير إلى أن PAK1 يساهم بشكل أساسي في -MSH / IBMX- المعتمدتكون الميلانين، وليس تكوين الميلانين القاعدي بدون منبه (محفزات) خارجية.

3.4. تأثير المصل على تكوين الميلانين الذي يسببه MSH / IBMX

الأكثر إثارة للاهتمام ، وجدنا أن تحريض تكوين الميلانين بواسطة -MSH / IBMX يتطلب 10 بالمائة FBS (مصل بقري جنيني) بالإضافة إلى PAK1. كما هو مبين في الشكل 4 أ ، في وسط خالٍ من المصل ، بالكاد تسبب -MSH أو IBMX في حدوثتكون الميلانينفي خلايا WT ، على الرغم من أن نسبة 10 في المائة من FBS وحدها (بدون -MSH / IBMX) تسببت في حدوثتكون الميلانينبشكل ملحوظ (بنحو 60 في المائة). ومن المثير للاهتمام أن تكون الميلانين في المواد المنقولة للعدوى SH (PAK 1- الخلايا الناقصة) في وجود أو عدم وجود مصل كان نفس المستوى الموجود في خلايا WT في غياب المصل (انظر الشكل 4 ب) ، مما يشير إلى أن تكوين الميلانين المعتمد على المصل يتطلب أيضًا PAK1. لدعم هذه الفكرة ، ينشط المصل وحده نشاط كيناز PAK1 بشكل كبير في خلايا WT ، لكن التنشيط المعتمد على MSH لـ PAK1 في خلايا WT يتطلب مصلًا (انظر الشكل 4C).

فيما يتعلق بالطبيعة الكيميائية لعامل مصل الميلانين الذي ينشط وحده PAK1 ، فإننا نتوقع أنه PDGF (عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية) للأسباب التالية: (1) منذ أكثر من عقد من الزمان ، أظهرنا أن PDGF هو عامل النمو الوحيد في مصل ينشط PAK1 من خلال معاملة مستقبلات EGF (عامل نمو البشرة) بواسطة مستقبل PDGF (13 ، 14) ، وقد أثبت آخرون مؤخرًا أن إما PDGF أو EGF وحده يحفز بالفعلتكون الميلانينعدد الخلايا الصباغية (15،16).

3.5 يتطلب تكوين الميلانين المعتمد على المصل / PDGF مستقبلات EGF

في محاولة لتحديد الطبيعة الكيميائية المحددة لعامل مصل الميلانين هذا ، اختبرنا تأثير إما AG1295 (مثبط خاص بمستقبل PDGF) أو AG1478 (مثبط خاص بمستقبل EGF) على المصل المعتمدتكون الميلانينفي الخلايا الصباغية. كما هو مبين في الشكل 5 ، إما 2 ميكرومتر AG1295 أو 400 نانومتر AG1478 قلل بشدة من المعتمد على المصلتكون الميلانينإلى المستوى المكافئ لتكوين الميلانين الأساسي (الخالي من المصل). نظرًا لأن PDGF موجود بكثرة في المصل ، ولكن ليس EGF و AG1295 لا يثبط مستقبل EGF ، في حين أن AG1478 لا يثبط مستقبل PDGF (13) ، فمن المرجح أن PDGF في المصل ينشط مستقبله الذي بدوره ينشط مستقبل EGF الذي في النهاية ينشط PAK1 وهو أمر ضروري لتكوين الميلانين المعتمد على المصل (لمزيد من التفاصيل ، انظر الشكل 6). بناءً على هذا الافتراض ، سنناقش لاحقًا الآلية الأكثر احتمالية الكامنة وراء التآزر الواضح بين -MSH والمصل / PDGF لتنشيط PAK1 ، مما يؤدي إلى تكوين الميلانين القوي.

أخيرًا ، تجدر الإشارة إلى أن محتوى الميلانين "الأساسي" بدون -MSH لم يتغير بشكل كبير عن طريق متحولة CA (نشطة بشكل أساسي) لـ PAK1 تحمل طفرة T423E (انظر اللوحة اليسرى من الشكل 3 ، الممر 5) مثل إذا كانت إما DN (سلبية سائدة) أو متحولة غير نشطة. في الواقع ، لم يحفز -MSH الفسفرة لـ WT PAK1 عند Thr 423 على الإطلاق (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، يمكن استنتاج أن الفسفرة التلقائية لـ PAK1 في Thr 423 لا علاقة لها بتنشيط PAK1 الناجم عن MSH ، مما يؤدي إلىتكون الميلانينفي خلايا الورم الميلانيني. نظرًا لأن متحولة T423E لـ PAK1 معروفة جيدًا بأنها مسرطنة بدرجة عالية (6) ، فربما تعمل الفسفرة التلقائية في Thr 423 على التبديل من الإشارات "الميلانينية" إلى "المولدة للورم".

4. مناقشة

من ملاحظتنا على كل من تكوين الميلانين المعتمد على PAK 1- والمعتمد على PAK 4- في الخلايا الصباغية / سرطان الجلد ، هناك مشكلتان يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام يجب الإشارة إليها: (1) النشاط الميلانيني "المحدد" لـ PAK1 ( فقط بدقة) يجب أن يكون أعلى بكثير من PAK4 (شديد التعبير) في خلايا الورم الميلانيني. (2) يبدو أن PAK1 مسؤول بشكل أساسي عن تكوين الميلانين الناجم عن المصل ، في حين أن PAK4 مسؤول بشكل أساسي عن الجوهر (القاعدية)تكون الميلانين. بعبارة أخرى ، على الرغم من أن نقص PAK 4- مميت من الناحية الجنينية في الفئران ، بينما يفشل نقص PAK 1- وحده في إنتاج فئران "ألبينو" ، فإن الاختلاف الواضح في لون الجلد الأصلي (أساسيتكون الميلانين) بين الأسود والأبيض على سبيل المثال يمكن أن يكون انعكاسًا جزئيًا على الأقل للاختلاف في مستوى التعبير عن PAK4 ، وكذلك الاختلاف في مستوى تكوين الميلانينالتيروزينازs.

في الجسم الحي ، وباستخدام فئران HRM -2 (مصطبغة ولكنها خالية من الشعر) ، أظهرنا مؤخرًا أن الكريم الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط PF3758309 (مثبط PAK1 / PAK 4-) يقلل من تكوين الميلانين المستحث بالأشعة فوق البنفسجية في بشرتهم إلى المستوى القاعدي ، على الرغم من أنه لا يزال يتعين توضيح ما إذا كان PAK4 أو PAK1 مسؤولان عن تحريض الأشعة فوق البنفسجية لتكوين الميلانين (8). نظرًا لأن PAK1 مسؤول عن تكوين الميلانين المحرض ، ولكن ليس الأساسي ، فسيكون من المفيد اختبار ما إذا كان PAK1 يساهم بشكل كبير في تحفيز الأشعة فوق البنفسجيةتكون الميلانين(دباغة الشمس) أيضًا ، باستخدام متحولة PAK1 KO النادرة المستمدة من سلالة C57B16 من الفئران التي تحمل الشعر الداكن والعينين (Hong He et al. ، ملاحظة غير منشورة) ، في محاولة لفهم ما إذا كانت مجموعة متنوعة من الأعشاب PAK1 الحاصرات في مستحضرات التجميل مفيدة لعوامل الحماية من الشمس أم لا. ومن المثير للاهتمام أنه تم الإبلاغ عن تنشيط PAK1 عن طريق الإشعاع فوق البنفسجي وغيره من العوامل الضارة بالحمض النووي (17).

لقد ثبت أن -MSH ينشط Tyr kinase JAK2 (18) ، والذي بدوره ينشط PAK1 عن طريق الفسفرة في Tyr 285 ، (بدلاً من Thr 423) ، مما يؤدي إلى تفاعل PIX-PAK1 (19). قد يفسر هذا سبب عدم وجود تنشيط يعتمد على -MSH لـ PAK1 أو تكوين الميلانين ينطوي على الفسفرة الذاتية لـ PAK1 في Thr 423. وبالتالي ، قمنا مؤخرًا بالتحقيق في ما إذا تم حظر تكوين الميلانين المعتمد على PAK 1- بواسطة JAK العشبي الفعال 2- مثبط يسمى cucurbitacin I (CBI) من البطيخ المر (Goya) الذي يثبط JAK2 مباشرة (20) ، ووجد أن CBI يمنعتكون الميلانينفي وجود هرمونات الميلانين بنسبة تزيد عن 70 في المائة ، مما يشير إلى احتمال أن يمنع CBI ليس فقط PAK1 ولكن أيضًا PAK4 (5). في هذا السياق ، سيكون من المهم ملاحظة أن حاصرات PAK 1- العشبية مثل CAPE ، والكركمين ، و shikonin ، و FTY 720 يمكن أن تثبط تكوين الميلانين المستحث بـ MSH في خلايا جلد الفأر أو الإنسان فقط حول 50 في المائة حتى في تركيزاتها حيث يتم حظر PAK1 بالكامل تقريبًا (1،2) ، في حين أن مانع عموم PAK الاصطناعي PF3758309 ، الذي يمنع كل من PAK1 و PAK4 ، يلغيتكون الميلانينفي خلايا الجلد بحوالي 90 بالمائة عند 300 نانومتر (8). بعبارة أخرى ، يمكن للنظام الميلانيني المستحث بـ MSH في الخلايا الصباغية أن يميز حاصرات PAK 1- المحددة عن حاصرات عموم PAK. حتى الآن لم يتم تحديد أي حاصرات عشبية معينة 4- (بخلاف siRNAs المحددة لـ PAK 4-). ومع ذلك ، فقد ثبت مؤخرًا أن مادة شبه قوية جدًا تسمى glaucarubinone مشتقة من شجرة مريرة تزرع في غابات الأمازون تمنع كل من PAK1 و PAK4 ، مما يثبط نمو خلايا سرطان البنكرياس في المختبر وفي الجسم الحي (21). وبالتالي ، سيكون من الأهمية بمكان اختبار ما إذا كان مانع PAK العشبي يثبط تكوين الميلانين في خلايا الجلد تمامًا كما يفعل PF3758309.

كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو التركيز على الدور المحدد للميلانين لـ PAK1 ، وليس التحقيق بالتفصيل في كيفية تنشيط PAK1 لمسار الإشارات الميلانينية بما في ذلك الإنزيمات الميلانينية و MTFs. ومع ذلك ، فمن المرجح أن PAK1 ينشط بيتا كاتينين مباشرة عن طريق الفسفرة في Ser 675 ، مما يؤدي إلى تنشيط MITF وهو أمر ضروري للتعبير عن ترميز الجينات للإنزيمات المولدة للصباغ مثلالتيروزيناز(صور).

اكتشفنا مؤخرًا أن PAK4 (كيناز 4 معتمد على CDC 42-) متورط أيضًا فيتكون الميلانينمن نفس خط خلايا الورم الميلانيني عن طريق تنشيط عاملين نسخ ، وهما CREB وبيتا كاتينين ، وكلاهما ضروري لتنشيط MIFT (8). نظرًا لأنه من المعروف أن CREB يتم تنشيطه بواسطة LIM kinase (22،23) الذي يشبه بيتا كاتينين ، فهو من بين الركائز المباشرة الشائعة لكل من PAK1 و PAK4 (6،18) ، فمن المرجح أن PAK1 و PAK4 يشتركان في نفس CREB / مسارات إشارات بيتا كاتينين MITF لتنشيط جينات الإنزيم الميلانيني.

ومع ذلك ، فإن مسارات الإشارة التفصيلية التي تؤدي إلى تنشيط PAK1 المعتمد على MSH / IBMX يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا عن تلك التي تؤدي إلى تنشيط PAK4 ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن الأول يتضمن عامل المصل (PDGF). المصل وحده قادر على تنشيط PAK1 (13) ويعزز التنشيط المعتمد على -MSH / IBMX لـ PAK1 أيضًا. بمعنى آخر ، هناك تآزر واضح بين المصل وهذه الهرمونات الميلانينية في كل من تنشيط PAK1 وتكون الميلانين.

فيما يلي فرضية العمل الخاصة بنا حول كيفية حدوث هذا التآزر. مسار الإشارات الرئيسي المؤدي إلى تنشيط PAK1 هو EGFR المنشأ (مستقبل عامل نمو البشرة) -RAS-PI 3 kinase-RAC / CDC 42- سلسلة PAK1. ومع ذلك ، فإن هذا التسلسل وحده لا يكفي للتنشيط الكامل. إنه يحتاج إلى عامل آخر يسمى PIX ، وهو بروتين محول SH3 الذي يربط مباشرة PAK1 من خلال نموذج Pro-rich المكون من 18 حمضًا أمينيًا يسمى PAK18. يحتاج تفاعل PIX-PAK1 إلى بروتين ثالث يسمى JAK2 ، وهو Tyr-kinase ، والذي يعمل على فسفوريلات PAK1 في Tyr 285. RAS ينظم JAK2 من خلال البرولاكتين. وفقًا لعدد قليل من النتائج السابقة التي أجريناها وآخرون (13-16) ، فإن PDGF (عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية) هو عامل (عوامل) مصل الميلانوجين الرئيسية الضرورية لـ MSH / IBMX المستحثةتكون الميلانين، لأنه ينشط مستقبله (PDGFR) Tyr-kinase الذي بدوره ينشط EGFR (مستقبل عامل نمو البشرة=ErbB1) Tyr-kinase ، مما يؤدي إلى تنشيط PAK1 من خلال RAS-PI3 kinase-RAC. / مسار CDC42 (13). وبالتالي ، يمكن لـ PDGF في المصل وحده تنشيط PAK1 والحث على تكوين الميلانين حتى منتصف الطريق. ومع ذلك ، من أجل التنشيط الكامل لتكوين الميلانين المعتمد على PAK 1- ، يلزم -MSH / IBMX لتنشيط JAK2 من خلال مسار يعتمد على cAMP (والذي قد يتضمن PKA) الذي يؤمن في النهاية تفاعل PIX-PAK1 (للحصول على التفاصيل ، انظر الشكل 6).

في الختام ، نقدم هنا أول دليل كيميائي حيوي قد يفسر كيف يمكن لمجموعة متنوعة من حاصرات PAK العشبية 1- مثل CAPE والكركمين والشيكونين في كريمات التجميل أن تساهم في "تفتيح البشرةالآثار: سلسلة من الدراسات المماثلة مع الخلايا الصباغية البشرية في انتظار مزيد من الإثبات أو التأكيد.

الجينسنغ maca cistanche

مراجع

1. Lee JH ، و Jang JY ، و Park C ، و Kim BW ، و Choi YH ، و Choi BT. يمنع الكركمين تكوين الميلانين المحفز للهرمون ألفا الميلانيني في خلايا B16F10. إنت J مول ميد. 2010 ؛ 26: 101-106.

2. Lee JY، Choi HJ، Chung TW، Kim CH، Jeong HS، Ha KT. يثبط إستر الفينيثيل حمض الكافيك تخليق الميلانين الذي يسببه هرمون ألفا الميلانين من خلال قمع نشاط المعاملات لعامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم. J نات برود. 2013 ؛ 76: 1399-1405.

3. Maruta H. العلاجات العشبية التي تمنع كيناز الورم PAK1: نهج عملي تجاه الأمراض التي تعتمد على PAK 1- وطول العمر. Phytother Res. 2014 ؛ 28: 656-672.

4. Nguyen BCQ ، Taira N ، Tawata S. العديد من المركبات العشبية في نباتات أوكيناوا تثبط بشكل مباشر كيناز المسرطنة / الشيخوخة PAK1. هناك اكتشاف المخدرات. 2014 ؛ 8: 238-244.

5. Nguyen BCQ و Be Tu PT و Tawata S و Maruta H. مزيج من الترسيب المناعي (IP) -ATP _ اختبار Glo kinase وتكوين الميلانين لتقييم حاصرات PAK 1- القوية والآمنة في ثقافة الخلية . هناك اكتشاف المخدرات. 2015 ؛ 9: 289-295.

6. He H، Maruta H. Oncogenicty of PAKs وركائزها. في: PAKs ، RAC / CDC42 (ص 21) كينازات نشطة: نحو علاج السرطانات والأمراض الأخرى التي تعتمد على PAK (Maruta H ، ed.). إلسفير ، أكسفورد ، 2013 ؛ ص. 23-51.

7. Widlund HR ، Horstmann MA ، Price ER ، Cui J ، Lessnick SL ، Wu M ، He X ، Fisher DE. - يتطلب نمو الورم الميلانيني الناجم عن الكاتينين عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم المصاحب للهدف المصب. J خلية بيول. 2002 ؛ 158: 1079-1087.

8. Yun CY ، You ST ، Kim JH ، Chung JH ، Han SB ، Shin EY ، Kim EG. ينظم p 21- الكيناز 4 المنشط بشكل حاسم تكون الميلانين من خلال تنشيط مسارات CREB / MITF و -catenin / MITF. J إنفست ديرماتول. 2015 ؛ 135: 1385-1394.

9. Huynh N ، Liu KH ، Baldwin GS ، He H. P 21- تنشيط كيناز 1 يحفز نمو خلايا سرطان القولون والهجرة / الغزو عبر مسارات تعتمد على ERK و AKT. Biochim Biophys Acta. 2010 ؛ 1803: 1106-1113.

10. تاجلياتي ف ، بوتوني أ ، بوسيتي أ ، زاتيلي إم سي ، ديجلي أوبرتي إي سي. استخدام تقنية الإنارة لتطوير اختبار كيناز: Cdk4 كنظام نموذجي. J فارم بيوميد الشرج. 2005 ؛ 39: 811-814 .11. Yoon NY ، Eom TK ، Kim MM ، Kim SK. التأثير التثبيطي للفلوروتانين المعزول من Ecklonia cava على نشاط التيروزيناز في الفطر وتكوين الميلانين في خلايا الورم الميلانيني B16F10 بالفأر. جي أغريك فود تشيم. 2009 ؛ 57: 4124-4129.

12. Li X، Guo L، Sun Y، Zhou J، Gu Y، Li Y. Baicalein يمنع تكوين الميلانين من خلال تنشيط مسار إشارات ERK. إنت J مول ميد. 2010 ؛ 25: 923-927.

13. He H، Levitzki A، Zhu HJ، Walker F، Burgess A، Maruta H. يتطلب عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية مستقبلات عامل نمو البشرة لتنشيط p 21- كينازات عائلة الكيناز المنشط. J بيول كيم. 2001 ؛ 276: 26741-26744.

14. Saito Y، Haendeler J، Hojo Y، Yamamoto K، Berk BC. تغاير المستقبلات: آلية أساسية لمعاملات مستقبلات عامل نمو البشرة المشتق من عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية. مول الخلية بيول. 2001 ؛ 21: 6387-6394.

15. Hirobe T ، Shibata T ، Fujiwara R ، Sato K. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ينظم تكاثر وتمايز الخلايا الصباغية البشرية بطريقة تمايز محددة المرحلة. علوم ديرماتول ي. 2016 ؛ 83: 200-209.

16. Garcez RC، Teixeira BL، Schmitt Sdos S، Alvarez-Silva M، Trentin AG. عامل نمو البشرة (EGF) يعزز التمايز في المختبر لخلايا القمة العصبية إلى الخلايا العصبية والخلايا الصباغية. نيوروبيول مول الخلية. 2009 ؛ 29: 1087-1091.

17. رويج جيه ​​، تراوغ جا. 21- ينشط بروتين كيناز جاما PAK بواسطة الإشعاع المؤين وغيره من العوامل الضارة بالحمض النووي. أوجه التشابه والاختلاف مع alpha PAK. J بيول كيم. 1999 ؛ 274: 31119-31122.

18. عربات التي تجرها الدواب JJ. ارتباط الهرمون المحفز للخلايا الصباغية ألفا بمستقبلاته المقترنة ببروتين G على الخلايا الليمفاوية B ينشط مسار Jak / STAT. Biochem J. 1998 ؛ 331: 211-216.

19. Hammer A، Oladimeji P، De Las Casas LE، Diakonova M. تسهل فسفرة التيروزين 285 من PAK1 تجليد PIX / GIT1 ودوران الالتصاق. FASEB J. 2015 ؛ 29: 943-959.

20. Blaskovich MA ، Sun J ، Cantor A ، Turkson J ، Jove R ، Sebti SM. اكتشاف JSI -124 (cucurbitacin I) ، وهو محول Janus kinase / إشارة انتقائي ومُنشط لمثبط مسار إشارات النسخ 3 مع نشاط قوي مضاد للأورام ضد الخلايا السرطانية البشرية والفأرية في الفئران. الدقة السرطان. 2003 ؛ 63: 1270-1279.

21. يعمل كل من Yeo D و Huynh N و Beutler JA و Christophi C و Shulkes A و Baldwin GS و Nikfarjam M و He H. Glaucarubinone و gemcitabine على تقليل نمو سرطان البنكرياس بشكل متآزر عن طريق التنظيم السفلي للكينازات المنشطة 21-. ليت السرطان. 2014 ؛ 346: 264-272.

22. Dan C ، Kelly A ، Bernard O ، Minden A. يتم التوسط في التغيرات الهيكلية الخلوية التي ينظمها PAK4 سيرين / ثريونين كيناز بواسطة LIM kinase 1 و cofilin. J بيول كيم. 2001 ؛ 276: 32115-32121.

23. Yang EJ، Yoon JH، Min DS، Chung KC. ينشط LIM كيناز 1 بروتين ربط العناصر المستجيب لـ cAMP أثناء التمايز العصبي للخلايا السلفية الحصينية الخالدة. J بيول كيم. 2004 ؛ 279: 8903-8910.